UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE AGRONOMIA

CARACTERIZAÇÃO POLIFÁSICA DE ISOLADOS BACTERIANOS OBTIDOS DE

NÓDULOS DE FEIJOEIRO-COMUM

ALINE ASSIS CARDOSO

Orientador:

Prof. Enderson Petrônio de Brito Ferreira

Goiânia, GO – Brasil

2014

ALINE ASSIS CARDOSO

CARACTERIZAÇÃO POLIFÁSICA DE ISOLADOS BACTERIANOS OBTIDOS DE

NÓDULOS DE FEIJOEIRO-COMUM

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Agronomia, da Universidade

Federal de Goiás, como requisito parcial à

obtenção do título de Mestre em Agronomia,

área de concentração: Solo e Água.

Orientador:

Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira

Co-orientadoras:

Drª. Tereza Cristina de Oliveira Borba

Profª Drª. Eliana Paula Fernandes Brasil

Goiânia, GO – Brasil

2014

Aos meus pais Ademar Marques Cardoso e Maria Regina Chaves de Assis e Cardoso

Ao meu amado marido Michel

E a minha filha, Maria Augusta

DEDICO

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira (Orientador) por suas valiosas

contribuições e sugestões.

A Drª Tereza Cristina de Oliveira Borba (Co-orientadora) pela paciência e

colaboração no decorrer da pesquisa e a todos do laboratório de Biotecnologia da Embrapa

Arroz e Feijão.

A Profª. Drª. Eliana Paula Fernandes Brasil (Co-orientadora) por todas as

oportunidades oferecidas.

Aos analistas do Laboratório de Análises de Biologia e Bioquímica do solo da

Embrapa Arroz e Feijão, Tatiana e Adriano Knupp pelo auxílio em vários momentos.

Ao laboratório de Bioquímica da Universidade Estadual de Goiás/Anápolis

pela infraestrutura e em especial a Profª. Drª. Cláudia Cristina Garcia Martin Didonet pela

dedicação e contribuições.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela concessão de bolsa de formação.

Ao meu marido Michel pelo carinho e incondicional apoio oferecido em todos

os estágios da pesquisa, desde a parceria nos trabalhos em disciplinas, ajuda em análises

laboratoriais até nos momentos da elaboração da dissertação. A minha filha Maria Augusta

pelo carinho. Aos meus Pais Ademar e Regina, em especial à minha mãe a qual cuida da

minha filha enquanto me dedico à formação profissional.

Também, a todos que de alguma forma contribuíram para que esse trabalho se tornasse

uma realidade

Agradeço sinceramente

SUMÁRIO

RESUMO......................................................................................................................... 7

ABSTRACT..................................................................................................................... 8

1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 9

2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 11

2.1 O FEIJOEIRO-COMUM........................................................................................ 11

2.2 A TAXONOMIA DOS RIZÓBIOS....................................................................... 12

2.3 EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA DE RIZÓBIOS......................................................... 13

2.4 TOLERÂNCIA DE RIZÓBIO À SALINIDADE E TEMPERATURA................. 15

2.5 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DOS RIZÓBIOS................ 17

3 MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 20

3.1 ISOLADOS AVALIADOS E BACTÉRIAS AVALIADAS.................................. 20

3.2 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA À SALINIDADE E TEMPERATURA......... 20

3.2.1 Análise dos dados de tolerência à salinidade e temperatura............................. 21

3.3 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR.................................................................. 22

3.3.1 Extração do DNA.................................................................................................. 22

3.3.2 Caracterização molecular por análise da região BOX-PCR........................... 23

3.3.3 Caracterização molecular por análise da região REP-PCR.............................. 23

3.3.4 Análise dos dados de marcadores moleculares................................................... 24

3.4 AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA EM CASA DE VEGETAÇÃO 25

3.4.1 Análises estatísticas............................................................................................... 26

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 27

4.1 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA A SALINIDADE E TEMPERATURA......... 27

4.2 AVALIAÇÕES MOLECULARES: BOX-PCR E REP-PCR................................. 36

4.3 AVALIAÇÃO DOS ISOLADOS EM CASA DE VEGETAÇÃO......................... 44

5 CONCLUSÃO....................................................................................................... 50

6 REFERÊNCIAS.................................................................................................... 51

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Estirpes padrão utilizadas como referência nos ensaios de

caracterização de novos isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-

comum....................................................................................................

20

Tabela 2 Avaliação de diferentes isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-

comum a diferentes temperaturas e concentrações de NaCl..................

28

Tabela 3 Número de nódulos, Massa seca de nódulos, Massa específica de

nódulos, Massa seca da parte aérea, Massa seca de raíz, Relação

raiz/parte aérea, N-Total e área foliar de plantas de feijoeiro-comum

inoculadas com diferentes isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-

comum....................................................................................................

45

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Avaliação da tolerância à salinidade e temperatura de isolados

bacterianos obtidos de nódulos de feijoeiro-comum......................

21

Figura 2 Visão geral do ensaio em casa-de-vegetação para avaliação da

eficiência simbiótica dos isolados obtidos de nódulos de

feijoeiro-comum..............................................................................

25

Figura 3

Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA

utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos

resultados de salinidade e temperatura de 107 bactérias isoladas

de nódulos de feijoeiro-comum......................................................

35

Figura 4 Perfil eletroforético obtido por BOX-PCR para isolados de

nódulos de feijoeiro-comum...........................................................

37

Figura 5

Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA

utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos

fragmentos amplificados por BOX-PCR de bactérias isoladas de

nódulos de feijoeiro-comum...........................................................

38

Figura 6 Perfil eletroforético de REP-PCR de isolados obtidos de nódulos

de feijoeiro-comum.........................................................................

39

Figura 7

Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA

utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos

fragmentos amplificados por REP-PCR de bactérias isoladas de

feijoeiro-comum..............................................................................

41

Figura 8

Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA

utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos

fragmentos amplificados por REP-PCR e BOX-PCR de bactérias

isoladas de feijoeiro-comum.......................................................

43

Figura 9 Análise de correlação correlação de Pearson entre a MSPA e

MSN de feijoeiro-comum inoculado com novos isolados e com

as estirpes padrão.......................................................................

47

Figura 10

Análise de correlação correlação de Pearson entre a MSPA e

MSN de feijoeiro-comum inoculado com novos isolados e com

as estirpes padrão............................................................................

48

Figura 11

Análise de correlação correlação de Pearson entre a AF e MSN

de feijoeiro-comum inoculado com novos isolados e com as

estirpes padrão................................................................................

49

RESUMO

CARDOSO, A. A. Caracterização polifásica de isolados bacterianos obtidos de

nódulos de feijoeiro-comum. 2014. 64 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia: Solo e

Água) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, 2014.1

A pesquisa sobre a fixação biológica de nitrogênio (FBN) no feijoeiro teve

bastante progresso nos últimos anos, especialmente no conhecimento do microsimbionte e

no estudo de novas abordagens buscando maior variabilidade no macrosimbionte para

maior eficiência da FBN. Os estudos da diversidade e taxonomia bacteriana, especialmente

aplicados aos simbiontes do feijoeiro-comum apresentou uma grande evolução devido às

novas metodologias moleculares de avaliação e caracterização. Este trabalho teve como

objetivo avaliar a resistência à salinidade e temperatura, caracterizar molecularmente e

avaliar a eficiência simbiótica de isolados de nódulos de feijoeiro-comum oriundos dos

estados de GO, MG e PR. Os isolados foram avaliadas quanto à salinidade e temperatura

em meio YMA com diferentes concentrações de NaCl (0%; 1%; 2%; 4% e 6%) em

diferentes temperaturas (28ºC; 33ºC; 38ºC; 43ºC e 48ºC). Para a caracterização molecular

os isolados foram crescidos em meio YMA líquido por 24 horas e logo em seguida foi

realizada a extração do DNA. Foram avaliados perfis BOX-PCR e REP-PCR. A avaliação

da eficiência simbiótica dos isolados foi conduzida em casa-de-vegetação com vasos tipo

Leonard com a cultivar Pérola inoculada com diferentes isolados selecionados na análise

anterior. Foi avaliado o número de nódulos (NN), massa seca de nódulos (MSN), massa

específica de nódulos (MEN), massa seca de raiz (MSR), matéria seca da parte aérea

(MSPA), relação raiz/parte aérea (R/PA), nitrogênio total (N) e área foliar (AF). Observou-

se que 41,12% dos isolados cresceram em condições mais restritivas que as estirpes padrão

SEMIA 4077, SEMIA 4080 e SEMIA 4088, e 29,90% dos isolados cresceram em

condições menos restritivas que as SEMIAs. Os perfis BOX-PCR e REP-PCR

apresentaram grande diversidade genética entre os isolados avaliados, demonstrando um

alto grau de polimorfismo. Os isolados JPrG8A7 e JPrG8A6 apresentaram desempenho

superior as estirpes padrão quando comparados o NN, MEN e MSN. Esta última

apresentou correlação positiva com a MSPA, N-Total e AF. Foi observado que alguns

isolados apresentaram características competitivas iguais ou superiores as estirpes-padrões

comerciais, apresentando resultados que podem melhorar o processo de simbiose entre a

planta e a bactéria, gerando assim uma maior produtividade para a cultura do feijoeiro-

comum.

