Guarapuava, 18 agosto de 2011

CARACTERIZAÇÃO FÍSICA, QUÍMICA E

BIOLÓGICA DE NOVOS

FOTOSSENSIBILIZADORES PARA

UTILIZAÇÃO EM TERAPIA FOTODINÂMICA

Tania Toyomi TominagaDepartamento de FísicaUNICENTRO, Guarapuava, PR

Seminário PET – Física UNICENTRO

Terapia Fotodinâmica (TFD)

Interação simultânea: fotossensibilizador (FS), luz e O2

ORTEL, B.; SHEA, C. R.; CALZAVARA, P. P. Molecular mechanisms of photodynamic therapy, v. 14, p. 4157-4172, 2009

luzFS

estado

fundamental

FSestado

excitado

O2

tecido

radicais

livres, oxigênio

singlete

toxicidade

celular

Terapia Fotodinâmica (TFD)

•O2̄

•OH

transferência

H, elétrons

transferência

energiaOxigênio singlete

morte

celular

Mecanismo Tipo II

Mecanismo Tipo I

FOOTE, C. S. Photochemistry and Photobiology, v. 54, p. 659, 1991

Pacientes tratados com TFD

Terapia Fotodinâmica (TFD)

A degeneração macular (DMR)

A mácula é a região central da retina. Ocorre acúmulo de substâncias nas células da mácula que levam a uma desestruturação dessa região com conseqüente perda da visão. Avisãocentral é comprometida

Tratamento convencional - destrói também a retina adjacente às lesões.

Visudyne - verterporfirina tem o poder de se ligar a moléculas de colesterol e se concentra fortemente nas membranas neovascularessub-retinianas.

TERAPIA FOTODINÂMICA NA OFTALMOLOGIA

PARA MANCHAS DE SOL

ACNE

RUGAS

VERRUGAS

PSORÍASIS

TERAPIA FOTODINÂMICA NA DERMATOLOGIA

INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA DE MICRORGANISMOS

E. coli

C. albicans S. aureus

TERAPIA FOTODINÂMICA NA ODONTOLOGIA

A terapia fotodinâmica antimicrobiana tem sido uma alternativa de na odontologia

PROPRIEDADES DE UM FOTOSSENSIBILIZADOR

Seletividade e alta afinidade por células malignas

Substância com estrutura química definida

Solubilidade e estabilidade em água

Fotossensibilidade não prolongada

Baixa toxicidade

Metabolização rápida

Elevado coeficiente de absorção em l > 600 nm

MOAN, J.; PENG, Q. Photodynamic Therapy. França: European Society for Photobiology, 2003 284 p.

JANELA TERAPÊUTICA (600-800 nm)

Representação esquemática de um corte de tecido humano e o percentual de penetraçãoda luz

SHLIAKHTSIN, S. V.; TRUKHACHOVAA, T. V.; ISAKAUA, H. A.; ISTOMINB, Y. P. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 6, p. 97-104, 2009

FOTOSSENSIBILIZADORES DE PRIMEIRA GERAÇÃO

Derivados de hematoporfirina

NH

N HN

N

R1CH3

R2H3C

CH3H3C

COOR4COOR3

Estrutura monomérica do Photogem

300 400 500 600 700

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ab

sorç

ão

óti

ca

comprimento de onda (nm)

Photofrin®, Photosan® e Photogem

Espectro de absorção ótica PG 15 µg mL-1, em PBS, pH = 7,4

FOTOSSENSIBILIZADORES DE SEGUNDA GERAÇÃO

a) clorinas e bacterioclorinas

b) ftalocianinas e naftalocianinas

300 400 500 600 700 800

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Absorb

ância

comprimento de onda (nm)

Espectro de absorção ótica Zn-tetra-carboxi-ftalocianina15 µg mL-1, em PBS, pH = 7,4

FOTOSSENSIBILIZADORES DE SEGUNDA GERAÇÃO

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

H3C

H3C

O

Hipericum perforatum:popularmente conhecida como Erva de São João

Hipericina

300 400 500 600 700 800

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ab

sorç

ão

óti

ca

comprimento de onda (nm)

Modificações no anel tetrapirrólico Composição química definida Pouca fotossensibilização cutânea

Espectro de absorção óticaHipericina, 15 µg mL-1, em PBS, pH= 7,4

♦ potencial como antiviral, antibactericida, antipsoriático e agente

antitumoral

♦ composto exibe atividade anticancer no escuro, que pode ser

aumentada cerca de 100 vezes na presença da luz

♦ alguns autores sugerem que HY é provavelmente o mais poderoso

fotossensibilizador encontrado na natureza

HIPERICINA

PAPEL DO FÍSICO NA TERAPIA

FOTODINÂMICA

FONTES DE LUZ

Laser

Led

Lâmpadas de Halogênio

Sistema de LED permite a

iluminação de áreas maiores.

Este sistema é comercializado

pela MM-Optics, São Carlos,

SP

Mardoqueu Martins da Costa, físico e autor da pesquisa

O instrumento é fruto de um trabalho conjunto da Escola de Engenharia (EESC) e do Instituto de Física (IFSC).

Fluorescência e luz para detectar alterações no epitélio de pacientes.

