FACULDADE FRASSINETTI DO RECIFECURSO DE CIENCIAS BIOLÓGICASDISCIPLINA DE BIOLOGIA CELULARPROFª ANA MARIA

ROTEIRO DE AULAS PRATICAS

RECIFE

Microscopia.

I. Introdução

Microscopia é uma ciência que vai adquirindo dia a dia maior importância. Utilizam-na os principais ramos da atividade humana; a arte, a ciência, a agricultura, a indústria .

Ao iniciar o curso, o aluno devera levar em consideração que os microscópios deste laboratório serão utilizados por este e pelos demais cursos ministrados pelos professores deste Instituto de biologia.

Em face disto, solicitamos que sigam extritamente o roteiro de manuseio para melhor conservação do mesmo.

O tipo de microscópio com o qual o aluno deverá manusear é o microscópio óptico composto; instrumento que consta de um sistema de lentes objetivas e oculares.

II. Descrição do microscópio

O microscópio é um instrumento óptico e mecânico, cuja utilização merece atenção e cuidados especiais. Ele é constituído por um sistema de lentes para ampliar as estruturas visualizadas e um sistema mecânico que mantém as lentes em posição correta, facilitando a sua focalização.

PARTE ÓPTICA

A parte óptica compreende :

- Sistema de ampliação : Lentes oculares Lentes objetivas

- Sistema de iluminação : Fonte luminosa Condensador Diafragma

PARTE MECÂNICA

A parte mecânica compreende os mecanismos de suporte e de focalização que estão representados por : Base ou pé

Coluna, braço ou estativoTubo ou canhãoRevolver

Mesa ou platinaPinça ou presilha

"Charriot"Parafuso macrométricoParafuso micrométrico.

A ampliação que as lentes oculares e objetivas formam é variável.O poder de ampliação do sistema óptico ( P.A.S ) é o produto dos fatores da objetiva

e da ocular. Por exemplo, se a objetiva aumenta 40 vezes e a ocular 10 vezes, o poder de ampliação do sistema ( P.A.S ) será 40 x 10 = 400x.

A distância acima ou abaixo do ponto focal do objeto, que ainda se pode mover sem perceber modificações de foco é chamada profundidade de campo.

O limite de resolução depende criticamente do aumento empregado: chama-se "limite de resolução" de um sistema óptico, a capacidade de separar detalhes, ou seja, é a menor distância que deve existir entre dois pontos, para que eles apareçam individualizados. Por exemplo, duas partículas separadas por 0,3 m, aparecem individualizadas. Então, na medida que aumentamos o poder de resolução e os aumentos empregados, a profundidade de campo diminui.

O microscópio de campo claro é o utilizado com mais freqüência; No entanto, é possível acrescentar diferentes acessórios ao M.O ( microscópio óptico ), que permitem outros tipos de microscopia, tais como : campo escuro, contraste de fase, interferência, fluorescência, polarização, quando se necessita analisar as estruturas celulares com mais detalhes.

III. Objetivos

a) Identificar os componentes ópticos e mecânicos do microscópio ópticob) Manusear corretamente as peças do microscópio compostoc) Determinar corretamente o aumento final fornecido pelos diferentes jogos de

objetivas/ocularesd) Iluminar adequadamente as diferentes preparaçõese) Focar uma preparação permanente ou a fresco, corada ou sem coloração utilizando

as objetivas à seco.f) Focar uma preparação histológica usando a objetiva de imersão em óleo.

IV. Material

1- Microscópio óptico2- Lâminas e lamínulas3- Água destilada 4- Recortes de jornais, usando as letras minúsculas.5- Fios de cabelos de pessoas diferentes6- óleo de imersão e lâminas histológicas (permanentes).

V. Procedimento

1. Ajustar o "Charriot" de modo a centralizar o orifício da platina na preparação2. Colocar a lâmina, com o material a ser analisado, sobre a platina e sobre a lente

frontal do condensador3. Começar as observações utilizando as objetivas de menor aumento4. Ajustar o condensador, obtendo a iluminação uniforme5. Olhar pela ocular, ao mesmo tempo em que se eleva lentamente a platina, girando-

se o parafuso macrométrico até a preparação aparecer focalizada6. Se houver necessidade de efetuar observações com outras objetivas, girar o

revólver e encaixar a objetiva adequada. Se a focalização não for automática, fazer uso unicamente do parafuso micrométrico

7. Deslocar a lâmina sobre a platina a fim de efetuar observações, em toda extensão, utilizando o "Charriot"

8. Ao efetuar a troca de objetivas, verificar se a iluminação permanece uniforme9. Para usar a objetiva de imersão ou 100x, deslocar a lente de 40x, deixando livre o

eixo óptico sobre a lâmina, depois colocar apenas UMA GOTA de óleo de imersão; Colocar no eixo óptico a lente de 100x e ajustar o foco no parafuso micrométrico

