rvcguido@ifsc usp [email protected] · – resultado = 1077 anos para testar todas as...

FFI0776 FFI0776 ‐‐Modelagem e Modelagem e E h i d P íE h i d P íEngenharia de ProteínasEngenharia de Proteínas

Prof. Rafael V. C. GuidoProf. Rafael V. C. Guidorvcguido@ifsc usp brrvcguido@ifsc usp [email protected]@ifsc.usp.br

Aula 07Aula 07Bacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares

Aula 07Aula 07Bacharelado em Ciências Físicas e BiomolecularesBacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares

Instituto de Física de São Carlos Instituto de Física de São Carlos ‐‐ USPUSP

ObjetivosObjetivos

l ã d í• Enovelamento e Desnaturação de Proteínas• Introdução à Engenharia de Proteínas

Enovelamento e DesnaturaçãoEnovelamento e DesnaturaçãoEnovelamento e Desnaturação Enovelamento e Desnaturação de Proteínasde Proteínas

ResíduosResíduos polarespolaresResíduosResíduos apolaresapolares

Enovelamento Enovelamento ‐‐ InteraçõesInterações DesnaturaçãoDesnaturação

O processo de desnaturação de proteínas é um evento cooperativo

E D

DesnaturaçãoDesnaturação 12 resíduos dif tdiferentes

↓ ΔT = 23 oCΔTm = 23 C

Perl, D. et al. Nat. Struct. Biol. 2000, 7, 380–383 Perl, D. et al. Nat. Struct. Biol. 2000, 7, 380–383

AxPyMOL: The PyMOL ActiveX ControlAxPyMOL: The PyMOL ActiveX Control

Desnaturação de ProteínasDesnaturação de Proteínas

Desnaturação→ alteração na estrutura 3D da proteína suficiente para determinar a perda da função biológica• Condições de desnaturaçãoç ç

– Temperatura • rompimento das ligações de H

– pH • alteração do estado de protonação ocasionando

l l árepulsão eletrostática e rompimento das ligações de H

– Solventes orgânicos (álcool cetona)Solventes orgânicos (álcool, cetona)• Desestabilização das interações hidrofóbicas

– Outros agentes (urea, guanidina, detergentes)g ( , g , g )• Desestabilização das interações hidrofóbicas

Desnaturação e EnovelamentoDesnaturação e Enovelamento

Adição de uréia e β‐mercaptoetanol

E t t tiEstrutura nativa, cataliticamente ativa Estrutura desenovelada,

cataliticamente inativa

Remoção da uréia e β‐mercaptoetanol

ConclusãoA estrutura primária da proteína contém toda aA estrutura primária da proteína contém toda a informação necessária para o enovelamento da estrutura 3D (forma nativa e funcional)

Estrutura reenovelada, cataliticamente ativa

Enovelamento de ProteínasEnovelamento de Proteínas

Paradoxo de Levinthal (1968)Hi ó d E l l ó i d• Hipótese de Enovelamento = processo aleatório de amostragem (tentativa e erro)– Proteína contendo 100 aa→ 10 conformações/aa (10100)– Amostragem de cada conformação = 10‐13 s (0,1 ps)

• (tempo de uma vibração molecular)– Resultado = 1077 anos para testar todas as conformações– Idade do universo = (13,7 ± 0,2) x 109 anos

• Conclusão: existe um processo otimizado• Exemplo: E coli• Exemplo: E. coli

– Enovela uma proteína contendo 100 aa em sua forma nativa em ~ 5 s a 37 oC

D d i t i i di i t l d t d• Dados experimentais indicam que o intervalo de tempo de enovelamento de proteínas varia entre 1 ms – 10 min.

Levinthal, C (1969) in Proceedings in Mossbauer Spectroscopy in Biological Systems, eds Debrunner P, Tsibris J, Munck E (University of Illinois Press, Urbana, IL), pp 22–24

EnovelamentoEnovelamento

O enovelamento de proteínas é um processo termodinâmico favorável, ou seja, o estado enovelado é menos energético que o estado desenovelado.seja, o estado enovelado é menos energético que o estado desenovelado.

