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SESQUITERPENOS DA ALGA LAURENCIA DENDROIDEA COM POTENCIAL
ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA
Karina Godarth Gonçalves
2017
Universidade Federal do Rio de Janeiro
SESQUITERPENOS DA ALGA LAURENCIA DENDROIDEA COM POTENCIAL
ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA
Karina Godarth Gonçalves
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio de
Janeiro-Campus Macaé Professor Aloísio Teixeira, para
obtenção do grau de mestre em produtos bioativos e
biociências.
Orientador: Nelilma C. Romeiro
Co-orientador: Angélica R. Soares
Macaé
Setembro, 2017
SESQUITERPENOS DA ALGA LAURENCIA DENDROIDEA COM POTENCIAL
ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA
Karina Godarth Gonçalves
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Produtos
Bioativos e Biociências da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Produtos Bioativos e Biociências.
Aprovada por:
Profª. Drª Michelle Frazão Muzitno
Profª. Drª Paula lvarez Abreu
Profº. Drº Leandro Louback da Silva
Macaé
Setembro, 2017
Godarth, Karina
Sesquiterpenos da alga Laurencia dendroidea com potencial atividade
anticolinesterásica / Karina Godarth Gonçalves - Macaé: UFRJ/NUPEM, 2017.
xv, 129f.: il.; 31 cm.
Orientadora: Nelilma Correia Romeiro
Co-orientadora: Angélica Ribeiro Soares
Dissertação (mestrado) – UFRJ/ Programa de Pós-graduação em Produtos
Bioativos e Biociências, 2017.
Referências Bibliográficas: f. 122 - 129.
1. Modelagem molecular. 2. Produtos Naturais. 3. Alzheimer 4. Elatol 5.
Acetilcolinesterase I. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Núcleo em Ecologia e
Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé. II. Sesquiterpenos da alga Laurencia
dendroidea com potencial atividade anticolinesterásica
“Quando a educação não é libertadora, o sonho do oprimido é ser o
opressor”
PAULO FREIRE
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por ter me trazido experiências que me tornaram forte e
perseverante o suficiente para não desistir.
Ao Professor Doutor Robson Mattos, quem primeiramente me acolheu na nova
Universidade e posso dizer que me deu a oportunidade de continuar.
Aos professores da minha antiga universidade, Universidade Federal Fluminense, que
me forneceram boa parte da base acadêmica necessária para que eu chegasse até aqui.
À Professora Doutora Nelilma Correia Romeiro, minha orientadora e nossa mãe
científica, com quem tive a oportunidade de aprender sobre modelagem molecular e cujas
valiosas lições que não se restringiram ao campo da pesquisa, inspiram o tipo de professora e
pesquisadora que quero me tornar.
À minha co-orientadora Professora Doutora Angélica Ribeiro Soares por todo
aprendizado que me proporcionou.
Ao Professor Doutor Leandro Louback por todo conhecimento e parceria, além das
valiosas contribuições a este trabalho.
Às professoras Michelle Frazão Muzitano e Paula Alvarez Abreu pela dedicação e
valiosas contribuições a este trabalho durante as bancas de acompanhamento.
Aos colegas do LICC – Laboratório Integrado de Computação Científica e GPNOA -
Grupo de Pesquisa de Produtos Naturais com Organismos Aquáticos pelo acolhimento e toda
parceria.
À Aline Gomes e ao Roberto Sousa, técnicos do LIQ - Laboratório Integrado de Química,
por todo o auxílio e pelas calorosas discussões e momentos de descontração.
À Nathália Nocchi, por toda ajuda com o mundo dos Produtos Naturais Marinhos.
Às amigas Priscila Baltazar Gonçalves e Stella Schuenck Antunes, por todo o apoio e
amizade. Que esta amizade, nascida durante o curso de mestrado, possa perdurar por toda a
vida. Vocês são muito especiais.
Ao amigo Vítor Rabelo, exemplo parceria e companheirismo no ambiente de trabalho,
por mais colegas de trabalho assim no mundo.
À amiga Izabella Cristina por toda sua amizade e por cuidar do meu jardim todas as
vezes em que eu não podia.
Ao meu amigo Luís Barbosa por se preocupar, torcer e se sentir feliz com minhas
conquistas, por estar sempre presente mesmo mediante a distância.
Às minhas irmãs, Layz Godarth Gonçalves e Lívia Godarth Gonçalves, pelo amor
sincero e despretensioso que me dedicam.
Ao Coletivo #VEM - Vida, Educação e Movimento, que através de todo seu trabalho
na busca por uma sociedade mais justa e igualitária faz de mim a cada dia uma pessoa melhor.
Aos meus alunos do #VEMproCursinho por me ensinarem a ser professora e pela
alegria que são capazes de me proporcionarem mesmo depois de um dia ruim.
À minha avó Tereza Godarth, que inspira o tipo de pessoa que desejo ser, e que do
céu, certamente está muito feliz e orgulhosa de mim. Quanta saudade...
Ao meu amor, que esteve presente nos momentos em que mais precisei e me incentiva
a sempre seguir em frente e nunca desistir.
RESUMO
PRODUTOS NATURAIS MARINHOS COM POTENCIAL ATIVIDADE
ANTICOLINESTERÁSICA
Karina Godarth Gonçalves
Nelilma C. Romeiro e Angélica R. Soares
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Produtos Bioativos e Biociências - Núcleo em Ecologia e Desenvolvimento Ambiental de
Macaé - Nupem, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Campus Macaé
Professor Aloísio Teixeira, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Mestre em Produtos Biativos e Biociências.
A doença de Alzheimer é uma enfermidade neurodegenerativa associada à idade, em
que, entre outras características fisiopatológicas, o portador possui níveis reduzidos do
neurotransmissor acetilcolina. Uma das vias de tratamento se dá com a inibição da enzima
AChE, que degrada esse neurotransmissor, aumentando assim a sua concentração. Através da
utilização da técnica de Quimiogenômica aplicada a um banco de dados de produtos naturais
marinhos, metabólitos secundários presentes em algas vermelhas do gênero Laurencia foram
apontados como potenciais inibidores de AChE. Neste trabalho, esses metabólitos foram
estudados através do docking molecular e ensaios de inibição enzimática. Dentre eles, o elatol
foi apontado com o mais promissor potencial anticolinesterásico. De forma a potencializar a
inibição observada experimentalmente e a afinidade de ligação pelo sítio da enzima observada
in silico, novos protótipos inibidores foram planejados a partir da adição de farmacóforos,
representados por aminas, à molécula do elatol e estudados através da modelagem molecular
quanto a propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas. As estruturas derivadas foram
divididas em quatro classes principais: aminas alifáticas, aminas cíclicas, arilaminas e
arilaminas substituídas. Os melhores resultados de docking, além de apresentarem
propriedades ADME-T favoráveis, mostraram alguns padrões interações a cada classe de
derivados com diversos resíduos importantes pertencentes ao sítio ativo da enzima. Dessa
forma, sugere-se a síntese dos derivados Tza 19 R, representante da classe das aminas
alifáticas, Tza 05 S, representante da classe das aminas cíclicas e Tzb 10 S, representante da
classe das arilaminas substituídas, de maneira a explorar o potencial das interações que foram
características de cada grupo.
Palavras chave: Alzheimer, Elatol, Acetilcolinesterase
Macaé,
Setembro de 2017
ABSTRACT
PRODUTOS NATURAIS MARINHOS COM POTENCIAL ATIVIDADE
ANTICOLINESTERÁSICA
Karina Godarth Gonçalves
Nelilma C. Romeiro e Angélica R. Soares
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Produtos Bioativos e Biociências Núcleo em Ecologia e Desenvolvimento Ambiental de
Macaé - Nupem, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Produtos Biativos e Biociências.
Alzheimer’s disease is a neurodegenerative disease associated to age in which, among
other physiopathological characteristics, the patient presents reduced levels of the
neurotransmitter acetylcholine. One of the possible treatment paths uses AChE enzyme
inhibitors, which degrades this neurotransmitter, leading to an increase in acetylcholine levels
in the brain. By the utilization of chemogenomics techniques applied to a marine natural
products database, secondary metabolites present in red algae of the genus Laurencia have
been pointed out as potential AChE inhibitors. In this work, these metabolites were studied
with molecular docking and enzymatic inhibition assays. According to the obtained results the
most promising secondary metabolite in relation to AChE inhibition capacity was Elatol. In
order to potentiate the observed experimental inhibition and the in silico binding affinity to
the enzyme active site, new inhibitor prototypes were planned through the addition of
pharmacophores to the structure, represented by amines, of the elatol molecule and studied
through molecular modeling for pharmacodynamic and pharmacokinetic properties. The
derivative structures were divided into four major classes: aliphatic amines, cyclic amines,
arylamines and substituted arylamines. The best docking results, in addition to having
favorable ADME-T properties, showed some interaction patterns for each class of derivatives
with several important residues belonging to the active site of the enzyme. Thus, the synthesis
of derivatives Tza 19 R, representative of the aliphatic amine class, Tza 05 S, representative
of the cyclic amines class and Tzb 10 S, representative of the class of the substituted
arylamines, is suggested in order to exploit the potential of the interactions that were
characteristic of each group.
Key words: Alzheimer, Elatol, Acetilcholinesterase
Macaé,
Setembro de 2017
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 21
1.1 A Doença de Alzheimer ..................................................................................................... 21
1.1.1 Hipótese colinérgica................................................................................................... 21
1.1.2 Hipótese amiloide ...................................................................................................... 25
1.1.3 Hipótese tau ............................................................................................................... 27
1.1.4 Hipótese glutamatérgica............................................................................................. 28
1.2 O tratamento farmacológico disponível e seus alvos terapêuticos ..................................... 30
1.2.1 Ação dos Inibidores de AChE ......................................................................................... 31
1.2.2 Produtos de Origem Natural no Tratamento da DA ........................................................ 34
1.3 Produtos Naturais ............................................................................................................... 36
1.3.1 Produtos Naturais Marinhos ............................................................................................ 37
1.3.1.1 Metabólitos bioativos de Laurencia sp. ....................................................................... 41
1.4 Modelagem Molecular ....................................................................................................... 44
1.4.1 Docking Molecular ......................................................................................................... 44
1.4.2 Cálculo de Parâmetros Farmacocinéticos in silico .......................................................... 47
1.4.2.1 Regra dos 5 de Lipinski ................................................................................................ 48
1.4.2.2 Permeabilidade através da barreira hemato-encefálica ................................................ 49
1.4.2.3 Predição da Toxicidade in Silico .................................................................................. 50
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................................. 52
3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 54
3.1 Objetivos específicos .......................................................................................................... 54
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 55
Parte I: Estudos in silico da afinidade teórica entre metbólitos secundários de Laurencia e
AChE ........................................................................................................................................ 55
4.1Obtenção das estruturas das Proteínas-Alvo ....................................................................... 55
4.1.2 Validação do método: Redocking .................................................................................... 55
4.1.3 Estudos de Docking Molecular ........................................................................................ 56
Parte II: Ensaios de cinética enzimática entre metbólitos secundários de Laurencia e AChE 57
4.2 Determinação da atividade anticolinesterásica de metabólitos secundários de Laurencia sp
.................................................................................................................................................. 57
Parte III: Obtenção do metbólito secundário mais ativo a partir de Laurencia dendroidea .... 59
4.3 Obtenção e Identificação do elatol ..................................................................................... 59
4.3.1 Coleta da Alga ................................................................................................................. 59
4.3.2 Processo de extração ........................................................................................................ 60
4.3.3 Fracionamento do Extrato Bruto ..................................................................................... 61
4.3.4 Purificação ...................................................................................................................... 62
4.3.5 Caracterização do elatol................................................................................................... 64
Parte IV: Proposição de derivados do metabólito secundário mais ativo e estudos in silico por
meio de docking e avaliação de parâmetros farmacocinéticos para realização de triagem
virtual ........................................................................................................................................ 64
4.4 Planejamento dos Derivados do Elatol ............................................................................... 64
4.4.1 Avaliação dos parâmetros farmacocinéticos ................................................................... 66
4.4.1.1 Regra dos 5 de Lipinski ................................................................................................ 66
4.4.1.2 Cálculo Teórico da Capacidade de Permeação da Barreira Hematoencefálica ............ 67
4.4.1.3 Predição da Toxicidade in silico ................................................................................... 67
4.4.2 Estudos de Docking Molecular........................................................................................ 69
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................... 69
5.1 Estudos de docking molecular ............................................................................................ 69
5.1.1 Seleção das estruturas de AChE ...................................................................................... 69
5.1.2 Validação do método: Redocking ................................................................................... 73
5.1.3 Estudos de docking molecular dos Metabólitos secundários de Laurencia sp ................ 74
5.2 Ensaio de inibição enzimática da AChE pelos Metabólitos secundários de Laurencia sp. 81
5.3 Isolamento e identificação do Elatol .................................................................................. 86
5.3.1 Processo de extração ........................................................................................................ 86
5.3.2 Fracionamento do extrato Bruto ...................................................................................... 87
5.3.3 Purificação ....................................................................................................................... 88
5.3.4 Caracterização do elatol................................................................................................... 89
5.4 Proposição de derivados do elatol ...................................................................................... 94
5.5 Cálculo Teórico da Capacidade de Permeação da Barreira Hematoencefálica ................ 100
5.6 Regra dos 5 de Lipinski .................................................................................................... 104
5.7 Predição da Toxicidade in Silico ...................................................................................... 105
5.8 Estudos de Docking Molecular dos Derivados do elatol .................................................. 107
5.8.1 Derivados alifáticos ....................................................................................................... 109
5.8.2 Derivados cíclicos.......................................................................................................... 111
5.8.3Derivados anilínicos ....................................................................................................... 115
6. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 122
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 123
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Esquema da transmissão colinérgica. Adaptado de HOGAN, 2009. ....................... 22
Figura 2: Ach ao fundo da cavidade de 20Å, onde se localiza o sítio catalítico da AChE.
Resíduos de aminoácidos que compõem os principais sítios de AChE humana em destaque.
(PDB id: 4EY7; Imagem gerada no programa Pymol)............................................................. 23
Figura 3: Mecanismo de hidrólise da acetilcolina. .................................................................. 24
Figura 4: Formação das placas -amilóides através da agregação oligomérica de fragmentos
A produzidos pela clivagem de APP através da via -secretase.Adaptada de PATTERSON
et al., 2008. ............................................................................................................................... 26
Figura 5: Processo de degeneração dos microtúbulos e formação dos emaranhados
neurofibrilares.Adaptado de: https://columbiasciencereview.com/2017/04/07/the-role-of-our-
immune-system-in-alzheimers/ ................................................................................................ 27
Figura 6: Ciclo glutamato-glutamina: (1) Glutamato mantido em vesículas em neurônios pré
sinápticos VGLUT1/2. (2) O glutamato liberado na fenda sináptica, ativando receptores
ionotrópicos e metabotrópicos. Os receptores NMDA se tornam totalmente ativos após a
ativação do receptor AMPA e despolarização da membrana pós-sináptica. (3) O glutamato é
removido da fenda sináptica por transportadores de glutamato GLT-1. (4) Dentro dos
astrócitos, o glutamato é convertido a glutamina pela glutamina sintase. (5) Glutaminase
converte a glutamina em glutamato nos terminais pré-sinápticos. Adaptado de REVETT et
al., 2013. ................................................................................................................................... 29
Figura 7: Exemplos de fármacos utilizados e/ou investigados para o tratamento de Alzheimer.
.................................................................................................................................................. 31
Figura 8: Donepezila e interações no sítio da AChE. (PDB id: 4EY7; Imagem gerada no
programa Pymol). ..................................................................................................................... 33
Figura 9: Galantamina e interações no sítio da AChE. (PDB id: 4EY7; Imagem gerada no
programa Pymol). ..................................................................................................................... 34
Figura 10: Estruturas derivadas de produtos naturais investigadas como potencias fármacos
anti-Alzheimer. ......................................................................................................................... 35
Figura 11: Substância de origem natural marinha candidata a fármaco para DA em estudos
pré-clínicos. .............................................................................................................................. 36
Figura 12: Fármaco narcótico, principal alcaloide presente no ópio, com alto poder
analgésico. ................................................................................................................................ 37
Figura 13: Primeiro produto natural com atividade farmacológica, produzido sinteticamente.
.................................................................................................................................................. 37
Figura 14: Substâncias isoladas de Tectitethya crypta que marcaram o início dos estudos com
produtos marinhos. ................................................................................................................... 38
Figura 15: Fármacos aprovados com origem em produtos naturais marinhos. ....................... 39
Figura 16: Alga marinha vermelha, Laurencia sp. Disponível em
https://www.marineplantbook.com/marinebooklaurencia.htm ................................................ 41
Figura 17: Exemplos de metabólitos secundários encontrados nas algas do gênero Laurencia.
.................................................................................................................................................. 42
Figura 18: Esquema representativo das reações químicas descritas por Ellman et al. (1961).
.................................................................................................................................................. 57
Figura 19: Esquema mostrando as etapas de obtenção e identificação do Elatol. .................. 59
Figura 20: Localização geográfica do ponto de coleta da alga Laurencia dendroidea. .......... 60
Figura 21: A e B: Processo de liofilização da alga; C: Ultrassom; D: extração por maceração;
E: filtração; F: Evaporação de solventes sob pressão reduzida; G: Extrato bruto. ................... 61
Figura 22: Fracionamento do extrato bruto de Laurencia dendroidea por cromatografia em
coluna........................................................................................................................................ 62
Figura 23: Processo de purificação do elatol. Fracionamento da fração 1 , que contém o
elatol, em coluna aberta sob gel de sílica. ............................................................................... 63
Figura 24: Série de derivados semi-sintéticos do elatol planejados pela adição de grupos
farmacofóricos. ......................................................................................................................... 65
Figura 25: Análise retrossintética com exemplos de derivados do Elatol. .............................. 66
Figura 26: A: Sobreposição de estruturas cristalográficas de AChE humana. B: Sobreposição
dos principais resíduos do sítio ativo e subsítios. ..................................................................... 70
Figura 27: Área e volume molar dos ligantes co-cristalizados com a AChE e dos candidatos a
inibidores. ................................................................................................................................. 73
Figura 28: Sobreposição do ligante co-cristalizado com a AChE e melhor pose obtida por
redocking com a função de scoreChemPLP e raio de 15Å. .................................................... 74
Figura 29: Scores com a função CHEMPLP para a Acetilcolina, fármacos usados no
tratamento da DA e metabólitos secundários de Laurencia sp candidatos a inibidores de
AChE. ....................................................................................................................................... 75
Figura 30: Melhor pose do Obtusol obtida por docking e interações no sítio da AChE. ........ 78
Figura 31: Melhor pose do Dendroidiol obtida por docking e interações no sítio da AChE. 79
Figura 32: Melhor pose do Cartilagineol obtida por docking e interações no sítio da AChE. 79
Figura 33: Melhor pose do (+)-elatol obtida por docking e interações no sítio da AChE. ...... 80
Figura 34: Melhor pose do (-)-elatol obtida por docking e interações no sítio da AChE........ 81
Figura 35: Inibição da atividade de AChE por metabólitos secundários de Laurencia sp. V0 é
a velocidade da reação hidrólise da acetiltiocolina pela AChE. Barras representam a média da
velocidade da atividade enzimática e traços representam o erro padrão. *** representam
P<0,001 quando comparado ao veículo pelo teste estatístico Anova de 1 via seguido do pós
teste de comparação múltipla de Bonferroni’s. ........................................................................ 82
Figura 36: Efeito do elatol sobre os parâmetros cinéticos da AChE. As velocidades iniciais
de reação (V) foram obtidas a partir de curvas de progressão em diferentes concentrações de
substrato e inibidor. As linhas sólidas são derivadas do modelo de inibição cinético de
Michaelis-Menten. .................................................................................................................... 83
Figura 37: Gráfico de Lineweaver-Burk para a inibição do elatol sobre a AChE. ................. 84
Figura 38: Cálculo do Ki do elatol para a AChE..................................................................... 85
Figura 39: Inibição da atividade de AChE pelo (+)-elatol. V0 é a velocidade da reação
hidrólise da acetiltiocolina pela AChE. Barras representam a média da velocidade da atividade
enzimática e traços representam o erro padrão. ........................................................................ 86
Figura 40: CCD dos extratos brutos de Laurencia dendroidea. Amostra padrão e amostras
AZ01 e AZ02 coletadas da praia Azeda - Búzios-RJ. Fase móvel – Hexano/Acetato de etila
8:2. Sistema revelador: ácido sulfúrico a 5% em etanol com posterior aquecimento. ............ 87
Figura 41: CCD das frações obtidas do extrato bruto de Laurencia dendroidea. Fase móvel:
A: Hexano/Diclorometano 7:3; B: Hexano/Diclorometano 3:7; C: Diclorometano 100%.
