Universidade Estácio de Sá Cursos de FARMÁCIA, NUTRIÇÃO e ENFERMAGEM

BIOQUÍMICA

Roteiros de Aulas Práticas

Curso Prático de Bioquímica

Aspectos Gerais:

Os alunos receberão instruções relacionadas às aulas práticas e

posteriormente, executarão os experimentos propriamente. Ambos os procedimentos acontecerão nos laboratórios. O aluno deve aguardar orientações para iniciar.

Ao final de cada prática, o grupo deverá entregar um relatório referente a prática executada, após a aula, com os seguintes itens:

a) Objetivos b) Resumo dos Procedimentos c) Resultados d) DISCUSSÃO (fundamentação teórica dos resultados)

Os relatórios serão avaliados, perfazendo 10% (dez por cento) do total do

bimestre referente.

PRÁTICAS E ATIVIDADES: 1) IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS; 2) PROPRIEDADES PROTEÍCAS – DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO; 3) FATORES INTERFERENTES NA REAÇÃO ENZIMÁTICA; 4) IDENTIFICAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS: CARBOIDRATOS E LIPÍDEOS 5) SEMINÁRIO DE VITAMINAS 6) PROCESSO DE FERMENTAÇÃO

AULA PRÁTICA Nº 01

IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS Objetivo: reconhecer, qualitativamente, a presença de aminoácidos e proteínas em soluções, através da reação da ninhidrina e do biureto. 1. REAÇÃO DA NINHIDRINA Em 4 tubos de ensaio marcados ( 1A ), ( 2A ), ( 3A ) e ( 4A ), ADICIONAR: a) Nos quatro tubos - 1,0 ml da solução de ninhidrina b) Em ( 1A ) - 1,0 ml da solução de Alanina ou Glicina; Em ( 2A ) - 1,0 ml da solução de Prolina; Em ( 3A ) - 1,0 ml da solução de Proteína; Em ( 4A ) - 1,0 ml da Salina Fisiológica (NaCl - 0,9%) c) Colocar os tubos em banho 60°C durante 5 minutos ou aqueçer diretamente em

bico de bunsen, até atingir a coloração esperada. d) Comparar os tubos e anotar os resultados. 2. REAÇÃO DE BIURETO (CuSO4 a 5% alcalino)

Em 4 tubos de ensaio marcados ( 1B ), ( 2B ), ( 3B ) e ( 4B ), adicionar: a) Nos quatro tubos - 1,0 ml do reagente de biureto b) Em ( 1B ) - 1,0 ml da solução de Alanina; Em ( 2B ) - 1,0 ml da solução de Prolina;

Em ( 3B ) - 1,0 ml da solução de Proteínas Em ( 4B ) - 1,0 ml de Salina Fisiológica c) Agitar e comparar os tubos. d) Anotar os resultados

AULA PRÁTICA Nº 02

PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO PROTEÍCAS

Objetivos: observar o comportamento da estrutura protéica frente a agentes desnaturantes e precipitantes, analisando fenômenos de desnaturação, renaturação e precipitação protéicos.

1. DESNATURAÇÃO TÉRMICA Em tubo de centrífuga (1), colocar 2,0 ml da solução de proteínas. Aquecer até fervura (ou no máximo até 10 minutos). Observe se ocorreu alguma modificação. Centrifuge a 500 rpm por 3min. Separe o sobrenadante (se houver), retirando-o com pipeta pasteur ou vertendo o tubo e transferindo a um novo tubo limpo (S1). Adicione soro fisiológico (2,0 ml) ao precipitado (se houver) e agite. Adicione 1,0mL de biureto no sobrenadante e agite. Anote o que observou.

2. DESNATURAÇÃO ÁCIDA Em tubo de centrífuga (1), colocar 2,0 ml da solução de proteínas. Adicionar 1,0 ml de ácido tricloroacético (TCA) a 10% (CUIDADO! Ácido corrosivo). Agite e observe o que ocorre. Centrifuge por 3min, separe o sobrenadante em novo tubo (S2). Faça a reação do biureto no sobrenadante (como no item 2), nesta fração. Ao precipitado, adicione soro fisiológico (2,0 ml) e anote sua observações.

3. PRECIPITAÇÃO PELO SULFATO DE AMÔNEO SATURADO (SALTING

OUT) Em tubo de ensaio (3), colocar 2,0 ml de solução de proteínas e 2,0 ml da solução saturada de sulfato de amônio (SAS). Observe a precipitação. Separe o sobrenadante cuidadosamente, com pipeta pasteur. Ao precipitado, adicionar 2,0 ml de água destilada e agitar. Caso não ocorra solubilização, repita a operação, descartando o sobrenadante e adicionando novamente 2,0 ml de água ao precipitado. Ao sobrenadante, faça o teste do biureto. Anote sua observações. COMPARAR OS RESULTADOS ENTRE OS TRÊS PROCESSOS.