Palavras-chave: Rhizobium, nodulação, BOX-PCR, REP-PCR, diversidade.

1 Orientador: Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira. Embrapa Arroz e Feijão.

Co-orientadora: Drª. Tereza Cristina de Oliveira Borba. Embrapa Arroz e Feijão.

Co-orientadora: Prfª Drª. Eliana Paula Fernandes Brasil. EA-UFG.

11

ABSTRACT

CARDOSO, A. A. Polyphasic characterization of bacterial isolates obtained from

common bean nodules. 2014. 64 f. Dissertation (Master in Agronomy: Soil and water) –

Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, 2014.2

Research on biological nitrogen fixation (BNF) in common bean had a great

progress in recent years, especially in the knowledge of microsimbiont and exploring new

approaches seeking greater variability in macrosimbiont for efficiency of BNF. Studies of

bacterial diversity and taxonomy, especially applied to common bean symbionts showed a

great evolution due to new molecular methodologies for evaluation and characterization.

This study aimed to evaluate the tolerance to salinity and temperature, to characterize

based on molecular markers and to evaluate the symbiotic efficiency of bacterial isolates

obtained from nodules of common bean cultivated on soil samples from the States of

Goiás, Minas Gerais and Paraná. The isolates were evaluated for salinity and temperature

on YMA medium with different NaCl concentrations (0%, 1%, 2%, 4% and 6%) at

different temperatures (28ºC, 33ºC, 38ºC, 43ºC and 48ºC). For molecular characterization

based on BOX-PCR and REP-PCR profiles the isolates were grown in liquid YMA for 24

hours and then DNA extraction was performed. Evaluation of symbiotic efficiency of the

isolates was conducted under greenhouse conditions in Leonard jars. Seeds of common

bean (var. Pérola) were inoculated with different isolates selected in the previous analysis.

Nodule number (NN), dry mass of nodules (DMN), specific mass of nodules (SMN), root

dry weight (RDW), dry matter of aerial part (DMAP), relation root/shoot (R/S), total

nitrogen (N) and leaf area (LA) were evaluated. It was observed that 41.12% of the isolates

grew in more restrictive conditions than standard strains SEMIA 4077, SEMIA 4080 and

SEMIA 4088, and 29.90% of the isolates grew in less restrictive conditions than SEMIAs

strains.BOX-PCR and REP-PCR profiles showed high genetic diversity among the

evaluated isolates, demonstrating a high degree of polymorphism. JPrG8A7 and JPrG8A6

isolates exhibited superior performance compared to standard strains when compared the

NN , SMN and DMN. The latter showed a positive correlation with the DMAP, Total-N

and LA. It was observed that some isolates showed competitive features equal or superior

than commercial standards strains, with results that can improve the process of symbiosis

between plant and bacteria, thereby generating greater productivity for the common bean

cultivation.

Key words: Rhizobium, nodulation, BOX-PCR, REP-PCR, diversity.

2 Adviser: Dr. Enderson Petrônio de Brito Ferreira. Embrapa Arroz e Feijão.

Co-adviser: Drª. Tereza Cristina de Oliveira Borba. Embrapa Arroz e Feijão.

Co-adviser: Profª Drª Eliana Paula Fernandes Brasil. EA-UFG.

1 INTRODUÇÃO

Oriunda da região Centro-americana a espécie Phaseolus vulgaris L. (feijoeiro-

comum) é de grande importância econômica e social para diversas nações das regiões

tropicais e subtropicais. Nestas regiões os grãos de feijão compõem a dieta básica de um

segmento populacional expressivo, constituindo-se frequentemente na principal fonte

básica de proteína e de carboidrato. No cenário agrícola internacional o Brasil destaca-se

como o segundo maior produtor de feijoeiro-comum, sendo a Índia o primeiro (FAO,

2012). No contexto brasileiro, a cultura do feijoeiro-comum encontra-se inserida

principalmente no sistema produtivo da agricultura familiar (65%), possuindo, portanto,

importante apelo social e econômico.

A cultura do feijoeiro-comum possui grande importância econômica, para o

Brasil, uma vez que a área cultivada, na safra 2012/2013, foi de cerca de 3,11 milhões

hectares, o que correspondeu a uma produção de 2,83 milhões toneladas, com rendimento

médio de 910 kg ha-1

(Conab, 2013). Juntos, os Estados do Paraná, Minas Gerais, São

Paulo e Goiás respondem por quase 60% dessa produção, em 34% da área cultivada. A

produtividade média desses Estados (1600 kg ha-1

) supera em 71% a média nacional que é

de 910 kg ha-1

. Na década de 1980, a produtividade do feijão era pouco mais de 500 kg ha-1

(Ferreira et al., 2006). Portanto, verifica-se que houve grande aumento na produtividade da

cultura. Grande parte desse aumento pode ser atribuída às novas cultivares obtidas.

A FBN é um processo essencial para transformar o N2, uma molécula estável e

abundante na atmosfera, que não pode ser utilizada pela maioria dos microrganismos e

pelas plantas, na forma inorgânica combinada NH3 e, a partir daí, em formas reativas

orgânicas e inorgânicas vitais em sistemas biológicos. A reação de redução do N2 a NH3 é

realizada por microrganismos que contêm a enzima nitrogenase e são conhecidos como

fixadores de N2 ou diazotróficos (Novais et al., 2007).

A pesquisa sobre a fixação biológica de nitrogênio (FBN) no feijoeiro-comum

vem progredindo nos últimos anos, especialmente no conhecimento do microsimbionte e

no estudo de novas abordagens buscando maior variabilidade no macrosimbionte para

maior eficiência da FBN (Nodari et al.,1993; Andriolo et al., 1994; Franco, 1998). Os

10

estudos da diversidade e taxonomia bacteriana, especialmente aplicados aos simbiontes do

feijoeiro-comum apresentou uma grande evolução nos últimos anos devido às novas

metodologias moleculares de avaliação e caracterização.

O caso de maior sucesso da FBN no Brasil é a simbiose de Bradyrhizobium

japonicum com a soja. A principal leguminosa cultivada comercialmente no Brasil

dispensa totalmente a adubação nitrogenada, uma vez que, em condições normais de

cultivo, a FBN é capaz de suprir as necessidades de N da cultura (Hungria et al., 2000). Por

outro lado, a FBN com outras leguminosas importantes, tais como o feijoeiro-comum e o

amendoim, não consegue, com a tecnologia atualmente disponível, suprir totalmente a

demanda por N dessas culturas, mas permite reduzir as doses de N aplicadas como

fertilizantes químicos (Novais et al., 2007).

O estudo da biodiversidade do rizóbio tem aplicações agrícolas importantes,

tanto em termos de manejo cultural, visando implementar a sobrevivência de populações

mais eficientes e mesmo mais específicas, quanto da obtenção de germoplasma mais

adaptado aos diferentes tipos de solos. Os dados levantados nos estudos de genética de

populações dos diferentes gêneros de rizóbio indicam que há um alto grau de diversidade

genética dentro desse grupo (Demezas et al., 1991, 1995; Eardly et al., 1990, 1995; Souza

et al., 1992; Bottomley et al., 1994; Leung et al.,1994; Paffetti et al., 1996).

No entanto, a maioria dos estudos de biodiversidade tem sido conduzida em

solos de clima temperado, sob condições completamente diferentes dos nossos solos

tropicais. Na avaliação da biodiversidade do rizóbio, as modernas técnicas de DNA

recombinante são uma ferramenta preciosa nas mãos dos pesquisadores das regiões

tropicais, especialmente as técnicas baseadas em PCR, relativamente baratas e de fácil

manuseio (Felice & Alshinawi, 1996).

Com base no exposto e no fato de que a eficiência da FBN depende de uma

interação muito específica entre os simbiontes, é de fundamental importância estudar as

diferentes estirpes de rizóbio. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos caracterizar

isolados bacterianos de feijoeiro-comum quanto à tolerância a salinidade e temperatura e

com base nos marcadores moleculares BOX-PCR e REP-PCR e a determinar a eficiência

simbiótica desses isolados.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 O FEIJOEIRO-COMUM

O feijoeiro-comum é cultivado em diversos países em todo o mundo. Tem

grande importância econômica principalmente em países em desenvolvimento, pois o seu

cultivo é fonte de renda para muitas famílias, principalmente famílias de pequenos

agricultores que dependem da produção da cultura. Seus grãos constituem uma das

principais e mais acessíveis fontes de minerais, aminoácidos, calorias e fibras para os

brasileiros, estando presente, diariamente, na dieta da população. A cultura do feijoeiro tem

recebido destaque por organizações de combate à desnutrição por micronutrientes

essenciais, tais como o programa Harvestplus, devido aos altos teores de Fe e Zn, apesar da

alta variabilidade genética e ambiental presente nesses teores (Aidar, 2003).