Sistema revelador: ácido sulfúrico a 5% em etanol com posterior aquecimento. .................... 87
Figura 42: CCD das frações obtidas na purificação da fração contendo elatol (código
KG451). Fase móvel: Diclorometano 100%, sistema revelador: ácido sulfúrico a 5% em
etanol com posterior aquecimento. ........................................................................................... 88
Figura 43: CCD das frações KG6415 e KG6416 obtidas na purificação da fração KG451 e
comparação com um padrão previamente isolado. Fase móvel: Diclorometano 100%, sistema
revelador: ácido sulfúrico a 5% em etanol com posterior aquecimento. .................................. 89
Figura 44: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada. ......................... 90
Figura 45: Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada de
4.15 ppm a 5.15 ppm. ............................................................................................................... 91
Figura 46: Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada de
1.75 ppm a 2.65 ppm. ............................................................................................................... 91
Figura 47: Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada de
1.05 ppm a 1.70 ppm. ............................................................................................................... 92
Figura 48: Série de derivados do elatol planejados pela adição de grupos farmacofóricos. ... 94
Figura 49: Visão geral dos derivados obtidos través das substituições realizadas na estrutura
do elatol. ................................................................................................................................... 96
Figura 50: Área e volume molar dos inibidores e média da área e volume molar das classes
de candidatos a inibidores de AChE derivados do Elatol. ........................................................ 99
Figura 51: Média dos scores com a função CHEMPLP para a Acetilcolina, Elatol e as classes
de candidatos a inibidores de Acetilcolinesterase propostos. ................................................. 108
Figura 52: Scores com a função CHEMPLP para as aminas alifáticas candidatas a inibidores
de AChE. ................................................................................................................................ 109
Figura 53: Melhor pose do derivado Tza 19_R e interações no sítio da AChE. ................... 111
Figura 54: Scores com a função CHEMPLP para as aminas cíclicas candidatas a inibidores
de Acetilcolinesterase. ............................................................................................................ 112
Figura 55: Melhor pose do derivado Tza 05 R e interações no sítio da AChE. .................... 114
Figura 56: Melhor pose do derivado Tza 05 S e interações no sítio da AChE. ..................... 115
Figura 57: Scores com a função CHEMPLP para as arilaminas e arilaminas substituídas
candidatas a inibidores de AChE. ........................................................................................... 116
Figura 58: Melhor pose do derivado Tzb 13 R e interações no sítio da AChE. .................... 119
Figura 59: Melhor pose do derivado Tzb 13 S e interações no sítio da AChE...................... 120
Figura 60: Melhor pose do derivado Tzb 16 R e interações no sítio da AChE. .................... 120
Figura 61: Melhor pose do derivado Tzb 16 S e interações no sítio da AChE...................... 121
Figura 62: Melhor pose do derivado Tzb 10 S e interações no sítio da AChE...................... 121
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Modelos de predição de toxicidade pelo pkCSM (PIRES et al.,2015)................... 68
Quadro 2: Interações observadas entre ligantes e resíduos aminoácidos de AChE. ............... 76
Quadro 3: Interações desfavoráveis e/ou fora dos sítios observadas entre ligantes e resíduos
de aminoácidos de AChE. ........................................................................................................ 77
Quadro 4: Predição de toxicidade pkCSM e FAF-Drugs 4 .................................................. 105
Quadro 5: Interações observadas entre ligantes e resíduos de aminoácidos da AChE. ........ 110
Quadro 6: Interações observadas entre ligantes e resíduos de aminoácidos de AChE. ........ 113
Quadro 7: Interações observadas entre ligantes e AChE ...................................................... 117
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Gradiente de eluição para o fracionamento do extrato bruto de Laurencia
dendroidea utilizando filtração em coluna aberta sob gel de sílica. ......................................... 62
Tabela 2: Gradiente de eluição para a purificação da fração 1 do extrato bruto de Laurencia
dendroidea por cromatoragrafia em coluna aberta sob gel de sílica. ....................................... 63
Tabela 4: Cálculo do Desvio Médio Quadrático (RMSD) entre as estruturas de AChE
humanas. ................................................................................................................................... 70
Tabela 5: Área e volume molar dos ligantes co-cristalizados a enzima. ................................. 71
Tabela 6: Área e volume molar dos candidatos a inibidores de AChE. .................................. 72
Tabela 7: Redocking e desvio médio quadrático (RMSD). ..................................................... 74
Tabela 10: Rendimento da obtenção de extrato bruto de Laurencia dendroidea. ................... 86
Tabela 11: Massas e rendimentos do fracionamento do extrato bruto de Laurencia
dendroidea. ............................................................................................................................... 88
Tabela 12: Massas e rendimentos de frações obtidas após a purificação da amostra KG451. 89
Tabela 13: Dados de RMN 1H (500 MHz) em CDCl3 para a substância isolada comparados
com dados de RMN 1H (300 MHz) em CDCl3 obtidos para o (-)- elatol por (MACHADO et
al., 2011) e para o (+)-elatol (KONIG e WRIGHT, 1997). ...................................................... 93
Tabela 14: Área e Volume molar dos derivados de elatol. ...................................................... 97
Tabela 15: Parâmetros para predição da permeação através da BHE propostos por Clark. .. 100
Tabela 16: Fármacos usados no tratamento da DA submetidos aos parâmetros para predição
da permeação através da BHE propostos por Clark, 2003. .................................................... 102
Tabela 17: Predição de permeação através da BHE pelo pkCSM. ........................................ 103
Tabela 18: Parâmetros associados à regra dos 5 de Lipinski calculados a partir da plataforma
molinspiration. ........................................................................................................................ 104
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DA- Doença de Alzheimer
BHE – Barreira hematoencefálica
AChE – Acetilcolinesterase
Ach – Acetilcolina
P&D – Pesquisa e Desenvolvimento
ADMET - Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade
ASP- Área de superfície polar
SNC – Sistema Nervoso Central
PDB – Protein data bank
GLY – Glicina
ALA – Alanina
VAL – Valina
LEU – Leucina
ILE – Isoleucina
MET – Metionina
PRO – Prolina
PHE- Fenilalanina
TRP – Triptofano
SER – Serina
THR – Treonina
CYS – Cisteína
ASN – Asparagina
GLN – Glutamina
TYR – Tirosina
ASP – Aspartato
GLU – Glutamato
GLN - Glutamina
LYS – Lisina
ARG – Arginina
HIS – Histidina
PAS – Sítio Periférico Aniônico
CAS – Sítio Periférico Catalítico
OH – Sítio Oxianiônico
iGluRs - Receptores glutamatérgicos ionotrópicos
mGluRs - Receptores glutamatérgicos metabotrópicos
AMPA - ácido-amino-3-hidroxi-5-metil isoxazol-4-propiônico
NMDA - N-metil-D-aspartato
KA – Cainato
GLT-1 - Transportador de glutamato
VGluT - Transportador vesicular de glutamato
BSA – Albumina Sérica Bovina
DTNB - Ácido Ditionitrobenzoico
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
21
1. INTRODUÇÃO
1.1 A Doença de Alzheimer
A Doença de Alzheimer (DA) é uma enfermidade neurodegenerativa associada à idade
que resulta em deficiência progressiva e irreversível e é a principal causa de demência e
incapacitação em idosos (BAIS et al., 2016; GRAHAM et al., 2017). O sintoma inicial é a
perda da memória recente e evolui para dificuldades de atenção, desorientação no tempo e
espaço, transtornos de humor, distúrbios comportamentais que incluem agressividade e
irritabilidade, depressão e alucinações até a perda da lucidez. A evolução da doença ocorre
geralmente entre 8 e 12 anos a partir dos primeiros sintomas, quando atinge seu estágio final
(SERENIKI et al.,2008; SANABRIA-CASTRO et al.; 2107).
Dentre as evidências da origem e desenvolvimento da doença estão: a ocorrência de
deposição extracelular de fragmentos do peptídeo β-amiloide (A) formando placas senis ou
placas A, a formação de emaranhados neurofibrilares intracelulares a partir da proteína Tau
(), além da alteração nas concentrações de certos neurotransmissores como a acetilcolina e
glutamato que estão envolvidas no controle de atividades cerebrais relacionadas à atenção,
cognição, aprendizagem e memória (KUMAR et al., 2015; BAIS et al., 2016; GRAHAM et
al., 2017).
Embora muitos aspectos neuropatológicos e fisiopatológicos da DA já sejam
reconhecidos e entendidos, o mecanismo de desenvolvimento da doença é bastante complexo
e ainda não está claramente definido, havendo muitas lacunas que prejudicam sua
compreensão completa (SANABRIA-CASTRO et al.; 2017).
Essa falta de compreensão em relação ao processo patogênico pode ser a razão
provável para a não disponibilidade de um tratamento efetivo que impeça a progressão da
doença. A causa desta enfermidade está relacionada com múltiplos fatores e várias hipóteses
são apresentadas com base nesses vários fatores para explicar a DA, tais como a hipótese
colinérgica, glutamatérgica, -amilóide e tau (KUMAR et al., 2015; BAIS et al., 2016;
GRAHAM et al., 2017; SANABRIA-CASTRO et al.; 2107).
1.1.1 Hipótese colinérgica
A hipótese colinérgica sugere que a perda de neurônios colinérgicos e a diminuição
nos níveis do neurotransmissor acetilcolina (Ach) no cérebro contribuem para o aparecimento
da DA (ANAND e SINGH, 2013; BISHARA et al., 2015).
22
A Ach é sintetizada no terminal pré-sináptico e, quando liberada no organismo tem um
curto tempo de meia-vida ao encontrar uma quantidade significativa da enzima
acetilcolinesterase (AChE) na fenda sináptica. Sua degradação produz acetato e colina, que
regressa ao terminal pré-sináptico para nova síntese do neurotransmissor (Figura 1) (SILMAN
e SUSSMAN, 2008).
Figura 1: Esquema da transmissão colinérgica. Adaptado de HOGAN, 2009.
A AChE é uma enzima da classe das hidrolases, reguladora da transmissão colinérgica
encontrada no sistema nervoso central. Composta por 537 resíduos de aminoácidos tem seu
sítio ativo em uma cavidade com cerca de 20 Å de profundidade e possui três principais
resíduos de aminoácidos envolvidos no processo de hidrólise do seu substrato, a chamada
tríade catalítica: histidina 447 (HIS447), Glutamato 334 (GLU334) e Serina 203 (SER203)
(Figura 1). Essa tríade reforça o caráter nucleofílico da serina, acentuando sua capacidade de
ataque ao substrato devido a forte interação pela ligação de hidrogênio entre a histidina e a
serina. Durante a hidrólise da acetilcolina forma-se um intermediário acil-AChE que é
estabilizado pelos resíduos de aminoácidos GLY121, GLY122 e ALA204, localizados na
cavidade oxianiônica (OH, do inglês “Oxyanion hole”), até que uma molécula de água
desloca o grupamento acila, regenerando a enzima e liberando acetato (ROMEIRO et. al,
2008; SILMAN e SUSSMAN, 2008).
O sítio catalítico aniônico (CAS, do inglês “Catalytic Anionic Site”), composto por
TRP86 e PHE338, tem um papel importante na delimitação do tamanho de substratos que
podem atingir o sítio ativo (SILMAN e SUSSMAN, 2008).
23
No topo da enzima está localizado o sítio aniônico periférico (PAS, do inglês
“Peripheral Anionic Site”) composto pelos resíduos TYR72, ASP74, TYR124, TRP286, e
TYR341, onde ocorre a interação inicial com o neurotransmissor. A ligação de inibidores ao
PAS provoca uma alteração conformacional da AChE, bloqueando a entrada da Ach no sitio
ativo (ROMEIRO et. al, 2008; SILMAN e SUSSMAN, 2008).
A partir do PAS é possível penetrar até o fundo da cavidade e atingir o sítio ativo,
onde se localiza a tríade catalítica (CASTRO et. al, 2008; SILMAN e SUSSMAN, 2008).
Esta cavidade estreita e longa contém 14 resíduos aromáticos conservados, como, por
exemplo, TYR72, TRP86, TYR124, TRP286, PHE295, PHE338 e TYR341, que levam ao
sitio ativo (Figura 2) (HAREL et al., 1993).
Figura 2: Ach ao fundo da cavidade de 20Å, onde se localiza o sítio catalítico da AChE. Resíduos de
aminoácidos que compõem os principais sítios de AChE humana em destaque. (PDB id: 4EY7; Imagem gerada
no programa Pymol).
No mecanismo de hidrólise da Ach pela AChE, um resíduo de histidina catalítico atua
inicialmente como uma base, aumentando a nucleofilicidade de um resíduo de serina (Figura
3).
24
O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H
O
NH2
O OHH:
:
N+
O
O
GLU
HIS
SER
AchN
+
OO
O-
O
NH2
OH
O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H H+
:: :
OO-
O
NH2
OH
O+
H H
::O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H :
OO-
O
NH2
OH
OH
: ::
O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H :
O+
O-
O
NH2
OH
OH
H
:
:+
O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H H
+
OH
O
Acetato
O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H :
GLU
O
NH2
O OHH
SER HIS
+ +
N+
O+
O
O
NH2
OHO
-
H
::
:: :O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H :
+
OO
O
NH2
OH
OH H
: :
O O
OH
NH2
O-
O
NH2
N N
OH
H :
N+
OH
Colina
+ +
::
:
:
Figura 3: Mecanismo de hidrólise da acetilcolina.
Em seguida, o resíduo de serina ataca o carbono carbonílico da acetilcolina. A
histidina ácida protona o intermediário formado, liberando colina, um intermediário
tetraédrico que é estabilizado por ligações de hidrogênio, e serina acetilada. Uma molécula de
25
água atua então como nucleófilo, atacando o grupo acetila da serina acetilada. O novo
intermediário formado é então atacado pela histidina que, ao tornar-se ácida, é atacada pelo
par de elétrons livre do átomo de oxigênio. Por fim, o átomo de oxigênio protonado libera
ácido acético e a serina é regenerada (JUNIOR et al., 2004; SILMAN e SUSSMAN, 2008).
De acordo com esta hipótese, uma diminuição na produção de Ach provoca um déficit
na transmissão colinérgica e, impedidos de realizar as sinapses, os neurônios atrofiam e
morrem. Dessa forma, o uso de substâncias que inibam a degradação da Ach pela AChE
poderia elevar os níveis de Ach dentro das sinapses e, assim, melhorar a neurotransmissão
colinérgica (BISHARA et al., 2015).
1.1.2 Hipótese amiloide
A hipótese da cascata amiloide sugere que o desenvolvimento de agregados de
fragmentos de peptídeos Aβ no cérebro formam placas senis que contribuem para o déficit na
transmissão colinérgica e a progressão da doença (Figura 4) (SELKOE, 2001; KUMAR et al.,
2015; GRAHAM et al., 2017).
A formação das placas senis se dá através de depósitos extracelulares esféricos,
compactos, compostos por fragmentos de uma pequena proteína chamada peptídeo Aβ. O
peptídeo Aβ é produzido a partir da proteína precursora APP (proteína transmembrana tipo I).
A APP pode ser processada por duas vias principais: Na via α-secretase a APP é clivada no
domínio Aβ resultando na liberação de um fragmento solúvel de APP (-sAPP) e um
fragmento C-terminal (C83) que posteriormente é clivado pela -secretase. Na via -secretase
a APP é clivada antes do domínio Aβ, liberando um fragmento solúvel de APP (-sAPP) e
um fragmento C-terminal amiloidogênico (C99) contendo o domínio Aque sofre uma
posterior transformação pela -secretase, liberando o peptídeo Aβ que tende a acumular em
agregados oligoméricos (Figura 4) (SELKOE, 2001; KUMAR et al., 2015; GRAHAM et al.,
2017).
26
Figura 4: Formação das placas -amilóides através da agregação oligomérica de fragmentos A produzidos pela
clivagem de APP através da via -secretase.Adaptada de PATTERSON et al., 2008.
Segundo a hipótese, mutações genéticas em doentes de Alzheimer levam a uma maior
clivagem da APP através da via -secretase e a uma maior atividade da -secretase, elevando
a produção de Aβ, que em seguida se agregam espontaneamente em oligômeros solúveis e
fibrilas insolúveis (KUMAR et al., 2015; GRAHAM et al., 2017).
Em condições normais, o peptídeo Aβ é degradado por algumas enzimas e eliminado,
mas um desequilíbrio entre a sua produção e eliminação leva ao acúmulo de agregados dos
fragmentos desse peptídeo (KUMAR et al., 2015; SANABRIA-CASTRO et al.;2017).
Estudos mais recentes mostram que o aumento dos níveis de Aβ pode ser causado não apenas
pela produção elevada, mas também pela degradação diminuída (GRAHAM et al., 2017).
A hipótese da cascata amilóide gerou um forte interesse pela β- e γ-secretase como
potenciais alvos com a finalidade de reduzir a produção de Aβ. No entanto, a extrema
complexidade da produção de placas Aβ ainda limita o progresso do estudo que visa β- e γ-
secretase como potenciais alvos para o tratamento do doente de Alzheimer. Ensaios com
inibidores de β-secretase falharam devido à baixa biodisponibilidade oral e baixa penetração
na barreira hematoencefálica. Ademais, a segunda geração desses inibidores falhou em
ensaios clínicos de fase avançada ao apresentarem elevada toxicidade, assim como inibidores
planejados de -secretase. Mais recentemente, um potente inibidor de β-secretase de terceira
geração mostrou farmacocinética satisfatória e forneceu dados clínicos encorajadores para os
estudos que se encontram em andamento (GRAHAM et al., 2017).
27
1.1.3 Hipótese tau
A hipótese de tau surge como um evento secundário induzido por ASANABRIA-
CASTRO et al.;2017). Segundo esta hipótese, os oligômeros A podem desencadear a
hiperfosforilação da proteína tau, originando novelos neurofibrilares (BISHARA et al., 2015;
KUMAR et al., 2015).
No metabolismo normal essa proteína promove a junção e estabilização dos
microtúbulos que por sua vez fornecem suporte para mudanças estruturais, transporte axonial
e crescimento neuronal SANABRIA-CASTRO et al.;2017). Porém, em doentes de
Alzheimer, a hiperfosforilação intracelular da proteína provoca a disjunção dos microtúbulos
axoniais, comprometendo a função microtubular e levando a disfunção neuronal e sináptica
(BISHARA et al., 2015; KUMAR et al., 2015).
A proteína hiperfosforilada apresenta agregação anormal com proteínas do
citoesqueleto e mostra uma menor interação com os microtúbulos, o que favorece um
aumento da proteína tau livre que leva a uma maior agregação e fibrilação da mesma, com o
consequente mau funcionamento do transporte axonial (Figura 5)SANABRIA-CASTRO et
al., 2017).
Figura 5: Processo de degeneração dos microtúbulos e formação dos emaranhados neurofibrilares.Adaptado de:
https://columbiasciencereview.com/2017/04/07/the-role-of-our-immune-system-in-alzheimers/
28
1.1.4 Hipótese glutamatérgica
O glutamato é o aminoácido livre mais abundante no sistema nervoso central e é um
importante neurotransmissor excitatório, participando de diversas funções cerebrais, como
cognição, aprendizado e memória. Porém a excitação excessiva dos receptores
glutamatérgicos pode provocar a morte neuronal num processo denominado de
excitotoxicidade. Pesquisas recentes têm sugerido que este processo envolvendo os receptores
glutamatérgicos tipo N-methyl-D-aspartato (NMDA) estão envolvidos na fisiopatologia da
doença de Alzheimer (BISHARA et al., 2015; BAIS et al., 2016; GRAHAM et al., 2017).
Os receptores glutamatérgicos são divididos em dois grupos: os ionotrópicos (iGluRs)
e os metabotrópicos (mGluRs). Os iGluRs podem ser divididos em: N-metil-D-aspartato
(NMDA), ácido-amino-3-hidroxi-5-metil isoxazol-4-propiônico (AMPA) e cainato (KA).
Estes receptores formam canais iônicos localizados nas membranas neuronais que permeiam a
passagem de cátions específicos e cuja ativação promove a despolarização da membrana
sináptica, desencadeando uma resposta excitatória (PAOLETTI et al. 2013).
Quando a membrana pós-sináptica está em seu potencial de repouso, os canais NMDA
encontram-se bloqueados por um íon magnésio (Mg2+
) que impede o influxo de íons de cálcio
(Ca2+
) para o terminal pós-sináptico. Após a ligação simultânea da glicina e do (L)-glutamato,
agonistas endógenos e despolarização simultânea da membrana neuronal, acontece a abertura
do canal iônico com a liberação dos íons Mg2+
que o bloqueiam, possibilitando a passagem de
íons Na+ e Ca
2+ para o interior da célula e de íons K
+ para o seu exterior (BISHARA et al.et
al., 2015; BAIS et al.et al., 2016).
Um mecanismo de recaptação é responsável por remover o (L)-glutamato do espaço
sináptico. Após se ligar aos seus receptores, ele é captado por transportadores de alta
afinidade presentes nos astrócitos adjacentes à sinapse, evitando sua permanência no espaço
extracelular. No astrócito, ele é convertido em glutamina pela enzima glutamina sintase. Essas
moléculas de glutamina são então liberadas para o meio extracelular e levadas por
transportadores específicos para o terminal pré-sináptico, onde são reconvertidas a glutamato
pela enzima glutaminase. O ciclo glutamato-glutamina é então o principal mecanismo de
finalização da neurotransmissão glutamatérgica, exercendo um efeito neuroprotetor (Figura
6).
29
Figura 6: Ciclo glutamato-glutamina: (1) Glutamato mantido em vesículas em neurônios pré sinápticos
VGLUT1/2. (2) O glutamato liberado na fenda sináptica, ativando receptores ionotrópicos e metabotrópicos. Os
receptores NMDA se tornam totalmente ativos após a ativação do receptor AMPA e despolarização da
membrana pós-sináptica. (3) O glutamato é removido da fenda sináptica por transportadores de glutamato GLT-
1. (4) Dentro dos astrócitos, o glutamato é convertido a glutamina pela glutamina sintase. (5) Glutaminase
converte a glutamina em glutamato nos terminais pré-sinápticos. Adaptado de REVETT et al., 2013.
O influxo de Ca2+
regula processos de proliferação, sobrevivência e morte celular.
Sendo assim, os neurônios possuem mecanismos homeostáticos que regulam as concentrações
extra e intracelulares deste íon. Uma ativação excessiva dos receptores NMDA, causada por
um excesso de (L)-glutamato, conduz a um aumento excessivo dos níveis de Ca2+
no meio
intracelular, causando morte celular neuronal por excitotoxicidade (BISHARA et al., 2015;
BAIS et al., 2016).
Alguns compostos desenvolvidos como antagonistas dos receptores NMDA atuam
como bloqueadores desse canal iônico. Um exemplo deste tipo de antagonista é a Memantina,
aprovada em 2002 pela Agência Europeia dos Medicamentos (EMEA) e em 2003 pela Food
and Drug Administration (FDA) para o tratamento da doença de Alzheimer moderada a
severa (BISHARA et al., 2015; BAIS et al., 2016; GRAHAM et al., 2017).
30
1.2 O tratamento farmacológico disponível e seus alvos terapêuticos
A terapia atual da DA envolve inibidores de AChE e antagonistas de NMDA e tem
como base a hipótese colinérgica e glutamatérgica, respectivamente (SILVA et al., 2014). O
tratamento da DA envolve medicamentos que têm sido utilizados para preservar a cognição e
as habilidades funcionais do doente. Contudo, esses fármacos tendem a desacelerar a
progressão da doença proporcionando o alívio sintomático, mas não levam à cura definitiva
(KUMAR et al., 2015; GRAHAM et al., 2017).
Os inibidores de AChE são os principais fármacos aprovados para o tratamento da
DA. Sua ação se baseia no aumento da disponibilidade de Ach no espaço sináptico, através da
inibição das enzimas AChE e Butirilcolinesterase (BChE) (ANAND e SINGH, 2013).
