seleÇÃo de estirpes rizobianas para leguminosas...
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCOPÓS - GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
DISCIPLINA: SEMINÁRIOS IIIPROFESSOR: MARIO DE ANDRADE LIRA JUNIOR
SELEÇÃO DE ESTIRPES RIZOBIANAS PARA LEGUMINOSAS FORRAGEIRAS
Recife - PE,dezembro de 2009
Doutorando: Altanys Silva Calheiros
Orientador: Dr. Mario de Andrade Lira JuniorCo-orientadores: Drª. Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Drª. Maria do Carmo Catanho Pereira de Lyra
INTRODUÇÃO
Agropecuária sustentável:
• É aquela que satisfaz necessidades humanas;
• Melhoria da qualidade ambiental e dos recursos naturais;
• Utilização eficiente dos recursos não renováveis;
• Viabilidade econômica e;
• Melhoria da qualidade de vida.
(Graham & Vance, 2000; Vanlauwe et al, 2001; Schiere et al, 2002)
Mata atlântica:• Maior intensificação em sua pecuária;• Conversão de áreas de pecuária para agricultura.
(Pereira et al, 2005; Lobato, 2005)
Problemas encontrados:
• Baixa fertilidade natural dos solos;(Resende & Resende, 1996).
• Deficiências de N e P em pastagens.(Boddey et al, 2004).
Elevadas perdas de N no sistema solo/planta/animal;
As perdas de P podem ser consideradas pequenas.(Lira et al, 2006)
Importância das Leguminosas em pastagens?
Fontes de N:
• Fixação Industrial;
• Fixação Natural:
• Via FBN (Bactérias);
• Matéria Orgânica de Solo e;
• Fezes e urina dos animais.
Pecuária da Zona da Mata de Pernambuco:• Baseada em pastagens, que em grande parte estão degradadas;• Potencial produtivo limitado pela falta de nitrogênio.
Altanys Silva Calheiros (2008)
Efeito da leguminosa arbórea Stryphnodendrom adstringens no desenvolvimento debraquiária (Brachiaria decumbens) crescendo sob sua copa, município de Oriximiná, PA.
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br
Puerária (Pueraria phaseoloides)
Algumas espécies são bastante promissoraspara consorciação com gramíneas tropicas:
(Aroeira et al, 2005; Fernandes et al, 2005; Hall eWalker, 2005; Moreira et al, 2005; Shelton et al,2005; Whitbread et al, 2005; Mapiye et al, 2006)
Gramínea X Leguminosa em pastagens
Amendoim forrageiro (Arachis pintoi)
http://www.quebarato.com.br; http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br; http://www.facholi.com.br
Calopogônio (Calopogonium mucunoides)
Desmódio (Desmodium ovalifolium) Cunhã (Clitoria ternatea)
http://www.fao.org; http://www.tropicalforages.info; http://www.quebarato.com.br
Estilosantes (Stylosanthes spp.)
Utilização de espécies arbustivo-arbóreas em sistema silvo-pastoril:
Combinação intencional de árvores, pastagem e gado numamesma área ao mesmo tempo e manejados de forma integrada,com o objetivo de incrementar a produtividade por unidade de área.
Benefícios dos sistemas silvipastoris:
• Melhoria do ambiente para os animais;• Aumento da produtividade por área e;• Diversificação da renda da propriedade.
www.fazendatamandua.com.br; http://www.aboaterra.com.br
Leucena, gliricidia, sabiá e diversas espécies do gênero Sesbania sãousualmente apontadas como opções para sistemas silvipastoris.
(Vieira et al, 2005; Moreira et al, 2006; Dias et al, 2007; Mundus et al, 2008)
Leucena (Leucaena leucocephala)
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br; http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br; http://www.agrotropical.org;
Sabiá (Mimosa ceasalpiniifolia)
Gliricidia (Gliricidia sepium)
Problemas relacionados com a fixação bacteriana:
Grande variabilidade bacteriana:
• Capacidade de fixação biológica de nitrogênio;
• Capacidade de sobrevivência no solo e;
• Quanto à competitividade.
(Duodu et al, 2006; Kaschuk et al, 2006; Raposeiras et al, 2006; Sebbane et al, 2006)(Duodu et al, 2006; Kaschuk et al, 2006; Raposeiras et al, 2006; Sebbane et al, 2006)
Necessidade de se fazer um processo contínuo e baseado na obtençãoem grande escala de isolados;
Selecionar estirpes com maior potencial de fixação de nitrogênio e;
Maiores potenciais de ganhos de produtividade na cultura estudada.