10. Ao terminar o uso do microscópio, girar o revólver de modo a deixar na objetiva de menor aumento em posição, abaixar a platina com cuidado para que os dedos e o óleo não sujem as lentes

11. Com o auxílio de uma gaze ou papel macio, LIMPAR A LENTE DE IMERSÃO, desligando-se em seguida a tomada da corrente elétrica

VI. Recomendações com o uso do microscópio

a) Conservar o microscópio sempre limpob) Não deixar o microscópio ligado quando não estiver utilizandoc) Quando o microscópio for monocular, deve-se trabalhar com a vista ESQUERDA

e a direita deve ser educada para que fique aberta durante todo usod) Evitar molhar o microscópio ao usar as preparações temporárias feitas em águae) As lentes do microscópio custam quase tanto como todas as partes juntas. Usar

sempre para limpá-las lenço de papel ou gazef) Jamais movimente o tubo da ocular para não prejudicar o alinhamento

óptico-mecânicog) Ao transportar o microscópio segure-o pela coluna e a base com ambas as mãos,

nunca pelos parafusos de mecanismos macro ou micrométricoh) Após o uso, recolocar sob o plástico para que não se encha de poeira

VII . Exercício

1)Colocar dois fios de cabelos, de pessoas e de cores diferentes, em cruz numa lâmina.

Iluminar o aparelho e focalizar o material empregado com o procedimento aprendido.

Observar os fios de cabelo, movimentando várias vezes o parafuso micrométrico, para ter idéia da distância e da profundidade.

2) Recortar uma letra ( a menor ) de jornal e adicionar uma gota de água entre lâmina e lamínula. Utilizar as lentes de pequeno, médio e grande aumentos.

VII. Questionário

1) Você percebe qual dos dois fios está por cima ?2) Pode ajustar o foco para diferentes níveis ?3) É possível distinguir variações nas tonalidade dos fios de cabelo ?4) Explique as observações que conseguiu fazer5) Conceitue poder de ampliação do sistema ( P. A. S ) 6) Determine os P. A. S utilizados7)Enumere as partes mecânicas do microscópio e diga as suas funções 8)explique as funções dos componentes do aparelho de iluminação

9) Identifique cada componente da parte óptica de formação de imagem do microscópio óptico

10) Cite os componentes do aparelho de ampliação11) Conceitue profundidade de campo12) Focalize no menor tempo que puder, uma preparação histológica, usando as

objetivas à seco13) Calcule o aumento final em que a preparação está analisada

MÉTODO IMEDIATO

I. Introdução

O estudo microscópico das células é limitado tanto pelo microscópio, quanto pelo modo de preparo do espécime para visualização. As células e tecidos vivos oferecem dificuldades de serem vistos diretamente ao microscópio comum.

Uma célula viva entretanto, é sempre mais fascinante do que uma célula morta. Várias partes da célula viva podem se salientar em nítidos contrastes, quando analisados em instrumentos especiais, como é o caso do microscópio de contraste de fase, em que a luz passando através dos cristais, salienta os detalhes das estruturas da célula estudada. Sob o microscópio de campo claro ou convencional essa célula apareceria quase sem estruturas visíveis. Entretanto, apenas um instrumento ou técnica não é usualmente suficiente, e vários métodos são freqüentemente empregados antes que uma resposta possa ser encontrada para o problema a ser investigado. Portanto, o citologista possui um grande e variado arsenal de instrumentos a uma grande quantidade de recursos para fazer que a célula mostre seu segredos.

Os métodos de observação das células podem ser classificados em dois grupos:

1- Métodos de observação após a morte ( após fixação ) ou mediatos;2- Métodos de observação in vivo ou imediato, que por sua vez podem ser feitos em:

2.1) Exame à fresco : * Direto * Indireto

2.2) Exame após coloração vital : * Intravital * Supravital

O exame à fresco é o que se faz sem coloração e sem nenhum outro artifício de técnica.

É direto quando efetuado em material transparente examinado diretamente ao microscópio no organismo intacto.

É indireto quando feito em material vivo, mas retirado do organismo e observado entre lâmina e lamínula.

O exame após coloração vital é aquele que se faz em células vivas coradas com corantes diluídos, para não afetarem a vida celular. A coloração é dita intravital quando feita em organismo íntegro e supravital quando em células ou tecidos vivos retirados do organismo.

Os exames à fresco e após coloração vital são muito favoráveis ao estudo de citofisiologia e histofisiologia, pois permitem observar diferentes tipos de movimento, aspecto da ingestão e excreções de substâncias metabólicas, assim como aspectos da reprodução celular, coleta de fluidos das estruturas glomerulares e tubulares do rim, etc.