Enquanto a atividade da AChE permanece inalterada, a atividade da BChE aumenta
progressivamente conforme a doença avança. Entretanto, embora a inibição de BChE
também possa ser considerada uma abordagem válida para restaurar a função colinérgica em
DA, seu papel na regulação da transmissão colinérgica em seres humanos ainda não é
totalmente compreendido e a AChE continua a ser o principal alvo da hipótese colinérgica.
No entanto, em geral, ensaios de inibição de BChE costumam ser realizados em paralelo com
os estudos de inibição de AChE, a fim de definir a seletividade dos compostos em estudo
(SILVA et al., 2014).
A Tacrina, inibidor reversível de curta duração de AChE e BChE, foi o primeiro
medicamento utilizado em pacientes com DA. Porém, seu uso foi descontinuado devido ao
elevado risco de hepatotoxicidade. Atualmente, estão disponíveis para a terapia da DA a
Rivastigmina, Donepezila e Galantamina, fármacos pertencentes à segunda geração de
inibidores (Figura 7) (ANAND e SINGH, 2013; BISHARA et al., 2015; BAIS et al., 2016).
Além dos inibidores de AChEi, a terapia da DA também envolve o uso da Memantina
, antagonista do receptor de NMDA que atua como bloqueador do canal (Figura 7)
(GRAHAM et al., 2017).
Cada um desses fármacos já foi aprovado e estão disponíveis em formulações
genéricas, sendo a Memantina o mais recente. Atualmente tem-se ainda o riluzol, que é um
inibidor da liberação de glutamato e da sinalização pós-sináptica do receptor de glutamato que
se encontra em ensaios clínicos de Fase II em pacientes com DA leve (GRAHAM et al.,
2017).
31
O
OO
N
H
OH
N
O
O
N
O
O
N
NH2
N
NH2
NH2N
SOF
FF
Figura 7: Exemplos de fármacos utilizados e/ou investigados para o tratamento de Alzheimer.
A segurança e a eficácia desses medicamentos em longo prazo ainda não são
inteiramente conhecidas e não há nenhuma evidência de modificação dos processos
patológicos. Dessa forma, eles têm atuado apenas como terapia paliativa, de forma a diminuir
a progressão dos sintomas cognitivos da DA e reduzir os problemas comportamentais
relacionados à doença em algumas pessoas (GRAHAM et al., 2017).
1.2.1 Ação dos Inibidores de AChE
Os inibidores de AChE podem atuar por um mecanismo competitivo com a Ach
interagindo com a tríade catalítica da enzima localizada no CAS, por um mecanismo não-
competitivo, ligando-se aos resíduos do PAS, ou podem interagir com ambos os subsítios,
sendo então considerados inibidores duais de AChE (FRANCIS et al., 1999; ANAND e
SINGH, 2013).
Estudos afirmam que, nos cérebros de pacientes com DA, a AChE encontra-se co-
localizada com o Aβ, sendo capaz de acelerar a agregação dos fragmentos de Aβ às fibras
amiloides. Como consequência, inibidores que sejam capazes de interagir com o CAS e o
PAS poderiam ter uma atividade dual, reduzindo o déficit cognitivo ao impedir a hidrólise do
substrato da enzima devido à interação com o CAS e retardando a formação das placas A
devido à interação com o PAS (ALVAREZ et al., 1995; CASTRO e MARTINEZ, 2001;
ANAND e SINGH, 2013; SILVA et al., 2014).
Donepezila Galantamina Rivastigmina
Memantina (5) Tacrina (4) Riluzol (6)
(1) (2) (3)
32
Foi postulado que classes de ligantes capazes de interagir com o CAS e o PAS são
mais potentes em comparação com aqueles que interagem somente com o CAS. Assim, uma
das estratégias adotadas para a obtenção de tais substâncias é através da fusão de duas
moléculas ativas em apenas um composto, conectadas por grupos espaçadores de tamanhos
adequados. Dessa forma, as moléculas são capazes de interagir com os dois sítios desejados.
Baseado nessas hipóteses, vários pesquisadores têm desenvolvido novos candidatos a
inibidores de AChE duais como estratégia para uma terapia mais eficiente da DA (PANG et
al., 1996; CARLIER et al., 1999; BOLOGNESI et al., 2005; BELLUTI et al., 2009; JIA et
al., 2009; MARTINS et al., 2011; SAMADI et al., 2011; FANG et al., 2014; KORABECNY
et al., 2014).
A Rivastigmina é um inibidor pseudo-irreversível de AChE e BChE de duração
intermediária. A vantagem desta inibição simultânea está relacionada ao fato de que a BChE,
enzima presente na corrente sanguínea que também hidrolisa a Ach, tem sua concentração
aumentada nas fases mais avançadas da doença (BISHARA et al., 2015 BAIS et al., 2016).
A Donepezila é um medicamento sintético classificado como um inibidor não
competitivo e reversível de longa duração, que interage com o PAS e também com o CAS
principalmente através de interações aromáticas, mas sem interagir com a tríade catalítica.
Alguns estudos destacam a interação envolvendo os resíduos de aminoácidos TRP 86 e TRP
286 com as subunidades benzilpiperidina e indol da Donepezila, respectivamente, através de
interações do tipo empilhamento pi (ANAND e SINGH, 2013; BISHARA et al., 2015; BAIS
et al., 2016) (Figura 8).
Segundo o mecanismo de ação proposto, o efeito da Donepezila pode diminuir à
medida a doença evolui e menos neurônios colinérgicos permanecem funcionalmente intactos
(ANAND e SINGH, 2013; BISHARA et al., 2015; BAIS et al., 2016).
33
Figura 8: Donepezila e interações no sítio da AChE. (PDB id: 4EY7; Imagem gerada no programa Pymol).
A Galantamina é um alcaloide encontrado em plantas da família Amarillydaceae e é
um inibidor competitivo e reversível que apresenta um mecanismo dual de inibição da AChE
e modulação alostérica de receptores nicotínicos da acetilcolina, sendo considerada menos
tóxica que a Tacrina porém menos potente também (CHEUNG et al., 2012; ANAND e
SINGH, 2013; BISHARA et al., 2015) (Figura 9).
34
Figura 9: Galantamina e interações no sítio da AChE. (PDB id: 4EY7; Imagem gerada no programa Pymol).
Atualmente, a busca por novos inibidores de AChE com maior afinidade e menor risco
de efeitos adversos tem se concentrado em derivados de produtos naturais com propriedades
duais, ou seja, capazes de interagir com a CAS e o PAS ou multi-alvos, atingindo assim mais
do que uma característica fisiopatológica da DA com um único composto (SILVA et al.;
2014).
1.2.2 Produtos de Origem Natural no Tratamento da DA
Atualmente, existe um considerável número de pesquisas que visam a descoberta de
novos produtos de origem natural com potencial neuroprotetor ou anti-colinesterásico que
possam ter menos efeitos adversos em comparação com fármacos sintéticos (CHOI et al.,
2015 ; OLASEHINDE et al., 2017).
Na história da medicina tradicional chinesa, muitas ervas foram descobertas e
empregadas para tratar demências e, nas últimas décadas, uma série de substâncias foram
isolados dessas ervas e têm sido testados contra DA. Entre essas substâncias destacam-se
flavonóides, alcalóides, fenilpropanóides, triterpenoides e polissacarídeos, entre outros
(HOUGHTON et al., 2006; GAO et al., 2013). Exemplos desse tipo de substâncias são a
35
huperazina A, huperazina B, berberina e seus derivados semissintéticos (Figura 10) (SILVA
et al., 2014).
H
ONH
NH2
H
OH
N
NH
H
O
O
O
N+
O
Figura 10: Estruturas derivadas de produtos naturais investigadas como potencias fármacos anti-Alzheimer.
A huperazina A e a huperazina B são sesquiterpenos alcalóides isolados da Huperzia
serrata, utilizados há séculos pela medicina chinesa no tratamento da demência, febre e
inflamação. Estudos relatam que a huperazina A é capaz de desempenhar um efeito
neuroprotetor, enquanto que a huperazina B possui atividade anticolinesterásica com uma
maior biodisponibilidade oral, seletividade e potência quando comparadas a Tacrina e
Donepezila. Apesar de estarem sendo investigados como um possível tratamento para DA,
ainda não existem estudos suficientes que comprovem suas ações como fármacos anti-
Alzheimer. Entretanto, atualmente essas substâncias têm sido estudadas como compostos líder
para o desenvolvimento de novos AChEi. Um exemplo disso é o estudo com estruturas
híbridas de Tacrina-Huperzina A (ZHANG et al., 2000; FENG et al., 2005; HE et al., 2007;
LI et al., 2007; SILVA et al., 2014).
A berberina é um alcalóide isoquinolínico presente nas raízes, rizomas e cascas do
caule de um grande número de plantas. Estudos indicam uma atividade dual anti-Alzheimer,
na qual essa substância atua não só como um AChEi mas também como agente neuroprotetor,
diminuindo a excitotoxicidade induzida pela ativação excessiva dos receptores NMDA.
Porém, cabe ressaltar que ainda não existem evidências clínicas dessa ação em seres humanos
(SILVA et al., 2014; LIANG et al., 2017).
A própria Galantamina, fármaco aprovado para o tratamento da DA como
anticolinesterásico, é um alcaloide encontrado em plantas da família Amarillydaceae
(ANAND e SINGH, 2013).
huperazina A (7) huperazina B (8) berberina (9)
36
A briostatina (Figura 11), isolado do extrato de Bugulaneritina, é uma molécula de
origem marinha com potencial terapêutico como fármaco anti-Alzheimer. Estudos pré-
clínicos recentes mostram que ela foi capaz de restaurar o déficit cognitivo, e reduzir o
acúmulo de fragmentos -amiloides e hiperfosforilação de proteína de tau (RUSSO et al.,
2015).
H
H
H
H
OO
H
H
H
O
O
H
OH
H
HO
O
OH
H
H
O
H
HOH
O
H
OO
O
HOH
H
O
O
briostatina (10)
Figura 11: Substância de origem natural marinha candidata a fármaco para DA em estudos pré-clínicos.
Estudos concentrados na atividade farmacológica de produtos naturais marinhos em
alvos terapêuticos da DA têm incluído macroalgas marinhas, principalmente pardas e
vermelhas (CHOI et al., 2015; RUSSO et al., 2015).
1.3 Produtos Naturais
Os produtos naturais são historicamente a fonte de muitos medicamentos e ainda hoje
representam um importante grupo para a identificação de novas estruturas químicas. A
maioria dos fármacos em uso clínico é de origem natural ou foram desenvolvidos a partir de
produtos naturais (DIAS et al.; 2012; ATANASOV et al., 2015; NEWMAN e CRAGG, 2016;
PATRIDGE et al; 2016; BERLINCK et al; 2017).
Em 1817, Friedrich Sertürner isolou pela primeira vez a Morfina a partir do ópio
obtido de Papaver somniferum (Figura 12), desencadeando assim o estudo de outras ervas
medicinais, usadas até então forma empírica, cujas substâncias presentes eram representadas
principalmente por alcalóides (SERTURNER, 1817 apud ATANASOV et al., 2015).
37
H
O
OH
N
H
H
OH
Figura 12: Fármaco narcótico, principal alcaloide presente no ópio, com alto poder analgésico.
Posteriormente, os esforços se concentraram na elucidação dos mecanismos de
obtenção dessas substâncias presentes nos produtos naturais por meio da síntese química, a
fim de permitir a produção em maior escala, com qualidade e baixo custo. O Ácido salicílico
foi então o primeiro produto natural produzido sinteticamente em 1853 (Figura 13), no
entanto, para estruturas complexas com múltiplos centros quirais, por exemplo, a síntese total
é ainda, muito difícil e muitas vezes economicamente inviável, exigindo ainda maiores
avanços tecnológicos para serem aplicados com sucesso (ATANASOV et al., 2015).
Atualmente a biotecnologia se apresenta como uma opção com potencial futuro para produção
em maior escala nestes casos (PEREIRA e COSTA-LOTUFO, 2012; SCOTTI et al.; 2012;
ATANASOV et al., 2015; DE OLIVEIRA et al.; 2015).
OH
OOH
Figura 13: Primeiro produto natural com atividade farmacológica, produzido sinteticamente.
1.3.1 Produtos Naturais Marinhos
Em 1951, Bergmann e Feeney isolaram a Espongouridina e a Espongotimidina a partir
de Tectitethya crypta, uma esponja marinha encontrada no mar do Caribe (BERGMANN e
FEENEY, 1951) (Figura 14). Essas substâncias serviram como modelos estruturais para o
desenvolvimento de análogos sintéticos usados no tratamento de tumores e doenças virais,
dando início à utilização de uma nova classe de fármacos para o tratamento dessas
enfermidades (NEWMAN e CRAGG; 2006).
Morfina (10)
Ácido Salicílico (12)
38
O
NH
O N
O
OH
OH
OH
H
H
H
O
NH
O N
O
OH
OH
OH
H
H
Figura 14: Substâncias isoladas de Tectitethya crypta que marcaram o início dos estudos com produtos
marinhos.
O primeiro produto natural marinho aprovado como fármaco foi a Ziconotida, em
dezembro de 2004 pelo FDA, com efeito anestésico, sendo indicado para dores crônicas de
pacientes com câncer ou AIDS (DIAS et al, 2012; NEWMAN e CRAGG, 2013; RUSSO et
al., 2015) (Figura 15). Esta substância foi isolada como um constituinte do veneno de Conus
magus, um molusco que usa essa toxina para imobilizar os seus predadores e presas. É
Considerado mais potente que a morfina e possui a vantagem de não ser narcótico (POPE e
DEER, 2013; WEBSTER 2015).
Entre outros exemplos está a Trabectedina isolada da ascídia Ecteinascidia turbinata,
um organismo invertebrado de aspecto esponjoso que vive grudado a rochas, que foi aprovada
como fármaco para o tratamento de câncer em 2007 (Figura 15). Atualmente, a Trabectedina
é produzida em semissíntese para atender a indústria farmacêutica (CUEVAS e
FRANCESCH; 2009; NEWMAN e CRAGG, 2013; RUSSO et al., 2015).
Espongouridina (13) Espongotimidina (14)
39
O
NH
O
NH
SS
O
NHO
NH
O NH
O
NH
O
NH
S
S
O
NH
SS O
NH
O
NH
O
NH
ONH
ONH
NH2
NH2
NH2
ONH
O
NH
ONH
ONH
OH
OH
NH
O
NHO
NHO
NH O
NH
O
NH
ONH
O OH
NHNH
NH2
S
OH
OOH
ONH2NH2
OH
NH
NH
NH2
NH2
H
HH
H
H
HH H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Ziconotida (15)
HSNH
OOH
O ON
OH
OOH
N
OO
O
OH
HH
H
Trabectedina (16)
Figura 15: Fármacos aprovados com origem em produtos naturais marinhos.
Alguns estudos recentes relatam, ainda, moléculas bioativas isoladas de organismos
marinhos com atividades neuroprotetoras através da inibição do estresse oxidativo induzido
por A no cérebro do paciente de DA (CHOI et al., 2015 ; RUSSO et al., 2015;
OLASEHINDE et al., 2017).
Apesar do potencial dos ambientes marinhos como fontes de novas substâncias
bioativas, somente em meados da década de 1970 os estudos de organismos marinhos foram
40
sistematicamente iniciados. Entre 1977 e 1987, cerca de 2.500 novos metabólitos foram
descobertos a partir de uma grande variedade de filos e espécies (PINTO et al., 2002). Ainda
hoje substâncias novas provenientes desse ambiente continuam a ser descritas, demonstrando
que o meio marinho é uma rica fonte de compostos bioativos, muitos pertencentes a classes
químicas nunca antes observadas e inexistentes em fontes terrestres (NEWMAN e CRAGG,
2013; NEWMAN e CRAGG, 2016).
O ambiente marinho apresenta uma maior diversidade de espécies que o ambiente
terrestre, o que tem como consequência a maior diversidade de estruturas químicas
(MACHADO et al., 2010). A especificidade desses ambientes produz compostos
estruturalmente únicos (NEWMAN e CRAGG, 2004). Representando 75% do planeta Terra,
o ambiente marinho tem se apresentado como uma rica fonte de produtos naturais
estruturalmente novos com efeitos anticâncer, anti-inflamatórios, analgésicos,
imunomoduladores, neuroprotetores, dentre outros. Por isso, tem sido cada vez mais
explorado como fonte de novas substâncias bioativas (NEWMAN e CRAGG, 2004;
NEWMAN e CRAGG, 2013; NEWMAN e CRAGG, 2016).
Atualmente, uma série de produtos naturais marinhos e seus derivados têm sido
submetidos a ensaios clínicos ou atingiram o estágio pré-clínico avançado (NEWMAN e
CRAGG, 2016). Apesar da perspectiva promissora, o uso desses compostos é muitas vezes
limitado pela sua complexidade química e pela dificuldade de obtenção em larga escala. Mas
hoje o trabalho com produtos naturais marinhos têm sido facilitado pelos avanços
tecnológicos nos processos de obtenção, purificação e caracterização. Além disso, a síntese
química e o desenvolvimento da biotecnologia têm sido grandes aliadas nesse processo. A
expansão do uso de técnicas de bioinformática também facilitou o trabalho com substâncias
de origem natural, de modo a permitir triagens preliminares e o planejamento de estruturas
derivadas desses produtos. Dessa forma, recursos naturais marinhos têm sido muito
explorados de modo a se obter ou planejar um candidato a fármaco (NEWMAN e CRAGG,
2004; ATANASOV et al., 2015; HARVEY et al., 2015; SUMNER et al.; 2015).
Em geral, esses compostos bioativos se apresentam como metabólitos secundários, que
são substâncias que não estão envolvidas com as funções vitais do organismo marinho. As
atividades identificadas para esses metabólitos secundários no organismo produtor mostram
que eles interagem biologicamente com outros organismos do meio em que estão inseridos,
apresentando atividades de defesa como ação anti-herbivoria, anti-incrustante e alelopática
(OLIVEIRA et al., 2015). Muitos metabólitos secundários representam matérias-primas
importantes para a produção de inúmeros medicamentos (NEWMAN e CRAGG, 2016).
41
Nesse contexto, as macroalgas são conhecidas como grandes produtoras de
metabólitos secundários no ambiente marinho. A maior variedade pode ser encontrada em
Rhodophyta algas marinhas vermelhas, onde as classes de compostos são representadas
principalmente por compostos halogenados (MACHADO et al., 2010).
1.3.1.1 Metabólitos bioativos de Laurencia sp.
Entre as algas marinhas vermelhas, espécies do gênero Laurencia (Figura 16) têm sido
apontadas como fonte de novos metabólitos secundários. Produzindo uma grande variedade
de terpenóides complexos e acetogeninas, representam o gênero mais quimicamente
complexo do mundo (PEREIRA et al., 2003). Atualmente, elas estão entre as mais estudadas,
sendo conhecidas pela produção de metabólitos secundários halogenados, como os
sesquiterpenos com esqueleto chamigreno, representando o maior grupo de metabolitos
secundários isolados de espécies do gênero Laurencia. Como exemplo podemos citar o
obtusol, dendroidiol, cartilagineol e elatol, entre outros (Figura 17) (DE OLIVEIRA et al.,
2015; HARIZANI et al., 2016).
Para o gênero Laurencia são aceitas 146 espécies taxonômicas diferentes e estima-se
que cerca de 700 compostos de estrutura química inédita já foram identificados (MACHADO
et al., 2014; HARIZANI et al.; 2016)
Presente em regiões de mares tropicais, subtropicais e temperados de todo o mundo
(HARIZANI et al.; 2016), este gênero é representado por 30 espécies no Brasil sendo L.
catarinenses, L. oliveirana e L. translucida consideradas endêmicas (MACHADO et al.,
2010) .
Figura 16: Alga marinha vermelha, Laurencia sp. Disponível em
https://www.marineplantbook.com/marinebooklaurencia.htm
42
Br
OH
Br
Cl
Br
OH
OH
Cl
Br
OH
Cl
Br
(+)-obtusol (17) (-)-dendroidiol (18) (-)-cartilagineol (19)
(+)-elatol (20) (-)-elatol (21)
Figura 17: Exemplos de metabólitos secundários encontrados nas algas do gênero Laurencia.
Diversas funções naturais já foram descritas para estes metabólitos isolados de
Laurencia sp e muitos estudos mostram que eles podem atuar como agentes anti-incrustantes
e anti-herbivorismo, indicando que possuem múltiplas funções ecológicas e que são parte do
sistema de defesa e do processo adaptativo da alga (TEIXEIRA e PEREIRA, 1999; KÖNIG e
WRIGHT; 1997; PEREIRA et al., 2003; MACHADO et al, 2010; HARIZANI et al., 2016).
Estas importantes funções ecológicas, são capazes de perturbar eficientemente sistemas
fisiológicos vitais de outros organismos, em particular, aqueles ligados ao movimento,
respiração e circulação (RUSSO et al., 2015). Dessa forma, podem representar um indicativo
de aplicabilidade biotecnológica, devido à possibilidade de atuação em outros organismos
(MACHADO et al.,2010).
Vários desses metabólitos de Laurencia e seus derivados semissintéticos apresentaram
atividades farmacológicas diversas (MACHADO et al., 2011; DESOTI et al., 2012; LANG et
al., 2012; DE OLIVEIRA et al., 2015; HARIZANI et al., 2016). Já foram descritas
atividades antileishmania, antibacteriana e potencial larvicida contra o Aedes aegypti para o (-
)- elatol e obtusol (MACHADO et al., 2014; SALVADOR-NETO et al., 2016; DÍAZ-
MARRERO et al., 2012; DA SILVA MACHADO et al., 2011). Estudos apontaram também
OH
Cl
Br
OH
Cl
Br
43
atividade citotóxica para o cartilagineol (WESSELS et al., 2000). Mas, embora as atividades
sejam diversas, um grande número de pesquisas com esses metabólitos se concentram na
busca por novas substâncias anticâncer (MACHADO et al., 2010).
Foi demonstrado que a maioria das moléculas encontradas em algas do gênero
Laurencia que apresentam atividade possuem halogênios em sua estrutura, sendo o átomo de
bromo o mais comum. Isso sugere que a atividade dessas moléculas pode estar relacionada
com a presença desses elementos (MACHADO et al., 2010).
