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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁFACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGALMESTRADO EM PATOLOGIA

ROSÂNGELA PINHEIRO GONÇALVES MACHADO

PERFIL CLÍNICO DOS PACIENTES COM LLC DO AMBULATÓRIO DO HUWC/HEMOCE: CORRELAÇÃO COM MARCADORES BIOLÓGICOS DE

PROGNÓSTICO

FORTALEZA2009

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PERFIL CLÍNICO DOS PACIENTES COM LLC DO AMBULATÓRIO DO HUWC/HEMOCE: CORRELAÇÃO COM MARCADORES BIOLÓGICOS DE

PROGNÓSTICO

Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, Curso de Pós-Graduação em Patologia, como requisito para obtenção do título de mestre em Patologia.

Orientador: Dr. José Ajax Nogueira Queiroz Co-orientador: Dr. Ronald Feitosa Pinheiro

FORTALEZA 2009

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M133p Machado, Rosangela Pinheiro Gonçalves Perfil clínico dos pacientes com LLC do ambulatório do

HUWC/HEMOCE: correlação com marcadores biológicos de prognóstico. / Rosângela Pinheiro Gonçalves Machado. – Fortaleza, 2009.

98f. : il.

Orientador: Prof. Dr. José Ajax Nogueira Queiroz. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará. Curso de Pós-

Graduação em Patologia, Fortaleza-Ce, 2009.

1. Estadiamento de Neoplasias. 2. Leucemia Linfocítica Crônica de Célula B. 3. Diagnóstico clínico. 4. Prognóstico. I. Queiroz, José Ajax Nogueira (Orient.) II. Título.

CDD T616.99419

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PERFIL CLÍNICO DOS PACIENTES COM LLC DO AMBULATÓRIO DO HUWC/HEMOCE: CORRELAÇÃO COM MARCADORES BIOLÓGICOS DE PROGNÓSTICO

Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, Curso de Pós-Graduação em Patologia, como requisito para obtenção do título de mestre em Patologia

Aprovado em: _____/_____/ 2009

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________Dr. José Ajax Nogueira Queiroz (Orientador)

Universidade Federal do Ceará - UFC

________________________________________________Prof. Dr. Yuri Vasconcelos Pinheiro

Instituto Goiano de Hematologia-INGOH

________________________________________________Dr. Francisco Dário Rocha Filho

Universidade Federal do Ceará-UFC

________________________________________________Dr. Herivaldo Ferreira da Silva

Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará – HEMOCE

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A Deus, fonte de vida, amor e sabedoria que ajuda-me nos trabalhos e faz frutificar meus esforços.

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AGRADECIMENTOS

Obrigada ao bom Deus, onipotente, onipresente, onisciente que mantem o bem que por mim iniciou.

Obrigada ao Prof. Dr. José Ajax Nogueira Queiroz meu orientador, pela sua força, determinação, competência e, principalmente, amizade. Uma pessoa rica não só em conhecimentos, mas também como ser humano de beleza interior inquestionável.

Obrigada ao Prof. Dr. Ronald Feitosa Pinheiro, meu co-orientador, por toda a ajuda, gratuidade, disponibilidade e conhecimentos que me ofereceu. Você foi essencial pelo sucesso do trabalho.

Obrigada a minha irmã Prof. Dra. Romélia Pinheiro Gonçalves Lemes pelo incentivo, amor, companheirismo e participação em todo o processo deste trabalho, tornando-se uma colaboradora fundamental.

Obrigada à Coordenação do Mestrado em Patologia pelo esforço em ajudar a todos os mestrandos. Parabenizo este curso pelos novos empreendimentos os quais resultarão em grandes conquistas.

Obrigada à Dra. Luciana Maria de Barros Carlos, Diretora do HEMOCE, pela amizade e disponibilização da estrutura dessa instituição para o desenvolvimento da pesquisa, e a todos os seus funcionários que colaboraram.

Obrigada à Profa. Dra. Silvia Maria Meira Magalhães, Chefe do Serviço de Hematologia do HUWC, pelo seu profissionalismo e apoio logístico através do ambulatório, à equipe que assiste aos pacientes e aos serviços vinculados.

Obrigada a todos dos Laboratórios: de Citogenética Clássica e Molecular, de Marcadores Celulares, de Citologia, de Hematologia e do LARP pela participação e conhecimentos compartilhados.

Obrigada à Gabriela, Juliana, Thiago Dias e José Barbosa pela valiosa colaboração.

Obrigada à Paula, secretária do mestrado, Gabriela e Juliana pelo apoio e amizade.

Obrigada aos pacientes participantes da pesquisa pela confiança e colaboração.

Agradeço às pessoas que direta e indiretamente colaboraram para o êxito desse estudo.

Obrigada aos meus pais, esposo, filhos, irmãos e à minha família pelo amor, apoio e renúncia da minha presença nesse período e durante toda minha caminhada. Vocês são a alegria maior da minha vida.

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“As pessoas que vencem neste mundo são as que procuram as circunstâncias de que precisam e, quando não as encontram, as criam”.

Bernard Shaw

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RESUMO

Introdução: A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é uma neoplasia caracterizada pela proliferação clonal de linfócitos de aspecto maduro. Apresenta curso clínico e prognóstico heterogêneo. Rai e Binet criaram sistemas de prognósticos clínicos que classificam a LLC em baixo, intermediário e alto risco. Surgiram os marcadores biológicos de prognóstico que aumentaram o poder preditivo na LLC. Objetivo:Caracterizar os marcadores clínicos e biológicos de pognóstico dos pacientes com LLC do ambulatório do Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC)/Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará/HEMOCE. Metodologia: Trata-se de um estudo retrospectivo, transversal e observacional com 43 pacientes portadores de LLC, recrutados de forma randomisada, no período de agosto de 2007 a Junho de 2009. Foram coletados dos pacientes dados nos prontuários, entrevista e três amostras com 5,0 ml de sangue venoso periférico em ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) para o hemograma, por metodologia automatizada no equipamento CellDyn®, modelo 3.500; dosagem da ß2-microglobulina (ß2-M) sérica pelo teste quantitativo automatizado no aparelho MINI- VIDAS (BioMérieux®) e imunofenotipagem em citômetro de fluxo Beckman Coulter® EPICS XL-MCL (Coulter). Em seguida, foi coletado pelapunção da medula óssea o aspirado para o mielograma e 4 a 5 ml, em 2 ml de heparina, para a avaliação citogenética por banda–G. A análise dos dados foi realizada utilizando os programas estatísticos Biostat 4.0 e GraphPad Prism (versão 5.0), o teste Coeficiente de Phi e o teste Coeficiente de Contingencia C. Os testes de Fisher e Qui-quadrado com índice de significância α = 5%. Kaplan-Meier para função de sobrevivência e o teste log rank. Os resultados foram gerados usando o software livre R, versão 2.7. Resultados: Os pacientes (74,42%) tinham idade acima de 60 anos; 58,14% homens e 41,86% mulheres; a maioria (32,56%) trabalhava na agricultura; pardos (74,42%), procedentes da capital (53,49%); história familiar de LLC desconhecida (46,51%); sintomáticos ao diagnóstico (53,49%); com comorbidades (hipertenção arterial e Diabetes Melitus) (51,16%); estágio 0 (34,89%), I e II (51,16%), III e IV (13,95%) de Rai; A (44,19%), B (44,19%) e C (11,62%) de Binet ; tempo de duplicação linfocitára (TDL) ausente (81,40%); biópsia da medula óssea com padrão não difuso (57,14%); a desidrogenase láctica (LDH) normal (83,72%), avaliados ao diagnóstico.Os exames obtidos durante a evolução dos pacientes revelaram um perfil imunofenotípico clássico de LLC- B, com expressão de CD5+, CD19+, CD23+ e imunoglobulina de superfície de baixa expressão; a maioria com Zap-70 negativa (77,50%); expressão de CD38 negativa (73,81%); ß2-M aumentada (55,81%); cariótipo normal (44,4%) e alterações genéticas em 11, 11% pela citogenética clássica. As curvas de sobrevidas dos pacientes com Zap-70 e CD38 negativos apresentaram maior tempo de sobrevida livre de tratamento. Conclusão:Os pacientes avaliados eram idosos, com tendêndia ao diagnostico tardio decorrente do contexto socioeconômico; apresentaram LLC indolente, pelos critérios de estadiamentos clássicos (Rai, Binet, TDL, padrão da histologia da medula óssea, LDH) e biológicos (as expressões da Zap-70 e CD38), exceção à ß2-M, porém, sem significância. Aqueles com Zap-70 e CD38 negativos apresentaram maior sobrevida livre de tratamento. Pacientes do sexo masculino apresentaram evolução e prognóstico semelhantes ao feminino. O tratamento prevalente foi clorambucil associado à prednisona e não levou os pacientes à remissão clínica ou hematológica. Os marcadores de prognósticos tenderam à correlação na identificação dos pacientes dentro dos subgrupos de riscos.

Palavras-chave: Leucemia Linfocítica Crônica de Células B. Diagnóstico clínico. Estadiamento de Neoplasias. Prognóstico.

8

ABSTRACT

Introduction: Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a neoplasm characterized by clonal proliferation of lymphocytes of mature appearance. Clinically and prognostic heterogeneous. Rai and Binet established clinical prognostic systems that classify LLC in low, intermediate and high risk. Soon, the biological markers of prognosis that increased the predictive power of the LLC. Objective: To characterize the clinical and biological markers of pognóstico of patients with CLL the outpatient department of a university hospital (HUWC) / Center for Hematology and Hemotherapy Ceará / HEMOCE). Methodology: This is a retrospective, cross-sectional and observational 43 patients LLC, recruited so randomisation, from August 2007 to June 2009. We collected patient data from medical records, interview and three samples with 5.0 ml of peripheral venous blood in ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for blood, for automated methodology CellDyn ® equipment, model 3500, measurement of ß2-microglobulin (ß2 - M) serum by automated quantitative test on the device MINI-VIDAS (BioMérieux ®) and immunophenotyping on flow cytometry Beckman Coulter ® EPICS XL-MCL (Coulter). Then collect the puncture of bone marrow aspirate and bone marrow examination for 4 to 5 ml in 2 ml of heparin for cytogenetic evaluation by Banda - G. Data analysis was performed using the statistical programs Biostat 4.0 and GraphPad Prism (version 5.00), the Phi coefficient test and the test coefficient Contingency C. The Fisher and chi-square test with significance level α = 5%. Kaplan-Meier survival function and log rank test. The results were generated using the free software R, version 2.7. Results: The patients (74.42%) were aged over 60 years, 58.14% 41.86% men and women, the majority (32.56%) worked in agriculture; brown (74.42%), coming the capital (53.49%), family history of unknown LLC (46.51%), symptomatic at diagnosis (53.49%), with comorbidity (arterial hypertension and Diabetes Mellitus) (51.16%), stage 0 ( 34.89%), I and II (51.16%), III and IV (13.95%) Rai, A (44.19%), B (44.19%) and C (11.62%) of Binet, lymphocyte doubling time (SRT) absent (81.40%), bone marrow biopsy with non-diffuse pattern (57.14%), lactate dehydrogenase (LDH) normal (83.72%), valued at diagnosis. The tests obtained during the course of the patients showed an immunophenotypic profile of classic B-CLL with expression of CD5 +, CD19 +, CD23 + surface immunoglobulin and low-expression, most with Zap-70 negative (77.50%); expression CD38 negative (73.81%), beta-2 microglobulin increased (55.81%), normal karyotype (44.4%) and genetic alterations in 11, 11% by classical cytogenetics. Survival curves of patients with Zap-70 negative and CD38 showed longer survival free of treatment. Conclusion: The patients studied were elderly, to encourage improve with late diagnosis due to the socioeconomic context, LLC indolent presented by classical staging criteria (Rai, Binet, TDL, standard bone marrow histology, LDH) and biological (the expression of Zap -70 and CD38), except for beta-2 microglobulin, but without statistical significance. Those with Zap-70 and CD38 negative had higher survival free of treatment. Male patients showed progress and prognosis similar to female. The prevalent treatment was associated with chlorambucil prednisone and did not lead patients to clinical remission or hematologic. The prognostic markers of the correlation tended to identify patients within the subgroups of risk.

Keywords: Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell. Diagnosis, Clinical. Neoplasm Staging. Prognosis

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 6.

Figura 7.

Gráfico 1.

Gráfico 2.

Gráfico 3.

Gráfico 4.

Gráfico 5.

Gráfico 6.

Gráfico 7.

Gráfico 8.

Gráfico 9.

Quadro 1.

Quadro 2.

Quadro 3.

Amostras de sangue periférico da LLC. ....................................................................

Padrão da biópsia de medula óssea na LLC. ............................................................

Análise do Cariótipo por banda G do paciente de número 28, com

resultado 46, XY[13] ...............................................................................................

Análise do Cariótipo por banda G do paciente de número 33, com

resultado 46,XX,del(11)(q23)[7]/46,XX[14] ..........................................................

Análise do Cariótipo por banda G do paciente de número 7, com resultado

46,XX[11] ...............................................................................................................

Análise do Cariótipo por banda G do paciente de número 35, com resultado

material adicional no cromossomo 1 e presença de cromossomo marcador ..........

Estratificação dos pacientes segundo o modo de apresentação da doença, ao

diagnóstico ..............................................................................................................

Estratificação dos pacientes segundo o modo de apresentação da doença, ao

diagnóstico ..............................................................................................................

Estratificação dos pacientes quanto à etnia .............................................................

Classificação dos pacientes em subgrupos de risco baixo, moderado e alto

segundo o sistema de estadiamento clínico de Binet ..............................................

Classificação dos pacientes segundo o marcador de progóstico TDL .................

Curva de sobrevivência estimada pelo Método de Kaplan-Meier para o tempo

sem tratamento dos pacientes segundo Zap-70 .......................................................


sem tratamento dos pacientes segundo CD38 .........................................................


sem tratamento dos pacientes segundo TDL ..........................................................


sem tratamento dos pacientes segundo LDH ..........................................................


sem tratamento dos pacientes segundo o sexo ........................................................

Sistema de estadiamento clínico de prognóstico de Raí .........................................

Sistema de estadiamento clínico de prognóstico de Binet ......................................

Sistema de pontuação característica de leucemia linfocítica crônica .....................

18

19

51

52

53

54

55

44

44

46

46

62

63

64

65

66

23

24

38

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.

Tabela 2.

Tabela 3.

Tabela 4.

Tabela 5.

Tabela 6.

Tabela 7.

Tabela 8.

Tabela 9.

Tabela 10.

Tabela 11.

Tabela 12.

Tabela 13.

Estratificação das características demográficas ao diagnóstico ...................

Estratificação das características clínicas e de prognóstico ao diagnóstico..

Expressão dos antígenos das células clonais da LLC, através da

imunofenotipagem dos pacientes .................................................................

Expressão dos antígenos obtidos através da imunofenotipagem dos

pacientes com leucemia linfocítica crônica ..................................................

Estratificação dos parâmetros de prognósticos realizados em um dado

momento no acompanhamento dos pacientes ..............................................

Estratificação dos pacientes em relação às características da citogenética

associada ao sexo e a idade ..........................................................................

Estratificação dos pacientes em relação à realização ou não do tratamento,

tipo de tratamento e situação atual ...............................................................

Relação dos pacientes com e sem tratamento e a expressão do CD38 ........

Relação dos pacientes com e sem tratamento com os níveis da Zap-70 ......

Estudo de correlação do Zap-70 com as variáveis CD38, TDL, β2-M,

LDH, Padrão da biópsia e linfocitose ..........................................................

Estudo de correlação do Zap-70 com as variáveis estadiamento clínico de

Rai e Binet e com a citogenética convencional ............................................

Estudo de correlação do CD38 com as variáveis TDL, β2-M, LDH,

Padrão da biópsia e linfocitose .....................................................................

Estudo de correlação do CD38 com as variáveis estadiamentos clínicos de

Rai e Binet e citogenética convencional ......................................................

