Microbiologia

Coloração e

Microscopia

O que é coloração ?

Coloração de gram é uma técnica inventada pelo médico bacteriologista Christian Joachim Gram em 1884. Ele inventou esta técnica para auxiliar na visualização e identificação de bactérias, sendo que elas podem se colorir de roxas ou rosadas dependendo do tipo de bactéria.

As bactérias roxas são chamadas de gram-positivas e as bactérias rosas de gram-negativas.

Essa variação de cor se deve a parede celular das bactérias gram-positivas de reterem o corante chamado de cristal violeta que é o violeta de metila, já as bactérias gram-negativas não tem essa propriedade.

Existem outros tipos de coloração como a coloração de Ziehl-neelsen, a coloração de Albert-Layborn e coloração de flagelos.

A importância da coloração está na identificação das bactérias seu agrupamento e sua morfologia para o tratamento médico mais adequado para cada tipo específico.

Bactérias gram-positivas e gram negativas.

A diferença entre as bactérias gram-positivas e as gram-negativas está na sua parede celular.

As gram-positivas : apresentam em sua parede celular mais peptídeoglicano(proteínas+carboidratos) e menos lipídeos;

É menos susceptível a dissolução ou seja, mais resistente;

Apresentam ácidos tecóico;

Contém magnésio na sua parede celular devido a isto se retém o cristal violeta.

As gram negativas : apresentam mais lipídios (LPS,lipoproteínas e fosfolipídios);

É mais permeável e mais complexa;

Sua parede celular não retém o cristal violeta devido sua parede não conter magnésio.

Observação: existem algumas bactérias que não podem ser coradas com a técnica de gram como por exemplo a mycobactérium tuberculosis que é um bacilo de Koch, essas bactérias possuem uma cápsula que impede a coloração.

O que é preciso para preparar os corantes de gram?

Para preparar os corantes, você vai precisar de:

1 béquer de 500 ml;

1 béquer de 1 litro;

1 balança gramatária ou eletrônica;

2 bastões de vidro;

1 proveta de 200 ml;

1 proveta de 500 ml;

1 espátula ou uma colher de café;

violeta-de-metila;

álcool etílico 99,5º

álcool metílico 99,5º

axalato de amônia;

iodeto de potássio;

iodo metálico;

safranina; e

água destilada.

Este material é utilizado para preparar os quatros reagentes mais utilizados para realizar a coloração de gram, que são eles:

Violeta-de-metila,( realiza a coloração das bactérias);

Álcool etílico(99,5º), (agente descolorante);

Lugol ou mordente,(fixador do cristal violeta);

Safranina, (diferenciador da cor e identificador bactéria).

Técnica da coloração de gram 1. Cubra o esfregaço com violeta-de-

metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;

2. Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por mais 45 segundos;

3. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente; Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;

4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;

5. Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;

6. Lave em um filete de água corrente;

7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;

8. Lave em um filete de água corrente;

9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo;

10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;

11. Leia em objetiva de imersão100X)

Modificações do método de gram

O método de gram original utilizava violeta genciana.Hoje se utiliza outro tipo de cristal violeta que é o violeta -de –metila .

O cristal violeta de metila já contém fixador químico, por isso a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é atualmente contra-indicado.

O diferenciador era uma mistura de solvente. Hoje se usa apenas o álcool etílico 99,5º, este é mais seguro do que o álcool acetona , que para o seu preparo era necessário experiência e habilidade, para não ocorrer hiperdescoloração,

A modificação mais importante foi a do corante secundário ou corante de fundo. A fucsina fenicada de gram Foi substituída pela safranina.

A safranina mantém-se mais distante da violeta no aspecto da cor , diferente com maior nitidez as bactérias gram-negativas que se destacam das gram-positivas e da coloração de fundo,que assume a cor vermelho claro.

Material biológico

Pode ser :

Swab,

Escarro,

Liquor ou outros fluidos orgânicos,

urina,

Biópsia ou fragmentos de tecido,

Aspirados ou exudatos.

Microscopia e leitura de gram

Na leitura de gram se utiliza o microscópio com uma objetiva de menor aumento(10x) e fazer uma análise do esfregaço com um todo avaliando:

A qualidade da coloração e a espessura de esfregaço;

Se o material coletado é próprio para cultura, observando a quantidade relativa de seus componentes com hemácias, leucócitos e células epiteliais;

Local e agrupamento das bacterianos;filamentos, pseudo-hifas e leveduras;

Se há presença de bactérias pertencentes a microbiota normal, indicando uma coleta inadequada da amostra.

Em um microscópio coloque a lamina a ser analisada aplicando uma gota de nujol que vai polarizar a luz facilitando a visualização do material;

Passe a lente do microscópio para uma objetiva de(100x) e examine várias áreas para melhor avaliação da coloração e dos diferentes tipos de microrganismos presentes, principalmente perto de células inflamatórias.

Coloração de Albert-Layborn

O objetivo da técnica de coloração pelo método de Albert- Layborn é direcionar a identificação de corynebacterium difhtheriae.

As bactérias deste gênero possui em seu interior grânulos de volutina que se coram diferentemente de outras estruturas bacterianas(granulações metacromátias). Além disso esta bactéria costuma aparecer no microscópio em arranjos semelhantes a letras chinesas. Portanto a pesquisa feita de bacilos com granulações metacromáticas é feita em caso de suspeita de difteria.

Material biológico para análise: swab orofaringe, nasofaringe e swab de lesões ou secreções.

Solução e execução

Solução A:

Azul-de-totuidina 0,15g;

Verde-malaquita 0,20g;

Acido acético glacial 1 ml;

Álcool 95 2ml;

Água destilada 100ml.

Solução B:

Iodo 2g;

Iodeto de potássio 3g;

Água destilada 300ml.

Execução :

Corar 3 min. com a solução A;

Escorrer e lavar com água corrente, cobrir com solução B,

Após 2 min. Lavar com água corrente rapidamente;

Enxugar com papel de filtro e secar sem passar na chama;

Observar o corpo bacteriano corado em verde e os grânulos metacromáticos (castanho-escuro).

Conclusões:

A técnica de coloração de bactérias e de fungos é muito importante para a medicina pois, é uma grande aliada no diagnóstico clinico e tratamento específico do paciente. Através desta técnica os bioquímicos em seu laboratório consegue identificar o agrupamento, morfologia e tipo de cada bactéria ali existente, contando com a ajuda do microscópio para realizar esta identificação e o antibiograma para saber a sua resistência a certos tipos de medicamentos.

Bibliografia:

www.bvsms.saude.gov.br/bvs/publicações;

www.recife.ifpe.edu.br/recife/gram.anvisa.pdf;

Conteudo fornecido pela professora;

www.mistérioda saude.com.br.

Integrantes:

Adelaide Arcanjo RA:7633722642

Damiana Santana de Freitas RA: 6805397305;

Deusinete da Silva S. Lima RA: 6805361121;

Eliane C. Costa RA: 7475691268;

Erika Zenilda M.F. Farias RA: 6658364534;

Glaucia Aparecida dos Santos RA: 12997404;

Juliane Jesus de Oliveira RA: 5694151095;

Tatiana X. Santos RA: 7493691513.