Dentre os metabólitos secundários de Laurencia pertencentes à classe dos
sesquiterpenos halogenados citados vale ressaltar o elatol (3S,4R,6R)-4-Bromo-8-cloro-5,5,9-
trimetil-1-metilenespiro[5.5]undec-8-en-3-ol) (Figura 17), que é considerado hoje um dos
seus principais metabólitos secundários com potencial econômico devido às suas
características e atividades relatadas (LORBEER et al., 2013; DE OLIVEIRA et al.; 2015;
HARIZANI et al., 2016).
Isolado pela primeira vez em 1974 por Sims e colaboradores (SIMS et al., 1974), o
elatol teve a síntese total descrita por White e colaboradores (WHITE et al., 2008). Foram
descritas para esse metabólito, atividades tripanocida (VEIGA-SANTOS et al., 2010;
SAEIDNIA et al., 2013; DESOTI et al., 2012), antileishmania (SANTOS et al., 2010;
MACHADO et al., 2011) e antitumoral (MACHADO et al., 2010), entre outras (LANG et al.,
2012; CAMPOS et al., 2012). Este metabólito está presente em diversas espécies do gênero
Laurencia e em algumas como seu componente majoritário (SIMS et al., 1974; LANG et al.,
2012). Em L. dendroidea a população da Praia Azeda, localizada em Búzios, e a população de
Biscaia localizada no município de Angra dos Reis, ambas no estado do Rio de Janeiro foi
possível observar o sesquiterpeno elatol como o metabólito majoritário (DA SILVA
MACHADO et al., 2016).
LANG e colaboradores planejaram e sintetizaram pela primeira vez derivados do
elatol e isobtusol, pela substituição da hidroxila por outros grupos funcionais, de maneira a
potencializar a ação desses metabólitos como antitumorais. Foram investigados os efeitos
citotóxicos in vitro de seis derivados semissintéticos, cujos resultados sugeriram que
modificações estruturais pela substituição da hidroxila podem ser uma boa estratégia para
intensificar a atividade desses compostos, reduzir a toxicidade e produzir estruturas de
polaridade diferente (EPIFÂNEO et al., 2009; LANG et al., 2012).
Recentemente, através da aplicação da técnica de Quimiogenômica a um banco de
dados de metabólitos de Laurencia, o Seaweed Metabolite Database (SWMDB) (DAVIS e
44
VASANTHI, 2011), alguns metabólitos secundários de Laurencia sp. foram apontados como
potenciais inibidores da AChE, dentre eles obtusol, dendroidiol, cartilagineol e elatol, (dados
não publicados) abrindo novas perspectivas para o planejamento de potenciais AChEis de
origem marinha.
1.4 Modelagem Molecular
O processo de desenvolvimento (P&D) de um novo fármaco é bastante longo, porém
o planejamento de fármacos auxiliado por computador pode reduzir o tempo e o custo do
processo de Pesquisa e Desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. A modelagem
molecular consiste na utilização dessas técnicas computacionais que possibilitam a construção
e manipulação de protótipos candidatos a fármacos, tornando-se importante na descoberta de
novos fármacos (PINTO et al; 2002; EPIFÂNEO et al.; 2009; HARVEY et al.,2015).
Na química medicinal moderna, estudos de modelagem molecular com as
biomacromoléculas-alvo podem auxiliar na proposição de novos derivados funcionais e
análogos sintéticos. Nesse contexto, a modelagem molecular tem sido aplicada à descoberta
de novos ligantes de alvos terapêuticos reconhecidos como, por exemplo, a partir de triagem
virtual (KROEMER, 2007).
Essa metodologia tem sido utilizada com sucesso na descoberta de ligantes e de
fármacos, inclusive inibidores de AChE, através da investigação dos mecanismos de interação
com alvos terapêuticos e da relação estrutura-atividade (SAR, do inglês “Structure-Activity
Relationship”) (MORRIS et. al., 2013).
Para prosseguir no processo de P&D, devem-se considerar ainda, parâmetros
farmacocinéticos como absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicológicos
(ADME-T) a fim de eliminar candidatos com propriedades druglikeness desfavoráveis, ou
seja, com maiores probabilidades de serem descartados nos estudos de fase clínica (WANG et
al., 2015).
Diante disso, esses estudos podem guiar a síntese de novas moléculas, minimizando o
conjunto de compostos a serem testados.
1.4.1 Docking Molecular
Técnicas computacionais de triagem virtual são aplicadas na seleção de estruturas que
podem ser ativas em um determinado alvo biológico (GIULIATTI, 2013).
45
Denomina-se “Triagem Virtual” os estudos baseados na estrutura tridimensional de
alvos biológicos SBVS, do inglês - Structure-Based Virtual Screening ou baseados na
estrutura tridimensional de ligantes LBVS, do inglês - Ligand-Based Virtual Screening, que
têm como base o docking molecular aplicado a um banco de dados de estruturas moleculares
tridimensionais selecionadas (ligantes) tendo como alvo um determinado receptor molecular
(KROEMER, 2007; ANDRICOPULO et al., 2008; ANDRICOPULO et al., 2009).
Métodos de docking receptor-ligante são métodos computacionais utilizados para a
identificação do modo de ligação de moléculas candidatas a fármacos, no sítio ativo de
proteínas consideradas como alvos moleculares para o tratamento de determinadas doenças
(MAGALHÃES et al., 2006)
Durante o processo de docking, a posição ideal e a orientação do ligante são
determinadas usando um algoritmo de busca e uma função de score que classifica as soluções
geradas. Os algoritmos de busca investigam um determinado número de conformações de
ligantes, explorando todos os graus de liberdade da estrutura, de modo a encontrar o mínimo
de energia global e as funções de score avaliam a qualidade das poses de docking,
distinguindo os modos de ligação entre ligante e receptor observados experimentalmente de
todas as outras poses exploradas pelo algoritmo de busca. Atualmente, existem diferentes
funções de score e diferentes metodologias de busca (GUEDES, 2016).
Os algoritmos de busca devem ser capazes de apresentar diferentes configurações e
orientações das moléculas envolvidas em um curto espaço de tempo e podem ser divididos em
algoritmos de docking rígido ou algoritmos de docking flexíveis. No docking rígido, tanto o
ligante quanto o receptor têm estruturas rígidas. Estes métodos têm menor custo
computacional, mas não permitem que o ligante e o receptor se adaptem à ligação. No
docking flexível a flexibilidade do ligante e/ou receptor é considerada, porém o custo
computacional é maior (GIULIATTI, 2013).
Os primeiros programas de docking consideravam rígidos receptor e ligante, incluindo
apenas os graus de liberdade translacionais e rotacionais do ligante. Hoje, a maioria dos
programas incluem graus de liberdade conformacionais para ligantes e alguns estudos
consideram, ainda, a inclusão de flexibilidade parcial do receptor para alguns resíduos da
cadeia lateral selecionados (MAGALHÃES et al., 2006).
Os métodos de busca utilizados nos algoritmos de docking podem ser classificados
como métodos de busca sistemática, métodos de busca determinística e métodos randômicos.
Na busca sistemática, todos os graus de liberdade do ligante são explorados de maneira
combinatória durante a busca. Métodos determinísticos produzem uma mesma saída para o
46
mesmo dado de entrada. Já os métodos randômicos produzem diferentes saídas para um dado
de entrada (MAGALHÃES et al., 2006).
As funções de score devem ser capazes de discriminar as diferentes interações entre
ligantes e receptores, avaliando e classificando os modos de ligação propostos. Podem ser
divididas em métodos baseados no campo de força, empíricos e semi-empíricos e com base no
conhecimento (GIULIATTI, 2013).
Métodos baseados no campo de força consideram interações intermoleculares
descritas por termos clássicos da mecânica molecular. Métodos empíricos e semi-empíricos se
baseiam no ajuste teórico de equações (regressão linear) que reproduzem dados
experimentais. Já os métodos baseados no conhecimento utilizam dados estatísticos dos
potenciais de pares atômicos de interação, os quais são derivados de conjuntos de dados
provenientes de complexos cristalográficos entre ligantes e proteínas (MAGALHÃES et al.,
2006).
AutoDock Vina (TROTT; OLSON, 2010), Glide (FRIESNER et al., 2004, 2006) e
GOLD (JONES et al., 1997) são exemplos de ferramentas de docking disponíveis bastante
utilizadas pela comunidade científica. Análises comparativas para avaliar o desempenho de
alguns dos programas de docking mais usados para a predição do modo de ligação de
complexos proteína-ligante destacam o GOLD por sua alta taxa de sucesso (HARTSHORN et
al., 2007; LI et al., 2014).
O GOLD (Genetic Optimization for Ligand Docking) usa um algoritmo genético
baseado em métodos randômicos que busca soluções através de um “encaixe” que propaga
múltiplas cópias de modelos flexíveis do ligante no sítio de ligação do receptor,
recombinando segmentos de cópias aleatoriamente até se gerar um conjunto convergente de
estruturas (GIULIATTI, 2013). O algoritmo genético do GOLD permite a inclusão de
flexibilidade parcial no receptor através de bibliotecas de rotâmeros, que são valores
preferenciais dos ângulos das cadeias laterais de resíduos de aminoácidos, determinando a
estrutura do receptor mais favorável para certa conformação do ligante (MAGALHÃES et al.,
2006).
Inicialmente, o GOLD contava com apenas uma função de score, porém atualmente é
possível escolher entre quatro funções de score. Em todos os casos se obtém uma pontuação
admensional que classifica o quanto uma pose é adequada (LIEBESCHUETZ et al., 2012).
Goldscore é a única função para a versão 5.0 e anteriores. Tem como base a mecânica
molecular e foi otimizada para predição de poses de ligação, sendo composta por quatro
termos que consideram energias de ligações de hidrogênio intramoleculares do ligante e entre
47
o complexo proteína-ligante, interações de Van der Waals entre o complexo proteína-ligante e
tensão intramolecular do ligante (VERDONK et al., 2003).
Chemscore é uma função de score empírica parametrizada a partir de 82 complexos de
afinidade de ligação conhecida. A função Chemscore estima a variação de energia livre total
para a ligação entre o ligante e a proteína incorporando termos para ligação de hidrogênio,
interações com metal, interações lipofílicas, perda de entropia conformacional do ligante após
a ligação, termos para energia interna, um termo que penaliza a flexibilidade excessiva e um
termo de colisão proteína-ligante (ELDRIDGE, et al., 1997; VERDONK et al., 2003).
ChemPLP trata os contatos neutros e repulsivos a partir de um potencial linear por
partes (PLP). Este potencial é composto por uma parte atrativa e outra repulsiva para contatos
neutros e apenas uma parte repulsiva para contatos anticomplementares (doador-doador,
doador de metal e aceitador-aceitador). O ChemPLP usa a função Chemscore para termos de
ligação de hidrogênio e para energia interna (LIEBESCHUETZ et al., 2012).
Em um estudo de Liebeschuetz e colaboradores, o desempenho de todas as quatro
funções de score do GOLD foi avaliado quanto à predição de poses e triagem virtual. A
função melhor executada tanto para a predição de pose quanto para a triagem virtual foi a
função de score ChemPLP (LIEBESCHUETZ et al., 2012).
1.4.2 Cálculo de Parâmetros Farmacocinéticos in silico
A farmacocinética estuda a velocidade e a extensão com que os fármacos são
absorvidos, distribuídos, biotransformados e excretados do organismo. Para produzir um
efeito em seu alvo, o fármaco precisa ser absorvido e, a seguir, distribuído para o seu alvo
antes de ser metabolizado e excretado. Esses são princípios básicos de farmacocinética e irão
afetar a quantidade de fármaco livre que finalmente irá alcançar o sítio-alvo, ou seja, a sua
biodisponibilidade, definida como a fração do fármaco que consegue ligar-se ao seu receptor
específico e produzir o efeito farmacológico desejado (BATCELOR et al, 2015; O’HARA et
al 2015).
O metabolismo de um fármaco pode resultar em metabólitos ativos ou inativos,
podendo trazer efeitos tóxicos. Os metabólitos ativos também podem exercer um efeito
farmacológico sobre os receptores-alvo ou, algumas vezes, em outros receptores, levando a
reações adversas (BATCELOR et al, 2015; O’HARA et al 2015).
Os fármacos afetam então o corpo humano podendo resultar na inibição do receptor,
ativação ou bloqueio de uma via de sinal, e o corpo humano dispõe do medicamento através
48
da absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME). Estes dois processos são
simultâneos e levam a função farmacológica desejada ou a efeitos secundários indesejáveis
(GOLAN, 2009).
Indicadores físico-químicos têm sido cada vez mais usados durante os primeiros
estágios da P&D de fármacos por fornecerem um conjunto de dados que se relacionam com as
principais propriedades que afetam as funções biológicas (TOROPOV et al.; 2014). Através
de parâmetros físico-químicos, é possível construir modelos de predição para propriedades,
como a absorção intestinal, metabolismo e transporte através de membranas, além de modelos
para predição de toxicidade que governam fatores que irão influenciar na drogabilidade de
compostos químicos (WANG et al, 2015).
A má drogabilidade envolve, por exemplo, insolubilidade em solução aquosa, não
permeação através da membrana para que seja possível chegar à concentração necessária no
sítio terapêutico desejado, tempo de eliminação do organismo muito longo, ou ainda a
presença de muitos sítios metabolicamente instáveis. Esses fatores comprometem a eficácia e
a segurança do fármaco (GOLAN, 2009).
O papel dos estudos in silico no desenvolvimento de fármacos tem se expandido,
reduzindo o número de substâncias a serem testadas e, consequentemente, o tempo e o custo
do processo de P&D, bem como o número de testes em animais, devido à avaliação precoce
da drogabilidade de uma estrutura (TOROPOV et al, 2014; WANG et al, 2015).
1.4.2.1 Regra dos 5 de Lipinski
Uma das primeiras aplicações de propriedades físico-químicas na descoberta e
desenvolvimento de medicamentos foi a avaliação da propriedade druglikeness através da
regra dos 5 de Lipinski que baseou-se na observação de propriedades físico-químicas de
medicamentos administrados por via oral. Essa regra é utilizada para selecionar compostos
suscetíveis à biodisponibilidade oral baseada em quatro preceitos simples relacionados com as
propriedades físico-químicas observadas em 90% dos medicamentos oralmente ativos que
tenham atingido o estudo clínico de fase II (LIPINSKI, 2004): Massa molecular ≤500;
logaritmo do coeficiente de partição (logP) ≤ 5; Número de aceptores de ligação de
hidrogênio ≤ 10 e Doadores de ligação de hidrogênio ≤ 5.
De acordo com o que foi preconizado por Lipinski, um composto possui uma boa
biodisponibilidade oral se não infringir mais que 1 das regras propostas.
49
1.4.2.2 Permeabilidade através da barreira hemato-encefálica
A barreira hemato-encefálica (BHE) é a camada de células endoteliais microvasculares
que separa o sistema nervoso central da corrente sanguínea. Para a maioria de fármacos que
visam alvos do sistema nervoso central é necessário uma alta penetração. A BHE apresenta
um impedimento altamente eficaz, e estima-se que ela impeça a absorção de mais de 98% dos
fármacos potenciais neuroterapêuticos (PARDRIDGE, 2012; KUMAR et al, 2013).
Os compostos podem permear pela BHE por difusão passiva ou catalisados por meio
de uma variedade de sistemas de transporte que levam esses compostos para o cérebro ou para
fora do cérebro, por transporte ativo (PARDRIDGE, 2012; KUMAR et al, 2013).
Um conjunto de regras foi sugerido como um modelo preditivo proposto por Clark (CLARK,
2003). Essas regras surgiram a partir de dados de estudos in vivo e in vitro para permeação da
BHE e orientam estudos in silico sobre as propriedades moleculares que favorecem a
permeação no cérebro: a) Soma do número de átomos de nitrogênio e oxigênio (N + O) igual
a 5 ou mais; b) logBB maior que zero: Se ClogP – (N + O) é maior que zero, o logBB é
positivo; c) A área da superfície polar (ASP) menor que 90 Å2 ; d) A massa molar deve ser
menor que 450 g; e) O logD deve estar em uma faixa entre 1 e 3.
A soma de átomos de nitrogênio e oxigênio em uma molécula indica uma medida da
capacidade da molécula realizar ligações de hidrogênio. Compostos com alta capacidade de
realizar ligações de hidrogênio tendem a não permear as membranas facilmente.
O logBB é um parâmetro amplamente utilizado para avaliar a penetração através da
BHE. Trata-se de uma medida experimental obtida a partir de dados in vivo (LIPINSKI,
2004). É definido como o logaritmo da razão entre as concentrações de um composto no
cérebro e no sangue (logBB = log [cérebro] / [sangue]). O ClogP é o logaritmo do coeficiente
de partição octanol-água e P é a razão entre a concentração do composto em octanol e água.
A área da superfície polar é definida como a soma de superfícies de átomos polares,
normalmente nitrogênios e oxigênios. Ou seja, é a medida da capacidade da molécula realizar
ligações de hidrogênio e é calculada pela soma das contribuições de oxigênios e nitrogênios
para a área da superfície molecular. Compostos altamente polares não permeiam as
membranas facilmente, dessa forma, o aumento da capacidade de ligação ao hidrogênio leva à
redução da permeação através da BHE.
Para um composto com um ou mais centros ionizáveis, a qualquer dado pH, haverá
uma mistura de espécies presentes na solução. Por analogia com logP, logD é o logaritmo do
coeficiente de distribuição de um composto. D é a razão entre a soma das concentrações de
50
todas as espécies do composto em octanol e a soma das concentrações de todas as espécies da
substância em água. Para as substâncias neutros, logD é igual ao logP.
A partir de um estudo comparativo com fámacos que não atravessam a membrana
hemato-encefálica (-SNC), fármacos que atingem o sistema nervoso central (+SNC) tendem a
serem mais lipofílicos, mais rígidos, têm menos doadores de ligações de hidrogênio, menos
cargas formais (em particular, cargas negativas), e ASP inferior a 90 A2. Mas é importante
observar que, em geral, a precisão da predição de moléculas + SNC é maior que a predição de
moléculas -SCN (CLARK, 2003).
Esses resultados foram confrontados com resultados para permeação da barreira
hemato-encefálica obtidos através do servidor on-line pkCSM, disponível em
http://bleoberis.bioc.cam.ac.uk/pkcsm/prediction. O servidor conta com 30 preditores
divididos em cinco classes principais: absorção (sete preditores), distribuição (quatro
preditores), metabolismo (sete preditores), excreção (dois preditores) e toxicidade (dez
preditores) (PIRES et al.,2015).
O modelo preditivo para permeação através da barreira hematoencefálica disponível
no servidor encontra-se dentro da classe de “distribuição” e foi construído com 320
compostos cujos valores de logBB são conhecidos experimentalmente e a predição é realizada
em termos de valores para o logBB. Se o log BB é maior que 0,3 o composto é capaz de
travessar a barreira hematoencefálica facilmente. Se o logBB for menor que -1, então o
composto não é capaz de permear a barreira hematoencefálica (PIRES et al., 2015).
1.4.2.3 Predição da Toxicidade in Silico
Estudos de toxicidade in vitro, são utilizados para prever as vias do metabolismo em
humanos. O uso de conjuntos de células in vitro expressando as principais enzimas
metabolizadoras humanas pode ajudar a prever a produção de metabólitos e avaliar sua
resposta tóxica ou não. O metabolismo normal dos fármacos pode gerar metabolitos que
possuem reatividade química intrínseca com moléculas endógenas e, portanto, têm o potencial
de alterar a função biológica e iniciar reações adversas ao fármaco (PARK et al.; 2011).
São considerados de grande importância para avaliação sobre a resposta tóxica,
estudos sobre a mutagenicidade e carcinogenicidade, hepatotoxicidade e a cardiotoxicidade
(TOROPOV et al.; 2014). O teste de AMES é um método amplamente utilizado para avaliar o
potencial mutagênico de compostos utilizando bactérias. Uma substância classificada como
um mutágeno bacteriano pode ser um carcinógeno em mamíferos, ou seja, um teste positivo
51
indica que o composto é mutagênico e, portanto, pode atuar como carcinogênico (XU et
al.,2012).
A Hepatotoxicidade está relacionada com acontecimentos patológicos ou fisiológicos
no fígado associado com uma interrupção nas funcionalidades normais (ALOMAR, 2014).
A inibição dos canais de potássio, chamados de hERG (do inglês, “human ether-a-go-
go gene”) leva ao desenvolvimento de arritmias ventriculares fatais. A inibição dos canais de
hERG já resultou na retirada de muitas substâncias do mercado farmacêutico. Dessa forma a
identificação de potenciais bloqueadores de hERG é uma importante etapa de avaliação da
cardiotoxicidade de um composto (VANDENBERG, et al., 2012).
52
2. JUSTIFICATIVA
A doença de Alzheimer (DA) é uma das doenças neurodegenerativas mais comuns e
representa atualmente mais de 80% dos casos de demência em pessoas idosas em todo o
mundo. São 5 milhões de idosos com a doença e 200 mil pessoas com menos de 65 anos.
(KUMAR et al., 2015). Segundo a Academia Brasileira de Neurologia (ABN), o doente
demora cerca de três anos para descobrir a enfermidade, devido ao fato de que os sintomas da
doença quase sempre são interpretados como consequências do envelhecimento. Feito o
diagnóstico, o tempo médio de sobrevida varia de 8 a 10 anos.
De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), nos anos 60
a expectativa de vida aumentou para 52,6 anos. O aumento das campanhas de vacinação, as
melhorias no saneamento básico, nas condições de moradia, educação e socialização,
contribuíram para isso. Em 2010, época do último Censo do IBGE, esse número subiu para
73,8 anos e, para 2030, a projeção é que a expectativa de vida seja de 78,5.
A associação internacional sobre a doença de Alzheimer ( ADI, do inglês Alzheimer's
Disease International ) estimou que o número de pessoas com a doença pode dobrar em 20
anos e revela que, após os 65 anos de idade, a chance de desenvolver a doença duplica a cada
5 anos. Espera-se que, até 2050, ocorram quase um milhão de novos casos de DA por ano no
mundo (KUMAR et al., 2015).
Com o aumento da expectativa de vida e consequentemente do número de idosos,
torna-se nítida a necessidade da busca por novos tratamentos mais eficazes para a doença de
Alzheimer. Nesse cenário, nossa pesquisa pode trazer uma grande contribuição para o
envelhecimento saudável da população ao tentar estratégias de tratamento envolvendo a
inibição da enzima AChE. Esta via de tratamento visa retardar o declínio cognitivo e
proporcionar conforto e qualidade de vida ao idoso e sua família, para que ele possa
envelhecer com saúde e, principalmente, autonomia (KUMAR et al., 2015).