43

45

47

48

49

50

56

57

57

58

59

60

61

11

LISTA DE ABREVIATURAS

LLC

β2-M

Zap-70

CD38

CD2

CD3

CD5

CD19

CD4

CD8

CD7

CD20

CD22

CD23

CD16

CD103

CD56

CD10

CD79b

sIgM

Κ

Λ

FMC7

TDL

LDH

Leucemia linfocítica crônica

Beta 2 microglobulina

Proteína tirosino quinase associada à cadeia ζ, de 70 kDa

Anticorpo monoclonal do antígeno celular 38















Anticorpo monoclonal do antígeno celular 79b

Imunoglobulina M de superfície

Cadeia leve kappa da imunoglobulina

Cadeia leve lambda da imunoglobulina

Anticorpo monoclonal do antígeno celuar FMC7

Tempo de duplicação linfocitária

Desidrogenase láctica

12

SUMÁRIO

11.11.21.31.41.51.61.6.11.6.21.6.31.6.41.6.51.722.12.233.13.23.33.3.13.3.23.3.33.3.43.3.53.3.63.43.5456

INTRODUÇÃO ......................................................................................................Definição .................................................................................................................Epidemiologia .........................................................................................................Etiopatogenia .........................................................................................................Clínica .....................................................................................................................Diagnóstico ..............................................................................................................Prognóstico .............................................................................................................Marcadores de prognóstico clássicos e biológicos na LLC ....................................Marcadores de prognóstico clássicos .......................................................................Marcadores biológicos de prognóstico na LLC .......................................................Estado de mutação do gene da imunoglobulina .......................................................Marcadores biológicos: Zap-70 e CD38 ..................................................................Alterações citogenéticas ..........................................................................................OBJETIVOS ...........................................................................................................Objetivos gerais ......................................................................................................Objetivos específicos ..............................................................................................CASUÍSTICA E MÉTODOS ................................................................................Desenho do estudo ..................................................................................................Casuística ................................................................................................................Metodologia ............................................................................................................Coleta das amostras do estudo .................................................................................Hemograma ..............................................................................................................β-2M .........................................................................................................................Dosagem sérica da desidrogenase láctica (LDH) ....................................................Imunofenotipagem ..................................................................................................Citogenética clássica ...............................................................................................Aspecto ético ...........................................................................................................Análise estatística .................................................................................................RESULTADOS ......................................................................................................DISCUSSÃO ...........................................................................................................CONCLUSÕES ......................................................................................................

13131314161821222226272831333333343434343535363637404041426772

REFERÊNCIAS ................................................................................................................ANEXOS ............................................................................................................................APÊNDICES ......................................................................................................................

739195

13

1 INTRODUÇÃO

1.1 Definição

A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é uma neoplasia linfoproliferativa crônica

caracterizada pela proliferação clonal progressiva de linfócitos pequenos e de aspecto maduro

(linfocitose a partir de 5x109/L), de células B CD5+ e CD19+, no sangue periférico, nos

tecidos linfóides e medula óssea, com conseqüente organomegalia e insuficiência medular

(CHIATTONE, 2005; GHIA et al., 2007; HALLEK et al., 2008a; INAMDAR; BUESCO –

RAMOS, 2007; OLIVEIRA; POLI NETO, 2004; ROBAC, 2007; VAN BOCKSTAELE;

VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009).

1.2 Epidemiologia

A LLC é responsável por cerca de 40% de todas as leucemias dos adultos acima

de 65 anos (HERISHANU; POLLIACK, 2004; LINET; BLATTNER, 1988; SGAMBATI;

LINET; DEVESA, 2003; YAMAMOTO, 2005), ocorre raramente abaixo dos 30 anos e não

existe relato de casos em crianças (DE ROSSI et al., 1989; MONTSERRAT et al., 1991;

YAMAMOTO et al., 2005). Apresenta uma idade média ao diagnóstico de 70 anos para

homens e 74 anos para mulheres (BINET et al., 2006; BROUET, 2003; GARICOCHEA,

2005; MACMAHON; KOLLER, 1957; RAWSTRON et al., 2002; SEGEL et al., 2003; XIE

et al., 2003).

A sua incidência varia também conforme a origem étnica dos pacientes. É mais

freqüente em americanos brancos que em afro-descendentes (3,9/2,8), sendo 5 vezes menor

em americanos descendentes de chineses, japoneses ou filipinos e duas vezes maior em

americanos judeus, quando comparados a americanos não judeus (BINET et al., 2006;

BROUET, 2003; GARICOCHEA, 2005; MACMAHON; KOLLER, 1957). É comum nos

países ocidentais e rara no oriente (YAMAMOTO, 2005). Sua incidência na Inglaterra e País

14

de Gales é de 6/100.000 habitantes/ano com variação entre 1,3 a 13,7/100.000 habitantes/ano

(CARTWRIGHT et al., 1987).

Nos Estados Unidos da América a incidência estimada é de 1%-2% na população

geral, ou seja, 3,5/100.000 habitantes/ano, sendo esta taxa maior em homens do que em

mulheres (5,0/2,5) (BINET et al., 2006; BROUET, 2003; GARICOCHEA, 2005;

MACMAHON; KOLLER, 1957; RAWSTRON et al., 2002; SEGEL et al., 2003; XIE et al.,

2003).

Dados epidemiológicos da LLC na população brasileira, envolvendo razoável

casuística, não foram encontrados na literatura. Há uma citação no trabalho de Redaelli et al.

(2004) referindo uma incidência em torno de 10% (KEATING, 2002; REDAELLI et al.,

2004).

A LLC apresenta uma predisposição familiar (LINET et al., 1989; SELLICK;

CATOVSKY; HOUSTON, 2006; YAMAMOTO, 2005) e é assim classificada quando dois

ou mais membros de uma família a apresentam. Parentes em primeiro grau de pacientes têm

incidência três vezes maior de desenvolver LLC ou outra neoplasia linfóide e maior

freqüência de outras doenças linfoproliferativas (DLPC) (SELLICK; CATOVSKY;

HOUSTON, 2006; YAMAMOTO, 2005).

1.3 Etiopatogenia

Durante muito tempo, a LLC foi considerada uma doença relativamente

homogênea decorrente do acúmulo de linfócitos B monoclonais, imuno-incompetentes e com

alterações nos mecanismos de apoptose. Entretanto, evidências demonstraram a

heterogeneidade da mesma e que as células leucêmicas constituem-se em linfócitos B

maduros, previamente expostos a antígenos, ou seja, provavelmente imunocompetentes

(CHIORAZZI, 2007; GARICOCHEA, 2005).

A etiologia da LLC ainda não está esclarecida e os fatores ambientais, a radiação

ionizante, agentes tóxicos ou virais específicos não têm mostrado associação com o

surgimento da doença exceto nos casos de agricultores e dos contactantes com herbicidas,

15

agentes laranja (herbicida usado no Vietnã) os quais foram relacionados com o surgimento de

LLC (DREXLER et al., 2003; YAMAMOTO, 2005).

Estudos recentes sugerem que a LLC é uma condição dinâmica na qual as células

neoplásicas apresentam níveis mensuráveis de multiplicação e morte e que o índice de

proliferação é maior em alguns clones. A proporção de duplicação ativa dos linfócitos

neoplásicos é de 0,1% a 1% por dia. Quando a taxa de proliferação excede 0,5% por dia a

doença apresenta uma evolução mais grave. Tais subclones podem desenvolver

anormalidades genéticas e apresentarem maior relação entre as taxas de proliferação e morte

celular (CHIORAZZI, 2007; MESSMER; MORENO; MONTSERRAT, 2008).

A descoberta de que o estado mutacional do gene que codifica a expressão da

região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (IGHV) é um marcador de prognóstico

importante, onde a presença de mutação da IGHV resulta em doença com prognóstico

favorável e os casos sem mutação possuem evolução desfavorável, tem orientando o

entendimento sobre a patologia da doença, representando um grande diferencial no

prognóstico da LLC (DIGHIERO; HAMBLIN, 2008; KEATING et al., 2005).

A célula de origem da LLC provavelmente é um progenitor linfóide,

comprometida com a linhagem B, porém com algumas características de linfócitos T,

anormalmente expressas. A evolução destas células para os linfócitos da LLC depende de

estimulação antigênica. Tanto as formas não mutadas como as mutadas expressam BCR

(receptor de células B), mas, aparentemente, as células com mutação são anérgicas

(CALLIGARIS-CAPPIO; GHIA, 2004; MELCHERS et al., 2000; WILLIAM et al., 2002).

As células da LLC derivam de uma população de células B-CD5+ localizadas na

zona do manto dos folículos linfóides, ou seja, são da linhagem B e a imunoglobulina de

superfície da membrana é de baixa densidade (KEATING et al., 2005).

O gene localizado no braço curto do cromossomo 2 codifica uma proteína tirosino

quinase de 70 kDa (Zap-70), essencial na transdução da sinalização dos linfócitos T e células

natural killer. Essa proteína intracelular encontra-se associada à cadeia ζ do complexo

receptor de células T (TCR)/CD3 +, do qual deriva seu nome Zap (zeta associated protein).

Normalmente, as células B não expressam Zap-70, exceto uma subpopulação B com fenótipo

ativado no baço e na tonsila, (NOLZ et al., 2005). Estudos que analisaram o perfil de

expressão gênica pelas técnicas de microarray de cDNA nas células da LLC revelaram que o

clone neoplásico de linfócitos B de certos pacientes expressavam a proteína Zap-70

16

(ROSENWALD et al., 2001; VASCONCELOS et al., 2005; WIESTNER et al., 2003). A

Zap-70 pode ser utilizada como um possível substituto do estado de não mutação do gene da

imunoglobulina (IGHV) para a avaliação prognóstica, correlacionando-se com doença mais

agressiva (GARICHOCEA et al., 2005; KEATING et al., 2005b; YAMAMOTO, 2005).

A baixa expressão de receptor de células B é uma característica dos linfocitos na

LLC (VUILLIER et al., 2005). Porém, os mecanismos para avaliar a etiologia da expressão

reduzida do receptor supracitado permanecem indefinidos. Com a exceção do relato de

mutação no CD79b (THOMPSON et al., 1997), não tem sido reconhecidos defeitos genéticos

nos componentes dos receptores de células B (ALFARANO et al., 1999; PAYELLE-

BROGARD et al., 1999).

Nenhum dos protooncogenes envolvidos na patogênese de outras malignidades de

células B maduras, incluindo BCL-1, BCL-2, BCL-6, PAX-5 e c-Myc, mostram alterações

primárias na LLC (ATHAN; FOITL; KNOULES, 1991; DYER et al., 1994; KEDAR;

BUESO-RAMOS, 2007).

Mutações do gene P53 ocorrem em cerca de 10% a 15% dos pacientes com LLC

(EL ROUBY et al., 1993; FENAUX et al., 1992; GAIDANO et al., 1991).

O gene CLLU1, o produto do qual se assemelha a interleucina-4 (IL-4), foi

identificado como um gene específico da LLC localizado no cromossomo 12q22 que pode

estar envolvido na patogênese (BUHL et al., 2006).

Alterações do cromossomo 14 na LLC, embora raras, são vistas em cerca de 6% a

14% dos casos LLC (pela banda-G) e geralmente envolvem a banda 14q32, a qual abriga o

gene da cadeia pesada Ig (IGHV) (ASOU et al., 1993; JULIUSSON et al., 1990).

1.4 Clínica

A forma de apresentação clínica inicial e a evolução da LLC são bastante

heterogêneas (BINET et al., 2006; BROUET, 2003; HAMBLIN, 2002; GARICOCHEA,

2005; MORENO; MONTSERRAT, 2008). Alguns pacientes evoluem a óbito em torno de

cinco meses do diagnóstico enquanto outros sobrevivem vinte anos ou mais (DEFOICHE et

al., 2008; MONTSERRAT; MORENO, 2008; RIPOLLÉS et al., 2006).

17

Em torno de 50% dos pacientes são assintomáticos ao diagnóstico e

frequentemente não requerem tratamento (ANDRITSOS; KHOURY, 2002; GHIA;

FERRERI; CALIGARIS-CAPPIOA, 2007; ROBAC, 2007) evoluindo com um curso clínico

favorável, caracterizado por uma lentidão ou estabilidade no aumento linfocitário, aos

hemogramas seriados, e evoluíram ao óbito devido a causas não relacionadas à doença

(FERRARINI; CHIORAZZI, 2004; GHIA et al., 2007; MORENO; MONTSERRAT, 2008).

Cerca de 75% dos pacientes são diagnosticados incidentalmente, ao fazer um hemograma e

evoluem oligosintomáticos (DIGHIERO; HAMBLIN, 2008).

Diferentemente, outros pacientes irão apresentar uma evolução grave da doença

com o aumento na contagem de linfócitos progressivamente e, ao exame clinico, hiperplasia

de linfonodos, esplenomegalia, hepatomegalia, hipertermia, perda de peso, adinamia,

hiporexia, sudorese noturna, anemia, trombocitopenia e anemia hemolítica auto-imune. Esses

pacientes irão necessitar frequentemente de tratamento precoce e morrerão da doença ou de

complicações relacionadas ao tratamento específico de LLC (FERRARINI; CHIORAZZI,

2004; MORENO; MONTSERRAT, 2008; GHIA et al., 2007).

A sobrevida dos pacientes com LLC varia de meses a décadas com uma mediana

de 7,5 anos (DIGHIERO; BINNET, 2000; HAMBLIN, 2002), que varia de um ano até mais

de quinze anos (MORENO; MONTSERRAT, 2008). A maioria dos pacientes irá evoluir a

óbito com sua doença e embora tenha havido um grande progresso terapêutico no controle e

sintomas da LLC, a cura completa é um evento extremamente raro (GHIA et al., 2007). A

idade média de óbito é de 76 anos para homens e 81 anos para mulheres (BINET et al., 2006;

BROUET, 2003; GARICOCHEA, 2005; MACMAHON; KOLLER, 1957; RAWSTRON et

al., 2002; SEGEL et al., 2003; XIE et al., 2003).

Em decorrência da grande heterogeneidade na apresentação clínica e evolução da

LLC, estudos foram sendo desenvolvidos com o objetivo de identificar parâmetros mais

fidedignos na previsão da evolução, progressão da doença e sobrevida. Então, os

pesquisadores demonstraram a existência dos fatores de prognósticos clínicos e biológicos,

capazes de classificar os pacientes em grupos, segundo os critérios de estratificação de riscos

(baixo, intermediário e alto), na tentativa, cada vez mais precisa, de individualizar a

gravidade, a evolução da doença e a escolha do tratamento (HALLEK et al., 2008a;

MONTSERRAT et al., 1991; GHIA, et al., 2007).

18

1.5 Diagnostico

O diagnóstico é obtido quando o paciente apresenta uma linfocitose persistente,

por mais de um mês, a partir de 5 x 109/L, no sangue periférico, a qual se caracteriza por

linfócitos pequenos e morfologicamente maduros (INAMDAR; BUESO-RAMOS, 2007)

(Figura 1). Podem ser encontradas células grandes ou atípicas, clivadas ou prolinfócitos,

porém, compreendem menos de 55% dos linfócitos sanguíneos. Sombras nucleares de

Gumprecht ou restos celulares são outras características morfológicas sugestivas de LLC. O

mielograma apresenta uma linfocitose em torno de 30%, com as mesmas características dos

linfócitos periféricos e um determinado percentual de prolinfócitos, independente da presença

de anemia, plaquetopenia e organomegalia. Esses achados permitem o diagnóstico diferencial

com as outras síndromes linfoproliferativas (BENNETT et al., 1989; BUESO-RAMOS et al.,

2004; CHESON et al., 1996; HALLEK et al., 2008a; MÜLLER-HERMELINK et al., 2001;

POLLIACK; MATUTES, 2000). A clonalidade dos linfócitos B circulantes necessita ser

confirmada por citometria de fluxo (GHIA et al., 2007; HALLEK et al., 2008a; HAMBLIN et

al., 1999; KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007; VASCONCELOS et al., 2005).

Figura 1- Amostras de sangue periférico da LLC.Os slides da esquerda e da direita da figura respectivamente mostram a linfocitose caracterizada por linfócitos pequenos e morfologicamente maduros.CLL= Leucemia Linfóide CrônicaFonte: TKACHUK; HIRSCHMANN, 2007.

19

Figura 2 - Padrão da biópsia de medula óssea na LLC.Acima no padrão nodular, os nódulos de linfócitos são tipicamente distribuídos em um padrão entre as trabéculas. No centro temos o padrão intertiscial, caracterizado pela infiltração da medula óssea por clones da LLC intercalados entre as células hematopoéticas e as células gordurosas. Abaixo se observa o padrão difuso, que invade e destroe completamente a arquitetura da medula óssea pelas células da LLC.

Fonte: TKACHUK; HIRSCHMANN, 2007.

Com a finalidade de diferenciar a LLC das outras doenças linfoproliferativas de

células B, tem sido estabelecido um sistema de pontuação internacional baseado na expressão

20

dos padrões dos marcadores imunofenotípicos na LLC. Portanto, cinco marcadores de

antígenos celulares são usados: sIg, CD5, CD23, FMC7 e CD79b (ou CD22). A pontuação é

baseada na baixa expressão de Ig de superfície (um ponto), expressão de CD5 (um ponto),

expressão de CD23 (um ponto), FMC7 negativo (um ponto) e CD79b, (ou 22) negativo ou

fraca expressão (um ponto). Casos com pontuação de 4 ou 5 são considerados típicos de LLC

e aqueles com 3 pontos ou menos são considerados atípicos da LLC (MATUTES et al., 1994;

MOREAU et al., 1997).