II. Objetivos

a) Identificar protozoários pelo exame imediato à fresco diretob) Identificar células epiteliais pelo método imediato à fresco indireto e pós coloração.

III. Material

- Microscópio óptico- Água estagnada - Espátula de madeira- Corante vital ( Azul de metileno )- Água destilada- Lâmina e lamínula- Pipeta

IV. Procedimento

1) Colocar com a pipeta duas gotas de água estagnada sobre uma lâmina, cobrindo-a com uma lamínula. Observar os protozoários existentes com as objetivas de 3.2x, 10x, 40x.

2) Com uma espátula de madeira, fazer uma raspagem da mucosa que reveste as bochechas. Em seguida, espalhar sobre a lâmina e cobrir com a lamínula. Observar as células epiteliais com as objetivas de 3.2x, 10x, 40x.

3) retirar a lâmina da preparação anterior e colocar duas gotas do corante vital. Observar com as objetivas de 10x e 40x as células epiteliais com corante.

V. Exercício de Fixação

1) Definir o que é método imediato2) Quais os tipos de exame do método imediato?3) Conceituar o exame á fresco direto4) Quando você observou as células epiteliais pelo exame indireto, quais os

componentes celulares que facilmente foram identificados ?5) O exame à fresco indireto pode sofrer coloração ? Como ?6) Qual a finalidade do uso numa preparação de um corante vital ?7) Identificar em cada exame efetuado o tipo de método biológico utilizado.

MÉTODO MEDIATO

I. Introdução

O avanço do conhecimento no campo da biologia celular, dependeu e ainda depende do progresso metodológico e instrumental. A célula viva só pode ser estudada com o microscópio de luz, uma vez que as observações ao microscópio eletrônico são realizadas no vácuo. Porém, nem todas as observações podem ser efetuadas em células vivas, uma vez que os índices de refração de seus vários componentes são muito próximos entre si, o que dificulta sua discriminação.

Indiferentemente aos instrumentos utilizados ou ao método de preparação das células para o exame, as suas partes que estão sendo investigadas devem distinguir-se claramente das regiões imediatamente circundantes. Costuma-se então fixá-las e a seguir submetê-las a processos de coloração que melhor evidenciam sua subestrutura ou componentes.

A maior parte dos estudos citológicos é realizada em cortes de tecidos que são conservados entre lâmina e lamínula, usualmente chamados de preparações histológicas ou simplesmente lâmina. Para obtenção destas lâminas, segue-se uma seqüência ou etapas que se inicia pela coleta e fixação dos tecidos em um líquido adequado.

FIXAÇÃO : é uma maneira que visa manter as estruturas biológicas de modo definitivo, isto é, evita a deterioração dos tecidos durante os vários procedimentos que permitem a realização de técnicas citológicas, necessárias para o estudo da célula ou tecido.

INCLUSÃO e IMPREGNAÇÃO : é a etapa que tem como finalidade impregnar os tecidos com uma substância de consistência firme que permite em etapa posterior cortá-los em fatias finas. A quase totalidade das inclusões é feita em parafina, por ser uma substância mais simples e de bons resultados. A inclusão conta com duas fases : desidratação, diafanização e a impregnação. Existem outras substâncias como a celoidina, ágar-ágar, goma arábica, carbowax que fazem o mesmo papel. O carbowax é o nome comercial de uma cera sintética hidrossolúvel.

MICROTOMIA : Uma das etapas mais importantes e, das mais difíceis da técnica histológica. Consiste, em obter cortes sucessivos dos blocos de para fina contendo fragmento de tecido, incluído num bloco.

Os cortes são feitos através de um aparelho especial - o micrótomo - que desloca o bloco, contra uma lâmina de aço afiada, deixando uma fina fatia do órgão incluído.

É extremamente importante que a lâmina esteja muito bem afiada. O micrótomo tem um botão que regula a espessura dos cortes, sendo que nesta técnica utilizamos corte de 5 a 7 m.

Quando necessitamos cortes com urgência ou casos especiais, como os exames realizados durante o ato cirúrgico, recorremos a técnica de congelação, que é um processo em que o tecido é fixado ou não, é submetido a um já to de CO2 sob pressão, congelando instantaneamente a água dos tecidos, dando consistência suficiente para serem cortados.

COLORAÇÃO : consiste em corar em diferentes cores, as estruturas celulares nos cortes do tecido, utilizando-se corantes específicos, que não atingem os componentes estruturais da célula e ou dos tecidos, de maneira que permite distinguí-los em cores diferentes e contrastantes, devido a especificidade de cada estrutura em relação ao corante utilizado. Em casos excepcionais um corante pode reagir no tecido, assumindo porém, uma cor diferente da original, é o fenômeno ao qual chamamos de metacromasia.