A cultura do feijoeiro-comum possui grande importância econômica, para o

Brasil, uma vez que a área cultivada, na safra 2012/2013, foi de cerca de 3,11 milhões

hectares, o que correspondeu a uma produção de 2,83 milhões toneladas, com rendimento

médio de 910 kg ha-1

. Juntos, os Estados do Paraná, Minas Gerais, São Paulo e Goiás

respondem por quase 60% dessa produção, em 34% da área cultivada. A produtividade

média desses Estados (1600 kg ha-1

) supera em 71% a média nacional que é de 910 kg ha-1

(Conab, 2013).

A inoculação do feijoeiro-comum em condição de campo no Brasil foi durante

muito tempo feita com inoculante produzido utilizando-se estirpes de R. leguminosarum

bv. phaseoli e R. etli, sendo que muitas das estirpes foram isoladas no exterior e testadas

pelas instituições de pesquisa no Brasil. Com a evolução dos estudos taxonômicos,

revelando os diferentes agrupamentos de isolados com características simbióticas e

adaptação ecológica distinta, inclusive envolvendo isolados obtidos nas regiões de clima

tropical, revelou-se a inequação das estirpes tradicionalmente recomendadas para as

condições brasileiras de cultivo. Atualmente sabe-se que as estirpes de R. leguminosarum

bv. phaseoli e R. etli estão sujeitas a um elevado grau de instabilidade genética (Soberón-

Chaves et al., 1986; Flores et al., 1988), o que pode explicar, pelo menos parcialmente, a

grande variabilidade na eficiência simbiótica verificada nestes experimentos.

12

2.2 A TAXONOMIA DOS RIZÓBIOS

O agrupamento dos rizóbios foi, inicialmente, baseado em características

fenotípicas, principalmente na habilidade de nodular algumas leguminosas, dando origem

ao conceito de “grupos de inoculação cruzada”. A taxonomia do rizóbio baseada na

especificidade hospedeira foi sendo substituída pela taxonomia numérica, que se apóia nas

características bioquímicas, fisiológicas, sorológicas e moleculares (Hungria et al., 1997).

Primeiramente, a família Rhizobiaceae era representada apenas pelo gênero

Rhizobium, o qual era constituído por bactérias capazes de nodular e fixar nitrogênio em

relações simbióticas com plantas da família Leguminosae. A classificação das espécies

tinha como base principalmente a leguminosa hospedeira com as quais fossem capazes de

formar nódulos e fixar nitrogênio. Desse modo, Rhizobium phaseoli nodula feijoeiro-

comum; R. japonicum, a soja; R. meliloti, a alfafa; R. lupini,o tremoço. e R. trifolii, o trevo

(Coutinho, 2003).

Devido a sua ampla distribuição geográfica e a sua longa história evolutiva,

existe uma enorme diversidade genética entre as bactérias da família Rhizobiaceae (Piñero

et al., 1988). Uma amostra da diversidade e heterogeneidade deste agrupamento pode ser

constatada quando uma mesma leguminosa atrai geneticamente vários simbiontes, ou

quando um mesmo rizóbio é capaz de nodular diferentes leguminosas. Graças a essa

diversidade a classificação destes organismos tem sido bastante dinâmica ao longo dos

anos. Substituindo o conceito de inoculação cruzada, os rizóbios foram agrupados em dois

grandes grupos: Rizóbios de crescimento rápido e lento, dando origem a dois grandes

gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium, respectivamente (Jordan, 1984). Mais tarde quatro

novos gêneros foram incluídos: Sinorhizobium (Lajudie et al, 1994; Chen et al., 1998),

Azorhizobium (Dreyfus et al., 1988), Mesorhizobium (Jarvis et al., 1982; Jordan, 1984;

Nour et al., 1994, Lindström et al.,1995) e Allorhizobium (Lajudie et al, 1998). Segundo

Young & Haukka (1996), com a utilização de técnicas moleculares, os gêneros passaram a

ser separados baseados em seqüências do gene 16S rDNA.

2.3 EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA DE RIZÓBIOS

13

Uma das características do feijoeiro-comum é a possibilidade de estabelecer

relação simbiótica com um grupo de bactérias capazes de captar o nitrogênio atmosférico

(N2). O N é um elemento essencial para a constituição da massa total dos sistemas vivos,

sendo componente indispensável à biossíntese de moléculas fundamentais, tais como:

ácidos nucléicos e aminoácidos, representando de 8 a 16% do total de massa orgânica.

Como 78% da atmosfera terrestre é constituída por N2 ou dinitrogênio, esta é a fonte mais

abundante deste elemento (Nelson & Cox, 2002). Entretanto, as formas solúveis e

biologicamente assimiláveis desta molécula são escassas. Nenhum animal ou planta é

capaz de utilizá-lo diretamente da atmosfera, devido à tripla ligação covalente que existe

entre os átomos de nitrogênio (Manyani et al., 2001), por isso há uma dependência de

microrganismos que realizem esta atividade.

Na natureza, somente um pequeno número de microrganismos, denominados

diazotróficos ou fixadores de nitrogênio, é capaz de reduzir nitrogênio atmosférico à

amônia. Esse processo, chamado de fixação biológica do nitrogênio (FBN), é realizado

pela enzima nitrogenase, um complexo protéico que catalisa a reação (Eady & Postgate,

1974).

A participação da FBN no ciclo biogeoquímico do nitrogênio é, sobretudo

importante na medida em que a atividade das bactérias diazotróficas representa cerca de

60% do nitrogênio anualmente fixado na Terra (Kim & Rees, 1994). Além disso, a FBN é

o processo primário através do qual o nitrogênio, quimicamente indisponível para a

maioria dos organismos, se torna fisiológica e metabolicamente disponível, inicialmente

sob a forma de amônia e, posteriormente, na ciclagem do nitrogênio, podendo formar

outros compostos nitrogenados, como: nitritos, nitratos e óxido nítrico. Em todas as

leguminosas a fixação de N2 não é iniciada até que a planta possa sustentar esta atividade,

ou seja, ceder energia para que a bactéria possa entrar em atividade e fornecer o nitrogênio

necessário, ou até que se esgote o nitrogênio presente na semente, e a planta, portanto,

venha a sentir a falta deste elemento (Mercante et al., 1992).

Quando o solo contém suficiente quantidade de N para suprir a demanda da

planta, a quantidade de N2 fixada será pequena, evidenciando que a nitrogenase é um

processo flexível que ajusta a demanda da planta por N (Mengel, 1994). Dentre as

associações entre bactérias fixadoras e plantas, a que ocorre entre bactérias comumente

chamadas de rizóbio e leguminosas é a mais conhecida.

14

Uma associação rizóbio x leguminosa eficiente, na qual a necessidade da planta

por nitrogênio seja suprida, é o alvo de muitas pesquisas que são desenvolvidas no mundo,

principalmente nos trópicos, uma vez que o nitrogênio é um dos elementos do solo mais

limitantes da produção nestas áreas (Franco & Balieiro, 1999). Existem aproximadamente

18000 espécies de plantas leguminosas, entretanto sabe-se que somente em 8% ocorre a

formação de nódulos (Sprent, 1995).

A formação dos nódulos é um processo complexo que ocorre em várias etapas

e envolve mudanças fisiológicas e morfológicas, tanto na célula hospedeira, como na

bactéria. As mudanças na bactéria visam, principalmente, o recebimento de fontes de

carbono da planta hospedeira, para prover o ATP e poder redutor, necessários para o

processo de FBN, enquanto que as mudanças na planta hospedeira visam assimilar a

amônia produzida pelas bactérias (Hungria & Campo, 2005).

Espécies de leguminosas tropicais, normalmente são capazes de nodular com

uma ampla faixa de rizóbios, contribuindo, desta forma, para a FBN nessas regiões. Por

outro lado, a introdução de inoculantes contendo rizóbios eficientes, é dificultada, pois as

estirpes nativas, em geral, são muito competitivas (Santos et al., 2007). Frente a esta

situação, torna-se interessante estudar estratégias para avaliar a composição e a

contribuição de estirpes de rizóbios nativos do solo onde se pretende introduzir o

inoculante visando realizar uma eficiente FBN (Zilli et al., 2006).

O reconhecimento das características estruturais do genoma rizobiano foi

facilitado pela observação de que ferramentas disponíveis aos estudos com Escherichia

coli poderiam ser aplicadas ao rizóbio. Isso levou à identificação dos genes nif, bem como

a sua localização aproximada no cromossomo (Hungria et al., 1997). Hoje, estão descritos

diversos genes, que são classificados em três categorias: genes de nodulação (nod, nol e

noe), responsáveis pelos passos iniciais da nodulação; genes nif (nitrogen fixation), ligados

à síntese e regulação da nitrogenase, todos homólogos a genes encontrados em Klebsiella

pneumoniae e os genes fix, com a mesma função dos nif, mas sem homologia com os genes

de K. pneumoniae (Hungria et al., 1994). Existem, ainda, outras categorias de genes,

envolvidos com a superfície das bactérias e que afetam a nodulação, exo

(exopolysaccharides), lps (lipopolysaccharides) e ndv (1,2−β−glucans, nodule

development), além dos genes hem (heme), relacionados com síntese de hemoglobina, dct

(dicarboxylic transport), gln (glutamine synthetase) e hup (hydrogenase uptake) (Hungria

et al., 1997).