Os linfócitos da LLC co-expressam antígeno CD5 de células T e antígenos de

superfície de células B: CD19, CD20 e CD23. O clone das células neoplásicas exibe baixos

níveis de imunoglobulinas de superfície, de CD20 e CD79b (ou CD22) comparados ao das

células B normais e também apresenta restrição seletiva para maior expressão de uma cadeia

da imunoglobulina kappa ou lambda (HALLEK et al., 2008a; HOFFBRAND; HAMBLIN,

2006; KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007; MOREAU et al., 1997; MONTILLO et al., 2005;

MÜLLER-HERMELINK et al., 2001).

O perfil imunofenotípico da LLC-B é diferente dos linfomas B leucemizados e

das outras doenças linfoproliferativas. O antígeno FMC7 e CD10 geralmente são negativos

nos casos de LLC e positivos em outros distúrbios de células B. Em uma minoria de LLC

ocorre positividade para o FMC7, e, nesses casos, também os linfócitos apresentam uma

morfologia atípica com clara expressão de CD20 e sIg (LORAND-METZE., 2005). O CD5,

em alguns clones de LLC, pode ser negativo decorrente da variação da técnica do exame,

permitindo pouco consenso entre os investigadores com respeito à significância clínica desse

subgrupo particular (KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007).

O estudo citogenético por meio do cariótipo convencional (banda G) e molecular

(por hibridização in situ por fluorescência-FISH) é recomendado para o diagnóstico de LLC

(CHAUFFAILLE, 2005; HALLEK et al., 2008a).

A avaliação através da citogenética clássica nos permite o encontro de

anormalidades cromossômicas em torno de 40%-50% das LLC (JAFFE et al., 2001;

CHAUFFAILLE, 2005; HALLEK et al., 1997; RIPOLLÉS et al., 2006) e em cerca de 80%

quando empregamos a citogenética molecular por FISH (DOHNER et al., 2000; DURAK et

al., 2009; HALLEK et al., 2008a; JULIUSSON; MERUP, 1998).

As alterações mais freqüentes na LLC são: deleção do braço longo do

cromossomo 13 (13q14), (em mais de 50% dos casos), trissomia do cromossomo 12 (em 10-

21

20% dos casos), deleção do 11q22-23 (em 10-20% dos casos), deleção do 17p13 (em menos

de 10% dos casos) no qual afeta também o gene supressor do tumor, P53 (CALIN et al.,

2002; DURAK et al., 2009; EL ROUBY et al., 1993; GAIDANO et al., 1991; MORENO et

al., 2008; MONTSERRAT; MORENO, 2008). Vários estudos identificaram trissomia do

cromossomo 12, 11q- e 17p- como marcadores de prognóstico desfavorável (BULLRICH et

al., 1999; CHAUFFAILLE, 2005; CROSSEN., 1997; DÖHNER et al., 2000; HALLEK et al.,

2008a; GARCIA-MARCOET et al., 1997; SCAFFNER et al., 1999; STANKOVIC et al.,

1999).

Pela análise cromossômica da banda G convencional, a mais comum

anormalidade cromossômica na LLC é a trissomia do cromossomo 12 (em 15-20% dos

casos), seguida pelas anormalidades estruturais dos cromossomos 11, 13 e 14, as quais podem

ocorrer isoladas ou junto com deleções ou translocações do cromossomo 13q14 (DOHNER et

al., 1999; JULIUSSON; GAHRTON, 1990; JULIUSSON et al., 1990). Morfologicamente,

casos com 6q- freqüentemente mostram características atípicas, incluindo grande linfocitose,

células prolinfóides (acima de 55%) e linfócitos clivados (CUNEO et al., 2004).

O estudo das alterações cromossômicas em LLC é importante no auxílio

diagnóstico, para identificar a doença clonal, no diagnóstico diferencial com as outras

linfoproliferações, no acompanhamento evolutivo ao permitir a detecção de alterações

adicionais, na escolha terapêutica dependendo do tipo de aberração cromossômica, no

monitoramento do tratamento em relação à avaliação de doença residual mínima e também no

diagnóstico de transformação e informações de prognóstico (como na Síndrome de Richter)

(CHAUFFAILLE, 2005; DURAK et al., 2009; VAN BOCKSTAELE; VERHASSELT;

PHILIPPÉ, 2009).

1.6. Prognóstico

O prognóstico dos pacientes com LLC é extremamente variado. Portanto, as

pesquisas têm sido desenvolvidas na tentativa de identificar os diferentes clones das células

neoplásicas, suas diversidades de comportamentos clínicos e biológicos a fim de definir o

comportamento evolutivo da doença nos pacientes, o momento de iniciar o tratamento e qual

22

a terapêutica adequada, diante da particularidade inerente de cada doente (VAN

BOCKSTAELE; VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009; GHIA; FERRERI; CALIGARIS-

CAPPIOA, 2007; HALLEK et al., 2008a; HAMBLIN, 2007; MORENO; MONTSERRAT,

2008).

1.6.1. Marcadores de prognóstico clássicos e biológicos na LLC

Os marcadores de prognóstico clássicos são: estágios clínicos (Sistemas de Rai e

Binet), contagem de linfócitos no sangue periférico, morfologia dos linfócitos, tempo de

duplicação dos linfócitos (TDL) no sangue periférico e padrão da infiltração na histologia da

medula óssea (aspirado/biópsia) (MORENO; MONTSERRAT, 2008). Exceto os estágios

clínicos, eles também são denominados indicadores da massa tumoral e da atividade da

doença (SEILER; DÖHNER; STILGENBAUER, 2006).

Os marcadores de prognóstico biológicos, extensivamente estudados, são: os

séricos (timidina quinase, β2-M, níveis de CD23 solúveis), estado de mutação da região

variável da cadeia pesada da imunoglobulina (IGHV), gene V3-21, citogenética por FISH

(baixo risco: resultado normal ou 13q- e alto risco: +12, 11q-, 17p- e cariótipo complexo), a

expressão do CD38 e expressão da Zap-70. E aqueles que requerem estudos futuros são: as

translocações cromossômicas, a expressão do CLLU1, a assinatura do microRNA, o gene

TCL-1, os genes antiapoptóticos (expressão do MCL1, Bcl-2/relação Bax), os genes

MDR1/MDR-3, indução da ativação deamina citidina mRNA, expressão da lipoproteína

lipase A, expressão da ADM29, VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular),

trombopoetina, atividade telomerase e comprimento telomérico, CD49d, CD69. Finalmente,

considera-se o relato do tratamento (resposta à terapia - estado de doença residual mínima

depois da terapia) (MORENO; MONTSERRAT, 2008).

1.6.2. Marcadores de prognóstico clássicos

23

Os sistemas de estadiamento clínico de Rai e Binet, introduzidos há trinta anos

por Rai et al., 1975 e Binet et al., 1981 são a base para a avaliação do prognóstico em LLC, os

quais requerem somente o exame físico do paciente e a contagem de células sanguíneas. Em

decorrência da simplicidade e reprodutibilidade, esses sistemas continuam sendo adotados e

têm sido validados em muitos estudos (HALLEK., et al., 2008b;VAN BOCKSTAELE;

VERHASSELT; PHILIPPÉ., 2009). Os estadiamentos clínicos de Rai e Binet são usados para

definir a extensão da doença, o prognóstico, especialmente como critério de iniciar o

tratamento; permitem avaliar o tamanho da massa tumoral, porém não auxiliam na previsão

dos pacientes, pertencentes aos subgrupos de risco baixo e intermmediário, que irão ter

evolução desfavorável e necessitarão de tratamento precoce (VAN BOCKSTAELE;

VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009; CHAUFFAILLE, 2005; MORENO; MONTSERRAT,

2008). Esse fato se deve à incapacidade de o exame físico e da contagem de células

sanguíneas, exclusivamente, em predizerem a sobrevida ou a necessidade de tratamento dos

pacientes nos subgrupos inicias de Rai e Binet (VAN BOCKSTAELE; VERHASSELT;

PHILIPPÉ, 2009). Eles são mais consistentes nos estádios de alto risco (KEDAR; BUESO-

RAMOS, 2007). Pacientes no estádio IV de Rai ou estádio C de Binet devem ser

considerados de eleição para tratamento precoce (GHIA; FERRERI; CALIGARIS-

CAPPIOA, 2007).

A classificação de Rai modificada define como doença de risco baixo o paciente

com linfocitose no sangue periférico e/ou linfocitose >30% na medula óssea (estágio O); os

pacientes com linfocitose e adenomegalia em qualquer sítio (estádio I) e aqueles com

linfocitose, esplenomegalia e/ou hepatomegalia (estádio II) são definidos como de risco

intermediário. E de risco alto incluem os pacientes portadores de anemia, definida como uma

Hb<11g/dL (estágio III), e/ou trombocitopenia, ou seja, plaquetas <100.000/mm3 (estagio IV)

(HALLEK et al., 2008b) (Quadro 1).

Estádio Características Clínicas

0 Linfocitose

I Linfocitose e adenomegalia

II Linfocitose, esplenomegalia e/ou hepatomegalia

III Linfocitose e Hb < 11g/dL

IV Linfocitose e trombocitopenia (plaquetas < 100.000/mm3)

Quadro 1- Sistema de estadiamento clínico de prognóstico de Rai. Fonte: KALLER et al., 2008b.

24

A sobrevida global estimada segundo o estadiamento de Rai é de doze anos para

os pacientes nos estágios 0 e I, sete anos no estádio II e menor que um ano nos estádios III e

IV (VAN BOCKSTAELE; VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009; GHIA; FERRERI;

CALIGARIS-CAPPIOA, 2007; HALLEK et al., 2008a; HAMBLIN, 2007; MORENO;

MONTSERRAT, 2008).

O sistema de estadiamento de Binet utiliza o número de sítios linfóides envolvidos

das seguintes regiões: cabeça e cervical, axilar, inguinal, baço e fígado. Os subgrupos de

Binet são: estágio A, inclui pacientes com hemoglobina Hg > 10 g/dL, plaquetas > 100.000 /

mm³ e menos de três sítios envolvidos (baixo risco); estágio B inclui pacientes com Hb >

10g/dL, plaquetas > 100.000 /mm³ e três ou mais sítios envolvidos (risco intermediário) e

estágio C inclui pacientes com Hb < 10g/dL ou plaquetas < 100.000 /mm³, independente do

número de sítios envolvidos. A sobrevida estimada, segundo Binet é de nove anos para o

estágio A, cinco anos para o estágio B e de dois anos para o estágio C (VAN BOCKSTAELE;

VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009; GHIA; FERRERI; CALIGARIS-CAPPIOA, 2007;

HALLEK et al., 2008b; HAMBLIN, 2007; MORENO; MONTSERRAT, 2008) (Quadro 2).

Estádio Areas* envolvidas Hb (g/dL) Plaquetas (x109L)

A Nenhuma, uma ou

duas áreas

>10 >100

B Três, quatros ou

cinco

>10 >100

C <10 <100

Quadro 2 - Sistema de estadiamento clínico de prognóstico de Binet.

Fonte: KALLER et al., 2008b.

O prognóstico de cada paciente será mais fidedigno na dependência das

complexas relações entre as características do paciente (idade, gênero, comorbidades, etnia,

performance status), da doença (carga tumoral, cinética e biologia do tumor), bem como da

sensibilidade da doença ao tratamento (VAN BOCKSTAELE; VERHASSELT; PHILIPPÉ,

2009; MORENO; MONTSERRAT, 2008).

25

A influência da idade no prognóstico é peculiar, pois a sobrevida global é maior

em pacientes jovens, porém, a sua sobrevida relativa é geralmente menor e o relato de óbitos é

maior nos pacientes jovens e do sexo masculino (JAKSIC et al., 1991; LEE et al., 1987;

MONTSERRAT et al., 1991; MAURO et al., 1999). Pacientes idosos costumam evoluir

menos favoravelmente em função de suas comorbidades (MAURO et al., 1999; TAMURA et

al., 2001). A raça não possui um papel relevante em relação ao prognóstico na LLC. Porém,

observa-se maior incidência de LLC na raça branca, nos países ocidentais e nos parentes de

primeiro e segundo grau de pacientes com LLC (DIGHIERO; HAMBLIN, 2008;

YAMAMOTO, 2005).

Em relação ao sexo, pacientes do sexo masculino geralmente evoluem de forma

mais desfavorável quando comparados aos pacientes do sexo feminino (VAN

BOCKSTAELE; VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009; CATOVSKY et al., 1989;

MONTSERRAT; MORENO, 2008).

O tempo de duplicação linfocitária (TDL) é considerado presente quando o

número absoluto de linfócitos no hemograma, contado a partir do diagnóstico, duplica num

período menor ou igual a doze meses. A presença da duplicação linfocitária está associada a

um aumento na cinética e progressão da doença (DEFOICHE et al., 2008; HALLEK et al.,

2008a; KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007), conferindo um pior prognóstico, e uma sobrevida

média de 61 meses (MONTSERRAT et al., 1986), porém, o TDL é inerentemente

retrospectivo (KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007). O aumento do valor absoluto dos linfócitos

de 50%, em dois meses, também constitui indicação para o inicio de tratamento nos pacientes

com LLC (CHESON, et al., 1996; DIGHIERO; HAMBLIN, 2008; MONTSERRAT et al.,

1985, 1986; ROZMAN et al., 1984; SEILER; DÖHNER; STILGENBAUER, 2006).

Os níveis séricos elevados da desidrogenase láctica (LDH) e da contagem de

linfócitos periféricos associam-se com a atividade da doença, ou seja, representam marcadores

de multiplicação das células neoplásicas e suas elevações estão associadas com um tempo de

sobrevida menor (LEE et al., 1987), com uma alta expressão de CD38 e de Zap-70 (DURIG

et al., 2002; SCHROERS et al., 2005) e del 17p (DOHNER et al., 2000). Esses parâmetros,

em análises multivariadas, incluindo dados clínicos e genéticos, mostraram-se como fatores

prognósticos independentes (VAN BOCKSTAELE; VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009;

DOHNER et al., 2000; KROBER et al., 2002).

26

A morfologia das células e a histologia da medula óssea têm sido, há muito

tempo, usadas como marcadores de prognóstico (ROZMAN et al., 1984; DOMINIS;

JAKSIC, 1987; VALLESPÍ; MONTSERRAT; SANZ, 1991). O padrão de infiltração da

medula óssea nos portadores de LLC mostra que infiltração difusa de linfócitos na histologia

da medula óssea é indicativa de doença mais agressiva quando comparado aos pacientes que

apresentam um padrão não-difuso (DOMINIS; JAKSIC, 1987; HALLEK; BERGMANN;

EMMERICH, 2004; KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007; ROZMAN et al., 1984; VALLESPÍ;

MONTSERRAT; SANZ, 1991).

O estudo da medula óssea (citologia e histologia) pode ser útil nos casos de

linfocitoses discretas, isoladas, com quadro clínico contraditório. A histologia de medula

óssea também pode ajudar no diagnóstico diferencial com alguns outros linfomas indolentes

leucemizados (MÜLLER-HERMELINK et al., 2001) e é auxilio no diagnóstico de LLC com

morfologia atípica pela análise do tipo de infiltração (SCHADE et al., 2006). .É um exame de

valor para determinar o curso de citopenias, suas etiologias e medir a resposta à terapia

(SCHADE et al., 2006).

O padrão difuso e o não difuso se correlacionam bem com a expressão da proteína

Zap-70 e ao estado de mutação da cadeia pesada da região variável da Ig (IGHV). Casos de

LLC com padrão de infiltração nodular apresentam mutação da região variável da IGVH e

não expressam Zap-70. Casos com envolvimento difuso têm um GENE IGHV não mutado e

apresentam expressão de Zap-70 (SCHADE et al., 2006).

1.6.3. Marcadores biológicos de prognóstico na LLC

Os níveis séricos elevados da β2-M, timidina quinase, CD23 solúvel (KEDAR;

BUESO-RAMOS, 2007) e a LDH correlacionam-se com uma menor sobrevida em indivíduos

com LLC (MAGNAC et al., 2003; MOLICA et al., 1999).

A β2-M é uma proteína associada à membrana expressa em células nucleadas e não

covalentemente associada com a cadeia α do complexo maior de histocompatibilidade classe I

(MHC) (VAN BOCKSTAELE; VERHASSELT; PHILIPPÉ, 2009; BJORKMAN;

BURMEISTER, 1994).