Geralmente os corantes agem como bases ou ácidos, e a coloração é uma verdadeira química entre o corante e os tecidos. Em outros casos, a causa da coloração não parece ser química, mas física, dependendo da velocidade de absorção dos corantes à estrutura.

A grande maioria dos corantes são diluídos em água ou álcool fraco, neste caso há necessidade de se retirar a parafina e hidratar os cortes. Este procedimento se faz mediante uma série de banhos de xilol, álcool e água numa seqüência inversa à impregnação, que são : desparafinização e hidratação dos cortes.

MONTAGEM: é uma etapa na qual iremos selar o corte entre lâmina e lamínula, que consiste em colocar uma gota de resina líquida sobre o corte e cobri-lo com uma lamínula. Após algum tempo a resina seca ( pode também ser feita em uma estufa ) e obtendo-se assim um preparado permanente, que se for bem feito, durará dezenas de anos.

O método mediato em todo o seu procedimento, pode sofrer modificações, quando da utilização de alguns tecidos como o sangüíneo, fazendo com que nem todas as etapas sejam realizadas.

O método mediato em todo o seu procedimento, pode sofrer modificações quando da utilização de alguns tecidos como o sangüíneo, fazendo com que nem todas as etapas sejam realizadas.

II. Objetivos

a) Identificar as etapas do método mediato aplicadas na técnica de esfregaço sangüíneo

b) Distinguir a função de cada substância aplicada nesta técnicac) Identificar ao M.O as células sangüíneas fixadas e coradas.

III. Técnicas para esfregaço sangüíneo

MATERIAL

- Lâminas- Lanceta- Algodão- Álcool- Água destilada- Corante Panótico Rápido- Microscópio óptico- Óleo de imersão- Luvas cirúrgicas

IV. Procedimento

1) Fazer o puncionamento do dedo médio do paciente2) Colocar uma gota de sangue, a 1-1,5cm da extremidade da lâmina3) Colocar o lado estreito da lâmina, com o qual se faz o esfregaço, num ângulo de

45o com a face superior da lâmina4) Fazer com a lâmina um ligeiro movimento para trás até tocar na gota de sangue,

deixando então que a gota se difunda uniformemente, ao longo de toda a borda, por capilaridade

Fixador – MetanolI Corante – XantenosII Crorante - Thiazinas

5) Levar a lâmina para a frente, de forma que ela carregue a gota de sangue, que se estenderá numa camada delgada e uniforme

6) Secar imediatamente o esfregaço, agitando a lâmina ao ar ou com o auxílio de um ventilador

7) Mergulhar por 3 vezes a lâmina em cada um dos 3 componentes do kit, lembrando de deixar escorrer o excesso pelas paredes do recipiente.

8) Cobrir a lâmina com água destilada e em seguida fazer uma mistura homogênea, movimentando a lâmina

9) Lavar em água (que pode ser água de torneira em um Becker)10) Observar ao M.O a lâmina preparada com as objetivas de 10x, 40x e 100x

V- Tipos celulares sanguíneos:.a) Hemácias : São os tipos celulares predominantes em seu esfregaço, podendo ser encontrados

em todas as regiões da lâmina.

b) Leucócitos ou glóbulos brancos: Normalmente se concentram nos bordos do esfregaço e são de vários tipos:

1- Monócitos:São os maiores da linhagem apresentando o núcleo tendendo a forma de rim.

2 – Linfócito- Possuem núcleo grande e esférico ocupando praticamente todo o citoplasma.

3- Eosinófilo:Seu núcleo é bilobulado, apresentando numerosas granulações em seu citoplasma.

4- Neutrófilo:Apresenta o núcleo polilobulado (2 a 5 lóbulos), apresentando também granulações em seu citoplasma.

5- Basófilos:Seu núcleo é de difícil visualização devido a grande quantidade de granulações em seu citoplasma

Plaquetas:Possuem diâmetro bem menor do que o das hemácias e comumente encontradas agrupadas.

VI. Exercício

1) Defina metacromasia2) Em que método está incluída a técnica do esfregaço sangüíneo ?3) Qual a importância da técnica de preparação definitiva ?4) como você diferencia um monócito de um basófilo?5) Faça desenhos dos vários campos ópticos observados, e identifique os vários tipos celulares sanguíneos de acordo com as explicações dadas no item V.6) Tente pesquisar em casa as devidas funções de cada célula sanguínea observada em laboratório. 7) como você diferencia um eosinófilo de um neutrófilo?

SUPERFÍCIE DE CÉLULAS PROCARIÓTICAS E EUCARIÓTICAS

I. Introdução

Os seres vivos procariontes incluem as Cianofíceas, Bactérias, Micoplasmas e Rickettsias, seres muito simples do ponto de vista estrutural e de tamanho diminutos. No entanto, apesar da simplicidade estrutural, bioquimicamente, as bactérias são bastante complexas, adaptando-se as mais variadas condições climáticas.