15

2.4 TOLERÂNCIA DE RIZÓBIO À SALINIDADE E TEMPERATURA.

A salinização do solo constitui uma das mais sérias formas de degradação dos

recursos edáficos e, em áreas secas, caracteriza-se como um fenômeno complexo causado

pela interação entre fatores biofísicos e sócio-econômicos. No Brasil, esses efeitos são

mais intensos no meio rural da região semi-árida do Nordeste, em virtude das

características de clima, relevo, geologia, entre outros fatores, serem condições favoráveis

à ocorrência de solos afetados por excesso de sais (Mota & Oliveira, 1999).

O excesso de sais solúveis provoca uma redução do potencial hídrico do solo,

resultando em menor capacidade de absorção de água pelas plantas. Essa redução,

associada com os efeitos tóxicos dos sais, interfere inicialmente no processo de absorção

de água pelas sementes, influindo também no desenvolvimento normal das plantas

(Rebouças et al., 1989) e sobre alguns processos biológicos, como a FBN, pois prejudica a

eficiência da simbiose (Shereen et al., 1998).

Assim como as plantas, as bactérias diazotróficas simbióticas apresentam

grande variação na tolerância à salinidade. Essa tolerância ao estresse salino pode ser

atribuída a variações de pH, temperatura, fonte de carbono solúvel e à presença de solutos

osmoprotetores (Graham, 1992). Para bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium,

os efeitos prejudiciais dos sais são mais evidentes, particularmente em relação aos efeitos

da concentração do íon específico do que ao efeito osmótico (Elsheikh, 1998), variando de

acordo com a forma iônica presente e a tolerância da estirpe. Nesse contexto, o NaCl tem

sido considerado bom indicador da tolerância de bactérias a sais (Abdelmoumen et al.,

1999).

O desenvolvimento de tecnologias e conhecimentos que favoreçam a atividade

agrícola em solos salinos ou afetados pela salinização decorrente de ações antrópicas é um

dos desafios à segurança alimentar de grandes contingentes populacionais em escala

planetária, em especial nas zonas áridas e semi-áridas. Nas áreas irrigadas do semi-árido

brasileiro, equivalente a 300 mil há, o problema está presente em 25% da área (Goes,

1977). Considfderando toda a região semi-árida, a salinidade alcança cerca de 20% dos 95

milhões de hectares (Melo et al., 2006). Caracterizado por baixa precipitação

pluviométrica, estiagens prolongadas, altas temperaturas e, muitas vezes, baixa fertilidade

do solo, o Semi-árido do Brasil concentra a população com menor Índice de

Desenvolvimento Humano (IDH) do país.

16

Alguns trabalhos realizados principalmente com leguminosas de clima

temperado relatam o efeito prejudicial da salinidade na nodulação. A maioria desses

trabalhos considera que o efeito é mais acentuado no sistema radicular, prejudicando o

desenvolvimento do rizóbio (Tu, 1981). Alguns pesquisadores observaram variações na

tolerância de diferentes estirpes quanto a concentrações crescentes de NaCl (Rai, 1983; Rai

et al., 1985), enquanto outros consideram que a tendência e magnitude das reduções por

efeito da salinidade dependem também das variedades apresentadas pelas plantas (Ahmad

et al., 1981).

Acredita-se que, quando os estresses são de curta duração, predominem os

efeitos osmóticos dos sais, fazendo com que o potencial hídrico do ambiente radicular

diminua e restrinja a absorção de água; em estresses de longa duração, todavia, os íons se

acumulam e provocam toxidez, induzindo distúrbios nutricionais e metabólicos (Munns,

2002). Nesse contexto, o NaCl tem sido considerado bom indicador da tolerância de

bactérias à sais (Abdelmoumen et al., 1999).

Por outro lado, temperaturas elevadas são outro fator também limitante para o

rizóbio, onde o tamanho do nódulo parece ser o parâmetro mais sensível a altas

temperaturas do que o número de nódulos em estudos com a cultura da soja realizados por

Castro et al. (1993). Esta sensibilidade a temperaturas elevadas pode ser exemplificada

pelas simbioses do feijoeiro-comum, a qual também apresenta sensibilidade.

No caso do feijoeiro-comum, tanto a planta como o rizóbio são afetados

quando em temperaturas superiores à 34 oC (Moreira & Siqueira, 2002), sendo que no caso

do rizóbio, os plasmídeos que carregam os genes simbióticos podem ser perdidos. Estirpes

isoladas de leguminosas florestais tolerantes a altas temperaturas e eficientes na nodulação

do feijoeiro-comum têm sido apontadas como uma valiosa fonte de recursos genéticos para

aumentar o potencial da FBN nesta cultura nos trópicos como as encontradas por Hungria

et al. (1993). Em feijão-caupi, Dart & Mercer (1965) encontraram que nódulos foram

reduzidos em número, tamanho e conteúdo de leghemoglobina quando submetidas a altas

temperaturas embora outros fatores, além da temperatura, estivessem também envolvidos.

A literatura é bem diversificada quanto a informações sobre as diferentes

capacidades de bactérias diazotróficas, tanto associativas quanto simbióticas, em tolerar

salinidade (Shereen et al., 1998; Rasa et al., 2001; Tamimi, 2001; Nóbrega et al., 2004), e

as faixas de tolerância das espécies diazotróficas simbióticas observadas variaram de 0 a

60 g L-1

de NaCl. Segundo Xavier et al. (2007), as concentrações máximas toleradas de

17

NaCl pelas estirpes, em meio de cultura YMA (Yeast Mannitol Agar), variaram de 2 até 30

g L-1

. Não houve nenhuma estirpe que cresceu na concentração de 50 g L-1

de NaCl. Os

padrões de crescimento de todas as estirpes foram reduzidos com o aumento da

concentração de NaCl no meio de cultura. Estudos com essa finalidade objetivam não só

identificar estirpes potenciais para usos diversos, mas também auxiliar na caracterização

das espécies bacterianas (Frioni et al., 2001; Nóbrega, et al., 2004).

Em geral, espécies de rizóbio de crescimento rápido são mais tolerantes a altas

concentrações salinas em meio de cultura, quando comparadas a espécies de crescimento

lento, pois produzem mais polissacarídeos extracelulares, que envolvem as células

bacterianas, diminuindo o contato da superfície celular com o meio salino, proporcionando

maior resistência da célula bacteriana ao efeito osmótico (Elsheikh, 1998).

2.5 AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DOS RIZÓBIOS

Além da contribuição de todo o conhecimento da biodiversidade do solo e da

utilização de coleções de rizóbios, ensaios sobre sua diversidade genética desempenham

importante papel no desenvolvimento a longo prazo de estratégias que aumentem a

contribuição da FBN na agricultura mundial.

Impressionantes progressos têm sido alcançados para o entendimento da

diversidade genética dos rizóbios, com a aplicação de várias técnicas de análise do DNA.

Alguns exemplos são amplificações de DNA de rizóbio pela PCR (Polymerase Chain

Reaction) com primers específicos como REP (Repetitive Extragenic Palindromic), ERIC

(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), BOX (Box Element) (De Bruijin, 1992;

Versalovic et al., 1994; Kaschuk et al., 2006), análise de genes ribosomais (rRNA 16S e

23S) e regiões intergênicas através de RFLP (“Restriction Fragment Length

Polimorphism”) e seqüência de DNA (Laguerre et al., 1996; Vinuesa et al., 1998).

A análise genética por meio de PCR utilizando primers específicos na

rizobiologia tem desempenhado importante papel nos estudos de diversidade genética.

Sequências repetitivas intergênicas, de consenso, dispersas no genoma bacteriano,

conhecidas como ERIC, REP e BOX, geram padrões altamente característicos quando

separados em gel de agarose (De Bruijn, 1992; Versalovic et al., 1994). As seqüências REP

consistem de regiões do DNA com repetições invertidas de 35-40 pb e são encontradas em

clusters, onde cópias sucessivas são organizadas em orientação alternada.

18

As seqüências ERIC têm o tamanho de 124-127 pares de bases. Tanto as

seqüências ERIC quanto os elementos REP estão localizados em regiões não codificadoras,

mas que provavelmente são transcritas e possuem potencial para formar estruturas

secundárias. As seqüências BOX assemelham-se mais a ERIC quanto ao tamanho,

parecendo estar envolvidas na duplicação do DNA. Sua ação seria com a DNA girase e

terminação da transcrição (Mehta, 2000). Os padrões de amplificação são menos

complexos que os obtidos com REP, mas permitem uma boa discriminação em nível de

estirpe (Olive & Bean, 1999).