Produtos Naturais apresentam uma ampla variedade de grupos farmacofóricos e
variação estereoquímica, e têm sido historicamente a fonte de muitos medicamentos ( DIAS et
al.; 2012;; ATANASOV et al., 2015; NEWMAN e CRAGG, 2016; PATRIDGE et al; 2016;
BERLINCK et al; 2017). Nesse sentido, o ambiente marinho ganha destaque por representar
70% do planeta e apresentar uma maior diversidade de espécies que o ambiente terrestre,
levando, consequentemente, à presença de maior variedade de estruturas químicas. Muitas
substâncias já identificadas, presentes em organismos marinhos possuem estruturas químicas
nunca encontradas anteriormente em organismos naturais terrestres. Estudos recentes
53
demonstraram o potencial dessas substâncias na descoberta de novos fármacos e hoje muitas
delas constituem-se em modelos para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos
modernos (NEWMAN e CRAGG, 2016).
Porém, o processo de desenvolvimento de um novo fármaco desde a descoberta do
protótipo e seu alvo molecular é bastante longo e possui um elevado custo (PINTO et al .,
2002; EPIFÂNEO et al., 2009; HARVEY et al., 2015). Na química medicinal moderna,
estudos de modelagem molecular com as biomacromoléculas-alvo podem auxiliar na busca
por novos fármacos de origem natural bem como na proposição de derivados funcionais e
análogos sintéticos. A modelagem molecular tem sido aplicada à descoberta de novos
ligantes de alvos terapêuticos reconhecidos como, por exemplo, a partir de uma triagem
virtual por docking em um banco de dados de estruturas moleculares tridimensionais
selecionadas (ligantes) tendo como alvo um determinado receptor molecular (KROEMER,
2007).
O papel dos estudos in silico no desenvolvimento de fármacos tem se expandido,
reduzindo o número de substâncias a serem testadas e, consequentemente, o tempo e o custo
do processo de PeD, bem como o número de testes em animais, devido à avaliação precoce da
drogabilidade de uma estrutura (TOROPOV et al., 2014; WANG et al., 2015).
Neste trabalho, a busca por novas substâncias de origem marinha através do estudo
computacional pode fornecer importantes informações para o desenvolvimento de
anticolinesterásicos aplicados ao tratamento da DA. É nesse cenário que o elatol, uma
substância isolada de Laurencia, se apresenta como candidato promissor a inibidor de AChE.
54
3. OBJETIVOS
O objetivo geral desse trabalho foi avaliar, in silico e in vitro, a atividade inibitória de
metabólitos secundários de Laurencia sp em AChE, isolar e caracterizar o metabólito mais
ativo e, propor potenciais inibidores de AChE derivados do mesmo.
3.1 Objetivos específicos
Avaliar a capacidade inibitória de quatro metabólitos secundários de Laurencia sp
(obtusol, dendroidiol, cartilagineol e elatol) para AChE;
Obter e caracterizar o metabólito secundário mais ativo a partir de Laurencia
dendroidea;
Propor derivados do metabólito secundário mais ativo por meio da adição de
farmacóforos;
Identificar, dentre os derivados propostos, os candidatos a inibidores de AChE
promissores;
55
4. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho se divide em quatro principais partes. A primeira parte envolve o
estudo in silico da afinidade teórica por meio de docking molecular entre metabólitos
secundários de Laurencia dendroidea e AChE. A segunda parte do trabalho traz ensaios de
cinética enzimática entre metabólitos secundários de Laurencia dendroidea e AChE avaliados
no estudo in silico. Uma terceira parte compreende a obtenção do metabólito secundário mais
ativo a partir de Laurencia dendroidea. Por fim, a quarta parte deste trabalho propõe então
derivados do metabólito mais ativo por meio da adição de farmacóforos e estudos in silico por
meio de triagem virtual para eleger o candidato a inibidor mais promissor.
Parte I: Estudos in silico da afinidade teórica entre metbólitos secundários
de Laurencia e AChE
4.1Obtenção das estruturas das Proteínas-Alvo
Estruturas cristalográficas da AChE de organismos humanos (Códigos PDB: 4EY5,
4EY6, 4EY7 (CHEUNG et al.; 2012), 4M0E, 4MOF (CHEUNG et al.; 2013) foram obtidas
no banco de dados PDB (do inglês, Protein Data Bank ) (http://www.rcsb.org/pdb/)
(BERMAN et al., 2006). As estruturas foram obtidas no formato PDB e a escolha da enzima
a ser utilizada em nossos estudos foi feita com base nos seguintes critérios: Resolução até 2,5
Å, com presença de ligantes, cadeia polipeptídica mais completa possível e ausência de
mutações.
A sobreposição das proteínas e o cálculo do desvio médio quadrático (RMSD - do
inglês, Root Mean Square Deviation) para verificação da correspondência entre as mesmas foi
realizada com o programa Discovery Studio 2016.
O cálculo da área e volume molar dos ligantes co-cristalizados foi realizado com o
programa Spartan’08 e os valores foram utilizados como último critério por meio da
comparação com a área e volume dos ligantes estudados.
4.1.2 Validação do método: Redocking
Para validação da metodologia de docking utilizada e escolha da função de score e raio
adequados, realizou-se um redocking entre a proteína e o ligante donepezila co-cristalizado
junto à mesma, utilizando-se as funções de score Goldscore, Chemscore e ChemPLP no
56
programa GOLD versão 4.1.2. Variou-se o raio a partir do átomo de referência escolhido em
10Å, 15 Å e 20 Å.
O átomo de oxigênio no 1557 do resíduo de aminoácido Ser203 foi utilizado como
átomo de referência na definição da região de ligação tanto para o redocking quanto para o
docking molecular com a enzima AChE de H. sapiens (Código no PDB:4EY7) (CHEUNG et
al.; 2012).
Com o Discovery Studio 2016 realizou-se a sobreposição entre as poses obtidas por
redocking e a pose do ligante co-cristalizado a enzima, de modo a calcular o desvio médio
quadrático e verificar qual função de score e o raio fornecem o resultado mais semelhante.
4.1.3 Estudos de Docking Molecular
As estruturas do obtusol, dendroidiol, cartilagineol, elatol e derivados foram
construídas no programa Spartan’08.
Nos estudos de docking molecular para a análise de possíveis modos de ligação e a
investigação das interações atômicas predominantes neste processo, foi utilizado o programa
GOLD versão 4.1.2 (VERDONK et al., 2003) com as moléculas construídas na etapa anterior
e a estrutura da AChE de H. sapiens obtida no PDB (Código: 4EY7 ) (CHEUNG et al.; 2012).
Os estudos iniciais de docking foram realizados com a acetilcolina, galantamina,
donepezila, obtusol, dendroidiol, cartilaginiol e elatol. Posteriormente, foram estudadas as
séries propostas de estruturas derivadas do metabólito considerado mais promissor após os
estudos in silico e in vitro.
A princípio, o docking foi realizado com a proteína rígida e, posteriormente, utilizando
a biblioteca de rotâmeros das cadeias laterais de Tyr72, Tyr124 e Trp 86 disponíveis no
programa GOLD.
As visualizações e análises dos resultados foram feitas nos programas Pymol 0.99 para
Windows (DELANO, 2002), PDB SUM (DE BEER, 2013) e Discovery Studio 2016
(BIOVIA, 2016).
57
Parte II: Ensaios de cinética enzimática entre metbólitos secundários de
Laurencia e AChE
4.2 Determinação da atividade anticolinesterásica de metabólitos
secundários de Laurencia sp
Os ensaios enzimáticos com a AChE foram realizados conforme metodologia descrita
por Ellman (ELLMAN et al., 1961), o qual se baseia na taxa de produção de tiocolina a
medida que a acetiltiocolina é hidrolisada pela enzima (1). A tiocolina produzida reage com
Ácido Ditionitrobenzoico (DTNB) produzindo um composto colorido (2) detectável em um
espectrofotômetro UV/Visível 412 nm (Figura 18).
S
O
N+
O-
O
+ SH
N+
SH
N+ +
S
SHOOC
O2N
COOH
NO2
S
HOOC
O2NS
N+ + S
-
COOH
N
O
OS
COOH
N
O-
O-
+
AchE
DTNB
Composto colorido
Acetiltiocolina Acetato Tiocolina
Tiocolina
(1)
(2)
Figura 18: Esquema representativo das reações químicas descritas por Ellman et al. (1961).
Em geral, faz-se inicialmente uma triagem preliminar com algumas concentrações pré-
definidas para as substâncias que se deseja testar. Aquelas que mostrarem uma inibição
significativa são direcionadas para estudos mais detalhados variando-se as concentrações do
inibidor e do substrato da enzima e objetivando a determinação de Ki.
Neste estudo utilizou-se a enzima AChE de Electrophorus electricus
(Sigma_Aldrich) a 0,25 U/mL em tampão de fosfato de sódio 0,1 M e pH 7,0 com Albumina
Sérica Bovina (BSA) 1%; solução 3 mM de Ácido Ditionitrobenzoico (DTNB) em tampão
58
fosfato, pH 7,0 e como substrato iodeto de acetiltiocolina 75 mM em tampão de fosfato 0,1 M
e pH 7,0. Preparou-se uma solução-mãe de obtusol, dendroidiol, cartilaginiol e elatol à
concentração de 10 mM em metanol.
Realizou-se uma triagem inicial das substâncias acima mencionadas a uma
concentração de 300 µM. Adicionou-se a placa de poços 7,5 µL da solução-mãe 10 nM de
cada substância separadamente, 222,5 µL do tampão de fosfato de sódio 0,1M e pH 7,0, 10
µL da solução da enzima, 5 µL da solução contendo o substrato e 5 µl da solução de DTNB.
Para o controle adicionou-se aos poços 10 µL da solução da enzima, 5 µL da solução
contendo o substrato, 5 µl da solução de DTNB e 230 µl tampão de fosfato de sódio 0,1M e
pH 7,0. Para o veículo adicionou-se aos poços 7,5 l de metanol, 10 µL da solução da enzima,
5 µL da solução contendo o substrato, 5 µl da solução de DTNB e 222,5 µl de tampão de
fosfato de sódio 0,1M e pH 7,0 .
Em seguida, estudos mais detalhados para a obtenção de ki foram realizados para a
substância que apresentou maior atividade. O experimento foi repetido variando-se então as
concentrações do inibidor e do substrato. A solução-mãe da substância mais ativa foi então
diluída na placa de poços para as concentrações de 30 µM, 100 µM e 300 µM e a solução
contendo o substrato nas concentrações de 1500 µM; 500 µM; 166,66 µM; 55,55 µM e 18,52
µM.
O período de incubação foi de 30 minutos e a absorbância foi monitorada a 412 nm em
espectrofotômetro SPECTRAmax 190-Molecular Devices. A absorbância foi lida a cada 1
minuto por um tempo total de 10 minutos.
Todos os ensaios foram realizados em triplicata e a análise dos resultados para
determinação do tipo de inibição e da constante de dissociação do inibidor (Ki) foi realizada
no programa GraphPad Prism versão 5.0.
59
Parte III: Obtenção do metbólito secundário mais ativo a partir de
Laurencia dendroidea
4.3 Obtenção e Identificação do elatol
A obtenção e a identificação do elatol foram realizadas conforme metodologia geral
descrita na Figura 19.
Figura 19: Esquema mostrando as etapas de obtenção e identificação do Elatol.
4.3.1 Coleta da Alga
As amostras coletadas neste estudo pertencem à população de Laurencia dendroidea
que ocorre nas praias Azeda e Azedinha, localizadas no município de Armação dos Búzios, na
zona tropical do continente sul-americano, no estado do Rio de Janeiro, Brasil (Figura 20). O
município possui 27.560 habitantes que vivem principalmente do turismo e da pesca, numa
área de aproximadamente 70 Km², caracterizando-se pelo clima tropical com temperatura
média anual de 25ºC. As chuvas ocorrem de novembro a março, enquanto que de abril a
setembro é o período de estiagem. Os espécimes de Laurencia dendroidea foram coletados
na faixa superior da região entre-marés entre agosto de 2015 e janeiro de 2016, através de
técnicas de mergulho livre. Os espécimes coletados foram separados em duas amostras
distintas e receberam os códigos AZ01 e AZ02.
60
Figura 20: Localização geográfica do ponto de coleta da alga Laurencia dendroidea.
4.3.2 Processo de extração
A amostra de Laurencia dendroidea coletada foi triada e separada de impurezas
como areia e pequenos crustáceos. Depois de ser distribuída em bandejas, foi congelada a
uma temperatura de – 20 ºC e então liofilizada por 24 horas.
Após a liofilização, a alga seca foi triturada e transferida para um erlenmayer, onde
foi submetida ao processo de extração por maceração com a adição de uma mistura de acetato
de etila:metanol 1:1 obedecendo a uma proporção de 4 mL de solvente para cada 1 grama de
alga seca. Após 48 horas, a mistura foi filtrada e o filtrado evaporado sob pressão reduzida.
Esse processo de extração foi repetido por 4 vezes (Figura 21).
Após a evaporação do solvente, obteve-se um material oleoso de coloração verde
escuro. Os perfis destes extratos foram avaliados por cromatografia em camada delgada
(CCD) utilizando-se como sistema revelador luz ultravioleta (UV) a 254 nm e 365 nm,
seguido de uma solução de ácido sulfúrico a 5% em etanol e posterior aquecimento (Figura
22).
61
Figura 21: A e B: Processo de liofilização da alga; C: Ultrassom; D: extração por maceração; E: filtração; F:
Evaporação de solventes sob pressão reduzida; G: Extrato bruto.
4.3.3 Fracionamento do Extrato Bruto
Inicialmente foram homogenizados 26 gramas de sílica gel ultra pura (60-200 m)
Silicycle em n-hexano. A mistura foi introduzida em uma coluna de vidro (ø = 3,5 cm)
acoplada a um kitassato e conectada a um sistema de vácuo. De 1,5 a 2,0 gramas de extrato
bruto foram misturadas a uma pequena quantidade de sílica gel ultra pura (60-200 m)
Silicycle. A amostra impregnada com sílica foi cuidadosamente adicionada ao topo da coluna
com o auxílio de uma espátula (Figura 22). A coluna foi eluída conforme o gradiente descrito
na Tabela 1.
62
Figura 22: Fracionamento do extrato bruto de Laurencia dendroidea por cromatografia em coluna.
Tabela 1: Gradiente de eluição para o fracionamento do extrato bruto de Laurencia
dendroidea utilizando filtração em coluna aberta sob gel de sílica.
Fase Móvel Volume (mL) Frações Volume recolhido (mL)
Hexano 100% 180 0 180
Hexano : Acetato de etila 9:1 180 1 180
Hexano : Acetato de etila 7:3 180 2 180
Acetato de etila : Metanol 1:1 90 3 180
Metanol 100% 90
Após evaporação do solvente sob pressão reduzida, o perfil das frações foi avaliado
por CCD utilizando-se como sistema revelador luz ultravioleta (UV) a 254 nm e 365 nm e
solução de ácido sulfúrico a 5% em etanol seguida de aquecimento.
Após a análise dos resultados, a fração 1 obtida foi submetida a novos processos de
purificação.
4.3.4 Purificação
A fração 1 foi submetida a um novo processo de separação por cromatografia em
coluna aberta (Figura 23). Homogeneizou-se 18 gramas de sílica gel ultra pura (60-200 m)
Silicycle em n-hexano. A mistura foi introduzida em uma coluna de vidro (ø = 1,5 cm). Cerca
de 1,00 grama da fração 1 foi misturado a uma pequena quantidade de sílica gel ultra pura
63
(60-200 m) Silicycle. A amostra impregnada com sílica foi cuidadosamente adicionada ao
topo da coluna com o auxílio de uma espátula. A coluna foi eluída conforme o gradiente
descrito na Tabela 2. As frações 1 a 15 foram coletadas em intervalos de 20 mL e as frações
16 a 18 foram coletadas a cada 50 mL.
Figura 23: Processo de purificação do elatol. Fracionamento da fração 1 , que contém o elatol, em coluna aberta
sob gel de sílica.
Tabela 2: Gradiente de eluição para a purificação da fração 1 do extrato bruto de Laurencia
dendroidea por cromatoragrafia em coluna aberta sob gel de sílica.
Fase Móvel Volume (mL) Frações Volume recolhido (mL)
Hexano/ Acetato de etila 100:0 80 1-4 20
Hexano / Acetato de etila 99:1 120 5-10 20
Hexano / Acetato de etila 98:2 100 11-15 20
Hexano / Acetato de etila 95:5 50 16 50
Hexano / Acetato de etila 90:10 50 17 50
Acetato de etila/Metanol 50:50 50 18 50
Os perfis das frações foram avaliados por CCD utilizando-se como sistema revelador
luz ultavioleta (UV) a 254 nm e 365 nm e solução de ácido sulfúrico a 5% em etanol seguida
de aquecimento. Após a análise do perfil, frações semelhantes foram reunidas.
64
4.3.5 Caracterização do elatol
A elucidação estrutural do elatol foi realizada utilizando espectroscopia de
Ressonância Nuclear Magnética (RMN) em aparelho de marca e modelo Varian VNMNR
com intensidades de campo magnético de 4,7 Tesla a 500 MHz no Laboratório Multiusuário
de RMN da Universidade Federal Fluminense - UFF (LaReMN). As amostras foram
preparadas utilizando-se clorofórmio deuterado (CDCl3). As análises e edições dos espectros
foram realizadas no programa MestReNova v6.0.2-5475.
A medida da rotação específica para identificar o enatiômero isolado foi realizada no
Instituto de Pesquisas de Produtos Naturais da Universidade Feral do rio de Janeiro – IPPN -
UFRJ, em polarímetro Jasco P200. As amostras foram diluídas em metanol para concentração
de 2,6 mg/mL.
Parte IV: Proposição de derivados do metabólito secundário mais ativo e
estudos in silico por meio de docking e avaliação de parâmetros
farmacocinéticos para realização de triagem virtual
4.4 Planejamento dos Derivados do Elatol
Os derivados do elatol foram propostos com base na adição de grupos funcionais
com potencial farmacofórico, em substituição ao grupamento hidroxila da molécula (Figura
24) e todas as estruturas moleculares foram otimizadas através do método semi-empírico AM
1 (Austin Model 1 ou Modelo Austin 1). A série 1 envolve a introdução de aminas alifáticas,
a série 2 envolve a introdução de aminas cíclicas não-aromáticas e a série 3 envolve a
introdução de aminas aromáticas, com diversos padrões de substituição.
65
Figura 24: Série de derivados semi-sintéticos do elatol planejados pela adição de grupos farmacofóricos.
A predição dos estados de protonação em pH fisiológico das séries de derivados
semissintéticos do elatol propostas foi realizada com o auxílio do programa MarvinView da
ChemAxon, versão 6.2.1 (http://www.chemaxon.com).
A síntese dos derivados que mostrarem maior desempenho durante a triagem virtual
por docking molecular poderá ser realizada conforme a figura 25.
66
Figura 25: Análise retrossintética com exemplos de derivados do Elatol.
O mecanismo proposto envolve inicialmente a substituição da hidroxila por um
grupamento tosil, de forma a torná-la um melhor grupo de saída. Em seguida, através de
reações de substituição nucleofílica seria possível introduzir os farmacóforos desejados.
Dependendo do tipo de substituição nucleofílica, se de primeira ordem ou de segunda
ordem, poderemos ter uma inversão de configuração no momento da substituição do grupo
tosil pelos farmacóforos propostos. Dessa forma há a possibilidade de obtenção de diferentes
enantiômeros ou ainda de uma mistura racêmica, fazendo-se necessário, dessa forma, o estudo
teórico de ambos.
4.4.1 Avaliação dos parâmetros farmacocinéticos
4.4.1.1 Regra dos 5 de Lipinski
A biodisponibilidade oral teórica foi avaliada através da regra dos 5 do Lipinski a
partir de parâmetros calculados na plataforma online Molinspiration disponível em
http://www.molinspiration.com/. Essa plataforma calcula cada parâmetro que compõe a regra
e fornece o número de violações da mesma.
67
4.4.1.2 Cálculo Teórico da Capacidade de Permeação da Barreira
Hematoencefálica
Os parâmetros envolvidos na regra estabelecida por Clark e colaboradores para
predizer a capacidade molecular de permeação da barreira hematoencefálica (CLARK et al.,
2003), foram calculados no módulo MarvinSketch da ChemAxon, versão 6.2.1
(http://www.chemaxon.com).
Esses resultados foram confrontados com resultados para permeação da barreira
hemato-encefálica obtidos através do servidor on-line pkCSM
(http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/).
4.4.1.3 Predição da Toxicidade in silico
Para a predição da toxicidade quanto a mutagenicidade e carcinogenicidade através do
teste AMES, cardiotoxicidade através da inibição dos canais de Herg e hepatotoxicidade,
utilizou-se servidor on-line pkCSM, disponível em http://structure.bioc.cam.ac.uk/pkcsm.
Esse servidor é uma ferramenta bastante utilizada para a predição da toxicidade de candidatos
a fármacos, ele utiliza assinaturas baseadas em gráficos para desenvolver modelos preditivos
das principais propriedades ADME-T. Com livre acesso, não retém nenhuma informação
enviada e fornece uma plataforma integrada capaz de avaliar de forma rápida propriedades
farmacocinéticas e de toxicidade de candidatos a fármacos (PIRES et al., 2015) (Quadro 01).
68
Quadro 1: Modelos de predição de toxicidade pelo pkCSM (PIRES et al.,2015).
Preditor Base de dados do modelo de predição Resultados
Teste de AMES
Este modelo preditivo foi construído a
partir dos resultados de mais de 8.000
compostos testados quanto a sua
mutagenicidade.
Ele prevê se um dado composto
é susceptível de ser Ames
positivo e, portanto,
mutagênico. Em caso
afirmativo o modelo reporta
SIM, e em caso negativo, NÃO.
Inibição de
hERG I e II
Estes indicadores foram construídos
usando um banco de dados de
informações de inibição de hERG I e II
para 368 e 806 compostos,
respectivamente.
O preditor irá determinar se um
determinado composto é
susceptível de ser um inibidor
de hERG I/II, e reportará como
resposta SIM ou NÃO.
hepatotoxicidade
Este preditor foi construído usando
efeitos adversos no fígado observado em
humanos, associados a 531 compostos.