27

Os níveis da β2-M foram inicialmente relatados como de significado prognóstico

por Di Giovanni et al., 1989 relacionando seu achado com tumor agressivo e estágios

avançados de pacientes com LLC (DI GIOVANNI et al., 1989; HALLEK et al., 1996).

Vários estudos têm mostrado que a presença de B2-M é um forte preditor de sobrevida em

cinco anos em análises multivariadas (DELGADO et al., 2009; DI GIOVANNI et al., 1989;

MOLICA et al., 1999). Apesar da disponibilidade de novos marcadores de prognósticos de

grande impacto na LLC, o valor dos marcadores sericos, como a β2-M, permanecem úteis na

avaliação prognostica (DEARDEN., 2008; TSIMBERIDOU et al., 2007; WIERDA et al.,

2007). Entretanto, devemos avaliar a função renal dos pacientes devido ao aumento dos

níveis de β2-M diante da insuficiência renal. Também, os níveis sericos de β2-M têm sido

considerados preditivos da sobrevida livre de tratamento em pacientes com LLC (DELGADO

et al., 2009), de importância, mesmo em pacientes após quimioterapia ou imuno-

quimioterapia, na previsão da sobrevida e apresenta correlação positiva com os estádios

clínicos (KEATING et al., 2005.). Os níveis séricos elevados de β2-M correlacionam-se com

um prognóstico desfavorável (HALLEK et al., 1996) e em associação com outros marcadores

prognosticos como CD23 solúvel (MOLICA et al., 1999), expressão positiva de CD38 (DEL

POETA et al., 2001; DURIG et al., 2002; HEINTEL et al., 2001; SCHROERS et al., 2005;

XU et al., 2008) e de Zap-70 (DURIG et al., 2003; DEL PRINCIPE et al., 2006; SCHROERS

et al., 2005) e LDH (MOLICA et al., 1999) nos fornece dados sobre uma menor sobrevida

global (DELGADO et al., 2009; MANSHOURI et al., 2003). Também existe uma correlação

entre os níveis aumentados de β2-M, CD44 solúvel e níveis de LDH com esplenomegalia,

estágio avançado da doença, necessidade de iniciar terapia e menor sobrevida livre de

progressão (DE ROSSI et al., 1997; EISTERER et al., 2004; MOLICA, 2001).

1.6.4 Estado de mutação do gene da imunoglobulina

Vários estudos recentes têm encontrado que aproximadamente 50% dos clones de

LLC exibem mutações somáticas em suas cadeias de Ig sugerindo que alguns clones, de

células B memória, de LLC surgiram após passagem pelo centro germinativo (CG) (DAMLE

28

et al., 1999; FAIS et al., 1998; HAMBLIN et al., 1999; KROBER et al., 2002; KEDAR;

BUESO-RAMOS., 2007; LIN et al., 2002).

Nos últimos dez anos, alguns estudos constataram que o estado de mutação dos

genes da região variável da cadeia pesada de imunoglobulinas (IGVH) está relacionado com a

patogênese da LLC, confere uma heterogeneidade à doença em dois subgrupos maiores e

permite uma predição de prognóstico bastante acurada e independente aos pacientes com LLC

(DAMLE et al., 1999; HAMBLIN et al., 1999; KIENLE et al., 2006; MALOUM et al.,

2000). Desde então, os portadores de LLC passaram a ser categorizados em mutados, aqueles

com doença indolente, e não-mutados, aqueles com doença agressiva e pequena mediana de

sobrevida, em relação ao estado mutacional IGVH passando, esse exame, a ser considerado

como padrão-ouro na avaliação de prognóstico da LLC (MORENO; MONTSERRAT, 2008).

A mediana de sobrevida foi de 8 a 9 anos para pacientes com genes da IGVH não

mutados (células da linhagem germinativa) e de acima de 24 anos para pacientes com

mutações somáticas nos gene IGVH (DAMLE et al., 1999). Também, pacientes com LLC

com genes da IGVH não mutados têm maior risco de recidiva após transplante de célula

tronco (stem cell) (RITGEN et al., 2003).

No entanto, a metodologia empregada para a avaliação do estado de mutação da

IGHV é bastante laboriosa, tecnicamente difícil, cara e pouco disponível na prática rotineira

dos serviços de onco-hematologia (DAMLE et al., 1999; HAMBLIIN et al., 1999; KROBER

et al., 2002; MALOUM et al., 2000). Por esta razão, marcadores de prognóstico que

pudessem ser substitutos à avaliação da IGHV começaram a ser investigados, por diversos

estudos, como os marcadores clássicos e biológicos supracitados. Dentre os marcadores

biológicos, extensivamente estudados, a expressão da Zap-70, a expressão do CD38 e as

aberrações cromossômicas são de incontestável valor na avaliação prognóstica da LLC na

prática clínica (MORENO; MONTSERRAT, 2008).

1.6.5. Marcadores biológicos: Zap-70 e CD38

O marcador de prognóstico Zap-70 tem sido apontado como um marcador

substituto do estado de mutação do gene da IGHV por ser um exame de maior facilidade

29

técnica, principalmente através da citometria de fluxo, rapidez na obtenção dos resultados,

disponibilidade nos centros onco-hematológicos e de apresentar um poder prognóstico

semelhante ao estado de mutação da IGHV, quando positivo, correlacionando-se com o

estado não mutado da IGHV, ou seja, doença agressiva (CHEN et al., 2002; CRESPO et al.,

2003; DEL PRINCIPE, 2006; GHIA et al., 2007; ORCHAR, 2004; MONTILLO et al., 2005;

RASSENTI et al., 2004; RESENWALD, 2001).

Padrões elevados de expressão do CD38, Zap-70 e a não mutação da região

variável da cadeia pesada da imunoglobulina nos linfócitos B da LLC estão freqüentemente

associados a pacientes com doença mais grave, independentemente do estádio clínico ao

diagnóstico (CRESPO et al., 2003; DAMLE et al., 1999; DEL POETA et al., 2001; DEL

PRINCIPE et al., 2006; DURIG et al., 2003; HEINTEL et al., 2001; IBRAHIM et al., 2001;

OPPEZZO et al., 2005; RASSENTI et al., 2004; RASSENTI; KIPPS., 2006). Esses

marcadores parecem estar correlacionados a um maior estado de ativação celular (CHEN et

al., 2002, 2007; DEAGLIO et al., 2003; LANHAM et al., 2003; MORABITO et al., 2009;

RASSENTI; KIPPS, 2006; ZUPO et al., 2000).

Pela expressão da Zap-70 podemos distinguir dois grupos de pacientes com

diferentes progressões da doença, quando mensurados por citometria de fluxo e com cut-off

de 30% (CRESPO et al., 2003; HUS et al., 2006; MORABITO et al.; 2009 ; RASSENTI et

al., 2004; RASSENTI et al., 2008 ; SHANAFELT et al., 2008; SCHROERS et al., 2005).

Recentes estudos têm reforçado a grande associação entre a expressão positiva de Zap-70 e o

maior risco de progressão precoce da doença, necessitando de tratamento (HAMBLIN et al.,

2007; RASSENTI et al., 2004). A avaliação de Zap-70, dentre outros marcadores biológicos,

nos clones neoplásicos de LLC é um bom marcador biológico de prognóstico fornecendo

importantes informações na decisão da escolha terapêutica (BOSCH et al., 2006). Diferentes

estudos têm provado a ligação entre Zap-70 e a expressão de CD38 em células leucêmicas

com a resposta à terapia e sua duração e com a possibilidade de informar sobre o estado de

doença residual mínima negativa (MRD-negativa). E, se outras triagens clínicas confirmarem

a presença da Zap-70 e expressão do CD38 com DRM, considerando a importância crescente

atribuída à erradicação da DRM em pacientes, o resultado poderá ser de fundamental

importância na avaliação dos riscos adaptados às terapias (BOSCH et al., 2008).

Existe uma controvérsia a respeito da estabilidade na manutenção da expressão da

Zap-70, com o decorrer do tempo, nos pacientes com LLC. Segundo Rassenti et al. (2004) e

30

Del Princepe et al. (2006) a mesma parece manter-se constante, ao contrário do observado por

Hamblin et al. (2007) que afirma haver uma mudança na expressão da Zap-70 ao longo da

doença. E que, portanto, as células neoplásicas podem expressar maiores níveis de Zap-70

com a progressão da doença (CHAAR; SCHERGEN; GROSSO, 2008) Também afirma

Morabito (2009) que o uso simultâneo desses marcadores biológicos (perfil da expressão

gênica, expressão de Zap-70, expressão de CD38 e estado de mutação da IGHV) pôde

aumentar o poder preditivo, no grupo de pacientes pertencentes ao estágio A de Binet, em três

subgrupos.

A Zap-70 no estudo desenvolvido por Zanotti et al, 2006 se correlacionou com

vários parâmetros clínicos e biológicos de prognóstico adversos como estádio avançado de

Binet, infiltração difusa na histologia da medula óssea, aumento sérico dos níveis de LDH,

β2-M e tempo de duplicação linfocitária inferior a 12 meses.

Segundo Ghia et al, 2003, a expressão do CD38 parece manter-se estável ao longo

do tempo (MARGALIT et al., 2005; EISELE et al., 2008) e não haver mudança na expressão

do CD38 de positivo para negativo induzida pela quimioterapia, exceção encontrada em uma

minoria pertencente ao subgrupo de pacientes com subclones bimodais de CD38 (presença de

duas subpopulações: CD38+ e outra CD38-), após iniciado o tratamento. Também refere o

pesquisador que uma técnica reprodutível e padronizada deveria ser determinada a fim de

estabelecer qual o padrão de expressão de CD38 correlacionado com o estado de mutação do

gene da IGHV que permitisse identificar os pacientes de risco para doença progressiva,

valorizando a observação biológica da presença de células CD38+ independente de um cuttof.

A metodologia mais comumente empregada na avaliação destes marcadores é a

citometria de fluxo multiparamétrica. Os estudos realizados com CD38 e com Zap-70

oferecem dados contraditórios em relação ao valor de expressão utilizado como ponto de

corte, porém o importante é considerar a porcentagem de linfócitos B com expressão destes

marcadores, já que subpopulações celulares – contendo padrões distintos de expressão –

podem coexistir numa mesma amostra analisada. Em geral, os pontos de corte mais

amplamente utilizados são 30% e 20% para CD38 e Zap-70, respectivamente (CRESPO et al.,

2003; DAMLE et al., 1999).

Segundo Ertault-Daneshpouy et al., 2008 uma menor sobrevida livre de

tratamento e diminuição da sobrevida global foram observados em pacientes com a presença

de Zap-70 e CD38 positivo em relação ao grupo onde Zap-70 e CD38 eram negativos.

31

As proteínas Zap-70 e CD38 possuem um papel independente no prognóstico da

LLC (HUS et al., 2008) com um poder de predição evolutiva tão preciso quanto o perfil

mutacional das imunoglobulinas. A proteína Zap-70 e o aumento da expressão de CD38

também tem estreita relação com a ausência da mutação da IgV e seus aumentos de expressão

estão relacionados com doença mais agressiva (AMIEL et al., 2003; BOONSTRA, et al.,

2006; CRUSE et al., 2007; KEATING et al., 2005; RAVANDI; O’BRIEN, 2006).

De acordo com o estado mutacional da imunoglobulina (DAMLE et al., 1999,

2000; GHIA et al., 2003) demonstraram que as células B da LLC não mutadas apresentaram

positividade para CD38, em níveis significativos, associadas a uma resposta desfavorável à

quimioterapia e sobrevida curta, em oposição àquelas com mutação, que não expressam CD38

(DAMLE et al., 1999, 2000).

Deaglio et al, 2006 têm sugerido que a expressão de CD38 funciona

especificamente na LLC para promover proliferação e prolongar a sobrevida de populações de

células da leucemia.

1.7 Alterações citogenéticas

Alterações genéticas podem ser identificadas em torno de 80% dos casos de LLC

através da citogenética molecular pela técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) e a

citogenetica convencional pela banda G revela 40% a 50% das anormalidades cromossômicas

(CHAUFFAILLE , 2005; COLL-MULET ; GIL , 2009).

Dentre as alterações genéticas mais conhecidas na LLC e de bom prognóstico

encontramos a deleção 13q isolada (em torno de 55%) e cariótipo normal (cerca de 18%). São

consideradas de alto risco a trissomia do cromossomo 12 (18%), deleção do 11q (16%) e a

deleção do 17p (7%) (DOHNERL et al., 1999, 2000; KROBER et al., 2002; KEDAR;

BUESO-RAMOS, 2007). A deleção 17p confere um prognóstico especialmente reservado

quando observamos uma má resposta dos pacientes aos tratamentos convencionais com

agentes alquilantes e análogos de purina, além de uma mediana de sobrevida inferior a três

anos (DOHNER et al., 2000; KROBER et al., 2002).

32

Em relação à avaliação de prognóstico, não está claro se as alterações na

citogenética são independentes do estágio da doença (ZWIEBEL; CHESON, 1998). Pacientes

com certas anormalidades cromossômicas têm sobrevida menor em relação aos de cariótipo

normal. A presença de anomalias complexas (mais de três anormalidades) caracteriza-se por

apresentar uma doença de evolução desfavorável e menor sobrevida (ESCUDIER et al.,

1993).

Elevadas porcentagens de células em metáfase com anormalidades

cromossômicas, indicando células leucêmicas altamente proliferativas, foram associadas com

menor sobrevida (KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007).

A deleção 13q14 representa alteração clonal precoce e sugere a presença da perda

ou inativação de um gene supressor de tumor a qual pode ser crucial para o desenvolvimento

da LLC. A região 13q14 abriga o gene do retinoblastoma (RB1) (CUNEO et al., 2004).

O grupo de pacientes com deleção 11q22.3 frequentemente tem um prognóstico

reservado com linfadenopatia volumosa e extensa, multiplicação linfocitária rápida e menor

sobrevida livre de tratamento (CUNEO et al., 2004).

O gene P53, localizado no braço curto do cromossomo 17 na subregião 13, tem

um papel integral na indução da apoptose ou de interromper o ciclo celular após dano no

DNA. Alterações P53 na LLC estão associadas com um estágio avançado da apresentação,

resistência à fludarabina e terapias baseadas em agentes alquilantes, alta incidência de

transformação e progressão da doença em 1 a 2 anos (DOHNER et al., 1995; FENAUX et al.,

1992; GILES; O’BRIEN; KEATING, 1998; MAURO et al., 1999 ; WATTEL et al., 1994).

Deleções P53 são detectadas pela FISH em 10% a 20% dos casos e predizem sobrevida

reduzida. (DOHNER et al., 1995).

Considerando a importância epidemiológica da LLC, o fato de sua abordagem

terapêutica ser iniciada com base em critérios de evolução clínica, hematológica,

classificações do estadiamento de Rai e Binet associados aos marcadores de prognósticos

biológicos, o estudo se propõe: avaliar os pacientes em seu perfil clinico, imunofenotípico das

células neoplásicas, os fatores de prognósticos clínicos, níveis séricos da β2-M, padrão

histológico da biópsia óssea, expressão da Zap-70, expressão do CD38 e citogenética clássica

a fim de compará-los entre si e avaliar o comportamento da LLC dos pacientes quanto a sua

apresentação clínica, evolução da doença e sobrevida livre de tratamento.

33

2 OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Caracterizar os marcadores clínicos e biológicos dos pacientes com LLC do

Hospital Universitário Walter Cantídio/HEMOCE (Hemocentro do Ceará).

2.2. Objetivos Específicos

Avaliar o perfil dos pacientes com LLC segundo as variáveis: características

demográficas, histórico familiar, estadiamentos de Rai e Binet, tempo de

duplicação linfocitária, padrão histológico da biópsia da medula óssea e níveis

séricos da desidrogenase láctica (LDH), ao diagnóstico;

Identificar o perfil imunofenotípico das células da LLC;

Avaliar os marcadores biológicos (expressão do Zap-70 e CD38, níveis séricos de

β2-M e os achados da citogenética clássica), nos pacientes com LLC, em um

determinado momento, do acompanhamento ambulatorial;

Determinar as curvas de sobrevida estimada segundo marcadores biológicos;

Correlacionar o perfil dos pacientes com LLC, ao diagnóstico, com os marcadores

biológicos avaliados no estudo.

34

3 CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1 Desenho do estudo

Trata-se de um estudo retrospectivo, transversal e observacional.

3.2 Casuística

Foram recrutados 54 pacientes, de modo randomizado, acompanhados no Serviço

de Hematologia do Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC) / Centro de Hematologia

e Hemoterapia do Ceará (HEMOCE), no período de agosto de 2007 a Junho de 2009.