(Alberton et al, 2006; Bala & Giller, 2006; Uchôas & Faria,2006; Silva et al, 2007)
Verificar a possibilidade de seleção de estirpes de bactérias
mais eficientes na FBN.
Baixa eficiência da inoculação;
Prevalece a população nativa.
Prof. Dr. Mauro Wagner de Oliveira (2005)
OBJETIVOS
GERAL:
Obter estirpes rizobianas capazes de aumentar a fixação biológica
de nitrogênio em leguminosas forrageiras em região tropical úmida.
ESPECÍFICOS:
• Obter um mínimo de 1000 isolados rizobianos para cada espécie• Obter um mínimo de 1000 isolados rizobianos para cada espécie
alvo;
• Avaliar a capacidade simbiótica e de fixação de N2 dos isolados;
• Selecionar um mínimo de duas estirpes rizobianas para cada
espécie alvo que apresentem capacidade de incremento no potencial
produtivo da respectiva leguminosa.
MATERIAL E MÉTODOS
1. ESPÉCIE-ALVO
Plantas forrageiras estudadas:
• Sabiá
• Calopogônio• Calopogônio
Além do caupi, que será utilizado como planta-isca devido a seuamplo espectro infectivo.
(Jensen & Hauggaard-Nielsen, 2003; Sanginga et al, 2003; Rasolomampiannina et al,2005)
2. OBTENÇÃO DE NÓDULOS
Coleta de solo:
Estação Experimental de Itambé, do Instituto Agronômico dePernambuco - IPA.
• Pastagens de capim braquiária decumbens;
• Bosques de sabiá e;• Bosques de sabiá e;
• Áreas de mata atlântica.
Em três áreas diferentes sob cada cobertura.
Avaliar possíveis efeitos do sistema de cultivo predominantesobre a diversidade e eficácia das comunidades rizobianas.
(Palmer & Young, 2000; Andrade et al, 2002; Depret et al, 2004; McInnes et al, 2005)
Coleta de solo:
• 2 amostras compostas em cada área;
• Camada de 0 a 10 cm.
Solo conservado em refrigerador a aproximadamente 4º C atéo processamento e realização das análises biológicas.
As amostras serão peneiradas;
Caracterização física e;
Fertilidade do solo.
(Barreto et al, 1997; EMBRAPA, 1999)
Coleta de nódulos:
Foram identificadas plantas de calopogônio e sabiá ocorrendonas áreas amostrais;
Coletou-se nódulos em 10 plantas em cada área amostral paracada espécie.cada espécie.
Os nódulos foram armazenados em tubos com sílica-gelindividualmente marcados para cada planta e;
Conservado em refrigerador.
Estudo em vasos:
As plântulas serão pré-germinadas em vermiculita esterilizadapor três a cinco dias.
Transplantadas para vasos de Leonard, recebendo diariamenteTransplantadas para vasos de Leonard, recebendo diariamentesolução nutritiva de Hoagland (Hoagland & Arnon, 1950).
Serão colhidas 30 dias após inoculação.
Os nódulos serão limpos e conservados em tubos com sílica-gel.
3. ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO
Serão amostrados cinco nódulos de cada amostra simples,totalizando 900 nódulos para cada espécie.
Também serão isolados os nódulos coletados no campo.
O isolamento seguirá o procedimento padrão como sintetizadoem Hungria (1994).
Os nódulos de cada tubo serão reidratados;
Imersos em álcool 95% para quebra da tensão capilar superficial;
A superfície dos nódulos será esterilizada por imersão emhipoclorito de sódio 5% por cinco minutos e;hipoclorito de sódio 5% por cinco minutos e;
Lavados em água destilada esterilizada.
O isolamento será conduzido em placas de Petri com meio 79,com azul de bromotimol (Vincent, 1970).
Após a obtenção de isolados de célula única, será efetuadapreservação de curto período (Silva & Oliveira, 1994).
• Os isolados serão cultivados em meio 79 líquido, sob agitação e;
• Inoculados em plântulas pré-germinadas, um ml por plântula• Inoculados em plântulas pré-germinadas, um ml por plântulapara a autenticação (Somasegaran & Hoben, 1994).
• Calopogônio e sabiá serão cultivados durantes 30 dias;
• O caupi será cultivado por 15 dias.
Os isolados autenticados serão caracterizados morfológica esimbioticamente.
Caracterização morfológica:
• Velocidade de aparecimento de colônias isoladas;• Forma;• Cor;• Brilho;• Brilho;• Superfície;• Borda e tamanho da colônia;• Produção e consistência de muco;• Absorção de corantes e;• Modificação do pH do meio de cultura.