AULA PRATICA Nº 03

FATORES QUE INTERFEREM NUMA REAÇÀO ENZIMATICA (Reação com Glicose Oxidase)

Objetivo: analisar, qualitativamente, o papel exercido pelo pH, temperatura e concentração do substrato numa reação enzimática. OBS: todos os tubos devem ser agitados após a colocação dos reagentes. Sempre anote a temperatura. MATERIAL 1. Reagente de Uso (E) : Enzima glicose oxidade e peroxidase em tampão fosfato

pH 7,4 (DO KIT COMERCIAL DE DOSAGEM DE GLICOSE); 2. Substrato (S): Solução de glicose 50ug/mL; 3. Tampão A (TA): acetato/ác. acético 0,5M pH 3,5; 4. Tampão B (TB): fosfato 0,5M pH 7,4 OU ÁGUA DESTILADA 5. Tampão C (TC): borato/ác. bórico 0,5M pH 10,5 NOTA: A enzima (reagente de uso) deve sempre ser a última a ser adicionada em cada tubo. A) INFLUÊNCIA DO pH

REAGENTES 1 2 3

Reagente de Uso (Enz.) 1 mL 1 Ml 1 mL

Tampão A 1 mL - -

Tampão B - 1 mL -

Tampão C - - 1 mL

Substrato (Glicose) 100 µL (microlitros) 100 µL 100 µL

Agite levemente. Coloque em banho-maria 37ºC por 10 min. Marque o tempo a partir da adição da glicose. Após 10 min, faça suas observações e as anote para posterior discussão.

B) INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO

REAGENTES 4 5 6 7 8 9

Reagente de Uso (Enz.) 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Tampão B (fosfato) ou

água destilada q.s.p.

480 µL 450 µL 400 µL 300 µL 200 µL -

Substrato (Glicose) 20 µL 50 µL 100 µL 200 µL 300 µL 500 µL

Agite levemente. Coloque em banho-maria 37ºC por 10 min. Marque o tempo a partir da adição da glicose. Após 10 min, faça suas observações e as anote para posterior discussão.

C) INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA

REAGENTES 10 11 12

Reagente de Uso (Enz.) 1 mL 1 mL 1 mL

COLOQUE OS TUBOS NAS SEGUINTES TEMPERATURAS

4ºC 37ºC 70ºC

Adicione apenas o reagente (enz.) nesses tubos (10, 11 e 12) e leve os tubos para os seus respectivos banho-marias. Aguarde 3 min para a enzima atingir a temperatura desejada. Depois disso, adicione 100 µL do substrato (glicose) nos tubos.

Substrato (Glicose) 100 µL 100 µL 100 µL

Marque o tempo a partir da adição da glicose. Após 7 min, faça suas observações e as

anote para posterior discussão.

NOTA: Procure colocar em gráficos as observações colhidas.

AULA PRÁTICA Nº 04

“IDENTIFICAÇÃO DE BIOMOLÉCULAS – CARBOIDRATOS E LIPÍDEOS”

Objetivo:

PROCEDIMENTOS: A) Identificação de Carboidratos

1. Teste de Benedict: Em tubos de ensaio limpos, secos e etiquetado com o nome do carboidrato, pipetar 1ml da solução de cada carboidrato: 1) água (controle), 2) amido, 3) glicose, 4) frutose e 5) suco de fruta. Adicionar:

1 ml reativo de Benedict; Ferver durante 1 minuto; Deixar esfriar espontaneamente; Observar/anotar os resultados.

2. Teste de Seliwanoff:

a) Rotular 6 tubos de ensaio com as respectivas amostras: 1) água (controle), 2) amido, 3) glicose, 4) frutose, 5) suco de fruta. b) Pipetar 1,0 ml de cada uma das amostras no tubo correspondente c) Pipetar 2 ml de reativo de Seliwanoff em todos os tubos d) Ferver, em banho – maria, estes tubos de ensaio por cerca de 10 minutos. Observe, minuto a minuto, durante este procedimento, a ocorrência de possíveis alterações e tire suas conclusões.

3. Teste do Iodo (Lugol) Em tubo de ensaio limpo, seco e etiquetado com o nome dos carboidratos do item anterior, colocar: 2,0 ml de solução de carboidrato; Gotas de iodo (Lugol); Notar o aparecimento da cor azul; Neste caso, aquecer o tubo direto na chama; Resfriar o tubo em água corrente; Observar/anotar os resultados.

B) Reação de caracterização de esteróides (lipídeos): Em tubo de ensaio limpo e seco, pipetar 0,5 ml de óleo animal + 1,0 ml de ácido

sulfúrico concentrado (CUIDADO). Observar Em tubo de ensaio limpo e seco, pipetar 0,5 ml de óleo vegetal + 1,0 ml de ácido

sulfúrico concentrado (CUIDADO). Observar Em tubo de ensaio limpo e seco, pipetar 0,5 ml de óleo mineral + 1,0 ml de ácido

sulfúrico concentrado (CUIDADO). Observar

AULA PRÁTICA Nº: 05

“PROCESSO DE FERMENTAÇÃO” Objetivo: observar o processo de fermentação, diferenciando a fermentação alcoólica da láctica. MATERIAL:

- células de Sacharomyces cerevisae (Fermento biológico seco). Pesar 5g/ erlenmeyer

- solução de sacarose 10% ou glicose 10%

- erlenmeyer de 250ml e balões de borracha

PROCEDIMENTO:

Preparar as amostras conforme tabela abaixo.

Erlenmeyers Sacarose

(ml) Levedura

5 g Água (ml)

Ferver 15min

Resultados obtidos

1 - 5 50 não 2 50 - - não 3 50 5 - não 4 50 5 - sim

Fechar os erlenmeyers com os balões de borracha vedando bem a boca do vidro e agitar

esporadicamente, até completar 30min. Observar e descrever o resultado.

QUESTÕES:

2. O que você observou nos erlenmeyers incubados com leveduras?

3. Como você acha que está a concentração de glicose no início e no final do

experimento? Faça um gráfico para ilustrar a sua resposta.

4. Quais são os produtos formados pelas leveduras durante este processo de fermentação

que ocorreu nos erlenmeyers?

5. Explique resumidamente a via bioquímica da fermentação da glicose neste processo, evidenciando as principais enzimas envolvidas.