As bactérias possuem tamanhos que variam de menos de 1 até 10 m (micrômetros), e de 0,2 a 1 m (micrômetro) de largura. Existem umas bactérias semelhantes a bastões (bacilos), esféricos (cocos) e formas espiraladas de bactérias (espiroquetas); e em grande parte são as bactérias de formas unicelulares individuais, no entanto algumas são encontradas como filamentos de células frouxamente agrupadas. As bactérias esféricas ocorrem em algumas espécies em grupos de dois - diplococos, ex: gonococos, em cadeia longas - estreptococos, ou em grupos irregulares, como um cacho de uva - estafilococos.

As bactérias e algas cianofíceas são envolvidas por uma membrana plasmática, e esta, por uma parede de proteoglicanas, que confere proteção e controle osmótico. Além da parede, as bactérias podem apresentar uma cápsula mucopolissacarídica, que confere à bactéria poder patogênico.

Os seres eucarióticos incluem os animais, vegetais e fungos. São seres mais complexos, cujas células apresentam riqueza de organelas em grande parte individualizadas por membranas, que contribuem para melhor divisão funcional entre as células, tornando-as mais eficientes. As células vegetais são envolvidas pela membrana e por uma parede celulósica, bem visível ao M.O. A superfície das células animais é envolvida por uma cobertura celular ou glicocálix.

II. Objetivos

- Diferenciar seres procariontes e eucariontes- Reconhecer as características básicas de um ser procarionte e um ser eucarionte- Identificar bactérias e sua morfologia ao M.O.- Citar as estruturas formadoras dos envoltórios das células procariontes e

eucariontes.

III. Material

- Microscópio óptico- Lâminas e lamínulas- Lâminas permanentes com bactérias: cocus e bastonetes gram + e -- Alface (raiz)- Lâmina com secreção oro-faríngea- Lâminas permanentes com células animais (cortes do intestino )- Folhas de Elodea canadensis- Pipeta- Óleo de imersão- Algodão e /ou gaze

IV. Procedimento

a) Lâmina de secreção oro-faríngea, analisar nas objetivas de 10x, 40x e 100x, para observação das formas bacterianas.

b) Lâmina de corte do intestino para observação da cobertura celular , analisar nas objetivas de 10x, 40x e 100x, para observação do glicocálice.

c) Lâmina para observação de protozoários, pingar uma gota da água estagnada, sobre a lâmina, cobrir com a lamínula e observar possíveis protozoários, nas objetivas de 3,2x, 10x e 40x.

d) Lâmina com folhas de Elodea brasiliensis canadensis , para observação das células vegetais, nas objetivas de 3,2x, 10x e 40x.

QUADRO PARA FIXAÇÃO DA ATIVIDADE PRÁTICA

Lâmina material célula morfologia método desenho

V- Exercício de fixação:

1- Que envoltórios recobrem a membrana das células bacterianas?2- Qual a composição do corante de Gram?3- De acordo com a composição da parede bacteriana, discuta porque algumas são

denominadas Gram+ e outras Gram- e porque isso ocorre.

VI- Perguntas para preleção dialogada: Turma A e turma B

MEMBRANA E TRANSPORTE

I. Introdução

A membrana plasmática ou plasmalema é uma película finíssima de cerca de 75 m de espessura, elástica, regenerável, com semipermeabilidade seletiva, que reveste todas as células, tanto eucariotas quanto procariotas. Sua tensão superficial é pequena e mantém a composição química da célula com características específicas, diferente da do ambiente extracelular.

A membrana serve como regulador das trocas entre a célula e o ambiente extracelular. Essas trocas químicas podem ser por transporte passivo ou por transporte ativo. No primeiro a membrana se deixa atravessar por moléculas e íons, sem ter gasto de energia, ou seja, a favor do gradiente de concentração. No segundo, ocorre a passagem de íons e partículas vão, de sua concentração menor para a maior e a célula por isso, gasta energia.

As substâncias lipídicas ( óleo e gorduras ) ou solúveis em lipídios atravessam a membrana com maior velocidade que as demais substâncias, isto porque ela é essencialmente fosfolipídica.

As células freqüentemente são hipotônicas com maior concentração de soluto no seu interior, que o líquido que está em contato com elas. A água portanto, entra nelas passivamente por osmose, é o fenômeno da desplasmólise.

O fenômeno inverso pode ser observado : como por exemplo em eritrócitos humanos e em células vegetais, quando colocadas numa solução hipertônica, elas diminuem de volume, a PLASMÓLISE, devido a perda de água para o meio externo.

A célula vegetal, diferente da animal, possui numa posição mais superficial à membrana, a parede celular, estrutura semi-rígida, permeável e constituída de polissacarídeos ( lignina, substâncias pectíneas e celulósicas ) que confere proteção e apoio mecânico célula, deformando-se e expandindo-se à medida que ela cresce e se diferencia. Não é porém uma barreira impermeável, possui orifícios por onde passam pontes de citoplasma entre duas células vizinhas, os PLASMODESMOS.