(Alberton et al, 2006; Sebbane et al, 2006; Uchôas & Faria,2006; Silva et al, 2007)
Caracterização simbiótica:
Será feita pela inoculação cruzada de todas as estirpes comtodas as leguminosas estudadas, independentemente da origem,em tubos de crescimento.
(Bala & Giller, 2001; Safronova et al, 2004)
Será aviado a presença ou ausência de nodulação para cadaespécie.
Análise estatística:
Será realizada análise de clusters para cada espécie-alvo,apenas das estirpes autenticadas, utilizando o SAS (SAS Institute,1999).
Estes grupamentos (“clusters”) formarão agrupamentos quelevam em consideração:
• As características morfológicas e;
• Presença e ausência de nodulação nas três espécies-alvo deque foram isoladas.
4. TESTE DE EFICIÊNCIA
Estirpes aleatoriamente selecionadas de cada agrupamentoserão submetidas a testes de eficiência simbiótica, em vaso deLeonard.
Um mínimo de 25 % das estirpes de cada grupo será avaliado.
Serão incluídos tratamentos não inoculados com N mineral.
Cada espécie-alvo será considerada um experimento separado.
Os experimentos serão conduzidos no delineamento em blocos,com quatro repetições.
Face à expectativa de 1000 estirpes para cada experimento, seráadotado o delineamento em blocos ao acaso com tratamentocomum, com três repetições no tempo.
Cada vaso receberá três plântulas, pré-germinadas por três diasem vermiculita esterilizada.
As plântulas serão inoculadas com um ml de solução contendo108 células rizobianas ml-1 (Urenha et al, 1994).
As plantas serão cultivadas por 90 dias em vaso de Leonard,com a parte superior em areia, e a inferior contendo soluçãonutritiva de Hoagland sem nitrogênio.
Avaliações:
As plantas serão cortadas ao nível do solo;
O sistema radicular será separado da areia.
Serão determinados:
• Número de nódulos;
• Tamanho dos nódulos;
• Massa seca dos nódulos;
• Massa seca das raízes e;
• Massa seca, teor de nitrogênio e nitrogênio total da parte aérea.
Análise estatística:
Análise de normalidade, presença de outliers e necessidade detransformação utilizando o SAS (SAS Institute, 1999).
O efeito de estirpes será considerado aleatório e os efeitos dosgrupos fenotípicos (“clusters”) definidos inicialmente consideradosfixos.fixos.
Será realizado análise de variância e teste de comparação demédias, para os efeitos fixos e variáveis.
As estirpes que se destacarem na maioria das variáveisestudadas serão selecionadas para a fase posterior.
5. COMPETIÇÃO EM SOLO
Experimento em casa de vegetação;
Argissolo Vermelho-Amarelo não esterilizado.
Tratamentos:
• Estirpes com melhor desempenho na fase anterior.• Estirpes com melhor desempenho na fase anterior.
Testemunhas:
• Estirpes recomendadas para a espécie;
• Ausência de inoculação e de fertilização e;
• Ausência de inoculação com fertilização nitrogenada.
As sementes serão pré-germinadas por três dias em vermiculitaesterilizada.
Será transferido seis plântulas para cada pote.
Por ocasião do transplante, será realizada a inoculação utilizandoum ml de solução com 108 células rizobianas por ml.
As plantas receberão irrigação com água potável conformenecessário.
Condução do experimento:
Período de 270 dias;
As plantas serão cortadas a cada 45 dias, a partir dos 90 diasapós semeadura.
Avaliações:
A cada corte será determinada a matéria seca e;
O teor de nitrogênio da parte aérea.
Análise estatística:
Será realizado análise de regressão:
Tendo-se como variáveis dependentes a MS e o N total da parteaérea dos tratamentos com N mineral e;
Variável independente o N adicionado.
O N fixado pelas estirpes inoculadas será estimado com basenestas regressões.
A cada experimento, os dados serão submetidos à análise denormalidade, presença de outliers e necessidade de transformaçãoutilizando o SAS (SAS Institute, 1999).
As análises serão realizadas separadamente para cada corte,bem como para o conjunto dos dados, neste caso utilizando oprocedimento de análise de medições repetidas (Wolfinger & Chang,2006).
Será realizado análise de variância e teste de comparação demédias.
Os critérios de seleção das estirpes para experimentos de campoincluirão produtividade da leguminosa em MS e N total.
As estirpes com melhor desempenho serão selecionadas parafase posterior de experimentação em campo.