Ele prevê se um dado composto
é susceptível de ser associado
com a interrupção de uma
funcionalidade normal no
fígado. E como resultado irá
reportar SIM ou NÃO.
Também foi utilizado o FAF-Drugs4 (do inglês “Free ADME-Tox Filtering Tool”),
disponível em http://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py?form=FAF-
Drugs4#forms::FAFDrugs4. Com base em relatos da literatura e análise estrutural de
fármacos aprovados, este programa auxilia na predição de uma resposta tóxica de moléculas
através de uma análise do número de ocorrências de uma dada subestrutura, considerada
toxicofórica, no mesmo composto e o classifica em três possíveis grupos (LAGORCE et al.,
2008):
a) Compostos aceitos: Compostos sem alertas estruturais e que satisfazem o filtro
físico-químico selecionado ou definido pelo usuário.
b) Compostos Intermediários: Compostos que incorporam alertas estruturais de baixo
risco com várias ocorrências abaixo do limite.
c) Compostos Rejeitados: Compostos que não passam o filtro físico-químico
selecionado ou definido pelo usuário e que incluem um alerta estrutural de alto risco e / ou
excedem o limite de ocorrência de alertas estruturais de baixo risco.
69
O FAF-Drugs4 é um programa construído com o objetivo de filtrar bibliotecas de
compostos candidatos a fármacos nas etapas iniciais dos estudos de modelagem molecular.
Essa ferramenta pode realizar a predição de algumas propriedades do ADME-Tox, auxiliando
na seleção de “hits”. Ele emprega filtros pré-definidos, mas possibilita também que usuários
selecionem seus próprios parâmetros de filtragem (LAGORCE et al., 2008).
4.4.2 Estudos de Docking Molecular
Nos estudos de docking molecular para a análise de possíveis modos de ligação e a
investigação das interações atômicas predominantes neste processo, foi utilizado o programa
GOLD versão 4.1.2 (VERDONK et al., 2003) com as estruturas derivadas do elatol
construídas na etapa anterior e a estrutura da AChE de H. sapiens obtida no PDB (Código:
4EY7 ) (CHEUNG et al.; 2012).
Foi realizado o docking flexível, utilizando-se a biblioteca de rotâmeros das cadeias
laterais de Tyr72, Tyr124 e Trp 86 disponíveis no programa GOLD.
As visualizações e análises dos resultados foram feitas nos programas Pymol 0.99 para
Windows (DELANO, 2002), PDB SUM (DE BEER, 2013) e Discovery Studio 2016
(BIOVIA, 2016).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Estudos de docking molecular
5.1.1 Seleção das estruturas de AChE
De mais de 100 estruturas de AChE depositadas no PDB, somente 14 são de
organismos humanos. Destas, 7 têm Resolução entre 2,0 e 2,5 Å. Destas, 5 foram
selecionadas de acordo os critérios adotados conforme descrito no item 4.1.
Com a sobreposição das estruturas no programa Pymol (Figura 26), pode-se verificar a
correspondência entre as mesmas, não havendo nenhuma distorção significativa nas
conformações das cadeias laterais dos resíduos do sítio ativo das enzimas e dos resíduos que
formam o “gorge channel”. Dessa forma, em uma primeira análise, as 5 estruturas proteicas
são consideradas aptas para a triagem virtual com os ligantes propostos.
70
Figura 26: A: Sobreposição de estruturas cristalográficas de AChE humana. B: Sobreposição dos principais
resíduos do sítio ativo e subsítios.
A correspondência entre as estruturas também pode ser verificada através do cálculo
do desvio médio quadrático (RMSD), que fornece um valor numérico que indica o grau de
semelhança entre as estruturas sobrepostas (Tabela 4). Quanto menor esse valor, maior a
semelhança entre as estruturas alinhadas.
Tabela 3: Cálculo do Desvio Médio Quadrático (RMSD) entre as estruturas de AChE
humanas.
Desvio médio quadrático (RMSD)
PDB - id 4EY5 4EY7 4EY6 4MOE 4MOF
4EY5 - 0,128 0,197 0,211 0, 196
4EY7 0,128 - 0,166 0,216 0,179
4EY6 0,197 0,166 - 0,248 0,182
4MOE 0,211 0,216 0,248 - 0,288
4MOF 0, 196 0,179 0,182 0,288 -
Para selecionar a estrutura cristalográfica a ser utilizada em nossos estudos adotou-se
como critério final a maior proximidade entre os valores calculados de área e volume molar
dos ligantes co-cristalizados e dos candidatos a inibidores (Tabelas 5 e 6) (Figura 27).
71
Tabela 4: Área e volume molar dos ligantes co-cristalizados a enzima.
Proteína
PDB-Id Ligante Estrutura
Área
(Å2)
Volume
Molar(Å3)
4EY5 Huperazina A
H
ONH
NH2
258,95 252,32
4EY6 Galantamina H
OH
NCH3
O
O CH3
299,92 297,20
4EY7 Donepezila
CH3
O
O
CH3O
N
426,38 412,23
4MOF Territrem B O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
489,12 507,36
4MOE Diidrotanshinona O
O
O
296,93 291,93
72
Tabela 5: Área e volume molar dos candidatos a inibidores de AChE.
Candidato a
inibidor Estrutura Área (Å
2) Volume Molar(Å
3)
(-)-elatol
OH
Cl
Br
286,79 287,80
(+)-elatol
OH
Cl
Br
287,22 287,95
cartilaginiol
Br
OH
Cl
Br
309,67 311,02
dendroidiol
Br
OH
OH
Cl
297,85 300,35
obtusol
Br
OH
Br
Cl
307,12 310,84
73
Figura 27: Área e volume molar dos ligantes co-cristalizados com a AChE e dos candidatos a inibidores.
A área e volume molar de alguns dos ligantes propostos ultrapassaram a área e volume
molar dos ligantes de 4EY5, 4EY6 e 4MOE. Além disso, os valores obtidos para os ligantes
propostos mostraram-se bastante inferiores aos do ligante de 4MOF. Dessa forma, percebe-se
que a estrutura de código 4EY7 é a mais adequada para os nossos estudos, considerando ainda
a proposição de derivados com a inserção de grupos que irão elevar a área e o volume.
5.1.2 Validação do método: Redocking
A sobreposição entre as poses obtidas por redocking e a pose do ligante co-
cristalizado com o Pymol 0.99 para Windows (Figura 28) mostra conformações e orientações
bastante semelhantes.
0
100
200
300
400
500
600
Áre
a(A
2)
e V
olu
me M
ola
r (A
3)
Ligantes
Área (Å2)
Volume (Å3)
74
Figura 28: Sobreposição do ligante co-cristalizado com a AChE e melhor pose obtida por redocking com a
função de scoreChemPLP e raio de 15Å.
O cáculo do desvio médio quadrático (RMSD) realizado com Discovery Studio
2016 (Tabela 7) é capaz de fornecer um valor numérico para esse grau de semelhança que
será maior quanto menor for o valor obtido, facilitando a comparação dos resultados. Nesse
estudo, o menor valor de RMSD foi obtido na função de score ChemPLP com um raio de 15Å
ou 20Å a partir do átomo de referência.
Dessa forma, escolheu-se a função de score ChemPLP com raio de 15 Å para
realizar o docking molecular entre a AChE e os candidatos a inibidores inibidores.
Tabela 6: Redocking e desvio médio quadrático (RMSD).
REDOCKING – função ChemPLP
Raio 10Å 15 Å 20 Å
RMSD 0,7 0,5 0,5
5.1.3 Estudos de docking molecular dos Metabólitos secundários de
Laurencia sp
Uma análise preliminar dos resultados de docking molecular entre a AChE humana, o
seu substrato, fármacos usados no tratamento da DA e metabólitos secundários de Laurencia
sp, mostra valores de score maiores para a Donepezila e Galantamina. Porém de acordo com
esses valores a afinidade pela enzima é menor para o seu substrato quando comparada as
moléculas candidatas a inibidores de AChE.
Ao compararmos os candidatos a inibidores (Figura 29), notamos uma maior afinidade
teórica entre o elatol e a enzima enquanto que a menor afinidade teórica foi observada para o
obtusol.
75
Figura 29: Scores com a função CHEMPLP para a Acetilcolina, fármacos usados no tratamento da DA e
metabólitos secundários de Laurencia sp candidatos a inibidores de AChE.
O quadro 2 demonstra o resultado do estudo detalhado dos ligantes e a enzima, e as
possíveis interações que podem estar contribuindo para a afinidade teórica obtida por docking
molecular.
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Score
Ligantes
76
Quadro 2: Interações observadas entre ligantes e resíduos aminoácidos de AChE.
Ligantes
Interações entre Ligantes e AchE Interações
com resíduos da tríade catalítica
LH LH
fraca pi-alquil pi-sigma Empilhamento pi Cátion-pi Van der Waals Resíduos envolvidos Interação
Fármacos
Donepezila 1 1 3 1 5 7 Não Realiza
Galantamina 2 4 3 5
SER203 Ligação de Hidrogênio
SER203 fraca ligação de H
HIS447 fraca ligação de H
Substrato Acetilcolina 2 1 3 4 HIS447 fraca ligação de H
Candidato a inibidor
obtusol
10
3 HIS447 Pi-Alquil
dendroidiol
8
5 HIS447 Pi-Alquil
cartilagineol
12 1
4 HIS447 Pi-Alquil
(+)-elatol 12 5 HIS447 Pi-Alquil
(-)-elatol 12 6 HIS447 Pi-Alquil
77
Os itens 1.4 e 1.5.1 apresentam detalhes sobre as interações observadas entre a AChE
e o seu substrato e entre a AChE e os fármacos Donepezila e Galantamina.
Quadro 3: Interações desfavoráveis e/ou fora dos sítios observadas entre ligantes e resíduos
de aminoácidos de AChE.
Ligantes Interações Desfavoráveis Interações fora do CAS, PAS e OH
Resíduos
envolvidos Tipo
Resíduos e átomos
envolvidos Tipo
Candidato
a inibidor
obtusol GLY118 Impedimento estérico PHE 297 – Cl18
TYR337- Br22
Pi-alquil
Pi-alquil
dendroidiol --- --- PHE 297 – Cl16
TYR337- C32
Pi-alquil
Pi-alquil
cartilagineol --- --- PHE 297 – Br39
TYR337- C30
Pi-alquil
Pi-alquil
(+)-elatol --- --- ---- ---
(-)-elatol --- --- --- ---
As moléculas de obtusol, dendroidiol, cartilagineol e elatol apresentam interações
envolvendo sistemas pi, do tipo pi-alquil, com resíduos do CAS e do PAS. Interações deste
tipo são relatadas como relevantes para o papel funcional e estrutural de proteínas (RIBAS, et
al., 2002). Ademais, apesar de apresentarem uma menor magnitude em comparação com
interações de caráter eletrostático como as ligações de hidrogênio e cátion-pi, apresentadas
tanto pelo substrato da enzima quanto pelos fármacos da terceira geração estudados,
apresentam-se em maior número, explorando a possibilidade de interações do tipo
hidrofóbicas com resíduos do PAS no “gorge channel” e diminuindo a probabilidade do
substrato chegar ao sítio ativo da proteína, já que o processo de hidrólise ocorre no fundo da
cavidade. Adicionalmente, a interação com resíduos aromáticos do PAS pode impedir a
ligação primária da Ach, essencial para que ela possa atingir o sítio ativo.
Além disso, todos apresentam ao menos uma dessas interações do tipo pi-alquil com
HIS 447, que compõe a tríade catalítica e é responsável por elevar a nucleofilicidade da serina
catalítica (SER203) pelo substrato.
Porém algumas diferenças podem ser observadas na forma como esses metabólitos
interagem com a enzima. O obtusol, dendroidiol e cartilagineol apresentam interações com
resíduos que não pertencem ao PAS, CAS ou OH. São duas interações do tipo pi-alquil com
PHE 297 e TYR 337.
No caso do obtusol (figura 30) as duas interações envolvem seus átomos de halogênio
e sistemas pi desses resíduos. A notável afinidade observada em diversos estudos entre
átomos de halogênio, principalmente cloro, e anéis aromáticos (MATTER et al., 2009) pode
78
estar contribuindo para a afinidade desta ligação em detrimento de interações com resíduos do
CAS, PAS e OH importantes no reconhecimento molecular e processo de hidrólise do
substrato da enzima. Além disso, observam-se interações desfavoráveis ocasionadas por
impedimento estérico entre o Obtusol e o resíduo de GLY118 pertencente ao OH.
Figura 30: Melhor pose do Obtusol obtida por docking e interações no sítio da AChE.
Para o dendroidiol (Figura 31) e cartilagineol (Figura 32), apenas a interação com PHE
297 ocorre através de seus átomos de halogênios, sendo cloro e bromo, respectivamente. A
interação com TYR 337 acontece através de átomos de carbono e o sistema pi do anel,
possuindo uma menor magnitude.
79
Figura 31: Melhor pose do Dendroidiol obtida por docking e interações no sítio da AChE.
Figura 32: Melhor pose do Cartilagineol obtida por docking e interações no sítio da AChE.
80
No caso do elatol (Figuras 33 e 34), os átomos de Cloro e Bromo presentes na sua
estrutura também apresentaram interações com sistemas pi do tipo pi-alquil, porém com
resíduos do CAS e do PAS. A afinidade do cloro por anéis aromáticos já mencionada
anteriormente, pode estar contribuindo fortemente para a afinidade da ligação no
reconhecimento molecular (MATTER et al.; 2009).
Figura 33: Melhor pose do (+)-elatol obtida por docking e interações no sítio da AChE.
81
Figura 34: Melhor pose do (-)-elatol obtida por docking e interações no sítio da AChE.
Tendo em vista os valores de score obtidos com o docking molecular e a análise das
interações observadas entre esses ligantes e a enzima AChE, consideramos que o Obtusol
pode ter sua atividade inibitória prejudicada devido as interações desfavoráveis com OH e as
interações envolvendo seus átomos de halogênio e sistemas pi fora do CAS e PAS. Podemos
ainda, considerar o elatol o candidato a inibidor mais promissor, enquanto que o Dendroidiol
e o Cartilagineol ocupariam posições intermediárias em relação à possível inibição da AChE.
5.2 Ensaio de inibição enzimática da AChE pelos Metabólitos secundários
de Laurencia sp.
Para avaliar experimentalmente a capacidade inibitória dos metabólitos secundários de
Laurencia sp estudados, fez-se inicialmente uma triagem preliminar em uma concentração de
300 µM com obtusol, dendroidiol, cartilagineol, (-)-elatol. Os metabólitos secundários de
Laurencia dendroidea utilizados neste estudo foram cedidos pelo Grupo de Produtos Naturais
de Organismos Aquáticos (GPNOA).
O gráfico abaixo (Figura 35) mostra a taxa de formação de produto da reação de
hidrólise entre a AChE e a Acetiltiocolina por unidade de tempo, sem a presença dos
82
candidatos a inibidores e na presença dos candidatos a inibidores. Nota-se que o obtusol não
exerceu efeitos significativos sobre a atividade da enzima, enquanto que dendroidiol,
cartilagineol e elatol foram capazes de exercer alguma atividade inibitória frente a enzima.
É importante notar que esses resultados concordam com a predição anterior obtida
durante a avaliação in silico por meio de docking molecular, onde a afinidade entre ligante e
enzima foi maior para o elatol, sendo o obtusol apontado como o candidato de menor
afinidade de ligação.
Contr
ole
MeO
H 3
% M)
Riv
astig
min
a (1
00
cartila
gineo
l
dendro
idio
l
elat
ol
obtuso
l0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Metabólitos secundários de Laurencia
(300 M)
****** *** ***
V0
(nm
ol.
min
-1)
Figura 35: Inibição da atividade de AChE por metabólitos secundários de Laurencia sp. V0 é a velocidade da
reação hidrólise da acetiltiocolina pela AChE. Barras representam a média da velocidade da atividade enzimática
e traços representam o erro padrão. *** representam P<0,001 quando comparado ao veículo pelo teste estatístico
Anova de 1 via seguido do pós teste de comparação múltipla de Bonferroni’s.
A fim de elucidar o mecanismo de inibição da AChE pelo elatol, estudos mais
aprofundados foram realizados. Para a realização destes estudos variam-se as concentrações
do inibidor e do substrato, e os dados plotados como velocidades iniciais de reação versus
concentração de acetiltiocolina, são ajustados por regressão não linear com a equação de
Michaelis-Menten (Figura 36).
83
0 200 400 6000.0
0.5
1.0
1.5Veículo
Elatol - 30 M
Elatol - 100 MElatol - 300 M
[Acetiltiocolina] (M)
V0 (
nm
ol.m
in-1
)
Figura 36: Efeito do elatol sobre os parâmetros cinéticos da AChE. As velocidades iniciais de reação (V)
foram obtidas a partir de curvas de progressão em diferentes concentrações de substrato e inibidor. As linhas
sólidas são derivadas do modelo de inibição cinético de Michaelis-Menten.
O gráfico de Michaelis-Menten (Figura 36) mostra a velocidade inicial da reação em
função da concentração do substrato da enzima, na presença do elatol a diferentes
concentrações. É possível identificar uma diminuição na velocidade máxima da reação
conforme maiores concentrações de elatol são adicionadas ao meio.
A curva da figura 37 representa a linearização do gráfico da figura 36 e mostra que as
retas obtidas nas reações sem inibidor e com inibidor sofrem intersecção em uma região
distinta tanto do eixo das abscissas quanto do eixo das ordenadas, representado por
1/[Acetiltiocolina] e 1/V respectivamente, indicando a variação tanto de Vmáximo quanto de
Km na presença do inibidor. Km é constante de Michaelis e Menten e é numericamente igual
à concentração de substrato que determina a metade da velocidade máxima da reação, é
característico da enzima e de seu substrato e indica o grau de afinidade da enzima pelo
Substrato (WILSON e WALKER, 2010).
84
-0.02 0.00 0.02 0.04 0.06
5
10
15
Elatol - 300 MElatol - 100 MElatol - 30 MVeículo
1/[Acetiltiocolina] M
1/V
má
x
(nm
ol.
min
-1)
Figura 37: Gráfico de Lineweaver-Burk para a inibição do elatol sobre a AChE.
Este padrão de interação entre a enzima e o inibidor, em que tanto a velocidade
máxima da reação quanto a afinidade da enzima pelo seu substrato são alterados, aponta para
um mecanismo inibitório misto quando a reta que representa a reação enzimática sem o
inibidor e as retas que representam a reação enzimática na presença do inibidor se interceptam
(WILSON e WALKER, 2010).
O valor de Ki pode ser determinado então, através de um terceiro gráfico de
1/Vmáximo versus a concentração do inibidor, em que o intercepto no eixo das abscissas,
representado por [elatol] fornece o valor da constante de inibição (–Ki) (Figura 38).
85
Figura 38: Cálculo do Ki do elatol para a AChE.
Dessa forma, o teste espectrofotométrico de Ellman sugere a ocorrência de inibição da
enzima pelo elatol com um Ki de 300,5 micromolar por um mecanismo de inibição mista.
É sabido que o Ki de fármacos como a Donepezila é da ordem de nanomolar
(CECILIA RODRIGUES SIMOES et al.,2014), todavia, espera-se ser possível o aumento
dessa afinidade experimental encontrada em virtude da adição de grupos farmacofóricos.
Tendo em vista o melhor potencial inibitório do elatol frente aos outros metabólitos
secundários de Laurencia sp. apontado pelos estudos de modelagem computacional e
posteriormente confirmado através do teste de inibição enzimática e o fato de encontrarmos o
elatol como componente majoritário em diferentes populações de Laurencia dendroidea da
região dos lagos no litoral do estado do Rio de Janeiro, decidiu-se por dar continuidade aos
estudos com esse metabólito de forma a tentar potencializar a sua atividade. Dessa forma, foi
proposto que se funcionalizássemos a molécula do elatol com grupos farmacofóricos
poderíamos elevar a capacidade inibitória do mesmo através do aumento número de
interações com a AChE e, consequentemente, da afinidade.
Conforme descrito no item 5.3.4, estudos de caracterização do elatol por meio de
medidas de rotação específica mostraram que o metabólito isolado a partir de Laurencia
dendroidea no presente trabalho tratava-se do enantiômero (+)-elatol. Enquanto que a amostra
cedida para os testes de inibição enzimática realizados durante a triagem junto a outros
metabólitos secundários de Laurencia revelou ser o enantiômero (-)-elatol.
86
Dessa forma, uma nova triagem foi realizada de modo a verificar se haveria diferenças
na atividade inibitória dos enantiômeros. Conforme mostra a figura 39, testes preliminares
sugerem que, diferentemente do (-)-elatol, o (+)-elatol não apresenta capacidade inibitória
frente a enzim AChE.
Contr
ole
MeO
H 30 100
300
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
(+)-elatol (M)
V0
(nm
ol.
min
-1)
Figura 39: Inibição da atividade de AChE pelo (+)-elatol. V0 é a velocidade da reação hidrólise da
acetiltiocolina pela AChE. Barras representam a média da velocidade da atividade enzimática e traços
representam o erro padrão.
5.3 Isolamento e identificação do Elatol
5.3.1 Processo de extração
Com o processo de extração descrito no item 4.3.2 obteve-se as seguintes massas e
rendimentos para o extrato bruto de Laurencia dendroidea, conforme mostra a Tabela 10.
Tabela 7: Rendimento da obtenção de extrato bruto de Laurencia dendroidea.
*AZ01 **AZ02
Massa de alga seca 112,05 g 215,14 g
Massa do extrato 6,40 g 9,22 g
Rendimento = 5,71% 4,29%
*Coleta 01; **Coleta 02.
A análise do perfil dos extratos por CCD em comparação a um padrão previamente
obtido e caracterizado pelo grupo GPNOA, mostra a coloração roxa predominante que sugere
87
a presença de sesquiterpenos halogenados de Laurencia sp, como o elatol, de forma
majoritária nos extratos (Figura 40).
Figura 40: CCD dos extratos brutos de Laurencia dendroidea. Amostra padrão e amostras AZ01 e AZ02
coletadas da praia Azeda - Búzios-RJ. Fase móvel – Hexano/Acetato de etila 8:2. Sistema revelador: ácido
sulfúrico a 5% em etanol com posterior aquecimento.