Os critérios de inclusão consistiram em pacientes com o diagnóstico de LLC,

confirmado pela citometria de fluxo, pertencer ao serviço supracitado e assinarem o do termo

de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (ANEXO A).

Dos cinqüenta e quatro pacientes, 43 foram incluídos no estudo após a

confirmação do diagnóstico de LLC, segundo os critérios do Instituto Nacional do Câncer-

Grupo de Trabalho (NCI-WG) (HALLEK et al., 2007). Onze pacientes foram excluídos, dos

quais quatro em decorrência de apresentarem diagnósticos de outras doenças

linfoproliferativas B crônicas e sete devido a não realização da imunofenotipagem em tempo

hábil. O grupo dos pacientes era composto de 12 que nunca receberam tratamento específico

para LLC e 31 previamente tratados. Quanto ao gênero, 24 pertenciam ao sexo masculino e 19

ao sexo feminino.

3.3 Metodologia

As informações relacionadas aos pacientes foram obtidas através da leitura dos

seus prontuários, complementadas por entrevistas com os mesmos e registradas em fichas

clínicas individualizadas (APENDICE) que continham as seguintes informações: dados

35

demográficos (idade, sexo, etnia, estado civil, nacionalidade, naturalidade e profissão),

clínicos (histórico familiar; contato com substâncias tóxicas; modo da apresentação clínica da

doença; exame físico e estadiamentos de Rai e Binet modificados na primeira consulta (RAI;

RAN., 1990); a avaliação da evolução clínica; análise dos parâmetros medidos ao diagnóstico

e durante o seguimento dos pacientes, grau de aumento do baço e/ou fígado, tamanho dos

linfonodos envolvidos, manifestações autoimunes, trombocitopênicas e quanto a presença de

infecções; evolução terapêutica; progressão, estabilidade ou remissão da doença de acordo

com os critérios definidos pelo NCI-WG (CHESON, et al., 1996) e laboratoriais (TDL,

hemogramas, mielogramas, padrão histológico da biópsia da medula óssea e LDH, ao

diagnóstico.

Em um segundo momento, realizamos os exames: imunofenotipagem com o

painel de LLC, expressão da Zap-70 e CD38, dosagem sérica de β2-M, mielograma e

citogenética clássica.

3.3.1. Coleta de amostras do estudo

Três amostras com cerca de 5,0 ml de sangue venoso periférico foram colhidas,

em três tubos estéreis a vácuo contendo EDTA para os exames de hemograma, dosagem

sérica de β2-M e imunofenotipagem, realizados nos laboratórios de Hematologia (HEMOCE),

Laboratório de Apoio Roberto Picanço (LARP) e Laboratório de Marcadores Celulares

(HEMOCE), respectivamente.

Em seguida, os pacientes foram submetidos a punção de medula óssea no

manúbrio esternal com coleta de cerca de 0,2ml do aspirado medular para o mielograma e 4 a

5 ml de material, em uma seringa contendo 2ml de heparina, e o material colhido

encaminhado ao Laboratório de Citogenética Clássica e Molecular do HUWC/HEMOCE para

a análise do cariótipo por banda G.

3.3.2 Hemograma

As amostras de sangue periférico foram analisadas pelo sistema automático do

aparelho CellDyn® para realização dos hemogramas e realizados esfregaços do sangue

36

periférico, corados pelo método May-Grünwald-Giemsa, para avaliação morfológica das

células.

3.3.3. ß2-M

Utilizamos um teste quantitativo automatizado no sistema (VIDAS -

BioMérieux®), que permite a medida quantitativa de ß2-M no soro ou plasma humano, pela

técnica ELFA (Enzyme Linked Flourescente Assay). O principio do doseamento associa o

método imunoenzimático ELISA em duas etapas com uma detecção final em fluorescência

(ELFA).

O aparelho, denominado MINI VIDA, possui um cone de utilização única que

serve tanto para a fase sólida como de suporte na pipetagem. Todas as etapas do teste foram

realizadas automaticamente pelo sistema. E são constituídas por uma sucessão de ciclos de

aspiração e dispersão do meio reacional.

A primeira etapa consiste na diluição da amostra e a ß2-M na amostra liga-se ao

anticorpo monoclonal específico fixado no cone. As etapas de lavagem eliminam os

componentes não fixados. A ß2-M retida é revelada por um anticorpo policlonal de carneiro

anti-β2-M humana marcado com fosfatase alcalina. O conjugado não fixado é eliminado por

lavagem.

Na segunda etapa final de revelação, o substrato (4-metil-umbeliferil fosfato) é

aspirado e dispersado pelo cone; a enzima do conjugado catalisa a reação de hidrólise do

substrato num produto (4-metil-umbeliferona) cuja fluorescência emitida é medida a 450nm.

O valor do sinal de fluorescência é proporcional à concentração da ß2-M presente na amostra.

Existe uma curva de calibração memorizada pelo equipamento que permite a

comparação com a leitura realizada no ensaio da amostra, sendo o resultado quantitativo

liberado e impresso em UI/ml, tendo com valor de referência (VR) 0,4 - 2,4 UI/ml

(REVILLARD., 1979; KARLSSON; WIBELL; EVRIN., 1980; VINCENT et al., 1985;

BELEC et al., 1992; ROMETTE et al., 1992).

3.3.4. Dosagem sérica da desidrogenase láctica (LDH)

37

As dosagens séricas da LDH foram realizadas na época da primeira consulta e em

outras consultas subseqüentes, solicitadas pelos médicos do referido ambulatório durante o

acompanhamento dos pacientes. As mesmas foram realizadas no Laboratório de bioquímica

do HUWC através da seguinte técnica: após a coleta de cerca de 5ml do sangue periférico, em

tubo contendo um gel separador, a mesma é levada para centrifugação a 3.500 rotações por

minuto (rpm) por dez minutos. O princípio do teste é baseado na utilização de ultravioleta

(UV), de acordo com a padronização do método; a amostra (soro do paciente) com adição do

reagente 1 (R1= tampão/piruvato) e, posteriormente, adicionado o reagente 2 (R2=NADH)

que resulta no início da reação:

piruvato+ NADH + H+ →← LACTATO + NAD+ .

A lactato desidrogenase catalisa a conversão de piruvato em lactato; neste

processo NADH é reduzido para NAD. A taxa de diminuição de NADH é diretamente

proporcional à atividade de LDH e é medida fotometricamente. Os reagentes R1 e R2 já são

fornecidos prontos para a utilização pela Empresa ESSEN, representante no Nordeste, da

ROCHE. Todo o processo da reação ocorre no aparelho Hitachi 917 da ROCHE e, a mesma, é

padronizada através de um manual da ROCHE, onde constam as normas para o analisador

utilizado, para a calibração do aparelho, controle de qualidade diário através do controle

normal com a solução Precinorm e o controle patológico usando a solução Precipath, entre

outras normas. Os resultados são fornecidos pelo analizador o qual faz um cálculo automático

tendo como valores de referência para adultos: 240-480 U/L (WACKER, et al., 1956;

GESELLSCHAFT; CHEMIE, 1972; RYDER; JACKSON, 1986; BABLOK et al., 1988;

TROMAS, 1992).

3.3.5. Imunofenotipagem

Marcadores monoclonais

As amostras de sangue periférico foram estudadas com um painel de anticorpos

monoclonais contendo os seguintes marcadores, com os respectivos fluorocromos entre

parênteses: Tubo1: Controle com linfócitos não marcados x CD19 (RC5); Tubo2:

Linfograma, CD3 (PE) x CD4 (PerCP) x CD8 (FITC) x CD19 (PC5) x CD56 (PE); Tubo3:

CD38 (FITC) x CD5 (PE) x CD19 (PC5); Tubo4: FMC7 (FITC) x CD23(PE); Tubo 5: CD20

38

(FITC) x CD10 (PE); Tubo 6: sIgM (FITC) x CD22 (PE); Tubo 7: Kappa (FITC) x Lambda

(PE)xCD19 (PC5); Tubo 8: CD16 (FITC) x CD56 (PE) x CD3 (PC5) ; Tubo 9: CD7 (FITC) x

CD3 (PC5); Tubo 10: Controle da Zap-70 (FITC) x CD8 (PE) x CD19 (PC5); Tubo11: Zap-

70 (FITC) x CD8 (PE) x CD19 (PC5); Tubo12: CD103 (FITC) x CD19 (PC5).

Tubo 10: Controle da Zap-70 (FITC) x CD8 (PE) x CD19 (PC5); Tubo11: Zap-70

(FITC) x CD8 (PE) x CD19 (PC5); Tubo 12: CD103 (FITC) x CD19 (PC5).

A população residual de linfócitos T (CD3+) presente na amostra foi utilizada

como controle positivo para a Zap-70. Como controles negativo, foram utilizadas células do

próprio paciente marcadas com um anticorpo isotipo de especificidade irrelevante. A análise

da Zap-70 foi realizada na população de células linfóides de interesse (CD19+). Foram

considerados os valores de 20% de células marcadas como ponte de corte para a expressão

positiva da Zap-70, e a partir de 30% para os outros marcadores.

Os anticorpos monoclonais foram adquiridos junto à IQ Products (Groninger,

Holanda), exceto o anticorpo anti-Zap-70 que foi obtido junto a Bioscience (San Jose, CA,

USA).

Todos os casos de LLC foram classificados segundo o sistema de pontuação

proposto por Matutes et al. (1994), complementado posteriormente por Moreau et al. (1997)

(Quadro 3) e a maioria obteve 4 a 5 pontos. Aqueles com pontuação igual a três apresentaram

características clínicas, hematológicas, padrão da histologia da medula óssea compatíveis com

LLC, aos quais atribuímos à expressão baixa da dupla positividade de CD5/CD19 ao

tratamento quimioterápico na ocasião do exame.

Marcador LLC Pontuação

sIg* Fraco 1

CD5 Positivo 1

CD23 Positivo 1

CD22 ou CD79b Negativo/Fraco 1

FMC7 Negativo 1

Quadro 3 - Sistema de pontuação característica de LLC.

*sIg: imunoglobulina de superfície. Fonte: MOREAU et al., (1997).

39

Os anticorpos monoclonais estavam conjugados com os fluorocromos

phycoerytrin (PE), fluorescein isothiocyanate (FITC) e phycoerytrin-cyanin-5(PC5).

Todas as amostras foram analisadas em citômetro de fluxo Beckman Coulter®

EPICS XL-MCL (Coulter), equipado com laser de 488 nm de comprimento de onda. Foram

captados a partir de 15.000 eventos por tubo. A janela (gate) utilizada para o estudo das

células leucêmicas caracterizava-se por baixo tamanho celular (FSC) e baixa complexidade

interna (SSC) (gate linfocitária). O programa Listmode foi utilizado para a aquisição e a

análise dos dados.

Marcação de membrana para CD38 e demais antígenos do painel

Cerca de 1,0x106 células em suspensão de 100μl de sangue total foram

adicionadas em cada tubo e incubadas em temperatura ambiente, por 30 min, com 5 μL de

cada anticorpo monoclonal. Posteriormente, 500μl de solução de lise (Opti-lyse) foram

adicionados em cada tubo. O material foi mantido por 10 minutos, no escuro, em temperatura

ambiente, com o objetivo de lisar as hemácias. Em seguida, as amostras foram centrifugadas

por 5 minutos, a 2.000 rpm. O sobrenadante foi desprezado, o pellet foi desfeito por meio de

agitação, no agitador Vortex, as amostras ressuspensas em 500μL de PBS, e,

subseqüentemente, levadas ao citômetro de fluxo para aquisição.

Marcação intracitoplasmática para a Zap-70

Inicialmente, foi realizada a marcação de membrana para o CD8 e o CD19 como

previamente descrito na técnica de marcação de membrana.

Para a fixação e permeabilização celular utilizamos o reagente Intraprep®

(Coulter Immunotech).

Foi adicionado 100µl do paraformaldeído e incubado por 15 minutos, no escuro.

Em seguida, foi realizada a lavagem com 4mL de PBS e centrifugado por 5 minutos, a 2.000

rpm. Adicionou-se 100 µl de Triton X e incubou-se por 5 minutos, no escuro. Em seguida, foi

adicionado 5µl do monoclonal anti-Zap-70 e incubado por 15 minutos e realizada nova

lavagem com 4mL de PBS, centrifugada por 5 minutos a 2.000 rpm. Desprezado o

sobrenadante, foi desfeito o pellet no vortex. Adicionou-se 500 µl de PBS e posteriormente,

levadas ao citômetro de fluxo para aquisição.

40

3.3.6. Citogenética clássica

As amostras de medula óssea para avaliação do cariótipo por banda G foram

coletadas em tubos 15x75 mm. O estudo do cariótipo por banda - G foi realizado à época das

coletas.O material foi coletado com agulha de mielograma após punção esternal.

A citogenética clássica por banda G foi realizada da forma habitual

(CHAUFFAILLE et al., 1997), isto é, a medula óssea (MO) colhida em heparina e de forma

estéril foi dividida em dois frascos contendo 7 mL de meio RPMI (pH 7,0), 3 mL de soro fetal

bovino e 100μl de L-glutamina. Este material foi cultivado por 24 horas em estufa a 37ºC.

Uma hora antes do término da cultura foram adicionados 50 uL de colchicina (Colcemid®),

por 30 minutos. Em seguida, o material foi centrifugado e ressuspenso em solução hipotônica

de KCL 0,075 M e fixado em solução de ácido acético e metanol (3:1), por 4 vezes. Para

confecção das lâminas para análise, o material foi gotejado em lâminas de microscopia e

secado ao ar. As bandas foram feitas pela técnica de tripsina-Giemsa (GTG), sendo analisadas

pelo menos 20 mitoses e os cromossomos classificados de acordo com o Sistema

Internacional de Nomenclatura Citogenética Humana (ISCN, 2009). As metáfases foram

capturadas em sistema computadorizado (CHROMU) com software para cariotipagem, e o

cariótipo digitalizado e impresso em impressora a laser (HP).

3.4 Aspecto ético

O projeto que resultou no presente trabalho está em conformidade com as

orientações constantes da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da

Saúde, e obteve o parecer favorável do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP), do HUWC, da

Universidade Federal do Ceará, sob protocolo de número 113.12.07.

Todos os pacientes que participaram do estudo foram informados sobre os

objetivos, a metodologia e riscos da pesquisa.

41

3.5 Análise estatística

A análise dos dados foi realizada utilizando os programas estatísticos Biostat 4.0 e

GraphPad Prism (versão 5.0). Para verificar o grau de associação entre as variáveis foi

utilizado o teste Coeficiente de Phi para tabelas de contingência 2x2 e o teste Coeficiente de

Contingência C para tabelas n x n (n < 2). Os testes de Fisher e Qui-quadrado foram utilizados

com o objetivo de verificar diferenças estatisticamente significante entre as proporções

observadas. Para a análise dos resultados fornecidos pelos testes estatísticos, foi escolhido

como índice de significância α = 5%, portanto com um nível de confiança de 95%.

Foi utilizado o estimador de Kaplan-Meier para função de sobrevivência e o teste

de igualdade das funções de sobrevivências para vários grupos (teste log rank). Os resultados

foram gerados usando o software livre R,versão 2.7.(www.r-project.org/).

42

4 RESULTADOS

Os pacientes recrutados quanto ao sexo foram: 25 (58%) masculinos e 18 (42%)

femininos. Houve uma discreta predominância do sexo masculino em relação ao feminino,

porém estatisticamente não significativa (p=0,6651). Quanto à idade, 32 (74,4%) deles tinham

idade acima de 60 anos e 11 (25,6%) abaixo de 60 anos, com uma média de 66,09 anos ao

diagnóstico. Portanto a LLC predominou nas idades acima de 60 anos (Tabela1).

Das profissões exercidas pelos pacientes destacou-se a de agricultores, estando

presente em 14 dos 43, e 29 pertenciam a outras diversificadas profissões. A predominância

da profissão de agricutor foi significativa (p=0,0057). Com relação à etnia, 32 (74%) eram

pardos, 10 (23%) brancos e 1 (3%) negro. A procedência foi de 23 (53,5%) da capital e 20

(46,6%) do interior (Tabela 1).

Obtivemos a presença de LLC na família em 5 (11,6%) dos pacientes e a ausência

em 29 (46,5%) (p=0,0051). A presença de outras doenças linfoproliferativas na família foi

identificada em 6 pacientes (14,0%), ausente em 17 (39,5%) e desconhecida em 20 deles

(46,5%) (p=0,0601), com uma tendência para significância. A presença de outras neoplasias

na família foi confirmada por 12, dos 43 pacientes (14,0%) (p=0,8564). O contato com

herbicida ocorreu em 11(25,6%) e ausência dele em 32 (74,4%) ( p=0,0439) (Tabela 1).