II. Objetivos

- Distinguir as diferenças morfológicas em células vegetais e animais, ocorridas durante os fenômenos de desplasmólise e plasmólise.

III. Material

- Lâminas e lamínulas- Microscópio óptico- Tubos de ensaio- Pipetas- Soluções hipotônica, isotônica e hipertônica de KCl ou NaCl- Folha de Elodea canadensis- Eritrócitos humanos

IV. Procedimento

-Fazer a experiência para a observação através do M.O, da plasmólise e desplasmólise, com células vegetais e eritrócitos humanos.

- Faça primeiramente a observação de uma folha de Elodea canadensis com água potável (isotônica).

- Em seguida, adicione algumas gotas de solução salina a 1,5% (hipertônica)- Em seguida, coloque água destilada na preparação, para retirar o excesso.- Repita a operação com solução a 0,4% (hipotônica), observando as alterações

morfológicas nas células.- Faça todo o processo de análise microscópica, utilizando uma mistura de

sangue humano com as soluções salinas.- Registre na tabela o que foi analisado ao M.O.

Lâmina material célula morfologia soluções fenômeno desenho celular salinas observado

V. Discussões

1) Que modificações você observou nas células após adicionar a solução de KCl ou NaCl a 1,5% ?

2) Explique o fenômeno que você observou3) Qual a modificação provocada pela solução a 0,4% de KCl ou NaCl ? A parede celular sofreu alguma modificação ?4) Explique o fenômeno observado5) Como se comportam os eritrócitos com a mudança de salinidade ?

ORGANELAS E INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS

I. Introdução

O citoplasma das células eucarióticas está constituído por uma parte amorfa, contínua a matriz citoplasmática, a qual se encontra repleta de diversos tipos de orgânulos, a maioria dos quais fica bem diferenciada por sistema de membranas.

O poder de resolução do microscópio óptico de luz é muito pequeno para a identificação de todas as estruturas citoplasmáticas.

As organelas citoplasmáticas - formações diversas com função parcialmente conhecidas -, são dificilmente ou incompletamente observáveis ao microscópio óptico e foi necessário o desenvolvimento da microscopia eletrônica para que o conhecimento de suas subestruturas e correlações fisiológicas pudessem ser estabelecidas. Podem ser evidenciadas ao M.O, com metodologia apropriada : Mitocôndrias, Lisossomos, Cloroplastos, Complexo de Golgi e Retículo endoplasmático rugoso. Outras maneiras de análise dessas organelas, podem ser realizadas utilizando o M.O de campo escuro e de contraste de fase, em células vivas sem coloração.

Nas células de animais, como também vegetais, distinguem-se diferentes frações que podem representar produtos do metabolismo, servindo como material de reserva ou então são produtos do catabolismo, que ficam temporária ou definitivamente nos seus citoplasmas.

Células vegetais processam e armazenam substâncias em organóides chamados de plastos, delimitados por duas unidades de membrana, e dependendo do tipo de material armazenado, isto é, com presença ou ausência de pigmentos, esses plastos podem ser classificados em:

1- Cromoplastos: coloridos , contendo pigmentos como os carotenóides e a clorofila., por exemplo xantoplasto- xantenos.

2- Leucoplastos: sem cor e não contendo pigmentos, por exemplo amiloplasto - amido, oleoplasto - gordura e proteoplasto - proteínas.

Os pigmentos lipogênicos são encontrados em numerosas células e aumentam com a idade. Acredita-se que esses pigmentos representam diversos graus de oxidação e polimerização dos ácidos graxos. Por meio de técnica microscópica de fluorescência, podem ser demonstrados em células nervosas, dois tipos de pigmentos: a lipofucsina e o ceróide.

Alterações rápidas na cor dos peixes, da rã, pelas quais se confundem com o ambiente, resultam de respostas de células pigmentares, tais como melanóforos e eritróforos. Dentro dessas células, grânulos de pigmento migram ao longo das vias delineadas por microtúbulos, se dispersando por toda célula ou se concentrando em uma pequena área. A pele e os pêlos humanos, como também da maioria dos mamíferos, possuem subjacentes contra raios ultravioletas da luz solar. A melanina é produzida a partir da diidroxefanilalanina.

CLASSIFICAÇÃO DAS INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS EM CÉLULASANIMAIS

Pigmentos: depósitos de substâncias de cor própria

Endógenos: sintetizados dentro do corpo, a partir de precursores ex: melanina

Exógenos: fabricados fora do corpo e capturados pelas células ex: cartoneis e tatuagens.