5.3.2 Fracionamento do extrato Bruto
O fracionamento do extrato bruto descrito no item 4.3.3 originou quatro frações com
diferentes perfis (Figura 41). A CCD sugere a presença de elatol na fração 1, obtida em
hexano/acetato de etila 9:1, devido a coloração roxa característica da presença de
sesquiterpenos halogenados.
As massas e rendimentos obtidos neste fracionamento encontram-se na Tabela 11.
Figura 41: CCD das frações obtidas do extrato bruto de Laurencia dendroidea. Fase móvel: A:
Hexano/Diclorometano 7:3; B: Hexano/Diclorometano 3:7; C: Diclorometano 100%. Sistema revelador: ácido
sulfúrico a 5% em etanol com posterior aquecimento.
Tabela 8: Massas e rendimentos do fracionamento do extrato bruto de Laurencia dendroidea.
Padrão AZ01 AZ02
88
Fração Código massa (mg) Rendimento (%)
0 KG450 22,10 1,10
1 KG451 887,40 44,37
2 KG452 418,30 24,07
3 KG453 606,1 30,31
5.3.3 Purificação
A fração 01 (Código KG451 - Tabela 11) foi submetida a um novo processo de
separação por cromatografia em coluna visando à purificação do elatol, conforme descrito no
item 4.3.4. O perfil das novas frações obtidas foi analisado por CCD (Figura 42) e frações
semelhantes foram reunidas. Massas e rendimentos das frações obtidas são apresentados na
tabela 12.
Figura 42: CCD das frações obtidas na purificação da fração contendo elatol (código KG451). Fase móvel:
Diclorometano 100%, sistema revelador: ácido sulfúrico a 5% em etanol com posterior aquecimento.
Tabela 9: Massas e rendimentos de frações obtidas após a purificação da amostra KG451.
Fração Código massa (mg) Rendimento (%)
89
3 KG64A 2,9 0.33
4
11 KG6411 44,5 5,01
12
KG64C 21,8 2,46 13
14
15 KG6415 71,45 8,05
16 KG6416 438,3 49,39
17 KG6417 145,8 16,43
18 KG6418 128,9 14,52
A análise por CCD das frações KG6515 e KG6516 obtidas após a purificação da
amostra KG451 em comparação do perfil com um padrão previamente isolado e caracterizado
pelo Grupo de Produtos Naturais de Organismos Aquáticos (GPNOA) confirma a presença do
elatol (Figura 43).
Figura 43: CCD das frações KG6415 e KG6416 obtidas na purificação da fração KG451 e comparação com um
padrão previamente isolado. Fase móvel: Diclorometano 100%, sistema revelador: ácido sulfúrico a 5% em
etanol com posterior aquecimento.
5.3.4 Caracterização do elatol
A análise inicial do espectro de RMN 1H (Figuras 44-47) indicou a presença de dois
sinais em δH 5,13 e δH 4,80 (simpletos largos), característicos de hidrogênios olefínicos; dois
sinais característicos da presença de heteroátomos em δH 4,61 (d, JHH 2,95 Hz) e δH 4,15 (dd,
JHH 2,99; 6,38 Hz) e três singletos característicos de grupos metílicos em δH 1,70; δH 1,08 e
δH 1,07 ppm.
KG6416 Padrão KG6415
90
O espectro apresenta mais oito sinais característicos de hidrogênios ligados a carbonos
metilênicos em δH 1,63 (m) e δH 1, 81(m); δH 1,84 (m) e δH 1,96 (dd, JHH 3,79; 14,08); δH
2,58 (m) e δH 2,37 (d, JHH 17,54); δH 2,63 (m) e δH 2,51 (dd, JHH 2,69; 14,54), que
correspondem aos hidrogênios nas posições axiais e equatoriais ligados aos carbonos 1, 2,5 e
8 respecivamente.
Figura 44: Espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada.
91
Figura 45: Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada de 4.15 ppm a 5.15
ppm.
Figura 46: Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada de 1.75 ppm a 2.65
ppm.
92
Figura 47: Expansão do espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) da substância isolada de 1.05 ppm a 1.70
ppm.
Os resultados obtidos apresentaram grande semelhança com os dados disponíveis na
literatura para o chamigrano elatol, conforme apresentado na Tabela 13. A numeração do
esqueleto chamigrano foi feita baseada nos dados de Konig e Wright (1997).
93
Tabela 10: Dados de RMN 1H (500 MHz) em CDCl3 para a substância isolada comparados
com dados de RMN 1H (300 MHz) em CDCl3 obtidos para o (-)- elatol por (MACHADO et
al., 2011) e para o (+)-elatol (KONIG e WRIGHT, 1997).
Br
OH
Cl
910
11 7
8
6
12
13
1
2 34
514
15
C H
(-)-elatol
(Machado, et al. 2011)
(+)-elatol
(Konig e Wright, 1997) Substância isolada
δH (multiplicidade; J/Hz) δH (multiplicidade; J/Hz) δH (multiplicidade; J/Hz)
1 ax
eq
1,62 (ddd 13,4; 12,5; 7,6)
1,82 (ddd 13,4; 4,1; 2,1)
1,62 (m)
1,82 (m)
1,63 (m)
1,81 (m)
2 ax
eq
1,81 (ddd 14,8; 12,5;2,1)
1,96 (ddd 14,8; 7,6; 4,1)
1,82 (m)
1,96 (m)
1,84 (m)
1,96 (dd 3,79; 14,08)
5 ax
eq
2,59 (dl 16,1)
2,37 (dl 16,1)
2,19 (dl 17,5)
2,08 (dl 17,5)
2,58 (m)
2,37 (d 17,54)
8 ax
eq
2,63 (dd 14,4; 3,0)
2,51 (dd 14,4; 3,0)
2,49 (dd 14,4; 2,8)
2,19 (dm 14,4)
2,63 (m)
2,51 (dd 2,69; 14,54)
9 eq 4,14 (ql 3,0) 4,14 (m) 4,15 (dd 2,99; 6,38)
10 ax 4,60 (d 3,0) 4,61 (d 2,9) 4,61 (d 2,95)
12 1,08 (s) 1,06 (s) 1,07 (s)
13 1,07 (s) 1,07 (s) 1,08 (s)
14 syn
anti
5,12 (sl)
4,79 (sl)
5,12 (sl)
4,79 (sl)
5,13 (sl)
4,80 (sl)
15 1,70 (sl) 1,70 (sl) 1,70 (sl)
OH 2,19 (sl) 2,19 (sl) -----
A medida polarimétrica para o elatol obtido no presente trabalho, a partir de Laurencia
dendroidea da população da Praia Azeda em Búzios- RJ, revelou a presença do enantiômero
(+)-elatol com []D= +83,77 (MeOH; c 0.26) semelhante ao descrito na literatura por
Vairappan e colaboradores, 2003 com []D= +75,30 (MeOH; c 0.40) .
94
Enquanto que a amostra de código BIS24-29(1), isolada e caracterizada previamente
pelo Grupo de Produtos Naturais de Organismos Aquáticos (GPNOA) a partir de Laurencia
dendroidea da população de Biscaia em Angra dos Reis-RJ e cedida para os testes de inibição
enzimática com AChE apresentou []D= -81,26 (MeOH; c 0.081), revelando tratar-se então
do enantiômero (-)-elatol.
5.4 Proposição de derivados do elatol
As séries de derivados do elatol foram planejadas a partir da adição de 19
substituintes, divididos entre aminas cíclicas, alifáticas e arilaminas substituídas ou não, em
substituição à hidroxila (Figuras 48, 49).
Figura 48: Série de derivados do elatol planejados pela adição de grupos farmacofóricos.
95
Derivados alifáticos
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NHCH3
Tz 01 (22)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
CH3
Tz 02 (23)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
CH3
Tz 19 (24)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
CH3CH3
Tz 03 (25)
Derivados cíclicos
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
N
Tz 04 (26)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
N
NH
Tz 05 (27)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
N
N
CH3
Tz 06 (28)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
N
O
Tz 07 (29)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
N
S
Tz 08 (30)
Derivados anilínicos
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
Tz 09 (31)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
Br
Tz 10 (32)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
Br
Tz 11 (33)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
Br
Tz 12 (34)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
Cl
Tz 13 (35)
96
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
Cl
Tz 14 (36)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
Cl
Tz 15 (37)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
F
Tz 16 (38)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
F
Tz 17 (39)
CH3
Br
CH3 CH2
Cl
CH3
NH
F
Tz 18 (40)
Figura 49: Visão geral dos derivados obtidos través das substituições realizadas na estrutura do elatol.
É importante destacar que todos os estudos foram realizados considerando-se o
estado protonado e não protonado de cada derivado, além da variação estereoquímica
totalizando, dessa forma, 84 estruturas a serem avaliadas in silico quanto à possíveis
interações com a AChE, por docking molecular e análise das propriedades ADME-T.
O estado protonado recebeu a adição da letra “A” à sua nomenclatura e o estado não
protonado recebeu a adição da letra “B” à sua nomenclatura. As letras “R” e “S” foram
também acrescidas à nomenclatura conforme a configuração do átomo de carbono número 9
de cada derivado.
Da mesma forma que no item 5.1.1, foi feito um estudo comparativo da área e
volume molar entre os ligantes co-cristalizados com as enzimas AChE humanas obtidas no
PDB e os derivados de elatol planejados. Os resultados deste estudo comparativo mantêm o
modelo 4EY7 como o mais adequado para a análise dos possíveis modos de ligação por meio
de docking molecular dos derivados planejados a partir do elatol (Tabela 14; Figura 50).
97
Tabela 11: Área e Volume molar dos derivados de elatol.
Candidato a
inibidor
Fórmula
Molecular
Estereoquímica
do carbono 9
Área (Å2) Volume Molar(Å
3)
Aminas Alifáticas
Tza01 C16H26BrClN R 314,57 314,01
S 310,54 313,76
Tzb01 C16H25BrClN R 313,33 311,58
S 310,29 311,28
Tza02 C17H28BrClN R 335,42 332,73
S 331,51 332,50
Tzb02 C17H27BrClN R 334,08 330,30
S 331,43 330,04
Tza19 C18H30BrClN
R 355,46 351,05
S 351,55 350,82
Tzb19 C18H30BrClN
R 353,87 348,74
S 351,47 348,36
Tza03 C18H30BrClN R 349,97 350,32
S 345,91 350,13
Tzb03 C18H29BrClN R 349,49 348,11
S 346,47 347,84
Aminas Cíclicas
Tza04 C20H32BrClN R 365,10 374,63
S 356,01 373,24
Tzb04 C20H31BrClN R 365,16 372,62
S 357,49 371,21
Tza05 C19H31BrClN2 R 364,70 370,02
S 356,76 368,42
Tzb05 C19H30BrClN2 R 361,33 369,16
S 352,15 367,82
Tzc05 C19H31BrClN2 R 361,08 367,11
S 353,24 365,73
Tzd05 C19H32BrClN2 R 364,82 371,87
S 355,46 370,40
Tza06 C20H33BrClN2 R 381,53 388,73
S 372,38 387,41
98
Tzb06 C20H32BrClN2 R 384,25 389,54
S 376,38 387,98
Tzc06 C20H33BrClN2 R 381,38 386,64
S 373,57 385,20
Tzd06 C20H34BrClN2 R 384,48 391,46
S 375,13 390,00
Tzb07 C19H29BrClNO R 357,42 364,07
S 349,59 362,65
Tza07 C19H30BrClNO R 357,47 366,06
S 348,31 364,75
Tza08 C19H30BrClNS R 364,64 374,51
S 355,70 373,04
Tzb08 C19H29BrClNS R 365,68 372,80
S 358,11 371,23
Arilaminas
Tzb09 C21H27BrClN R 385,66 383,52
S 373,40 377,05
Tza09 C21H28BrClN R 375,59 379,81
S 371,53 379,51
Arilaminas substituídas
Tzb10 C21H26Br2ClN R 385,32 394,07
S 390,44 394,61
Tza10 C21H27Br2ClN R 384,04 396,15
S 384,82 396,88
Tzb11 C21H26Br2ClN R 390,51 394,68
S 390,14 394,38
Tza11 C21H27Br2ClN R 390,76 396,9
S 391,33 397,36
Tzb12 C21H26Br2ClN R 390,27 394,37
S 390,31 394,38
Tza12 C21H27Br2ClN R 390,79 396,89
S 391,35 397,35
Tzb13 C21H26BrCl2N R 382,53 389,92
S 386,34 390,10
Tza13 C21H27BrCl2N R 384,5 392,20
S 384,28 392,34
99
Tzb14 C21H26BrCl2N R 383,95 389,71
S 388,52 390,34
Tza14 C21H27BrCl2N R 390,62 393,03
S 386,45 392,70
Tzb15 C21H26BrCl2N R 385,42 389,79
S 388,65 390,34
Tza15 C21H27BrCl2N R 385,96 392,24
S 386,49 392,70
Tzb16 C21H26BrClFN R 373,82 381,43
S 384,38 385,91
Tza16 C21H27BrClFN R 376,78 384,04
S 375,88 384,56
Tzb17 C21H26BrClFN R 376,39 381,38
S 383,71 385,70
Tza17 C21H27BrClFN R 377,02 383,92
S 377,41 384,36
Tzb18 C21H26BrClFN R 376,25 381,39
S 379,50 381,96
Tza18 C21H27BrClFN R 376,97 383,92
S 377,50 384,37
Figura 50: Área e volume molar dos inibidores e média da área e volume molar das classes de candidatos a
inibidores de AChE derivados do Elatol.
0
100
200
300
400
500
600
Áre
a e
Volu
me
Mola
r
Ligantes
Área (Å2)
Volume (Å3)
100
A partir do gráfico acima é fácil perceber que a estrutura de código 4EY7 é aquela co-
cristalizada com o ligante que mais se assemelha, em termos de área e volume molar ocupado,
aos ligantes planejados a partir do elatol, corroborando a decisão de utilizá-la nos estudos de
docking molecular.
5.5 Cálculo Teórico da Capacidade de Permeação da Barreira
Hematoencefálica
A aplicação do modelo preditivo para permeação da BHE proposto por Clark, mostrou
infrações de até 2 das regras propostas (CLARK, 2003) (Tabela 15).
Tabela 12: Parâmetros para predição da permeação através da BHE propostos por Clark.
Candidato a Inibidor CLogP LogD
(1-3)
(N+O)
≤ 5
CLogP - (N+O)
> 0
ASP ≤ 80 (A2) MM
< 450 R S
elatol 3,28 3,85* 1 2,28 18,94 17,68 333,69
Tza01 1,13 2,17 1 0,13 14,34 10,98 347,74
Tzb01 4,36 2,17 1 3,36 11,59 9,27 346,73
Tza02 1,50 2,50 1 0,50 14,10 10,77 361,77
Tzb02 4,72 2,50 1 3,72 11,28 8,74 360,76
Tza19 2,05 2,90 1 1,05 14,11 10,77 375.79
Tzb19 5,28 2,90 1 4,28 10,93 8,75 374.79
Tza03 1,93 2,88 1 0,93 13,75 10,47 375,79
Tzb03 5,16 2,88 1 4,16 11,14 8,55 374,79
Tza04 2,13 3,64 1 1,13 5,88 5,85 401,83
Tzb04 5,53 3,64 1 4,53 1,65 1,34 400,82
Tza05 1,00 2,41 2 -1,00 18,87 18,49 402,82
Tzb05 4,22 2,41 2 2,22 18,27 18,24 401,81
Tzc05 0,82 2,41 2 -1,18 14,27 14,01 402,82
Tzd05 -2,41 2,41 2 -4,41 23,65 23,53 403,83
Tza06 1,1 3,52 2 -0,9 8,28 8,24 416,85
Tzb06 4,51 3,52 2 2,51 8,76 8,37 416,84
Tzc06 1,1 3,52 2 -0,9 4,17 3,84 416,85
Tzd06 - 2,30 3,52 2 -4,30 13,51 13,38 417,85
Tza07 1,13 4,33 2 -0,87 13,71 13,66 403,80
Tzb07 4,53 4,33 2 2,53 9,47 9,20 402,80
101
Tza08 1,63 3,98 1 0,63 5,84 5,81 419,87
Tzb08 5,04 3,98 1 4,04 1,59 1,18 418,86
Tza09 3,84 5,83 1 2,84 13,95 10,72 409,81
Tzb09 5,53 5,83 1 4,53 10,36 8,43 408,80
Tza10 4,62 6,61 1 3,62 13,74 9,79 488,71
Tzb10 6,61 6,61 1 5,61 9,40 7,01 487,70
Tza11 4,62 6,61 1 3,62 14,40 10,70 488,71
Tzb11 6,61 6,61 1 5,61 11,36 8,31 487,70
Tza12 4,62 6,61 1 3,62 14,41 10,71 488,71
Tzb12 6,61 6,61 1 5,61 10,55 8,27 487,70
Candidato a Inibidor CLogP LogD
(1-3)
(N+O)
≤ 5
CLogP - (N+O)
> 0
ASP ≤ 80 (A2) MM
< 450 R S
Tza13 4,47 6,46 1 3,47 13,08 9,32 444,26
Tzb13 6,46 6,46 1 5,46 10,53 7,26 443,25
Tza14 4,47 6,46 1 3,47 13,94 10,70 444,26
Tzb14 6,46 6,46 1 5,46 10,63 8,37 443,25
Tza15 4,47 6,46 1 3,47 14,40 10,69 444,26
Tzb15 6,46 6,46 1 5,46 10,59 8,37 443,25
Tza16 3,96 5,95 1 2,96 13,96 10,11 427,80
Tzb16 5,95 5,95 1 4,95 10,74 7,59 426,79
Tza17 3,96 5,95 1 2,96 14,36 10,66 427,80
Tzb17 5,95 5,95 1 4,95 10,54 7,84 426,79
Tza18 3,96 5,95 1 2,96 14,39 10,66 427,80
Tzb18 5,95 5,95 1 4,95 10,62 8,41 426,79
*Em vermelho = valores que infringem as regras de Clark, 2003.
Submetendo alguns dos fármacos de terceira geração utilizados no tratamento da DA
às mesmas regras de Clark, observamos que os mesmos também infringem ao menos uma das
regras propostas. Porém, sabe-se que tais fármacos são capazes de permear a BHE uma vez
que têm seu alvo, a enzima AChE, no sistema nervoso central (Tabela 16).
102
Tabela 13: Fármacos usados no tratamento da DA submetidos aos parâmetros para predição
da permeação através da BHE propostos por Clark, 2003.
Fármaco CLogP LogD
(1-3)
CLogP - (N+O)
> 0
(N+O)
≤ 5 ASP ≤ 80 (A
2)
MM
< 450
Donepezila 1,05 2,96 - 2,95 4 35,67 380,51
Galantamina -2,40 - 0,52 -6,4 4 38,87 288,37
*Em vermelho = valores que infringem as regras de Clark, 2003.
Dessa forma, devemos atentar para o fato de que os conjuntos de dados disponíveis
para predição de permeabilidade da BHE são limitados e vêm a partir de uma variedade de
fontes que podem não ser suficientes para fins de modelagem dos parâmetros relacionados
(KUMAR et al., 2013). Vale lembrar também que o modelo possui uma precisão maior para
predição de moléculas + SNC do para moléculas –SNC (CLARK, 2003).
Segundo o pkCSM todos os candidatos a fármacos têm o logBB ≥ 0,3 e teriam,
portanto, uma boa permeação através da BHE. Já os fármacos Donepezila e Galantamina,
com valores inferiores a 0,3 e superiores a -1, teriam uma permeabilidade intermediária
(Tebela 17).
103
Tabela 14: Predição de permeação através da BHE pelo pkCSM.
Inibidores/
Candidatos AChEi Log BB ≥ 0,3
Inibidores/
Candidatos AChEi Log BB ≥ 0,3
elatol 0,189 Tza10 0,571
Tza01 0,585 Tzb10 0,539
Tzb01 0,571 Tza11 0,571
Tza02 0,615 Tzb11 0,539
Tzb02 0,601 Tza12 0,571
Tza19 0,649 Tzb12 0,539
Tzb19 0,635 Tza13 0,574
Tza03 0,619 Tzb13 0,542
Tzb03 0,605 Tza14 0,574
Tza04 0,812 Tzb14 0,542
Tzb04 0,703 Tza15 0,574
Tza05 0,41 Tzb15 0,542
Tzb05 0,734 Tza16 0,602
Tza06 0,883 Tzb16 0,57
Tzb06 0,774 Tza17 0,602
Tza07 0,736 Tzb17 0,57
Tzb07 0,628 Tza18 0,602
Tza08 0,847 Tzb18 0,57
Tzb08 0,739 Donepezila 0,218
Tza09 0,61 Galantamina 0,26
Tzb09 0,579
É importante considerar que todos os modelos construídos até agora se baseiam na
suposição de que a maioria dos fármacos é transportado através de difusão passiva. Assim,
para maior eficácia, os modelos de permeação no cérebro terão de explicar o papel dos
sistemas de transporte e de efluxo ativo, à medida que mais dados sobre estes se tornem
disponíveis (WANG et al., 2015).
Dessa forma, nenhum dos ligantes foi descartado do estudo por todos apresentarem
potencial para permear a barreira hematoencefálica.
104
5.6 Regra dos 5 de Lipinski
De acordo com o servidor utilizado, todas as moléculas possuem uma boa
biodisponibilidade oral teórica, segundo a regra dos 5 de Lipinski, uma vez que não violaram
mais que 1 das regras propostas (tabela 18).
Tabela 15: Parâmetros associados à regra dos 5 de Lipinski calculados a partir da plataforma
molinspiration.