Os estudos de diversidade normalmente são realizados a partir de simples

amostragens de bactérias do solo. Na maioria deles, os rizóbios são obtidos a partir de

amostras de plantas inoculadas (Mercante et al., 1998; Straliotto et al., 1999; Ferreira et al.,

2000) ou de nódulos de plantas cultivadas no campo (Mostasso et al., 2002). Menos

comuns são os métodos de cultivo de plantas em vasos com solo pela presença de rizóbios

nativos do solo (Palmer & Young, 2000) ou em tubos contendo solução isenta de

nitrogênio (Frémont et al., 1999). Ainda podem ser isolados do solo sem a planta

hospedeira, usando placa de Petri, contendo meio sólido semi-seletivo (Bromfield et al.,

1994; Louvrier et al., 1996).

Atualmente os critérios de agrupamento e/ou classificação taxonômica têm-se

baseado em análises filogenéticas moleculares. Seqüências de nucleotídeos altamente

conservadas em bactérias têm sido o fundamento para a revisão das reais inter-relações

entre espécies, gêneros ou mesmo famílias (Olson et al., 1994). O uso da seqüência de

nucleotídeos do gene que codifica o 16S rRNA (subunidade menor do ribossomo) foi

estabelecido como método padrão de análise em procariontes.

Para fins de determinação da diversidade genética e agrupamento por

similaridade, a técnica de PCR parece demonstrar bons resultados. Fernandes et al. (2003)

analisaram rizóbios isolados dos tabuleiros costeiros de Sergipe empregando três técnicas:

PCR com o oligonucleotídeo específico BOX; PCR-RPFL da região do DNA que codifica

para o gene 16S rRNA e da região intergênica entre 16S e 23S rRNA, com cinco enzimas

de restrição; e seqüenciamento parcial da região 16S rRNA. Os resultados obtidos neste

estudo revelaram diversidade genética elevada entre as estirpes nativas e confirmam que a

análise por BOX-PCR é eficiente para discriminá-las, mas como já relatado por outros

autores (Laguerre et al., 1997; Chueire et al., 2000) nem sempre foi adequada nas

avaliações filogenéticas, onde houve coerência entre as análises envolvendo a região do

19

16S rRNA, mas o agrupamento com uma das estirpes diferiu pela análise do espaço

intergênico.

Nos estudos conduzidos para avaliar a qualidade dos inoculantes, Chueire et al

(2000) estudaram a variabilidade das estirpes de Bradyrhizobium sp. e Rhizobium sp.

(coleção SEMIA – Seção de Microbiologia Agrícola) recomendadas respectivamente para

soja e feijoeiro. Desde 1992, variantes naturais destas estirpes foram incluídas na coleção

SEMIA. Não foi possível, no entanto, diferenciar entre as estirpes parentais e as variantes,

dentro de cada par de estirpes de Bradyrhizobium pela análise sorológica de aglutinação

com anticorpos de células totais, ou com anticorpos de lipopolissacarídeos celulares.

Contudo, no estudo foi possível distinguir as quatro estirpes pela reação de amplificação

aleatória de DNA polimórfico (RAPD). Os autores observaram que as estirpes SEMIA

5079, SEMIA 5080 e as duas outras recomendadas para o uso em inoculantes comerciais,

SEMIA 587 e SEMIA 5019 (= 29w), mostraram perfis diferenciados pela técnica de PCR

com os oligonucleotídeos iniciadores REP e ERIC, no entanto, o REP e ERIC-PCR

produziram perfis idênticos para os pares de estirpes SEMIA 566 X SEMIA 5079 e

SEMIA 586 X SEMIA 5080. Tanto o RAPD como o REP e ERIC-PCR mostraram perfis

distintos para as duas estirpes de Rhizobium, SEMIA 4077 (=CIAT 899) e SEMIA 4080

(=PRF 81), demostrando alta diversidade entre as estirpes.

Marcadores moleculares de diferentes classes, como aqueles baseados na PCR

têm contribuído para a determinação da variabilidade de rizóbios, tanto entre estirpes de

uma mesma espécie, quanto de estirpes de diferentes espécies. Com estes estudos podem

gerar melhoria no processo da FBN e garantir assim uma maior produtividade do feijoeiro-

comum.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 ISOLADOS AVALIADOS E BACTÉRIAS UTILIZADAS

Os 107 isolados avaliados neste trabalho (Anexo A) foram obtidos a partir de

amostras de solo oriundas dos estados de GO, MG e PR, cultivadas com 11 diferentes

genótipos de feijoeiro-comum, utilizandos como plantas-isca. Os nódulos foram coletados

e isolados em placas de Petri contendo meio Yeast Mannitol Agar (YMA) (Sampaio,

2012). As estirpes utilizadas como referência foram as SEMIA 4077, SEMIA 4080,

SEMIA 4088 e a CFN42 (Tabela 1).

Tabela 1. Estirpes padrão utilizadas como referência nos ensaios de caracterização de

novos isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum

Espécie Estirpe Sinonímia Origem do solo

para isolamento Referência

R. etli bv. Phaseoli* CFN 42 ATCC 51251,

USDA 9032 México Segovia et al., 1993

R. tropici CIAT 899 SEMIA 4077 Colombia Martínez-Romero et al., 1991

R. tropici PRF 81 SEMIA 4080 Paraná, Brasil Hungria et al., 2000

R. tropici H12 SEMIA 4088 D. Federal, Brasil Mostasso et al., 2002

* Usada somente nas analises de BOX e REP.

3.2 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA A SALINIDADE E TEMPERATURA

Os 107 isolados e as três estirpes padrão de Rhizobium tropici (SEMIA 4077,

SEMIA 4080 e SEMIA 4088), foram usados nas avaliações para a determinação da

tolerância dos isolados a diferentes salinidades e diferentes temperaturas.

Os isolados foram transferidos para vidros de penicilina contendo 5 mL de

meio YMA (Yeast Manitol Agar) líquido e colocados para crescer (28ºC;120 RPM) por

48 horas. Da suspensão de cada isolado foram transferidos, em triplicata, 200 µL para uma

microplaca de 96 poços. Com o auxílio de um carimbo replicador os isolados foram

inoculados em placas de Petri contendo meio YMA sólido com diferentes concentrações de

NaCl (0%; 1%; 2%; 4% e 6%), as quais foram adicionadas no momento do preparo do

meio YMA sólido. As placas de Petri inoculadas com os isolados em meio YMA sólido

21

com diferentes concentrações de NaCl foram incubadas em incubadora B.O.D por 48 horas

em diferentes temperaturas (28ºC; 33ºC; 38ºC; 43ºC e 48ºC). Após as 48 horas de

incubação as placas de Petri foram retiradas da BOD para as avaliações do crescimento

(Figura 1).

Figura 1. Avaliação da tolerância à salinidade e temperatura de isolados bacterianos

obtidos de nódulos de feijoeiro-comum

3.2.1 Análise dos dados de tolerância a salinidade e temperatura

Para a discriminação dos resultados foi utilizado o símbolo “+” para os

isolados que apresentaram crescimento e o símbolo “-” para os que não cresceram. Com

esses resultados foi gerada uma tabela agrupando as bactérias que apresentaram

crescimentos similares, gerando diferentes grupos, através dos quais foram selecionados,

para as análises de BOX-PCR e REP-PCR, 68 isolados que apresentaram desempenho

melhor ou semelhante ao das SEMIAS, crescendo em condições mais restritivas ou

próximas. A partir dessa tabela também foi gerada uma matriz binária atribuindo os valores

1 ou 0, indicando presença ou ausência de crescimento, respectivamente. A matriz binária

foi submetida a uma análise de similaridade usando o coeficiente de Jaccard utilizando a

fórmula J = a/(n-d), sendo “a” o número de combinações com a presença dos crescimentos,

menos as combinações de ausência dos crescimentos, “d” é o número de combinações de

ausência de crescimentos e “n” é o número de combinações possíveis. A partir dessa

análise resultou uma matriz de similaridade entre todas as bactérias estudadas, a qual foi

utilizada para o agrupamento das mesmas utilizando o método da média aritmética das

22

distâncias entre os elementos dos dois grupos (UPGMA - Unweighted Pair Group Method

with Arithmetic Mean). Para estas análises foi utilizado o software NTSYSpc® (versão

2.02i ,1986-1998 Applied Biostatistcs) que gerou um dendrograma de similaridade entre as

bactérias analisadas, permitindo avaliar a similaridade entre os isolados e selecionar 68

isolados para análise de BOX-PCR e REP-PCR.