43

Tabela 1 - Estratificação das características demográficas, ao diagnóstico.

Idade (anos) Acima de 60 anos32 (74,42%)

Abaixo de 60 anos11 (25,58%)

p = 0,0439٭٭

Sexo Masculino25 (58,14%)

Feminino18 (41,86%)

p = 0,6651٭٭

ProfissãoAgricultor 14 (32,56%) p = 0,0057٭Doméstica 9 (20,93%)Comerciante 3 (6,98%)Aposentado 3 (6,98%)Demais 14 (32,56%)

EtniaBranca 10 (23,26%) p < 0,0001٭Parda 32 (74,42%)Preta 1 (2,33%)

ProcedênciaCapital 23 (53, 49%) p = 0,8294٭٭Interior 20 (46, 51%)

Histórico Familiar LLC

Presente 5 (11,63%) p = 0,0051٭Ausente 29 (67,44%)Não informou 9 (20,93%)

Outras doenças lifoproliferativas

Presente 6 (13,95%) p = 0,0601٭Ausente 17 (39,53%)Não informou 20 (46,51%)

Outras neoplasiasPresente 12 (27,91%) p = 0,8564٭Ausente 15 (34,88%)Não informou 16 (37,21%)

Contato com Herbicida

Sim11 (25,58%)

Não32 (74,42%)

p = 0,0439٭٭

* Teste do Qui-quadradoTeste de Fish ٭٭

Quanto à apresentação inicial da doença, 23 (53,50%) procuraram assistência médica

devido à presença de sinais e/ou sintomas de LLC, na primeira consulta e 20 (46,50%) foram

encaminhados ao hematologista devido à linfocitose no hemograma, assintomática (p=1,000).

Obtivemos 22 (51,02%) pacientes com comorbidades (dentre elas, as mais freqüentes foram

hipertenção arterial e Diabetes Mellitus) e ausência das mesmas em 21(48,8%) (p=1,000)

(Tabela 2 e Gráfico 1).

44

Gráfico 1 - Estratificação dos pacientes segundo o modo de apresentação da doença, ao diagnóstico.

Dos 43 pacientes, 15 (34, 88%) eram do estágio 0, 22 (51,16%) dos estágios I, II e

6 (13,95%) do estágio III e IV de Rai. A maioria dos pacientes pertencem aos estádios 0, I e II

(baixo e moderado risco), totalizando 37 (86,04%), dos 43 pacientes (p= 0,0112) (Tabela 2).

Dos 21 pacientes que já possuíam a biópsia da medula óssea somente 9 (42,86%)

tinham um padrão difuso e 12 (57,14%) apresentaram um padrão histológico não difuso

(p=0,0012) (Tabela 2).

Todos os pacientes do estudo já possuíam a dosagem da LDH ao diagnóstico com

os seguintes resultados: 7 (16,30%) possuíam LDH aumentada e 36 (83,70%) os valores

foram normais (p= 0,0012) (Tabela 2).

A raça parda predominou em relação às outras (p<0,0001) (Gráfico 2).

Gráfico 2 - Estratificação dos pacientes quanto à etnia.

23,26 %

74,42%

2,33%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Per

cent

agem

(%)

Branca Parda Preta

Etnia

53,49%

46,51%

42

44

46

48

50

52

54

Per

cent

agem

(%)

Sintomática Assintomática

Apresentação inicial da doença

45

Tabela 2 - Estratificação das características clínicas e de prognóstico ao diagnóstico.

Apresentação inicial da doença Sintomática

23 (53,49%)

Assintomática

20 (46,51%)

p = 1,000٭٭

Comorbidades Presente

22 (51,16%)

Ausente

21 (48,84%)

p = 1,000٭٭

Estadiamento de Rai Risco Baixo (0, I) 21 (48, 84%) p = 0,0943٭

Risco Moderado (II) 16 (37, 21%)

Risco Alto (III, IV) 6 (13, 95%)

Estadiamento de Binet Risco Baixo (A) 19 (44,19%) p = 0,0559٭

Risco Moderado (B) 19 (44,19%)

Risco Alto (C) 5 (11, 63%)

TDL(≤ 12 meses) Presente 8 (18, 60%) Ausente 35 (81,0%) p = 0.0029٭٭

Linfócitose ≥ 50.000/mm³

28 (65,12%)

< 50.000/mm³

15 (34,88%)

p = 0.2744٭٭

Padrão da biopsia da medula

Óssea

Difuso

9 (42,86%)

Não Difuso

12 (57,14%)

p = 1,000٭٭

LDH ≥ 480 U/l

7 (16,28%)

< 480 U/l

36 (83,72%)

p = 0.0012٭٭

Teste do Qui-quadrado ٭Teste de Fisher ٭٭

No estadiamento de Binet, foram classificados 19 (44,20%) pacientes no estádio

A, 19 (44,20%) estágio B e 5 (11,60%) no estágio C. Portanto, a maioria dos pacientes

pertenciam aos estágios de risco baixo e intermediário, os quais somados foram 38 (88,40%)

pacientes, com uma tendência para significância estatística (p=0,0559). Achado semelhante

ao sistema de Raí (Tabela 2 e Gráfico 3).

46

Gráfico 3 - Classificação dos pacientes em subgrupos de risco baixo, moderado e alto segundo o sistema de estadiamento clínico de Binet.

Dos 43 pacientes, apenas 8 (18,60%) apresentaram um número absoluto de

linfócitos duplicados em menos de 12 meses, com significância (p = 0.0029). Foi observado

que 15 (34,90%) dos pacientes possuem contagem absoluta de linfócitos ≥ 50.000/mm3, ao

diagnóstico, e 28 (65,10%) possuíam linfocitose < 50.000/mm³ (p = 0.2744) (Gráfico 4).

As características imunofenotípicas dos pacientes com leucemia linfocítica

crônica encontram-se nas tabelas 3 e 4.

Gráfico 4 - Classificação dos pacientes segundo o marcador de progóstico TDL

44,19 % 44,19 %

11,63%

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Pe

rce

nta

gem

(%

)

Risco Baixo (A) Risco Moderado (B) Risco Alto (C )

Estadiamento de Binet

18,6 %

81,4 %

0102030405060708090

Per

cen

tag

em (

%)

Presente Ausente

Tempo de duplicação linfocitária < 12 meses

47

Tabela 3 - Expressão dos antígenos das células clonais da LLC, através da

imunofenotipagem, dos pacientes (1 a 21).

Fonte : Matutes et al. (1994) ; Moreau et al., (1997)*=Houve expressão de dupla positividade, porém em valor < 30% (paciente em quimioterapia).; AG=antígeno; PA=paciente; NR=não realizado.

AG/PA CD10

CD5/19

CD22 CD23 CD103 FMC7 Κ Λ sIgM Expres Pontos

1 - + + + - - - + + fraca 52 - + - + NR - + - + fraca 53 - + - + NR + + - + fraca 44 - + - + NR - - + + fraca 55 - + - + NR - + - + fraca 56 - + - + - - - + - fraca 57 - + + + - - + - + fraca 58 - + + + - - - + + fraca 59 - + + + - - + - + fraca 510 - + + + - - + - - fraca 511 - + - + - - - + + fraca 512 + + + + - - + - + fraca 513 - + - + NR NR + - + fraca 514 - + + + - - - + + fraca 515 - + - + - NR - + + fraca 516 - + + + - - + - + fraca 417 - + - + NR - - + + fraca 518 - + - + - NR + - + fraca 519 - + - + NR - - + - fraca 420 - + - + - - + - + fraca 521 - + - + NR - + - + fraca 5

48

Tabela 4 - Expressão dos antígenos das células clonais da LLC, através da imunofenotipagem, dos pacientes (22 a 43).

AG/PA CD10 CD5/19 CD22 CD23 CD103 FMC7 Κ Λ sIgM Expres Pontos

22 - + - + NR - + - NR fraca 523 - + - + - - + - + fraca 524 - + + + - - - + + fraca 525 - + + + - - - + - fraca 526 - + + + - - - + + fraca 527 - + + + NR - NR NR NR fraca 428 - + - + - - - + + fraca 529 - + - + NR - + - + fraca 530* - - - + NR + - + + fraca 531 - + - + - - - - - fraca 332 - + - + NR - + - + fraca 533 - + + + - - + - + fraca 534 - - + + - - - - º + Fraca 435 - + + + - - - - - Fraca 536* - - - + - NR + - + Fraca 337 - + + + - - + - NR Fraca 538 - + - + - - - - - fraca 539* - - + + - - - - + fraca 540 - + + + - - + - + fraca 541* - - - + - - - - - fraca 442* - - + + - - + - - fraca 443 - + + + - - + - + fraca 5

Fonte : Matutes et al., (1994) ; Moreau et al., (1997). *=Houve expressão de dupla positividade, porém em valor < 30% (paciente em quimioterapia)ºº= relação K/L: 0,6: 1,0.º = relação K/L: 1,5: 1,0; AG=antígeno; PA=paciente; NR=não realizado.

A expressão da Zap-70 foi realizada em 40 pacientes, sendo que 9 (22,50%)

apresentaram positividade para Zap-70 e 31 (77,50%) negatividade (p=0,0193) (Tabela 5).

A expressão de CD38 foi realizada em 42 pacientes, sendo que 11 (26,19%)

apresentaram positividade para o CD38 e 31 (73, 81%) com ausência na expressão.

A citogenética clássica, realizada em 27 pacientes, obteve resultados em 15

pacientes (55, 55%), sendo normais em 12 (44, 44%), alterado em 3 (11,11%) e sem mitoses

em 12 (44, 44%) (p= 0,1414) (Tabela 5).

A dosagem sérica de β2-M mostrou-se elevada em 24 pacientes (55,81%) e em 19

(44,19%) os resultados foram normais. A presença de infecção foi evidenciada durante o

acompanhamento ambulatorial em 38 (88,37%) dos pacientes e 5 (11,63%) não apresentaram

infecções em sua evolução (p= 0,0003) (Tabela 5).

49

Encontramos 8 (18, 60%) dos pacientes com o teste da antiglobulina direta e

autoanticorpos positivos, os quais desenvolveram o quadro de anemia hemolítica autoimune

e 35 (81, 40%) evoluíram sem essa complicação (p= 0,0054) (Tabela 5).

Tabela 5 - Estratificação dos parâmetros de prognósticos realizados em um dado momento do

acompanhamento dos pacientes.

Expressão da Zap-70(n=40)

Positiva9 (22,50%)

Negativa31 (77,50%)

p = 0,0193٭٭

Expressão do CD38(n=42)

Positiva11 (26,19%)

Negativa31 (73,81%)

p = 0,0422٭٭

β2-M(n=43)

Normal19 (44,19%)

Aumentada (>4UI/ml)24 (55,81%)

p = 0,6662٭

Alterado 3 (11,11%) p = 0,1414٭

Citogenética clássica(n=27)

Normal 12 (44, 44%)

Ausência de mitose 12 (44, 44%)

Infecção (n=43) Não ocorreu5 (11, 63%)

Ocorreu38 (88,37%)

p = 0,0003٭٭

AHAI(n=43)

Ocorreu8 (18, 60%)

Não ocorreu35 (81,40%)

p = 0,0054٭٭


50

Tabela 6 - Estratificação dos pacientes em relação às características da citogenética

associadas ao sexo e a idade.

Paciente Sexo Idade Resultado

01 M 76 46, XY [7]03 F 74 46, XX [3]

05 F 65 Ausência de mitoses

06 M 63 46, XY [7]

07 F 73 46, XX [11]

08 F 63 01 mitose condensada

09 M 45 46, XY [7]

10 F 73 Ausência de mitose

11 F 85 Ausência de mitose

12 F 57 46, XX [5]

13 M 52 Ausência de mitoses

14 F 73 46, XX [2]

15 F 64 46, XX [3]

16 M 62 04 mitoses condensadas.

18 M 68 46, XY [2]



26 M 53 46, XY [5]


28 M 66 46, XY [13]



33 F 59 46, XX, del(11)(q23)[7]/46,XX[14]

35 F 56 46, XX, add(1)(p43)[10]/46,XX[5]

37 F 71 48, XX, +mar1,+mar2[3]/46,XX[3]

39 M 76 Ausência de mitose

43 F 65 46, XX [4]

51

Resultado baseado no ISCN-In International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2009

Figura 3 - Análise do Cariótipo por banda G do paciente de número 28, com resultado 46,

XY [13].

52


Figura 4 - Análise do Cariótipo por banda G do paciente de número 33, com resultado 46,

XX, del (11) (q23) [7] /46, XX [14].

53


Figura 5 - Análise do Cariótipo por banda G do paciente de número 7, com resultado

46,XX[11].

54


material adicional no cromossomo 1 e presença de cromossomo marcador.

55

PACIENTE NÚMERO 35: MATERIAL ADICIONAL NO CROMOSSOMO 1 E

PRESENÇA DE CROMOSSOMO MARCADOR


material adicional no cromossomo 1 e presença de cromossomo marcador

Em relação ao tratamento, 31 (72,09%) dos pacientes receberam tratamento

durante o acompanhamento ambulatorial e 12 (27,91%) nunca receberam (p= 0,0464). Os

protocolos quimioterápicos utilizados foram: clorambucil e prednisona, em 24 (77,42%)

pacientes (p= 0,0464); ciclofosfamida e fludarabina em 5 (16,13%) deles e a associação de

ciclofosfamida, oncovin e prednisona foi administrada em 2 (6,45%) (Tabela 7).

56

Ao término do estudo, a maioria dos pacientes apresentava doença em progressão

(60, 47%), independente de ter recebido tratamento (p= 0,0004) (Tabela 7).

Tabela 7 - Estratificação dos pacientes em relação à realização ou não do tratamento, tipo de

tratamento e situação atual.

Tratamento Tratou31 (72, 09%)

Não tratou12 (27, 91%)

p = 0,0464٭٭

Modalidade de tratamento

Clorambucil + Prednisona

24 (77, 42%) p = 0,0017٭

Ciclofosfamida + Fludarabina

5 (16,13%)

Ciclofosfamida + Oncovin + Prednisona (COP)

2 (6,45%)

Situação atual(doença)

Ativa progredindo 26 (60,47%) p = 0,0004٭

Remissão(clínica/hematological, nos tratados)

2 (4, 65%)

Ativa, sem progressão

13 (30,23%)

Óbito 2 (4, 65%)


Aplicou-se o teste de independência para verificar se existe dependência ou

associação entre os níveis dos marcadores da Zap-70 e expressão do CD38 em relação ao

paciente ter ou não tratamento. Para o marcador CD38, obtivemos o valor p = 0,096, isto é, o

paciente ter tratamento ou não independe do marcador CD38 para um nível de 0,05 de

significância. Em relação ao Zap-70, observou-se que o valor do p foi bem menos significante

(0,827), indicado que não houve associação entre tratamento e Zap-70. Esse fato pode ser

verificado nas tabelas 8 e 9. Percebemos que a proporção de tratados e não tratados é bem

parecida para os dois níveis de Zap-70 (25,81% e 22,22% ), mas a expressão do CD38, essa

relação proporcional não foi tão forte (35,45% e 9,09%).

57

Tabela 8 - Relação dos pacientes com e sem tratamento e a expressão do CD38

PacientesCD38

Sem Tratamento Com TratamentoTotal

11 20 3135,48% (CD38) 64,52% (CD38) -Negativo

91,67% (Pacientes)

66,67 % (Pacientes) -

1 10 119,09% (CD38) 90,90% (CD38) -Positivo

8,33% (Pacientes)

33,33% (Pacientes) -

Total 12 30 42

Tabela 9 - Relação dos pacientes com e sem tratamento com os níveis da Zap-70

PacientesZap-70

Sem Tratamento Com TratamentoTotal

8 23 3125,81% (ZAP-

70)74,19% (ZAP-

70) - Negativo80,00%

(Pacientes) 76,67 %

(Pacientes) -2 7 9

22,22% (ZAP-70)

77,78% (ZAP-70) -Positivo

20,00% (Pacientes)

23,33% (Pacientes) -

Total 10 30 40

Correlações entre as variáveis

Conforme se observa na tabela 10, não encontramos correlação do Zap-70 com as

variáveis CD38, TDL, β2-M, LDH, padrão da biópsia e linfocitose.

58

Tabela 10 - Estudo de correlação do Zap-70 com as variáveis CD38, TDL, β2-M, LDH,

Padrão da biópsia e linfocitose.