Substâncias de Ex; grânulos de glicogênio e gotículas de lipídio. reserva energética.

II. Objetivos- Identificar em preparações definitivas:

a) Lisossomos em neutrófilos e eosinófilosb) Retículo endoplasmático rugoso pela preparação definitiva

- Identificar em preparações imediatas:c) Mitocôndrias pelo método imediato após coloração vitald) Cloroplastos pelo método à fresco direto

III. Material- Microscópio óptico- Lâminas e lamínulas- Lâminas com esfregaço sangüíneo humano- Lâminas de tecido nervoso- Pinça - Tesoura- Espátula de madeira- Óleo de cedro- Papel de filtro- Folhas de Elodea canadensis- Corante Verde jânus- Solução de Lugol- Pipetas- Pedaços de frutas: maçã e banana- Bisturi- Lâminas permanentes de escama de peixe

IV. Procedimento

a) Preparar lâminas com uma folha de Elodea, colocar duas gotas de água e cobrir com lamínula. Analisar os cloroplastos bem visíveis no citoplasma celular, nas objetivas de 3,2x, 10x e 40x.

b) Preparar lâminas com raspagem da cavidade oral, acrescentar duas gotas do corante Verde janus, esperar por três minutos, colocar a lamínula e analisar as mitocôndrias ao M.O, com objetivas de 10x, 40x, 100x

c) Analisar os esfregaços sangüíneos com objetiva de 100x, e identificar os leucócitos granulócitos polimorfonucleares. Nos seus citoplasmas, identificar os lisossomos

d) Analisar a célula nervosa com objetivas de 40x e 100x e identificar no seu citoplasma, o Retículo endoplasmático rugoso ( granulações de Nissl )

e) Preparar lâminas com polpa de banana, colocar uma gota de lugol e cobrir com lamínula. Analisar os amiloplastos bem visíveis no citoplasma celular, nas objetivas de 4x, 10x e 40x.

f) Preparar lâminas com polpa de mamão, colocar duas gotas de água e cobrir com lamínula. Analisar os xantoplastos bem visíveis no citoplasma celular, nas objetivas de 4x, 10x e 40x.

g) Analisar lâminas permanentes de escama de peixe, usando as objetivas de 4x, 10x ,40x e 100x, para identificar as inclusões de meanina.

V. Exercícios

TABELA DE EXERCÍCIO

lâmina material método usado células organóide desenho tipo forma função

NÚCLEO INTERFÁSICO

I. Introdução

O núcleo é a unidade de comando da célula; é essencial para a continuação do metabolismo e funções celulares, devido ao seu papel primário na produção do RNA necessário à síntese de protéica.

Cromossomos e cromatina são dois estados morfológicos das entidades celulares dos seres eucariontes que têm como função armazenar, transmitir e expressar a informação genética neles contida.

No núcleo interfásico não observamos cromossomos, pois os mesmos estão desespiralizados formando a cromatina em forma de filamentos no núcleo e os cromossomos aparecem, geralmente, como bastonetes condensados durante a ocorrência da divisão celular, particularmente na metáfase.

Em 1928, Heitz classificou a cromatina em hetero e eucromatina, segundo as características estruturais. Definiu heterocromatina como regiões do cromossomo que permanecem condensadas durante a intérfase e são consideradas geneticamente inativas, até o momento segundo a grande maioria dos pesqisadores, enquanto a eucromatina é a porção não condensada na intérfase e, portanto, geneticamente ativa.

A heterocromatina pode ser constitutiva ou facultativa. Chama-se constitutiva aquela que está permanentemente condensada e facultativa aquela que está condensada apenas em certos tipos de célula ou em estágios especiais do desenvolvimento, como, por exemplo, um dos cromossomos X que formam par nas células de mamíferos que se inativa para formar as estruturas conhecidas como Corpúsculo de Barr nas celulas interfásicas da mucosa oral ou vaginal e Baqueta de Tambor vizualizada nos Neutrófilos.

Morfologicamente, os núcleos exibem formas diversas de acordo com o tipo celular. Esta diferença morfológica entre os núcleos nos permite, por vezes, identificar as células; é o que ocorre, por exemplo, com a linhagem de células brancas do sangue. Nos leucócitos, os núcleos podem ser bi ou trilobulados, condensados (ocupando quase toda a célula), em forma de rim, etc., variando de acordo com a célula.

II. Objetivosa) Caracterizar o núcleo interfásico com sua respectivas estruturasb) Identificar os componentes nucleares visíveis ao M.O..c) identificar o tipo de leucócito de acordo com a forma do núcleo.d) distinguir em células femininas a heterocromatina sexual (corpúsculo de Barr e

baqueta de tambor)e) reconhecer a eucromatina e a heterocromatina em núcleos interfásicos.