3.3 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

3.3.1- Extração do DNA

O DNA genômico dos 107 isolados e das três estirpes padrão foi extraído como

descrito por Ausebel et al. (1999), com modificações. Os isolados foram cultivados em

tubos de 10,0 mL contendo 8,0 mL de meio líquido YMA sem azul de bromotimol e

mantidos sob agitação (120 rpm 48 h;. Foram utilizados três mL de cultura bacteriana para

a extração de DNA, sendo centrifugados (13.000 rpm; 2 min) e então adicionados 600 μL

de solução de lise (50 μM Tris pH 7,6; 20 mM de EDTA; 400 mM de NaCl; 1% SDS) e

incubados (10 min; 80 °C). Após esta etapa as amostras foram transferidas para o banho de

gelo por 5 minutos e adicionados 3 μL de solução RNAse (25 μg mL-1

), seguido de

incubação (37ºC; 15 min). Foram acrescentados 200 μL de NaCl 5M na mistura que foi

homogeneizada por inversão sendo acondicionada em banho de gelo por 5 minutos. A

mistura então foi centrifugada (13.000 rpm; 3 min) e o sobrenadante transferido para um

novo tubo já contendo 600 μL de isopropanol (P.A.) à temperatura ambiente e levada ao

banho de gelo por 10 minutos. A mistura foi centrifugada (13.000 rpm; 15 min) e o

sobrenandante descartado. Em seguida foram utilizados 600 μL de etanol 70% para

ressupensão, seguida de centrifuação (13.000 rpm; 2 min) e descarte do sobrenadante. O

precipitado foi seco à temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas e

ressuspendido em 30 μL de água ultrapura estéril e estocado a -20 °C. O DNA foi

quantificado em equipamento digital para que todas as amostras fossem padronizadas com

a concentração de DNA de 50 ng µL-1

.

23

3.3.2 Caracterização molecular por análise da região BOX-PCR.

Para a amplificação por PCR da região BOX foi utilizado o primer BOX A1R

(5’-CTACGGCAAGGCGACG-3’), sintetizado pela Invitrogen® (Life Technologies)

(Versalovic et al., 1994).

O sistema de reação de amplificação utilizado foi: 2,9 μL de água milli-Q

estéril; 7,5 μL de 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (3mM Mg2+

); 1,6 μL de primer

BOX A1R (50 pmolμL-1) e 3 μL de DNA (10 ng. μL-1), em um volume final de 15 μL.

A amplificação foi realizada usando os seguintes ciclos: 1 ciclo de

desnaturação inicial (95 °C; 7 min); 35 ciclos contendo as etapas de desnaturação (94 °C; 1

min), anelamento (55 °C; 1 min) e extensão (65 °C; 8 min); 1 ciclo de extensão final (65

°C; 15 min) em termociclador Biocycler® (Applied Biosystens) de acordo com Kaschuk et

al. (2006).

Às amostras amplificadas foram adicionados tampão de corrida Agarose (azul

de bromofenol 0,25%, SDS 0,1%, Ficoll® 20% em T10E1) e Syber na proporção de 3:3:6

(Agarose: SYBR®: DNA). Conduziu-se a eletroforese em gel de agarose 1%, durante 7

horas a 50 V, em tampão TAE 0,75X (Sambrook et al., 1989) para a visualização dos

fragmentos amplificados.

Os fragmentos foram visualizadas em transiluminador UV acoplado a um

sistema de fotodocumentação MultiDoc-it® (UVP). O marcador de tamanho molecular

utilizado foi 1kb DNA Ladder® (Norgen).

3.3.3 Caracterização molecular por análise da região REP-PCR.

Para a amplificação por PCR da região REP presente nas bactérias foi utilizado

os primers REP-1 (5’- IIIICGICGICATCIGGC -3’) e REP-2 (5’-ICGICTATCIGGCCTAC

-3’), sintetizados pela Invitrogen® (Life Technologies)(Versalovic et al., 1994).

O sistema de reação de amplificação utilizado foi: 2,0 μL água milli-Q estéril;

7,5 μL 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (3mM Mg2+

); 1,25 μL primer REP 1 (10

24

pmol μL-1

); 1,25 μL primer REP 2 (10 pmol μL-1

); 3 μL DNA (10 ng μL-1

),em um volume

final de 15 μL.

A amplificação foi realizada usando os seguintes ciclos: 1 ciclo de

desnaturação inicial (95 °C; 7 min); 35 ciclos contendo as etapas de desnaturação (94 °C; 1

min), anelamento (40 °C; 1 min) e extensão (65 °C; 8 min); 1 ciclo de extensão final (65

°C; 15 min) em termociclador Biocycler® de acordo com Kaschuk et al (2006).

Às amostras amplificadas foram adicionados tampão de corrida Agarose (azul

de bromofenol 0,25%, SDS 0,1%, Ficoll® 20% em T10E1) e Syber na proporção de 3:3:6

(Agarose: SYBR®: DNA). Conduziu-se a eletroforese em gel de agarose 1%, durante 7

horas a 50 V, em tampão TAE 0,75X (Sambrook et al., 1989) para a visualização dos

fragmentos amplificados.

Os fragmentos foram visualizadas em transiluminador UV acoplado a um

sistema de fotodocumentação MultiDoc-it® (UVP). O marcador de tamanho molecular

utilizado foi 1kb DNA Ladder® (Norgen).

3.3.4 Análise dos dados de marcadores moleculares

Foi construída uma matriz binária, com os dados obtidos da análise dos

fragmentos amplificados para as regiões BOX e REP. Para cada posição de migração dos

fragmentos foram atribuídos os valores 1 ou 0, indicando presença ou ausência, do

fragmento, respectivamente. A matriz binária foi submetida a uma análise de similaridade

usando o coeficiente de Jaccard utilizando a fórmula J = a/(n-d), sendo “a” o número de

combinações com a presença dos crescimentos menos as combinações de ausência dos

crescimentos, “d” é o número de combinações de ausência de crescimentos e “n”, o

número de combinações possíveis. A matriz de similaridade foi utilizada para o desenho de

um dendrograma utilizando o método da média aritmética das distâncias entre os

elementos dos dois grupos (UPGMA - Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

Mean) através do software NTSYSpc® (versão 2.02i ,1986-1998 Applied Biostatistcs).

Através da análise desse dendrograma foram selecionados 28 isolados para avaliação da

eficiência simbiótica em casa-de-vegetação pela similaridade do grupo com as estirpes

padrões e agrupamentos próximos.

25

3.4 AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA EM CASA-DE-VEGETAÇÃO

O experimento foi realizado em casa-de-vegetação da Embrapa Arroz e Feijão

no Município de Santo Antônio de Goiás. As sementes de feijoeiro-comum cv. Pérola

foram levadas para ambiente controlado onde recebeu 35 tratamentos (Figura 2), sendo 32

tratamentos com inoculação 29 isolados (Tabela 3) e as três estirpes-padrão (SEMIA 4077,

SEMIA 4080 e SEMIA 4088), um tratamento sem inoculação e dois tratamentos

nitrogenados recebendo durante o período de condução do experimento doses de N

equivalentes a 60 Kg ha-1

e 120 Kg ha-1

.

Figura 2. Visão geral do ensaio em casa-de-vegetação para avaliação da eficiência

simbiótica dos isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum

Para o plantio foram utilizados vasos de 1000 mL tipo Leonard, preenchidos

com areia e vermiculita autoclavadas na proporção 2:1 (v/v). Os vasos Leonard foram

colocados sobre uma mesa cuja superfície foi desinfestada com álcool (70%) e mantidos

dentro de casa-de-vegetação em blocos casualizados com três repetições. As sementes

foram selecionadas, eliminando aquelas que apresentavam má formação e danos físicos,

desinfestadas superficialmente com álcool utilizando-se um erlenmayer com a parte

superior fechada com uma malha plástica trançada. Acrescentou-se um volume de álcool

(70%) de modo que todas as sementes ficassem imersas. As sementes foram agitadas

suavemente por 30 segundos e em seguida o álcool foi descartado. Acrescentou-se

hipoclorito de sódio (2%), seguida de agitação por 3 minutos e descarte do hipoclorito de

sódio. Em seguida as sementes foram lavadas sucessivamente por 10 vezes utilizando-se

26

água destilada autoclavada. Após a desinfestação das sementes, com auxílio de um bastão

de vidro, foram feitos dois orifícios nos vasos Leonard nos quais foram colocadas a

sementes com o auxílio de uma pinça, cobrindo-se as sementes com areia autoclavada.

Aos cinco dias após a emergência (DAE) foi realizado o desbaste, deixando

apenas uma plântula por vaso e aos oito DAE foi realizada a inoculação das plântulas com

um mL de uma suspensão crescida em meio líquido (YMA), contendo cerca de 1 X 109

células por mL para cada um dos tratamentos com isolados e estirpes padrão. Após a

inoculação foi adicionada uma camada de areia autoclavada na superfície dos vasos para

evitar possíveis contaminações. Uma vez por semana foram adicionados 200 mL de uma

solução nutritiva isenta de nitrogênio (Franco & Dobereiner, 1967).