Expressão(n=39)

CD38+(n = 10)

CD38-(n = 29)

Zap70+ (n = 8) 3 (7, 69%) 5 (12, 82%) p = 0, 6836*

Zap70- (n = 31) 7 (17, 95%) 24 (61, 54%)

TDL(n=40)

TDL + (n = 8) TDL – (n = 32)

Zap-70+ (n = 9) 2 (5, 00%) 7 (17, 50%) p = 0, 8899*

Zap-70- (n = 31) 6 (15, 00%) 25 (62, 50%)

β2-M(n=40)

β2-MNormal (n = 16)

β2-Maumentado (n = 24)

Zap-70 + (n = 9) 5 (12, 50%) 4 (10, 00%) p = 0, 4867*

Zap-70 - (n = 31) 11 (27, 50%) 20 (50, 00%)LDH

Normal (n = 33)LDH

Aumentado (n = 7)Zap-70 + (n = 9) 6 (15, 00%) 3 (7, 50%) p = 0, 3566*

Zap-70 - (n = 31) 27 (67, 50%) 4 (10, 00%)

Biópsia da medula óssea

Difuso(n = 8)

Não Difuso(n = 12)

Zap-70 + (n = 5) 4 (20, 00%) 1 (5, 00%) p = 0, 1138*

Zap-70 - (n = 15) 4 (20, 00%) 11 (55, 00%)

Linfocitose ao diagnostic

< 50.000 mm³(n = 25)

≥ 50.000 mm³(n = 15)

Zap-70 + (n = 9) 3 (7, 50%) 6 (15, 00%) p = 0, 0965*

Zap-70 - (n = 31) 22 (55, 00%) 9 (22, 50%)

*Teste de coeficiente de Phi

A correlação entre a expressão de Zap-70 só pôde ser evidenciada com os

resultados da citogenética, não ocorrendo com os sistemas de classificação de prognóstico de

Rai e Binet, embora com tendência à significância (Tabela 11).

59

Tabela 11 - Estudo de correlação do Zap-70 com as variáveis estadiamento clínico de Rai e

Binet e com a citogenética convencional.

Estádio de Rai(n=40)

Risco Baixo (0)

(n = 15)

Risco Moderado (I, II)

(n = 22)

Risco Alto(III, IV)(n = 6)

Zap-70 + (n = 9) 2 (5, 00%) 6 (15, 00%) 1 (2, 50%) p = 0,4194**

Zap-70 - (n = 31) 13 (32, 50%) 13 (32, 50%) 5 (12, 50%)

Estádio de Binet(n=40)

Risco Baixo (A)

(n = 16)

Risco Moderado(B)

(n = 19)

Risco Alto (C)(n = 5)

Zap-70 + (n = 9) 3 (7, 50%) 5 (12, 50%) 1 (2, 50%) p = 0,8583**

Zap-70 - (n = 31) 13 (32, 50%) 14 (35, 00%) 4 (10, 00%)

Citogenética clássica(n=27)

Normal(n = 12)

Alterado(n = 3)*

Sem mitose(n = 12)*

Zap-70 + (n = 6) 2 (8, 00%) 2 (8, 00%) 2 (8, 00% ) p = 0,0319**

ZAP70 - (n = 19) 10 (40, 0%) 0 9 (36, 00%)

**Teste de coeficiente de contingência C*Um cariótipo com alteração e outro sem mitose, porém não avaliada a Zap-70.

Obtivemos ausência de correlação entre a expressão do CD38 e as variáveis TDL,

β2-M, LDH, padrão da histologia da biópsia e linfocitose ≥ 50.000/mm3 (Tabela 12)

60

Tabela 12 - Estudo de correlação do CD38 com as variáveis TDL, β2-M, LDH, Padrão da

biópsia e linfocitose.

TDL(n=42)

TDL + (n = 8)

TDL –(n = 34)

CD38 + (n = 11) 3 (7, 14%) 8 (19, 05%) p = 0,7175*

CD38 - (n = 31) 5 (11, 90%) 26 (61, 90%)

Β2-microglobulina(n=42)

β2 Normal(n = 18)

β2 aumentado(n = 24)

CD38 + (n = 11) 5 (11, 90%) 6 (14, 29%) p = 0,8792*

CD38 - (n = 31) 13 (30, 95%) 18 (42, 86%)

LDH(n=42)

LDH Normal(n = 36)

LDH Aumentado(n = 6)

CD38 + (n = 11) 9 (21, 43%) 2 (4, 76%) p = 0,9429*

CD38 - (n = 31) 27 (64, 29%) 4 (9, 52%)

Biópsia da Medula óssea

(n=20)

Difuso(n = 8)

Não Difuso(n = 12)

CD38 + (n = 5) 1 (5, 00%) 4 (20, 00%) p = 0,5982*

CD38 - (n = 15) 7 (35, 00%) 8 (40, 00%)

Linfocitose ao diagnóstico

< 50.000 mm³(n = 28)

≥ 50.000 mm³(n = 14)

CD38 - (n =31) 21 (50, 00%) 10 (23, 81%)

CD38 + (n =11) 7 (16, 67%) 4 (9, 52%) p = 0,9013*

*Teste de coeficiente de Phi

A associação entre a expressão de CD38 e as variáveis: estadiamentos clínicos de

Rai e Binet e a citogenética convencional apresentou uma tendência a significância (Tabela

13).

61

Tabela 13 - Estudo de correlação do CD38 com as variáveis estadiamentos clínicos de Rai e

Binet e citogenética convencional.

Estádio de Rai(n=42)

Risco Baixo(0)

(n =15)

Risco Moderado(I, II)

(n = 22)

Risco Alto(III, IV)(n = 5)

CD38 + (n = 11)

1 (2, 32%) 9 (21, 43%) 1 (2, 38%) p = 0,063**

CD38 - (n = 31) 14 (33, 33%) 13 (30, 95%) 4 (9, 52%)

Estádio de Binet(n=42)

Risco Baixo (A)

(n=19)

Risco Moderado(B)

(n=19)

Risco Alto(C)

(n=4)CD38 + (n =

11)3 (7, 14%) 7 (16, 67%) 1 (2, 38%) p = 0,336**

CD38 - (n = 31) 16 (38, 10%) 12 (28, 57%) 3 (7, 14%)Citogenética

clássica(n=26)

Normal(n = 12)

Alterado(n = 2)

Sem mitose(n = 12)

CD38 + (n = 6) 1 (3, 85%) 1 (3, 85%) 4 (15, 38%) p = 0,2234**

CD38 - (n = 20) 11 (42,31%) 1 (3, 85%) 8 (30,77%)

**Teste de coeficiente de contingência C

62

Curvas de sobrevida estimadas segundo os marcadores biológicos

No gráfico 5, através do teste de Log-Rank, mostrou que os pacientes com ausência

de expressão da Zap-70 apresentaram maiores tempos sem tratamento do que aqueles com

Zap-70 positivo (p= 0,024).

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tempo (Mês)

Fu

nçã

o d

e s

obre

vivê

nci

a e

stim

ada

Curva de sobrevivência estimada segundo ZAP70 Tempo sem tratamento

ZAP70 -ZAP70 +

Valor p = 0,024 Teste logrank

Gráfico 5 - Curva de sobrevivência estimada pelo Método de Kaplan-Meier para o tempo sem tratamento dos pacientes segundo Zap-70.

63

Os pacientes com ausência de expressão do CD38 apresentaram maior tempo sem tratamento em relação àqueles de resultados positivos para o CD38 (p= 0, 001) (Gráfico 6).

Gráfico 6 - Curva de sobrevivência estimada pelo Método de Kaplan-Meier para o tempo sem tratamento dos pacientes segundo CD38.

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tempo (Mês)

Fu

nçã

o d

e s

obr

evi

vênc

ia e

stim

ada

Curva de sobrevivência estimada segundo CD38 Tempo sem tratamento.

CD38 -CD38 +


64

Os pacientes que não apresentaram duplicação linfocitária no período de doze

meses do diagnóstico permaneceram sem tratamento por períodos maiores do que aqueles

pacientes com duplicação linfocitária no mesmo período (Gráfico 7).

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tempo (Mês)

Fu

nçã

o d

e s

ob

revi

vên

cia

est

ima

da

Curva de sobrevivência estimada segundo TDL Tempo sem tratamento.

TDL -TDL +


Gráfico 7 - Curva de sobrevivência estimada pelo Método de Kaplan-Meier para o tempo sem tratamento dos pacientes segundo TDL.

65

Obtivemos que os pacientes que apresentaram a dosagem sérica da desidrogenase

láctica normal evoluíram com um tempo sem tratamento maior em relação àqueles com LDH

aumentada (Gráfico 8).

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tempo (Mês)

Fu

nçã

o d

e s

ob

revi

vên

cia

est

ima

da

Curva de sobrevivência estimada segundo LDH Tempo sem tratamento.

LDH ALDH N

Valor p = 0,006Teste logrank

Gráfico 8 - Curva de sobrevivência estimada pelo Método de Kaplan-Meier para o tempo sem tratamento dos pacientes segundo LDH.

Os pacientes que apresentaram níveis normais de LDH evoluíram com um maior

tempo sem tratamento específico para LLC do que aqueles pacientes com LDH aumentada

(Gráfico 9).

.

66

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Tempo (Mês)

Fu

nção

de

sob

revi

vênc

ia e

stim

ad

a

Curva de sobrevivência estimada segundo sexo Tempo sem tratamento

FemininoMasculino

Valor p = 0,102

Teste logrank

Gráfico 9 - Curva de sobrevivência estimada pelo Método de Kaplan-Meier para o tempo sem tratamento dos pacientes segundo sexo.

Pelo teste de Log-Rank, verificamos que não existe diferença significativa entre os

tempos sem tratamento, sem eventos (anemia hemolítica auto-imune e infecções) em

progressão e em remissão, entre os pacientes quanto ao gênero, cujos valores p’s obtidos

foram de 0, 102, 0, 276, 0,930 e 0, 361, respectivamente, todos não significantes.

O tempo mediano sem tratamento para o sexo feminino e masculino é 20 e 16 meses,

respectivamente. Já para o tempo sem evento se obteve 20 e 19, respectivamente para

feminino e masculino. Para o tempo sem progressão, obteve-se um tempo mediano de 7,5 e 8

meses, e em relação ao tempo em remissão, o tempo mediano obtido foi nulo (0 mês), para

ambos os sexos dos pacientes.

67

5 DISCUSSÃO

A leucemia linfocítica crônica (LLC) apresenta uma evolução clínica e biológica

bastante heterogênea sendo necessário se estabelecer critérios de classificação de riscos

(baixo, moderado e alto) com o objetivo de orientar as condutas terapêuticas. Rai e Binet

criaram os sistemas de estadiamentos clínicos, ainda utilizados atualmente e de importância

inquestionável, os quais estratificam os pacientes nos três subgrupos de riscos, estabelecendo

uma previsão de sobrevida global e indicação de tratamento precoce para os pacientes de risco

alto. Entretanto, esses sistemas não detectam alguns pacientes pertencentes aos subgrupos de

baixo e moderado risco que terão uma evolução desfavorável e que necessitarão de

terapêutica precoce, contrariamente ao esperado nestes estágios. Portanto, esses sistemas de

estadiamento têm sido mais consistentes no prognóstico do subgrupo de risco alto.

Na tentativa de obter maior poder de previsão, os pesquisadores descobriram uma

grande diversidade de marcadores de prognóstico dos quais o estado de mutação do gene da

região variável da cadeia pesada da imunoglobulina (IGHV) se destacou pelo seu poder de

dividir os pacientes com LLC em dois subgrupos: os com mutação, de prognóstico favorável,

e o sem mutação, de prognóstico desfavorável. Porém, este exame é tecnicamente laborioso,

demorado, de difícil execução, caro, exigindo profissionais especializados e, portanto,

indisponível na maioria dos centros onco-hematológicos, tornando seu uso inviável na prática

clínica. Então, surgiram novos marcadores de prognóstico a fim de substituir o anterior tais

como: desidrogenase lática, β2-M, a expressão do CD38, a expressão da Zap-70, as alterações

citogenéticas, dentre outros, os quais se correlacionam com o prognóstico e orientam a

decisão terapêutica.

Enfim, é consenso que o prognóstico do paciente portador de LLC depende das

complexas relações entre as características do paciente (idade, gênero, comorbidades, etnia,

performance status), da doença (carga tumoral, cinética e biologia do tumor), bem como da

sensibilidade da doença ao tratamento as quais determinam o grau de risco do mesmo.

Nosso resultado relacionado ao gênero foi de uma maior prevalência da doença no

sexo masculino, com relação M: F de 1,4: 1, 0, fato também evidenciado na literatura (BINET

et al., 2005; BROUET, 2003; GARICOCHEA, 2005; MACMAHON; RAWSTRON, et al.,

2002; SGAMBATI; LINET; DEVESA, 2003; SEGEL et al., 2003; XIE et al., 2003;

YAMAMOTO, 2005) e foi semelhante a Redaelli et al., (2004) que demonstrou a incidência

nos Estados Unidos com a relação M:F de 1,9:1,0.

68

Pacientes do sexo masculino possuem prognósticos mais desfavoráveis em

relação ao feminino, segundo vários pesquisadores (VAN BOCKSTAELE; VERHASSELT;

PHILIPPÉ, 2009; CATOVSKY et al., 1989; MORENO; MONTSERRAT., 2008), porém, não

evidenciamos essa diferença de prognóstico quanto ao gênero, ao avaliarmos os parâmetros:

tempo mediano sem tratamento de 20 e 16 meses, tempo mediano sem eventos (infecções,

anemia hemolítica autoimune) de 20 e 19 meses, tempo mediano sem progressão de 7,5 e 8

meses para os pacientes do sexo feminino e masculino, respectivamente, com diferenças sem

significância estatística. O tempo em remissão foi nulo em ambos, mulheres e homens. Na

avaliação dos marcadores de prognósticos clínicos, através das classificações de Rai e Binet,

os pacientes do sexo feminino em 88,8%, em ambos marcadores, pertenciam aos subgrupos

de risco baixo e moderado e 11,1% ao subgrupo de risco alto. Enquanto os do sexo

masculino, segundo Rai e Binet, apresentaram um percentual de 84, 00% e 88, 00%, nos

estágios de risco baixo e moderado e 16, 00% e 12, 00%, respectivamente, no estágio de risco

alto. Segundo os marcadores de prognóstico biológicos: expressões positivas do CD38 e da

Zap-70 foram de 29, 40% e 31, 30%, respectivamente no sexo feminino e 16, 60% e 17, 70%

para o sexo masculino. Tais diferenças também não apresentaram significância. Portanto, o

prognóstico relacionado ao gênero foi semelhante. A divergência de resultado do estudo em

relação à literatura pode ser decorrente das particularidades inerentes aos pacientes e das

características da doença no grupo avaliado, as quais são sabidamente apontadas na literatura

como influenciadoras no prognóstico na LLC (MORENO; MONTSERRAT., 2008).

Houve predominância da doença nas idades acima de 60 anos com uma mediana

de 66,09 de idade, ao diagnóstico. Este dado é concordante com a literatura (BINET et al.,

2005; BROUET, 2003; GARICOCHEA, 2005; RAWSTRON et al., 2002; SGAMBATI;

LINET; DEVESA, 2003; SEGEL et al., 2003; XIE et al., 2003; YAMAMOTO, 2005).

Das profissões exercidas pelos pacientes destacou-se a de agricultores. Essa

atividade ocupacional propicia um maior contato com herbicidas, substâncias que podem estar

associadas com o surgimento da doença (DREXLER et al., 2003; YAMAMOTO, 2005).

Encontramos predominância de LLC, quanto à etnia, nos pacientes de cor parda.

Os pesquisadores relatam que a freqüência de LLC é maior em brancos (DIGHIERO;

HAMBLIN., 2008; YAMAMOTO., 2005). O encontro predominante em pardos pode ser

atribuído ao fato dos pacientes avaliados pertencerem à região Nordeste do Brasil que,

segundo dados do IBGE, concentram uma maior população afro-descendente quando somada

ao número de indivíduos negros e brancos (IBGE, 1996-2003). Este resultado sugere uma

variabilidade na incidência da doença quanto à etnia dependendo da região geográfica.

69

O ambulatório que presta assistência aos pacientes envolvidos na pesquisa

localiza-se na capital do Estado do Ceará. Porém, houve apenas uma ligeira predominância de

pacientes oriundos da capital sobre os do interior (p = 0,829). Sabemos que o ambulatório

citado faz parte de um serviço de referência, de assistência terciária especializada, da Rede de

Saúde Pública do Sistema Único de Saúde (SUS) do estado do Ceará, e, portanto, atende aos

doentes de toda a região, incluindo o interior, o que explicaria esse resultado.