DIAGNÓSTICO

TRATAMENTO NA ODONTOLOGIA

A terapia fotodinâmica antimicrobiana tem sido uma alternativa de na odontologia

As nanopartículas como possíveis carregadores de agentes para o aumento da eficácia da terapia fotodinâmica antimicrobiana, ou no aumento dos sinais ópticos de espectroscopia Raman ou FTIR para diagnóstico diferencial de microorganismos, células ou neoplasias

PRODUÇÃO DE NANOPARTÍCULAS

Fotossensibilizadores são introduzidos por via

intravenosa: efeitos colaterais ou causar entupimento das

veias.

Investigações com estruturas presentes no sangue, tais

como a albumina e membranas, subsidia a compreensão da

interações e ação farmacológica.

ESTUDO FEITO POR ABSORÇÃO ÓTICA,

FLUORESCÊNCIA E FOTOACÚSTICA

INTERAÇÃO DOS FOTOSSENSILIZADORES COM PROTEÍNAS

CARACTERIZAÇÃO DOS FS

•AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DOS FS

•DETERMINAÇÃO DE RADICAIS LIVRES - RPE

•TESTES EM CÉLULAS

FOTOXIDAÇÃO DO ÁCIDO ÚRICO

FISCHER, F.; GRASCHEW, G.; SINN, H-J.; MAIER-BORST, W.; LORENZ, W. J.; SCHLAG, P. M. Clinica Chimica Acta, v. 274, p. 89-104, 1998

Espectro de absorçãoIntensidade da banda 292 nm

Irradiação LED 5min sob agitação

200 300 400 500 600 700

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ab

so

rbâ

ncia

(u

.a.)

Comprimento de onda (nm)

235

292

FS 5 µg/ mL + Ácido Úrico 10 µg/mL

Espectro de absorção ótica do ácido úrico em PBS, pH = 7,4

Método indireto determinar rendimento quântico de formação de oxigênio singlete

Ácido úrico supressor de oxigênio singlete dosímetro químico

)(tAE

AF

irrFS

AU

l

0

510

FOTOXIDAÇÃO DO ÁCIDO ÚRICO

300 400 500 600 700 800

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ab

sorb

ân

cia

comprimento de onda (nm)

tempo de irradiação

0

2 min

5 min

8 min

15 min

Eo = 180 J/s

Espectro de absorção ótica do ácido úrico eFS em PBS, em função do tempo pH = 7,4

Fotossensibilizador Atividade Fotodinâmica (m2 J-1)

HY 26 ± 5

PG 7 ± 1

AF HY PG

gera mais 1O2

Atividade Fotodinâmica dos FSs

DETECÇÃO DE RADICAIS LIVRES - RPE

Radicais livres – formados nos processos

tipo I

O2•̄ superóxido, HO• hidroxila

Espectroscopia de Ressonância Magnética

(RPE) – Spin trapping

ESPECTRÔMETRO DE RPE

N

O

HH3C

H3C O2

N

O

H

OHH3C

H3C

O N

O

H

OHH3C

H3C

DMPO DMPO-OH

Reação do DMPO com radical O2•- formando o aduto DMPO-OH.

Radicais livres não estáveis reagem com spin trap (compostos diagmagnéticos)

para formar radicais livres estáveis

SPIN TRAPPING

Espectro de RPE do aduto DMPO- OH

3340 3360 3380 3400 3420 3440

Inte

nsid

ad

e

experimental

Campo Magnético (Gauss)

simulado

Aduto DMPO-Hidroxila em solução de Hipericina (50 mL/mL) e DMPO (0.5 M).Tempo de irradiação 15 min, LED vermelho.

aN= 15,08 G; aH=14.95

3360 3380 3400 3420 3440

0

3

6

Simulado

Experimental

Inte

nsi

dad

e

Campo Magnético (Gauss)

Espectro de RPE do aduto DMPO- OOH

Aduto DMPO-superoxido em solução de Hipericina (50 mL/mL) e DMPO (0.5 M).Tempo de irradiação 15 min, LED vermelho.

aN= 13,02 G; aH=10,51 G; aH=1.41 G

CARACTERIZAÇÃO

BIOLÓGICA

CULTURA CELULAR

Conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora

do organismo original, mantendo suas características próprias

Linhagem de cresce aderida ao substrato

células epiteliais meio de cultura + 10 % SFB + antibióticos

mantida em estufa 37 °C atmosfera de CO2

Manipulação em capela de fluxo laminar Estufa de cultura celular

Experimentos citotóxicos

leitor de placas

manipulação em capela de

fluxo laminar

placa 96 poços

biotable 630 nm

1x105 cél. mL-1

placa de 96 poços

24 h

incubação

2 h

irradiação

48 h

ensaio MTT

índice

sobrevivência

0 5 10 15 20 25 30 35

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25 30 35

0

20

40

60

80

100

(b)

IS (

%)

[FS] mg/mL

(a)IS

(%

)

escuro

[FS] mg/mL

ENSAIO CITOTÓXICO DOS FSDETERMINAÇÃO VIABILIDADE COM MTT

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

4

8

12

16

20

[FS

] (m

g m

g p

rote

ína

-1 )

Tempo (h)

HY

PZ

PG

0,5 1 2 4 6 8 10 12 14 24

ACUMULAÇÃO INTRACELULAR DE HY, PG E PZEM CÉLULAS HEP-2

LED – conjunto de LEDs - diodos emissores de luz

BIOTABLE

630 nm I= 18 mW cm-2 590 nm I= 10 mW cm-2

CONSIDERAÇÕES FINAIS

OBRIGADA PELA

ATENÇÃO !!!