A coleta foi realizada aos 35 DAE das plantas, onde estas foram cortadas na

altura do nó cotiledonar e retiradas as raízes dos vasos. As raízes foram lavadas

cuidadosamente em água corrente, secas em papel toalha e os nódulos destacados e

contados para avaliar o número de nódulos (NN). A parte aérea foi separada em sacos

identificados e as folhas levadas para aferir a área foliar (AF) em medidor de área foliar LI-

COR modelo 3100 (LI-COR, 1996). Em seguida a parte aérea, raiz e nódulos foram

colocados para secar em estufa (65ºC; 72 h) e pesados para determinar a massa seca da

parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR) e massa seca de nódulos (MSN).

Após pesagem da parte aérea esse material foi moído em moinho tipo Willey

para a análise de Nitrogênio total (N-Total) da parte aérea pelo método de Kjedahl, a partir

do extrato obtido de 100 mg de massa seca com solução digestora de ácido sulfúrico

(H2SO4) e posterior destilação com hidróxido de sódio (NaOH), titulando com H2SO4

como descrito por Silva & Queiroz (2006).

3.4.1 Análises estatísticas

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e, quando observada

significância do “F”, as médias foram comparadas pelo teste de Skott-Knott a 5% de

probabilidade usando o software SISVAR (Ferreira, 2011). Foi realiza análise de

correlação de Pearson entre o NN e MSPA, N-Total e AF, usando o software R (Wessa,

2014).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA A SALINIDADE E TEMPERATURA

Em função dos resultados de tolerância à salinidade e temperatura, os isolados

foram divididos em 28 grupos utilizando como critério para a separação o crescimento em

condições mais restritivas para as menos restritivas (Tabela 2). Nessa avaliação observou-

se isolados que apresentaram crescimento até 38ºC em todas as concentrações de NaCl e

até 48ºC a 4% de NaCl (JPrG11A7 e UnPaG6A2), formando o grupo um (G1). Dos

isolados de rizóbio avaliados por Leite (2011) em meio YMA a diferentes temperaturas,

154 apresentaram crescimento positivo a 41 °C. Este número foi reduzido para 100 quando

a temperatura era de 43 °C. Com acréscimo da temperatura para 45 °C ocorreu uma

redução de 59% dos isolados tolerantes a este estresse. No presente trabalho, nas

temperaturas de 43ºC e 48ºC, 57 isolados dos 107 avaliados apresentaram crescimento.

A partir dos resultados verificou-se para as temperaturas de 43ºC e 48ºC que

nenhum dos isolados e estirpes padrão cresceu em concentração de NaCl de 6%,

independente da temperatura. Por esse motivo, para essa concentração não foram

apresentados resultados. Segundo Xavier et al. (2007), as concentrações máximas toleradas

de NaCl pelas estirpes, em meio de cultura YMA, variaram de 2 até 30 g L-1

. Não houve

nenhuma estirpe que cresceu na concentração de 50 g L-1

de NaCl. Após a triagem de 189

isolados de rizóbio de feijão-caupi avaliados por Leite (2011), onde foi verificado

crescimento em meio YMA e diferentes temperaturas, foi verificado que houve uma queda

no percentual de bactérias tolerantes à medida que ocorreu aumento do estresse e que esta

redução foi mais pronunciada para o estresse induzido pelo NaCl, mostrando ser este fator

mais limitante ao crescimento dos isolados do que o estresse de temperatura.

Os testes de tolerância à salinidade, usando cloreto de sódio (NaCl) e

temperatura são importantes fatores para caracterização e descrição de bactérias isoladas

de nódulos de leguminosas, pois podem inibir seu crescimento e multiplicação (Peter et al.,

2009; Elboutahiri et al., 2010).

Tabela 2. Avaliação de diferentes isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum a diferentes temperaturas e concentrações de NaCl

Grupos Bactérias

Temperatura 28ºC

Temperatura 33ºC

Temperatura 38ºC

Temperatura 43ºC Temperatura 48ºC

Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4

G1 JPrG11A7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G1 UnPaG6A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G2 JPrG5A7 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G3 JPrG1A1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 JPrG10A6 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 ALSG2A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UbALG7A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UnPaG8A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UnPaG8A2 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UbALG3A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UnPaG8A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UnPaG3A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 JPrG9A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UnPaG8A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UbALG3A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UnPaG8A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 UnPaG7A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 JPrG6A8 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 PCGG5A8 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++

G4 ALSG6A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +

G4 NVSG2A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +

G5 UnPaG2A9 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G5 NVSG1A1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

Continua...

28

Tabela 2. Continuação

Temperatura 28ºC Temperatura 33ºC Temperatura 38ºC Temperatura 43ºC Temperatura 48ºC

Grupos Bactérias Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4

G5 UnPaG7A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G5 ALSG5A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G6 UnPaG3A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G6 NVSG2A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G6 NVSG11A3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G6 NVSG3A3 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 JPrG10A10 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 UnPaG3A6 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 ALSG5A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 NVSG3A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 NVSG5A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 UnPaG3A17 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 UnPaG4A6 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 NVSG4A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 NVSG2A4 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 UnPaG8A8 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 UbALG8A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 NVSG7A11 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G7 NVSG2A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G8 ALSG2A10 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G9 ALSG10A8 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G9 JPrG1A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G9 SEMIA 4080 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

Continua...

29

Tabela 2. Continuação

Temperatura 28ºC Temperatura 33ºC Temperatura 38ºC Temperatura 43ºC Temperatura 48ºC

Grupos Bactérias Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4

G9 NVSG8A2 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - +++ +++ +++ -

G10 UnPaG3A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ +++ +++ - -

G11 UnPaG11A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - +++ +++ - -

G11 NVSG8A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - +++ +++ - -

G11 UnPaG6A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ + - - +++ + - -

G12 PCG4A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - -

G12 NVSG7A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - -

G12 PCG8A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - -

G12 JPrG6A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - -

G12 UnPaG8A12 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - -

G12 UbALG6A3 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - -

G12 JPrG7A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ +++ - - +++ +++ - -

G12 JPrG3A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - + + - - - + + - - + + - -

G13 UbALG4A6 +++ - - - - +++ - - - - +++ - - - - +++ - - - +++ - - -

G14 NVSG4A6 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G14 UnPaG1A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G15 NVSG6A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 NVSG7A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 UnPaG1A9 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 UnPaG6A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 UbALG8A1 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 ALSG3A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 NVSG4A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

Continua...

30

Tabela 2. Continuação

Temperatura 28ºC Temperatura 33ºC Temperatura 38ºC Temperatura 43ºC Temperatura 48ºC

Grupos Bactérias Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4

G16 UnPaG3A19 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 JPRG9A3 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G16 UnPaG1A10 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - - - - - - - - -

G17 NVSG2A2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G18 NVSG7A11 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G18 UnPaG6A12 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G18 UnPaG6A7 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G18 SEMIA 4077 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G18 SEMIA 4088 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G19 JPrG8A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G19 ALSG2A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G19 UnPaG1A12 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - - - - - - - - -

G19 UnPaG4A13 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ + - - - - - - - - - -

G20 JPrG7A5 +++ +++ +++ +++ - +++ +++ +++ +++ - +++ +++ - - - - - - - - - - -

G21 PCG1A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - - - - - - - -

G21 PCG2A2 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - - - - - - - -

G21 PCG4A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - - - - - - - -

G22 JPrG4A9 +++ +++ + + - +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - -

G23 UnPaG4A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - -

G24 PCG5A6 +++ +++ +++ - - +++ +++ +++ - - +++ - - - - - - - - - - - -

G25 UnPaG2A5 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ - - - - - - - - - - - -

G25 JPrG4A4 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ - - - - - - - - - - - -

G25 PCG2A5 +++ +++ - - - +++ +++ - - - +++ - - - - - - - - - - - -

Continua...

31

Tabela 2. Continuação

Temperatura 28ºC Temperatura 33ºC Temperatura 38ºC Temperatura 43ºC Temperatura 48ºC

Grupos Bactérias Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl) Concentrações (% NaCl)

0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 6 0 1 2 4 0 1 2 4

G26 UnPaG11A9 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G27 JPrG9A9 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G27 JPrG2A5 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G27 PCG10A7 +++ +++ +++ - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 PCG3A3 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 ALSG11A2 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 ALSG9A8 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 PCG7A8 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 JPrG5A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 ALSG5A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 PCGG7A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 UnPaG6A5 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 JPrG4A10 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 ALSG7A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 JPrG8A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 PCG1A3 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 JPrG3A7 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

G28 UnPaG1A1 +++ +++ - - - +++ +++ - - - - - - - - - - - - - - - -

32

33

O grupo dois (G2) foi formado pelo isolado JPrG5A7 que apresentou

crescimento em todas as concentrações de NaCl com temperaturas de 28ºC e 33ºC,

apresentando ainda crescimento até 4% de NaCl nas outras temperaturas (38ºC, 43ºC e

48ºC). O grupo três (G3), ao qual pertence somente o isolado JPrG1A1, apresentou

crescimento a 28ºC em todas as concentrações de NaCl e, para as demais temperaturas, até

4% de NaCl. O grupo quatro (G4) é composto por 17 isolados, os quais cresceram até 4%

de NaCl em todas as temperaturas. Do total de isolados de rizóbio obtidos de feijão-caupi

avaliados por Leite (2011), avaliando temperaturas de 39ºC e 42ºC, todos foram capazes de

crescer a 39 °C.