Candidatos
AchEi
PM
≤500
miLogP
≤ 5
Aceptores de ligação
de hidrogênio
≤ 10
Doadores de ligação
de hidrogênio ≤ 5
Violações à
regra
elatol 333.70 4.41 1 1 0
Tza01 347.75 1.81 1 2 0
Tzb01 346,74 4,83 1 1 0
Tza02 361.77 2.19 1 2 0
Tzb02 360,77 5,2 1 1 1
Tza19 375,79 2,69 1 2 0
Tzb19 374,79 5,71 1 1 1
Tza03 375.80 2.55 1 2 0
Tzb03 374,79 5,5 1 1 1
Tza04 401.84 2.82 1 1 0
Tzb04 400,83 5,98 1 0 1
Tza05 402.83 1.70 2 2 0
Tzb05 401,82 4,37 2 1 0
Tzc05 402,83 1,21 2 2 0
Tzd05 403,84 1,41 2 3 0
Tza06 416.86 1.80 2 1 0
Tzb06 415,85 4,96 2 0 0
Tzd06 417,86 1,51 2 2 0
Tza07 402.80 4.92 2 0 0
Tzb07 403,81 1,76 2 1 0
Tza08 419.88 2.30 1 1 0
Tzb08 418,87 5,46 1 0 1
Tza09 408.81 7.19 1 1 1
Tzb09 409,82 3,51 1 2 0
105
Tza10 487.71 7.95 1 1 1
Tzb10 488,71 4,27 1 2 0
Tza11 487.71 7.98 1 1 1
Tzb11 488,71 4,29 1 2 0
Tza12 487.71 8.00 1 1 1
Tzb12 488,71 4,32 1 2 0
Tza13 443.26 7.82 1 1 1
Tzb13 444,26 4,14 1 2 0
Tza14 443.26 7.82 1 1 1
Tzb14 444,26 4,16 1 2 0
Tza15 443.26 7.87 1 1 1
Tzb15 444,26 4,19 1 2 0
Tza16 426.80 7.31 1 1 1
Tzb16 427,81 3,62 1 2 0
Tza17 426.80 7.33 1 1 1
Tzb17 427,81 3,65 1 2 0
Tza18 426.80 7.35 1 1 1
Tzb18 427,81 6,68 1 2 0
5.7 Predição da Toxicidade in Silico
São considerados de grande importância para avaliação sobre a resposta tóxica,
estudos sobre a mutagenicidade e carcinogenicidade, hepatotoxicidade e a cardiotoxicidade.
Para a predição da toxicidade dos ligantes planejados a utilizou-se novamente o servidor
online pkCSM. No quadro 3 podemos visualizar a resposta tóxica teórica com base nos
potenciais riscos citados. Além disso, encontram-se também os resultados da predição de
resposta tóxica com base em alertas estruturais calculados com o FAF-Drugs 4.
Quadro 4: Predição de toxicidade pkCSM e FAF-Drugs 4
Candidatos AchEi Teste AMES Inibidor de hERG
Hepatotoxicidade Alertas estruturais
I II
elatol negativo não não negativo Intermediário
Tza01 negativo não não negativo Intermediário
Tzb01 negativo não não negativo Intermediário
Tza02 negativo não não negativo Intermediário
106
Tzb02 negativo não não negativo Intermediário
Tza19 negativo não não negativo Intermediário
Tzb19 negativo não não negativo Intermediário
Tza03 negativo não não negativo Intermediário
Tzb03 negativo não não negativo Intermediário
Tza04 negativo não não negativo Intermediário
Tzb04 negativo não não positivo Intermediário
Tza05 negativo não não positivo Intermediário
Tzb05 negativo não não positivo Intermediário
Tza06 negativo não não positivo Intermediário
Tzb06 negativo não não positivo Intermediário
Tza07 negativo não não positivo Intermediário
Tzb07 negativo não não negativo Intermediário
Tza08 negativo não não negativo Intermediário
Tzb08 negativo não não negativo Intermediário
Tza09 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb09 negativo não não negativo Intermediário
Tza10 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb10 negativo não não negativo Intermediário
Tza11 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb11 negativo não não negativo Intermediário
Tza12 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb12 negativo não não negativo Intermediário
Tza13 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb13 negativo não não negativo Intermediário
Tza14 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb14 negativo não não negativo Intermediário
Tza15 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb15 negativo não não negativo Intermediário
Tza16 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb16 negativo não não negativo Intermediário
Tza17 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb17 negativo não não negativo Intermediário
Tza18 negativo não sim negativo Intermediário
Tzb18 negativo não não negativo Intermediário
107
De acordo com o pkCSM, os derivados piperidínicos não protonados (Tzb 04 R e Tzb
04 S), apresentaram um resultado positivo para o teste de hepatotoxicidade. Como em pH
fisiológico a concentração do derivado piperidínico não protonado é próxima de 1%,
conforme veremos no item 5.6.1.2, decidiu-se por prosseguir os estudos mantendo os
derivados Tza 04 R e Tza 04 S, em nossa biblioteca de candidatos a inibidores.
Já os derivados piperazínicos (Tza 05 R, Tza 05 S, Tzb 05 R, Tzb 05 S, Tza 06 R, Tza
06 S, Tzb 06 R e Tzb 06 S) são considerados hapatotóxicos, independentemente do estado de
protonação. O derivado morfolínico (Tza 07 R e S), apesar de ter sido considerado
hepatotóxico apenas na sua versão protonada, esta representa 36% da sua concentração em pH
fisiológico.
Dentre os derivados anilínicos, todos os protonados foram considerados inibidores de
hERG II. Conforme veremos adiante no item 5.6.1.3, anilinas protonadas têm uma
concentração próxima de zero em pH fisiológico e por este motivo decidiu-se manter os
derivados anilínicos no estudo.
Ao submeter os candidatos a inibidores a análise no FAF-Drugs 4, a classificação
baseada em alertas estruturais considera os ligantes da nossa biblioteca como intermediários.
Em concordância com a orientação dos desenvolvedores dessa ferramenta, decidiu-se por fim
prosseguir os estudos com todos os ligantes propostos, incluindo os derivados piperazínicos e
morfolínicos. E, de acordo com os resultados de docking molecular, propor, caso mostrem
relevância, modificações estruturais de forma a otimizar suas características druglikeness.
5.8 Estudos de Docking Molecular dos Derivados do elatol
Uma análise preliminar dos resultados de docking molecular entre a AChE humana, o
seu substrato, fármacos usados no tratamento da DA, o elatol e seus derivados propostos,
mostra que os valores de score continuam sendo maiores para a Donepezila, porém o valor de
score da Galantamina encontra-se entre os valores obtidos para o elatol e seus derivados da
classe das aminas alifáticas. Observamos também um score maior quando comparamos o
elatol e o neurotransmissor acetilcolina e ainda um score crescente conforme variamos a
classe dos substituintes da hidroxila do elatol, sugerindo que melhores resultados podem ser
encontrados quando o substituinte for uma arilamina substituída (Figura 51).
108
Figura 51: Média dos scores com a função CHEMPLP para a Acetilcolina, Elatol e as classes de candidatos a
inibidores de Acetilcolinesterase propostos.
A avaliação do docking molecular mostra, como era esperado, que a substituição da
hidroxila por diferentes aminas eleva não só os valores de scores, como também eleva e
diversifica os tipos de interações observadas.
Para derivados alifáticos e cíclicos, foi predominante o aparecimento de interações
cátion-pi com o resíduo Trp86 e interações do tipo carga atrativa com o resíduo Glu202, até
mesmo devido ao estado de protonação predominante nessas classes como será visto adiante.
Muitos ligantes estabeleceram também fracas ligações de hidrogênio com a His447 ou
Glu202.
Já dentre os derivados anilínicos foram predominantes as interações do tipo
empilhamento pi com o resíduo de aminoácido Trp86 e para os derivados anilínicos
substituídos em orto observou-se também ligações de halogênio com o resíduo Glu202.
A seguir, um estudo detalhado entre os ligantes e a enzima mostra as possíveis
interações que podem estar contribuindo para os valores de afinidade teórica (representados
pelos valores de score) observados. Dessa forma, o modo de interação de cada classe gerada
por diferentes padrões de substituição será analisado separadamente.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 S
core
Ligantes
109
5.8.1 Derivados alifáticos
Dentre os derivados pertencentes ao grupo das aminas alifáticas, de acordo com o
programa Marvin view, é predominante a concentração da espécie protonada em pH
fisiológico, sendo a concentração da espécie não protonada inferior a 1% em todos os casos.
Dessa forma, neste grupo, analisaremos abaixo as interações entre a enzima e o ligante na sua
versão protonada.
Neste grupo, o derivado Tza19 R se destaca com um score mais elevado e também
com as interações mais interessantes quando realizamos a inspeção visual das soluções do
docking (Figura 52; Quadro 4).
Figura 52: Scores com a função CHEMPLP para as aminas alifáticas candidatas a inibidores de AChE.
56
58
60
62
64
66
68
70
72
74
76
Tza19 R Tza03 S Tza19 S Tza03 R Tza02 R Tza02 S Tza01 R Tza01 S
Sco
re
Derivados
110
Quadro 5: Interações observadas entre ligantes e resíduos de aminoácidos da AChE.
Derivados
Interações entre Ligantes e AChE Interações com resíduos da
tríade catalítica
Fraca lig. de
Hidrogênio pi-
alquil pi-
sigma Cátion-
pi carga
atrativa
Van
der
Waals Resíduo Interação
Tza01 R 1 14 2 1 5 HIS447 Pi-Alquil
HIS447 fraca ligação de H
Tza01 S 14 2 5 HIS447 Pi-Alquil
Tza02 R 1 15 2 1 4 HIS447 Pi-Alquil
HIS447 fraca ligação de H
Tza02 S 13 1 1 6 HIS447 Pi-Alquil
Tza03 R 11 2 1 5 HIS447 Pi-Alquil
Tza03 S 13 1 2 6 HIS447 Pi-Alquil
Tza19 R 1 16 2 1 5 HIS447 fraca ligação de H
HIS447 Pi-Alquil
Tza19 S 15 1 Não realiza
O Derivado Tza 19 R apresenta duas interações com um resíduo da tríade catalítica da
enzima: uma fraca ligação de hidrogênio com o átomo de oxigênio de HIS447 e uma
interação do tipo pi-alquil com HIS447 através do seu átomo de bromo. Além disso, o seu
átomo de nitrogênio protonado realiza duas interações cátion-pi com TRP86 e uma interação
carga-atrativa com GLU202, ambos pertencentes ao CAS. O derivado realiza ainda outras
interações do tipo pi-alquil com resíduos do CAS e também do PAS (Figura 53).
111
Figura 53: Melhor pose do derivado Tza 19_R e interações no sítio da AChE.
5.8.2 Derivados cíclicos
Os efeitos do estado de protonação em pH fisiológico para cada derivado pertencente
ao grupo das aminas cíclicas também foram estudados com o programa Marvin view. No
caso da piperidina (derivados Tz 04 R e S) é predominante a concentração da espécie
protonada, sendo a concentração da espécie não protonada em torno de 1%. Os derivados
formados pela adição do anel piperazínico em substituição à hidroxila (derivados Tz 05 R e S)
apresentaram, predominantemente, em pH fisiológico, apenas o átomo de nitrogênio
periférico da piperazina protonado, semelhantemente ao derivado piperidínico.
Os derivados formados pela adição de metil piperazina (derivados Tz 06 R e S)
apresentaram, predominantemente, em pH fisiológico, o átomo de nitrogênio ligado à metila
protonado e o átomo de nitrogênio periférico na sua forma neutra.
Para a morfolina (derivado Tz 07 R e S) o átomo de nitrogênio encontra-se,
predominantemente, na sua forma não protonada, enquanto que para a tiomorfolina (derivado
Tz 08 R e S) o mesmo apresenta-se sob sua forma protonada.
112
A Figura 54 mostra os valores de score referentes ao estudo dos derivados de acordo
com o estado de protonação predominante predito em pH fisiológico. Ademais, as principais
interações atômicas observadas estão descritas no quadro 5.
Dentro do grupo das aminas cíclicas o derivado TZa05 S apresentou um score mais
elevado e as interações mais interessantes foram observadas tanto para o derivado TZa 05 R
quanto para TZa 05 S.
Figura 54: Scores com a função CHEMPLP para as aminas cíclicas candidatas a inibidores de
Acetilcolinesterase.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tza05 S Tzb07 S Tza04 S Tza08 S Tza06 S Tza04 R Tza05 R Tza08 R Tza06 R Tzb07 R
Sco
re
Derivados
113
Quadro 6: Interações observadas entre ligantes e resíduos de aminoácidos de AChE.
Derivados
Interações entre Ligantes e AChE Interações com resíduos da tríade
catalítica
ponte
salina fraca lig. de
hidrogênio pi-enxofre pi-alquil pi-sigma cátion-pi carga atrativa Van der Waals Resíduos envolvidos Interação
Tza04 R 12 2 6 HIS447 Pi-Alquil
HIS447 Pi-Alquil
Tza04 S
14 2 6 HIS447 Pi-Alquil
Tza05 R 1 1 9 1 5 HIS447 Pi-Alquil
Tza05 S
1 14 2 1 5 HIS447 Fraca ligação de H
HIS447 Pi-Alquil
Tza06 R
1 10 1 5 Não Realiza
Tza06 S
2 13 5 HIS447 Pi-Alquil
Tza07 R 2 14 1 5 HIS447 Fraca ligação de H
HIS447 Pi-Alquil
HIS447 Pi-Alquil
Tza07 S
1 18 6 HIS447 fraca ligação de H
HIS447 Pi-Alquil
HIS447 Pi-Alquil
Tza08 R 12 1 2 6 HIS447 Pi-Alquil
Tza08 S 1 12 2 6 HIS447 Pi-Alquil
114
O derivado Tza 05 S apresenta duas interações com HIS 447: uma fraca ligação de
hidrogênio e uma pi-alquil. Além disso, esse derivado faz uma interação do tipo carga atrativa
com GLU202 e duas interações cátion pi com TRP86, além de manter interações do tipo pi-
alquil com outros resíduos do PAS e CAS (Figura 55).
Na análise do derivado Tza 05 R, foram observadas uma interação cátion pi com
TRP 86 e uma fraca ligação de hidrogênio com HIS447. Porém, este derivado realiza uma
ponte salina com GLU202, que é uma combinação de duas interações: ligação de hidrogênio e
interações de carga atrativa. Conforme os demais derivados, também mantém interações do
tipo pi-alquil com outros resíduos do PAS e CAS (Figura 56).
Figura 55: Melhor pose do derivado Tza 05 R e interações no sítio da AChE.
115
Figura 56: Melhor pose do derivado Tza 05 S e interações no sítio da AChE.
5.8.3Derivados anilínicos
O próximo grupo a ser analisado compreende substituições da hidroxila por um anel
anilínico e anéis anilínicos substituídos por átomos de bromo, cloro e flúor nas posições orto,
meta e para. O anel anilínico costuma ser estabilizado por ressonância devido ao
deslocamento do par de elétrons livre do nitrogênio. Na anilina protonada não mais haverá par
de elétrons livres no átomo de nitrogênio e, desta forma, não será possível a estabilização por
ressonância. Em concordância com isso e, de acordo com a predição do programa Marvin
view, é predominante a concentração da espécie não protonada em pH fisiológico, sendo a
concentração da espécie protonada próxima a 0% para todos os casos. Dessa forma, neste
grupo, analisaremos abaixo as interações entre a enzima e o ligante na sua versão não
protonada.
Dentro desta classe destacaram-se os ligantes Tzb 10 S, Tzb13 R e Tzb16 R com
interações mais diversificadas que os demais, sendo o derivado Tz13 S aquele que apresentou
o maior valor de score (Figura 57). As interações atômicas predominantes observadas neste
estudo estão destacadas no quadro 6.
116
Figura 57: Scores com a função CHEMPLP para as arilaminas e arilaminas substituídas candidatas a inibidores
de AChE.
70
72
74
76
78
80
82
84
86
Score
Derivados
117
Quadro 7: Interações observadas entre ligantes e AChE
Derivados
Interações entre Ligantes e AchE Interações com resíduos da tríade catalítica
fraca lig. de hidrogênio
ligação de halogênio
pi-sigma pi-alquil Empilhamento pi Van der Waals Resíduo e átomos envolvidos Interação
Tzb09 R 1 11 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil Tzb09 S 11 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil Tzb10 R 11 2 7 Não Realiza
TZb10 S 1 16 2 5
HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
HIS447 - Ligante:Br51 Pi-Alquil
TZb11 R 16 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
TZb11 S 17 2 5 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb12 R 14 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb12 S 15 2 5 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb13 R 1 14 2 5 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb13 S 1
16 2 6
HIS447:HD2 - Ligante:Cl50 Fraca ligação de H
HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
HIS447 - Ligante:Cl50 Pi-Alquil
Tzb14 R 17 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb14 S 15 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb15 R 15 2 7 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb15 S 12 2 7 Não Realiza
Tzb16 R 2 13 2 5 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb16 S 1 10 2 5 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb17 R 13 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb17 S 13 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb18 R 13 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
Tzb18 S 14 2 6 HIS447 - Ligante:Br34 Pi-Alquil
118
Todos os ligantes da classe anilínica, com substituintes ou não, diferentemente das
classes anteriores, apresentaram interações do tipo empilhamento-pi entre o anel anilínico e o
resíduo de aminoácido TRP86 (Figuras 58-62). Essas interações são consideradas fortes
(ZHOU et al., 2012) e podem ter uma maior magnitude quando substituintes são adicionados
ao anel (SINNOKROT e SHERRILL, 2004). A atratividade dessas interações é aumentada
quando os átomos de hidrogênio do anel tornam-se mais ácidos, o que segundo Bissantz e
colaboradores, ocorre quando introduzimos substituintes fortemente eletrofílicos nas posições
orto ou para (BISSANTZ et al., 2010). Os substituintes eletroretiradores devem reduzir a
carga pi-negativa da nuvem eletrônica acima do centro do anel e levar à diminuição da
repulsão eletrostática e, consequentemente, a maior atração por outros sistemas pi
(SINNOKROT e SHERRILL, 2004).
Além das interações por empilhamento –pi, os derivados Tzb 10 S, Tzb 13 R e Tzb16
R, ambos com o anel anilínico substituído na posição orto por átomos de Bromo, Cloro e
Flúor, respectivamente, destacaram-se realizando ligações de halogênio com o resíduo de
aminoácido GLU202. O conceito de ligação de halogênio contribui para a especificidade no
reconhecimento de uma grande classe de compostos halogenados. Trata-se de um tipo de
interação eletrostática, decorrente da formação de uma região eletropositiva na superfície do
átomo de halogênio, que servirá como um ácido de Lewis atraindo uma variedade de bases de
Lewis. É considerado um tipo de interação forte, de modo análogo a uma ligação de
hidrogênio (ZHOU et al., 2012; SCHOLFIELD et al.; 2013).
A introdução de átomos de halogênio em compostos líder pode modular propriedades
farmacocinéticas e é uma estratégia de otimização desses compostos, influenciando a
permeabilidade através de membranas e a distribuição nos tecidos (MATTER et al.; 2009).
Derivados de Donepezila, por exemplo, contendo átomos de flúor como substituinte do
sistema indol já foram sintetizados e testados (ANAND e SINGH, 2013).
Tem sido demonstrado experimentalmente que os átomos de cloro e bromo em
compostos orgânicos podem contribuir favoravelmente para a afinidade de ligação no
reconhecimento molecular. Já átomos de flúor em moléculas orgânicas têm sido investigados
devido aos seus efeitos no ganho de afinidade nas interações proteína-ligante em bolsas
hidrofóbicas (BISSANTZ et al, 2010). Porém, ainda é muito pouco conhecida a natureza
dessas interações com resíduos aromáticos de áreas hidrofóbicas de proteínas e a sua
contribuição para as afinidades de ligação (MATTER et al.; 2009).
Os derivados propostos Tzb 10 S, Tzb 13 R e Tzb16 R também apresentaram
interações com o resíduo HIS447 da tríade catalítica e variadas interações de caráter
119
hidrofóbico do tipo pi-alquil com diversos resíduos do CAS e PAS. Tzb 13 S e Tzb16 S
apresentaram essas mesmas interações, porém, ao invés das ligações de halogênio,
apresentam fracas ligações de hidrogênio. Dentre estes, podemos destacar Tzb13 S, que
realiza três interações com HIS447, sendo uma delas uma fraca ligação de hidrogênio.
Finalmente, o derivado Tzb16 S destaca-se por ser o único ligante a interagir com GLY121,
resíduo de aminoácido pertencente ao sítio oxianiônico.
Figura 58: Melhor pose do derivado Tzb 13 R e interações no sítio da AChE.
120
Figura 59: Melhor pose do derivado Tzb 13 S e interações no sítio da AChE.
Figura 60: Melhor pose do derivado Tzb 16 R e interações no sítio da AChE.
121
Figura 61: Melhor pose do derivado Tzb 16 S e interações no sítio da AChE.
Figura 62: Melhor pose do derivado Tzb 10 S e interações no sítio da AChE.
122
6. CONCLUSÃO
Dentre os metabólitos secundários de Laurencia sp. estudados, o elatol apresentou
maior potencial de inibição da AChE segundo a avaliação in silico por meio do docking
molecular e segundo a avaliação da atividade enzimática por meio do teste
espectrofotométrico de Ellman.
Estudos de rotação específica do elatol revelaram que o metabólito obtido no
presente trabalho a partir de Laurencia dendroidea da população da praia Azeda, localizada
em Búzios-RJ, tratava-se do enantiômero (+)-elatol e o metabólito cedido para os testes
enzimáticos proveniente da população de Biscaia localizada no município de Angra dos Reis-
RJ, tratava-se do enantiômero (-)-elatol. Uma avaliação preliminar da atividade enzimática
por meio do teste espectrofotométrico de Ellman para o (+)-elatol sugeriu que este
enantiômero não teria atividade inibitória em AChE.
Foram sugeridos então, 84 AChEi derivados da molécula de elatol. Os melhores
resultados de docking mostraram interações relevantes, como carga-atrativa, cátion-pi, pontes
salinas, empilhamento pi e ligações de halogênio, além de interações pi-alquil com diversos
resíduos pertencentes ao CAS e PAS, sugerindo que as estruturas planejadas a partir do elatol
poderiam representar novos inibidores duais da AChE, mais potentes que o metabólito de
origem.
O estudo teórico também indicou que todos os candidatos a AChEi possuem boa
permeação através da BHE e outras propriedades ADME-T favoráveis.
Dessa forma, sugerimos a síntese de um derivado de cada classe proposta, de maneira
a explorar o potencial das interações que foram características de cada grupo.
Sugere-se então a síntese do derivado Tza 19 R, representante da classe das aminas
alifáticas, que apresentou interações carga-atrativa com GLU202, cátion-pi com TRP86 e
fraca ligação de hidrogênio com HIS447. Tza 05 S, representante da classe das aminas
cíclicas, realizando duas interações com HIS447: uma fraca ligação de hidrogênio e uma pi
alquil, além de uma ligação carga atrativa com GLU202 e duas interações cátion-pi com
TRP86. Finalmente, sugere-se Tzb 10 S, da classe dos derivados anilínicos, por ter
apresentado potenciais interações por empilhamento-pi com TRP86 e ligações de halogênio
com GLU202.
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