Keq = [E] / [D]

ΔG = RT ln Keq

E D

Estado de transição

desenovelado

enoveladoenovelado desenovelado

““MoltenMolten GlobuleGlobule””

Parâmetros Importantes:

Largura↓

espaçoespaço conformacionalRugosidade

↓ΔE entre

conformaçõesconformaçõesProfundidade

↓ΔEΔE entre os estados

desenovelados e a estrutura enovelada


Sequência de eventos1. Colapso dos resíduos hidrofóbicosp2. Interações locais estabilizam as estruturas secundárias3. Estruturas secundárias interagem para formar os

ti t t imotivos estruturais4. Motivos estruturais se agregam para formar a estrutura

terciárias (forma funcional)


Ordem de Contato (CO, contact order) → distância média entreê i d d d íd ãsequência de todos os pares de resíduos que estão em contato

normalizada pelo comprimento total da sequência da proteína

ΔS = distância de separação entre os resíduos i e j (no. de resíduos)

N = no. total de contatosL = no. total de resíduos

↓ CO = proteínas enovelam‐se mais rapidamente↑ CO = proteínas enovelam‐se mais lentamente

Doenças causadas pelo enovelamento Doenças causadas pelo enovelamento defeituosodefeituoso

Doença de Huntington (DH)Doença de Alzheimer (DA)

Algumas proteínas têm umarepetição de um únicoaminoácido glutamina (Poli‐Q).Essas repetições poli‐Q, sel fi i t f

DA é causada pela agregação de proteínasrelativamente pequena (42 aa). Estas proteínasformam agregados que mesmo em pequenosl d ã tó i ô i d d longas suficiente, formam

agregados que causam DH.aglomerados são tóxicos para os neurônios podendocausar morte celular.

Folding@Folding@homehomehttp://folding.stanford.edu/

Evolução Evolução in vitro in vitro ‐‐ççPlanejamento e Construção de Planejamento e Construção de Bibli ( l õ d )Bibli ( l õ d )Bibliotecas (coleções de genes) Bibliotecas (coleções de genes)

Princípios da EvoluçãoPrincípios da Evolução

As características‐chave de organismos em evolução são:As características chave de organismos em evolução são:– capacidade de replicação (fazer cópias de si mesmos)– capacidade de mutação (submeter‐se a mudanças que sãocapacidade de mutação (submeter se a mudanças que são

passadas para os seus descendentes).

Evolução Evolução in vitroin vitro

A engenharia de proteínas se baseia em métodos de evoluçãoA engenharia de proteínas se baseia em métodos de evolução molecular direcionada ‐ ou evolução dirigida de proteínas – para a construção de grandes bibliotecas de genes variante.

Uma vez construída a biblioteca são empregados métodos de seleção para identificação de membros na biblioteca que codificam proteínas com propriedades desejadas.


• Evolução in vitro é uma estratégia utilizada paraEvolução in vitro é uma estratégia utilizada para evoluir moléculas em laboratório com determinadas propriedades por meio de diversificação e seleçãopropriedades, por meio de diversificação e seleção.

• Objetivos: d i id d– aumento da atividade

– estabilidade (e.g., térmica, pH, salinidade, etc)f d d– especificidade

– novas funções.


Seleção do gene

Definição dos objetivos evolucionários

Geração da diversidade éti (Bibli t d )genética (Biblioteca de genes)

Identificação do gene mutanteIdentificação do gene mutante

Triagem de proteínas otimizadasg p

Seleção do gene otimizado

Objetivos evolucionários alcançados? SIMSIMNÃONÃO


• Procedimentos:Procedimentos:– Mutação sítio‐dirigida

• ciclos sucessivos de mutagêneseciclos sucessivos de mutagênese

– Mutação aleatória (Error‐prone PCR)• Condições do meio de reação induzem a mutação aleatória Co d ções do e o de eação du e a utação a eató a

– Recombinação gênica (DNA shuffling)• Recombinação de sequências homólogas

Mutação Mutação sítiosítio‐‐dirigidadirigida

→

Gly77 → Ala77

→

Ala82 → Pro77

Mutação Mutação sítiosítio‐‐dirigidadirigida MecanismoMecanismo de de inibiçãoinibição

Inibidor nãocompetitivo

Ki = 5 µMαK = 43 µM competitivoαKi = 43 µM

1/Vmax

[I]

‐1/KMapp

CristalografiaCristalografia de de raioraio‐‐XX

GAPDH‐AACSítioSítio de de ligaçãoligação do do inibidorinibidor

Data collectionResolution range (Å) 40,7 - 1,90 (1,90 - 2,15)*Space group P21Cell parameters (Å) a= 94.39 b= 76.01 c=119.64 SítioSítio p ( )Cell parameters (°) α=γ=90 β=90.16Total number of frames 180Total collected reflections 385,310 No of unique reflections 61,692 (5,591)*