III. Material- Microscópio óptico- Lâminas com esfregaço sangüíneo humano- Lâminas de esfregaço da mucosa vaginal.- Lâminas de corte de medula- Lâminas com cortes de fígado- Óleo de imersão

IV. Procedimento1) Observe ao M.O o esfregaço sangüíneo, utilizando as objetivas de 10x, 40x e 100x

2) Observe a lâmina com epitélio, seguindo a mesma seqüência de lentes da observação anterior

3) Observe a lâmina com células do fígado, com a mesma seqüência de lentes das observações anteriores

4) Observe a lâmina com células vegetais (raiz de cebola), utilizando as mesmas seqüências das lentes, e em todas as lâminas observadas, observar e distinguir a cromatina interfásica.

V. Exercício

QUADRO PARA FIXAÇÃO DA ATIVIDADE PRÁTICA.

LÂMINA CÉLULA FORMA DO NÚCLEO

ESTRUTURAS NUCLEARES

DESENHOS

Divisão celular I – MITOSE

I. Introdução

Todas as células de um organismo multicelular são descendentes de células originais, através do processo de divisão que envolve duas etapas : duplicação do núcleo e divisão do citoplasma. A função primária da mitose é a de construir uma cópia exata de cada célula nas divisões subsequentes.

A divisão mitótica quer em animais, quer em vegetais tem quatro estágios principais : Prófase, Metáfase, Anáfase e Telófase. Alguns autores, consideram uma quinta fase, a Prometáfase, antecedente à metáfase. Deve-se salientar entretanto, que esta é uma classificação meramente didática, pois o conjunto de fenômenos que caracteriza a mitose é dinâmico e contínuo.

Os produtos da mitose são células-filhas e podem não ser de tamanhos iguais, dependendo onde o plano de citocinese seccionou a célula. Embora, não havendo componentes citoplasmáticos, as células-filhas normalmente contém o mesmo tipo e número de cromossomos e, por conseguinte, possuem exatamente a mesma constituição genética.

II. Objetivosa) Observar as fases do ciclo mitótico ao microscópio óptico pelos métodos imediato

e mediato.b) Caracterizar morfologicamente as diversas fases da mitose animalc) Reconhecer e desenhar as diversas fases da mitosed) Citar as principais diferenças do processo mitótico entre animais e vegetaise) Observar a consequência do antimitótico na divisão celular.

III. Material

- Lâmina permanente com tecido vegetal- Lâmina permanente com cultivo de linfócitos humano- Meristemas de raiz de cebola fixados e estocados.- Ácido acético 45%- Lâminas e lamínulas.- Estiletes (seringas descartáveis)- Papel de filtro e microscópio óptico.

IV. Procedimento - Depois de analisar o ciclo celular preencha o quadro à baixo:

/// Célula Fase Característica Método Desenho1

ANEXO:

Procedimento para obtenção do ciclo mitótico utilizando meristemas de raiz de cebola Allium cepa.

No experimento seguinte serão utilizados meristemas de raiz de cebola onde suas estruturas foram fixadas com Carnoy 3:1 (3 partes de álcool etílico para 1 parte de ácido acético glaceal) por 24h. Após a fixação, os meristemas foram estocados em álcool 70% até sua utilização.

Vale salientar que para a obtenção do ciclo mitótico os meristemas devem ser hidrolizados em HCL a 5N cuja finalidade é facilitar o esmagamento conforme etapas a seguir:

1. Três banhos em água destilada por cinco a dez minutos.2. Colocar as raizes em cima do papel de filtro para retirar o

excesso de água e transferir para um recipiente contendo HCL 5N por 15 à 20 minutos.

3. Transferir as raizes para água destilada.4. Com uma pinça colocar uma raiz numa lâmina limpa.5. Secar ao redor da raiz com cuidado.6. Com um estilete, isolar o meristema e desprezar o resto.7. Fragmentar ao máximo o meristema com a ponta do estilete.8. Colocar uma gota de ácido acético 45% em cima dos

fragmentos.9. Colocar com cuidado um lamínula sobre o meristema

despedaçado.10. Com o dedo indicador – prender com cuidado – a extremidade

da lamínula e bater levemente com o estilete em cima e ao redor dos fragmentos, objetivando seu espalhamento.

11. Enxugar o preparado com papel de filtro para retirar o excesso de líquido, pressionando levemente sem deixar a lamínula escorregar.

12. Observar ao M.O com condensador abaixado, simulando um contraste de fase.

BIBLIOGRAFIA

ALBERTS, B.- 1999- Fundamentos da Biologia Celular, Ed. Artes Médicas, Porto Alegre.

De ROBERTIS – H I B. – 2010- Bases da Biologia celular e molecular, Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro

JUNQUEIRA, L. C. U. e CARNEIRO, J. -2012– Biologia celular e molecular. Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.

Di FIORE. Atlas de Histologia. Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.

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