Não encontramos predisposição familiar nos pacientes do estudo. Pesquisadores

relatam que parentes em primeiro grau de pacientes com LLC possuem incidência três vezes

maior de LLC, maior incidência de doenças linfoproliferativas ou outras neoplasias

(SELLICK; CATOVSKY; HOUSTON, 2006; YAMAMOTO, 2005). Observamos que o nível

intelectual dos pacientes limitado em relação ao conhecimento sobre a LLC, neoplasias

linfoproliferativas e neoplasias em geral, associado à ausência de informações sobre os

diagnósticos das doenças que acometeram seus parentes, na maioria deles, teveram influência

sobre os dados coletado.

Em relação ao modo de apresentação clínica da doença encontramos uma maior

incidência de pacientes que buscaram assistência médica por sinais e/ou sintomas decorrentes

da doença em 53,49% (p=1,00) quando comparados àqueles encaminhados ao hematologista

devido unicamente à linfocitose ao hemograma (46,51%), sendo este último o modo de

apresentação mais comum da LLC, segundo a literatura, no percentual de 50% a 75%

(ANDRITSUS et al., 2002; FERRARINI; CHIORAZZI, 2004; GHIA; FERRERI;

CALIGARIS-CAPPIOA, 2007; MORENO; MONTSERRAT, 2008; PAOLO et al., 2007;

ROBAC, 2007). A divergência encontrada poderá ser decorrente do baixo nível

socioeconômico dos pacientes e das características geográficas da região, principalmente

daqueles oriundos do interior, devido às dificuldades de acesso aos centros de saúde terciários

da capital, certa desinformação sobre a existência dos mesmos e as carências locais na

assistência médica de avaliações clínicas periódicas.

Segundo o sistema de estadiamento de Rai, encontramos uma predominância dos

pacientes nos estágios 0 (34,88%), risco baixo, e estágios I e II (51,16%) de risco moderado.

Portanto, nossos pacientes são, em sua maioria, de risco baixo e intermediário. Quanto ao

estadiamento de Binet, os resultados foram semelhantes ao de Rai, ou seja, obtivemos 44,2%

nos estágios A e B, de riscos baixo e intermediário, respectivamente, totalizando 88,4% dos

pacientes da pesquisa.

A maioria dos pacientes não apresentou duplicação dos linfócitos em doze meses

(TDL). Este resultado está associado a pacientes pertencentes aos estágios de risco baixo e

70

intermediário, a maioria dos nossos casos, em que geralmente a cinética e progressão da

doença é menor, conferindo um prognóstico favorável (DEFOICHE et al., 2008; HALLEK et

al., 2008-b; KEDAR; BUESO-RAMOS, 2007).

Obtivemos valores normais nas dosagens séricas da desidrogenase láctica (LDH)

na grande maioria dos pacientes, ao diagnóstico. Este resultado confere bom prognóstico aos

pacientes do estudo já que a literatura refere que a LDH aumentada associa-se com a atividade

da doença, sendo considerada como marcador de multiplicação das células neoplásicas e,

portanto, de progressão da doença, menor tempo de sobrevida (LEE et al., 1987; MOLICA et

al., 1999) e associa-se com a expressão de CD38 e da Zap-70 (DURING et al., 2002;

SCHROERS et al., 2005) e deleção do 17p (DOHNER et al., 2000).

A grande maioria dos pacientes não apresentou a expressão da Zap-70, ou seja, foi

negativa para esta proteína. Este resultado vem corroborar com a tendência dos outros

marcadores de prognóstico, já citados, os quais classificaram os pacientes do estudo como

pertencentes aos estágios de risco baixo e intermediário, ou seja, uma LLC indolente já que a

expressão da Zap-70 está associada com prognóstico desfavorável (CRESPO, 2003; DEL

PRINCIPE, 2006; MONTILO, 2005; RASSENTI, 2004).

Segundo Nascimento et al. (2006), foi encontrado em seu estudo uma positividade

da Zap-70 de 44, 82% e de CD38 de 34, 48% em 29 pacientes com LLC-B e Chauffaille

(2005) encontrou positividade da Zap-70 em 52,63%. Em nosso estudo, encontramos

positividade de 22,50% para Zap-70 e de 26,19% para CD38. Nosso resultado apresentou

positividades inferiores aos descritos pelos pesquisadores supracitados. As divergências nos

reultados da pesquisa podem ser atribuídas, em parte, ao tratamento, presente em 72,09% dos

pacientes avaliados o qual, segundo alguns pesquisadores diminuem a expressão da Zap-70

e/ou por estarmos frente a uma doença de bom prognóstico, conforme sugerem os outros

marcadores de prognóstico analisados na pesquisa e também pelo fato desse exame ter sido

realizado vários meses após o diagnóstico, o esperado seria encontrar aumentos das

expressões de Zap-70 com a progressão da doença, segundo Chaar et al., 2008 o que não

ocorreu. Ou o tratamento teria uma influência independente em diminuir a expressão da Zap-

70, mesmo em pacientes com mais de doze meses de evolução de LLC.

Quando avaliamos a curva de sobrevida relacionada ao tempo sem tratamento

entre pacientes com Zap-70 positivo e Zap-70 negativo encontramos que aqueles com Zap-70

negativo apresentaram um maior tempo sem tratamento. Este resultado representa,

possivelmente, o comportamento menos agressivo deste grupo de pacientes os quais

apresentaram uma menor necessidade de iniciar terapêutica precoce, ratificando os achados da

71

literatura que atribuem à expressão ausente da proteína Zap-70 como um indicador de

prognóstico favorável enquanto que a presença da Zap-70 associa-se com maior risco de

progressão e necessidade de tratamento precoce na LLC (HAMBLIN et al., 2004;

RASSENTI, 2004).

A expressão de CD38 foi realizada em 42 pacientes, sendo que 11 (26,19%)

apresentaram positividade para o CD38. Ao observarmos a curva de sobrevida considerando o

tempo sem tratamento dos pacientes com CD38 negativo encontramos um tempo sem

tratamento superior nesse grupo. Este resultado é compatível com o marcador anterior:

expressão da Zap-79 ausente, na maioria dos pacientes, e igualmente com a literatura,

conforme já citada acima.

Com relação às curvas de sobrevida livre de eventos e livre de progressão

considerando as variáveis Zap-70, CD38, tempo de duplicação linfocitária, LDH, e ß2-M não

encontramos qualquer diferença. Estes resultados podem ser decorrentes da amostra pequena

de pacientes estudados.

Na avaliação das alterações citogenéticas pela banda-G, encontramos 44, 44% dos

casos com cariótipo normal e 11,11% deles apresentaram alterações cromossômicas. Sabe-se

que este resultado é decorrente do baixo índice proliferativo das células neoplásicas na LLC.

Neste sentido, o uso da Hibridização in situ por fluorescência (FISH) com sondas alvo-

específicas apresenta resultados bem mais fidedignos. Apesar disto, encontramos resultados

de alguns casos com alterações nos cromossomos um, onze, além de cromossomos

marcadores. Consideramos que a banda-G é um método inferior à FISH na detecção de

alterações características de LLC, porém podemos detectar anormalidades que jamais seriam

vistas pela FISH como aqui demonstrado.

72

6 CONCLUSÔES

A maioria dos pacientes em acompanhamento é de idosos, provenientes da capital, do

sexo masculino e apresentaram Rai/Binet de baixo e moderado riscos. Os eventos de

AHAI e infecções foram pouco freqüentes. O padrão histológico da biópsia foi na sua

maioria não difuso. O nível sérico de LDH se apresentou normal na grande maioria

dos casos.

Os pacientes deste estudo apresentaram perfil imunofenotípico clássico de LLC de

células B com expressão de CD5+, CD19+, CD23+ e imunoglobulina de baixa

expressão, tendo esse exame sido essencial para o diagnóstico diferencial com outras

linfoproliferações.

A maioria dos pacientes estudados apresentou Zap70 negativa, ausência de expressão

de CD38 e ß-2 M aumentada.

Pelo estudo das curvas de sobrevida, encontramos que pacientes com Zap-70 e CD38

negativos apresentaram maior tempo de sobrevida livre de tratamento. Nas demais

curvas não foram encontradas alterações significativas.

Não foram encontradas associações entre as variáveis estudadas, embora tenha havido

uma tendência, talvez em decorrência da amostra pequena.

O prognóstico dos pacientes do sexo masculino não se revelou mais desfavorável em

relação ao feminino.

73

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91

ANEXO A

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPAÇÃO EM PESQUISA

A pesquisa intitulada: “Perfil clínico dos pacientes com LLC do ambulatório do HUWC/HEMOCE: correlação com marcadores biológicos de prognóstico ” tem o desejo de avaliar o seu estado clínico, classificar se sua doença é do tipo que apresenta uma evolução lenta (leve), moderada ou mais grave(acelerada) e sua condição de defesa contra infecções, em decorrência de sua doença. Assim, tentaremos melhorar a assistência do tratamento e de meios para evitar infecções. Iremos obter informações clínicas e dos exames, já realizados, nos prontuários. As informações que não estiverem nos prontuários serão obtidas perguntando ao paciente, quando ele vier para sua consulta. Os exames da pesquisa serão realizados no mesmo dia em que o paciente vier para a coleta de sangue, solicitada pelo médico que o atendeu no ambulatório. Nesta ocasião, retiraremos dois tubos a mais de sangue da veia, de 5ml, para a realização de exames da imunofenotipagem (avalia o tipo de célula doente) e da classificação do estágio de sua doença. Também, neste dia, faremos o exame de aspirado da medula do osso, com anestesia local, para avaliação citogenética (quais as mutações dos cromossomos). Não serão mais colhidos exames em outras ocasiões para a pesquisa. Os riscos da realização dos exames são a dores das punções e a possibilidade de sangramentos, porém raros, porque só colheremos o aspirado da medula óssea daqueles pacientes que tiverem os níveis de plaquetas adequados para a coleta. O paciente poderá desistir de participar da pesquisa, a qualquer momento, sem prejuízo de sua assistência médica no ambulatório. Sua identidade será mantida em sigilo absoluto, sendo a divulgação dos resultados totalmente proibida a terceiros, ficando no seu prontuário os resultados dos exames e uma cópia irá para a discussão acadêmica de âmbito científico e, ainda assim, sem qualquer possibilidade de identificação dos pacientes. Será permitido aos participantes da pesquisa obter as informações relacionadas à pesquisa.Convido o Sr.(a) a participar da pesquisa, em caso de dúvida, poderá comunicar-se com a pesquisadora Dra. Rosângela Pinheiro Gonçalves Machado, que reside na rua Tomas Acioli, número 1620, Apto. 902, bairro Dionísio Torres, Fortaleza,CE. Fone: (0xx85)-96126060. Também poderá obter informações no Comitê de Ética em Pesquisa no telefone (85)-33668589. Para tanto, necessitamos que o Sr.(a) autorize a obtenção da coleta de sangue e aspirado medular e das informações no prontuário.A participação do Sr.(a) na pesquisa será plenamente voluntária e consciente, não havendo qualquer forma de pagamento ou compensação material, sendo que , ao participar da pesquisa, não ficará exposto(a) a nenhum risco.Certo e ciente dos detalhes acima descritos, e, por concordar com todos os termos, acima expostos, manifesto, por vontade própria, livre e consciente, o propósito de participar do presente estudo.

Fortaleza, ____ de _________________ de ______._________________________________________

Assinatura do participante da pesquisa________________________________________

Assinatura do responsável legal_________________________________________

Assinatura de quem obteve o termo

UFC

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁFACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGALMESTRADO EM PATOLOGIA

92

ANEXO B

93

ANEXO C

94

ANEXO D

95

APENDICE A

FICHA CLÍNICA

IDENTIFICAÇÀO DO PACIENTE

Paciente: ____________________________________________No do Prontuário:_________________.Profissão: __________________ Est. Civil: ______________CPF__________________________CNS_________________________________Mãe_______________________________________Telefone___________________Dt.Nasc: _____________ Sexo: ( ) Fem ( ) Mas ( ) Indeterminado

Cor: ( ) Amarela ( ) Branca ( ) Outra ( ) Preta ( ) Vermelha ( ) Parda

Cidade (residência): _____________________________________________________Telefone: ________________. Naturalidade_________________Estado___________ Nacionalidade_____________________

HISTÓRICO FAMILIAR

Casos de LLC na família: ( )sim ( )não ( )não sabe. Grau de parentesco:( )mãe ( )pai( )irmã ( )irmão : ( )materno( )paterno ( ) ambos( )avó( )avô : ( )materno( )paterno( )ambos( )tia ( )tio : ( )materno( )paterno( )ambos( )prima( ) : ( )materno( )paterno( )ambosOutras doenças linfoproliferativas: ( )sim ( )não ( )não sabeSe sim indique: ( )Linfoma não Hodgkin(LNH)( )Linfoma de Hodgkin(LH)( )Mieloma Múltiplo(MM)( )OutrosOutras neoplasias ________________________________________________________HISTÓRIA INICIAL: _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________HÁBITOS SOCIAIS: ____________________________CONTATO COM: Agrotóxicos ( )sim ( )não.Solventes: ( )sim ( )não.Rx ionizante: ( )sim ( )não.Outros:_________________________________________________________________________EXAME FÍSICO INICIAL___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Data do diagnóstico (dd/mm/aaaa): _____/_____/____Adenomegalia número tamanho Adenomegalia número tamanhoCervical _______ _______mm intra abdominal _______ _______mmAxilar _______ _______ mm Inguinal _______ _______mmIntra torácica _______ ________mm Outras cadeias _______ _______mmHepatomegalia:( )sim( )não Tamanho: __________mmEsplenomegalia:( )sim( )não Tamanho: __________mm

96

EXAMES LABORATORIAIS INICIAIS E NAS INFECÇÕES

Hemograma - Data: __/__/____ Hemograma – Data: __/__/____Valor Unidade Valor UnidadeHb _______ g/dl Hb ______ g/dlHtc _______ % Htc ______ %Leucócitos _______ x109/L Leucócitos ______ x109/LNeutrófilos _______ % Neutrófilos______ %Eosinófilos _______ % Eosinófilos______ %Basófilos _______ x109/L Basófilos ______ x109/LLinfócitos _______ % Linfócitos ______ %Monócitos _______ % Monócitos ______ %Plaquetas _______ % Plaquetas ______ %

Hemograma - Data: __/__/____ Hemograma – Data: __/__/____Valor Unidade Valor UnidadeHb _______ g/dl Hb ______ g/dlHtc _______ % Htc ______ %Leucócitos _______ x109/L Leucócitos ______ x109/LNeutrófilos _______ % Neutrófilos______ %Eosinófilos _______ % Eosinófilos ______ %Basófilos _______ x109/L Basófilos ______ x109/LLinfócitos _______ % Linfócitos ______ %Monócitos _______ % Monócitos ______ %Plaquetas _______ % Plaquetas ______ %

Linfócitos na Medula Óssea (__/__/____): ________ %Teste de Antiglobulina Direta Coombs (__/__/____): ( )Positivo ( )Negativo ( )Não realizadoMorfologia dos Linfócitos: ( )Típico ( )Atípico ( )Não informadoLinfócito atípico: ______% Pró-linfócito: ______%

Imunofenotipagem (__/__/____): ( )Sangue periférico ( )MO

Antígeno +/- % Antígeno +/- %CD3 ( )+ ( )- ______% CD38 ( )+ ( )- ______%CD5 ( )+ ( )- ______% CD79b ( )+ ( )- ______%CD7 ( )+ ( )- ______% FMC7 ( )+ ( )- ______%CD19 ( )+ ( )- ______% ĸ ( )+ ( )- ______%CD20 ( )+ ( )- ______% λ ( )+ ( )- ______%CD22 ( )+ ( )- ______% sIgM ( )+ ( )- ______%CD23 ( )+ ( )- ______% ZAP70 ( )+ ( )- ______%

Cariótipo (__/__/____): ( )Alteração no cromossomo ( )Sem alteração no cromossomo ( )não realizadoOutras alterações:_________________________________________________

97

ESTADIAMENTO

Estádio Binet: ( )A ( )B ( )C Estádio Raí: 0( ) ( )I ( )II ( )III( )IV

TRATAMENTOData início do tratamento (dd/mm/aaaa): __/__/____Número de ciclos: ______ Drogas: ( )Clorambucil ( ) Prednisona ( )Fludarabina ( ) Ciclofosfamida ( )OutrosSituação atual: ( )Estável ( )Em atividade ( )ÓbitoSe óbito indique: data: __/__/____ Causa: ( )Própria doença( )Infecção( )Sangramento( )Outras causas

rosÂngela pinheiro gonÇalves machado - … · (edta) para o hemograma, por metodologia...

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