SítioSítiocatalíticocatalítico

q , ( , )Overall completeness (%) 91.2 (90.8)*Overall Rmerge (%) 24,0 (16,6)*<(I)/σ(I)> 4,6 (2,6)*Multiplicity 2,5 (2,0)*p y , ( , )

RefinementNo of aa residue/monomer 359water molecules in a.u. 1,154Rfactor (%) 15,6factor ( ) ,Rfree (%) 18.9rmsd in bonds angles (O) 0.93rmsd in bond lengths (Å) 0.007

PDB code ---* The values in parenthesis correspond to the last resolution shell

LisozimaLisozima

Hidrólise das ligações glicosídicas beta 1 4 entre resíduos do ácido N acetilmurâmico

EC 3.2.1.17Hidrólise das ligações glicosídicas beta 1,4 entre resíduos do ácido N‐acetilmurâmico(Mur2Ac) e N‐acetil‐D‐glucosamina (GlcNAc) num pepitídeoglicano

Mecanismo de açãoMecanismo de ação Mecanismo de açãoMecanismo de ação

Engenharia de Proteínas: Engenharia de Proteínas: Aumento de estabilidadeAumento de estabilidade

• Tm = temperatura capaz de inativar 50% da enzima durante o processo de desnaturação térmica reversível

• Estratégias para o aumento de estabilidade:aumento de estabilidade:– Redução do número de conformação no estadoconformação no estado desenovelado

– Estabilização das α‐hélicesEstabilização das α‐hélices– Aumento no número de interações hidrofóbicasinterações hidrofóbicas

Redução do número de conformação Redução do número de conformação desenoveladasdesenoveladas

1. Redução do número de conformação no estado1. Redução do número de conformação no estado desenovelado

• ↑ o número de conformações no estado desenovelado ↑ o custo entrópico para enovelar a proteína em um único estado nativo

• ↓ no número de conformações desenovelada ↑ estabilidade da conformação nativaconformação nativa


Cys3–Cys97

↑↑ Tm = 4,8 oC

Cys9–Cys164

↑ Tm = 6,4 oC

Cys21–Cys142

↑ Tm = 11 oC

Efeito aditivo



l T f id d d id d li i≠ no valor Tm entre as formas oxidada e reduzida da lisozima mutante



Gly77 → Ala77↑ Tm = 1 oC↑ Tm = 1 C

Ala82 → Pro77

↑ Tm = 2 oC↑

Efeito aditivo


Estabilização das Estabilização das αα‐‐héliceshélices

Lisozima11 α hélices11 α‐hélices 7 α‐hélices apresentam aa carregados negativamente no N‐terminalg

δ‐ δ+δ δ+

δ‐ δ+

δ‐ δ+

Estabilização das Estabilização das αα‐‐héliceshélices

Ser38→ Asp38Ser38 → Asp38↑ Tm = 2 oC

Asn144 → Asp144↑ Tm = 2 oC↑ Tm = 2 oC

Efeito aditivoduplo mutante ↑ Tm = 4 oC


Aumento no número de interações Aumento no número de interações hidrofóbicashidrofóbicas

• Preenchimento de cavidades hidrofóbicas com resíduos mais volumososmais volumosos


Mutação aleatóriaMutação aleatóriaMutação aleatória Mutação aleatória ErrorError‐‐proneprone PCRPCRpp

Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase –– PCR PCR Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase –– PCRPCR

1 4 7

2 5 8

3 6 9

ErrorError‐‐proneprone PCRPCR

• Condições alteradas da PCR para d daumentar a taxa de erros durante a

cópia do gene • Taq‐polimerase apresenta uma taxa deTaq polimerase apresenta uma taxa de

erro de 1 nucleotídeo não complementar para cada 10.000‐100.000 bases

• Aumentando‐se a concentração de Mn+2 ou Mg+2 a taxa de erro da Taq‐polimerase aumenta parada Taq polimerase aumenta para 2‐15 erros para cada 1.000 pares bases (↑ 1 3 d d i d )(↑ 1‐3 ordens de magnitude)

DNA DNA polimerasepolimerase


ErrorError‐‐proneprone PCRPCR ErrorError‐‐proneprone PCRPCR

Mutações aleatórias produzidas por error‐prone PCR são tendenciadas a incluir alterações onde a probabilidade detendenciadas a incluir alterações onde a probabilidade de incorporação é maior para aminoácidos codificados poraminoácidos codificados por vários códons (e.g., leucina, arginina e serina)g )

rvcguido@ifsc usp [email protected] · – resultado = 1077 anos para testar todas as...

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