Das três SEMIAs avaliadas, a que apresentou maior tolerância à salinidade e

temperatura foi a SEMIA 4080 que está no grupo (G9) com crescimento até 2% de NaCl

em todas as temperaturas avaliadas, grupo no qual também aparecem os isolados

ALSG10A8, JPrG1A9 e NVSG8A2. As outras estirpes padrão (SEMIA 4077 e SEMIA

4088) estão inseridas no grupo 20, junto com os isolados NVSG7A11, UnPaG6A12 e

UnPaG6A7, que apresentaram crescimento até 33ºC em 4% de NaCl, até 38ºC em 2% de

NaCl e não cresceram nas temperaturas de 43ºC e 48ºC em nenhuma das concentrações

avaliadas de NaCl. Boa parte dos isolados (41,12%) cresceu em condições mais restritivas

que a SEMIA 4080, estirpe padrão que apresentou melhor desempenho, e os isolados que

cresceram em condições menos restritivas que as SEMIAs representam 29,90% do total de

isolados avaliados.

A literatura é bem diversificada quanto a informações sobre as diferentes

capacidades de bactérias diazotróficas, tanto associativas quanto simbióticas, em tolerar

salinidade (Hungria et al., 2001; Nóbrega et al., 2004). Segundo Xavier et al. (2007), as

concentrações máximas de NaCl toleradas (CMT) pelas estirpes, em meio de cultura

YMA, variaram de 2 até 30 g L-1

, equivalente a 0,2 e 3%. Essas condições são menos

restritivas que as aplicadas em nosso estudo, visto que duas SEMIAs apresentaram

crescimento em concentração de 4% de NaCl e temperatura de 28 e 33ºC.

A SEMIA 4080 cresceu até a temperatura de 48ºC, corroborando os autores

Martínez-Romero et al. (1991), quando afirmaram que bactérias pertencentes ao gênero

Rhizobium tem crescimento ótimo a temperatura de 28-30 °C, podendo algumas espécies

mostrar bom crescimento a temperaturas maiores que 40 °C, como o Rhizobium tropici.

Assim como as plantas, as bactérias diazotróficas simbióticas apresentam

grande variação na tolerância à salinidade. Essa tolerância ao estresse salino pode ser

34

atribuída a variações de pH, temperatura, fonte de carbono solúvel e à presença de solutos

osmoprotetores (Graham, 1992). Para bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium,

os efeitos prejudiciais dos sais são mais evidentes, particularmente em relação aos efeitos

da concentração do íon específico do que ao efeito osmótico (Elsheikh, 1998), variando de

acordo com a forma iônica presente e a tolerância da estirpe. Nesse contexto, o NaCl tem

sido considerado bom indicador da tolerância de bactérias a sais (Abdelmoumen et al.,

1999).

Alguns trabalhos realizados principalmente com leguminosas de clima

temperado relatam o efeito prejudicial da salinidade na nodulação. A maioria desses

trabalhos considera que o efeito é mais acentuado no sistema radicular, prejudicando o

desenvolvimento do rizóbio (Tu, 1981). Alguns pesquisadores observaram variações na

tolerância de diferentes estirpes quanto a concentrações crescentes de NaCl (Rai, 1983; Rai

et al., 1985), enquanto outros consideram que a tendência e magnitude das reduções por

efeito da salinidade dependem também das variedades apresentadas pelas plantas (Ahmed

et al., 1981).

No caso do feijoeiro-comum, tanto a planta como o rizóbio são afetados

quando em temperaturas superiores a 34 oC, sendo que no caso do rizóbio, os plasmídeos

que carregam os genes simbióticos podem ser perdidos (Hungria et al., 1993, citado por

Moreira & Siqueira, 2002). Em feijão caupi, Dart & Mercer (1965) encontraram que

nódulos foram reduzidos em número, tamanho e conteúdo de leghemoglobina quando

submetidas a altas temperaturas embora outros fatores, além da temperatura, estivessem

também envolvidos. Estudos com essa finalidade objetivam não só identificar estirpes

potenciais para usos diversos, mas também auxiliar na caracterização das espécies

bacterianas (Nóbrega, et al., 2004).

A partir da transformação da Tabela 2 em uma tabela binária, seguida da

análise de similaridade foi gerado um dendrograma de similaridade para os isolados e

estirpes padrão avaliadas, elaborado a partir dos dados de tolerância a salinidade e

temperatura (Figura 3).

35

Figura 3. Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o

coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos resultados de salinidade e

temperatura de 107 bactérias isoladas de nódulos de feijoeiro-comum

75%

G1

G2

G3

G4

G5

G6

36

Com aproximadamente 75% de similaridade foram formados seis grupos. O

primeiro grupo é formado por 52 isolados, representando 48,6% do total de isolados

avaliados, e pela estirpe padrão SEMIA 4080 (Figura 3). No segundo grupo estão as

estirpes padrão SEMIA 4077 e 4088, além de 17 isolados, representando 17,75% do total

de isolados avaliados. Os demais grupos foram formados por 38 isolados (Figura 3).

Pelos padrões de tolerância a salinidade e temperatura apresentados pelos

isolados e pelas estirpes padrão, observa-se que a maior parte dos isolados (66,5%)

pertencente aos grupos G1 e G2 que apresenta tolerância semelhante às estirpes padrão de

R. tropici. Além disso, os isolados ALSG10A8 e JPrG1A9 apresentaram 100% de

similaridade com a estirpe padrão SEMIA 4080 e os isolados NVSG7A11, UnPaG6A12 e

UnPaG6A7 apresentaram 100% de similaridade com as estirpe padrão SEMIA 4077 e

SEMIA 4088. Segundo Leite et al. (2009) os isolados de rizóbio de feijão-caupi

apresentaram baixa similaridade entre os grupos avaliando com crescimento a 28ºC. Pela

análise de salinidade e temperatura foram selecionados 64 isolados aleatórios entre os

grupos formados no dendrograma para análise molecular utilizando os primers de BOX e

REP.

4.2. AVALIAÇÕES MOLECULARES: BOX-PCR E REP-PCR

Os 64 isolados e as 4 estirpes padrão (SEMIAs 4077, 4080, 4088 e CFN42)

amplificaram para o BOX-PCR, sendo possível visualização em gel de agarose (Figura 4).

No perfil de amplificação dos fragmentos foi possível observar no máximo 14 bandas e no

mínimo uma, com diferentes tamanhos e perfis entre as amostras, demonstrando assim um

alto grau de polimorfismo entre os isolados, o que também foi observado por Leite (2011)

avaliando 50 isolados de rizóbio de feijão-caupi caracterizados com o primer BOX A1R.

Os isolados JPrG1A1, UnPaG3A2 e JPrG8A6 apresentam perfis de

bandeamento semelhante ao da SEMIA 4077. O JPrG10A10 apresenta semelhança com a

SEMIA 4088. Os isolados PCG7A1 e JPrG6A8 apresentam perfis de bandeamentos

similares e o isolado PCG10A7 com UbALG3A4.

37

Figura 4. Perfil eletroforético obtido por BOX-PCR para isolados de nódulos de feijoeiro-

comum. Linhas: 1 e 26- Marcador ladder 1 kb, 2- UnPaG1A2, 3- JPrG1A1, 5-

UnPaG3A2, 6- UnPaG4A9, 7- UnPaG8A8, 8- UbALG4A6, 9- JPrG10A10, 10-

NVSG2A4, 11- JPrG8A6, 12-PCG10A7, 13- UbALG3A4, 14- NVSG3A3, 16-

SEMIA 4077, 17- SEMIA4088, 18- PCG7A1, 19- JPrG6A8, 20- NVSG8A2,

21- NVSG2A2, 22- JPrG7A5, 23- UnPaG8A2, 24- UnPaG11A5, 25-

UnPaG2A4

Diversos estudos de determinação das relações genéticas entre estirpes de

rizóbio têm empregado a amplificação do DNA pela técnica de PCR com

oligonucleotídeos específicos, como as sequências REP e BOX, que codificam regiões

altamente conservadas, normalmente no espaço intergênico (Santos et al., 1999; Mostasso

et al., 2002).

Pelo dendrograma de similaridade gerado a partir do padrão de bandeamento

dos fragmentos amplificadas por BOX-PCR (Figura 5), pode-se inferir que a maioria dos

isolados apresentou perfil único de DNA, o que resultou na separação dos grupos em

valores de similaridade muito baixos, a partir de 3% de similaridade, sendo observada

similaridade de 100% somente entre dois isolados (NVSG11A3 e UnPaG7A3). Pelo

resultado desse dendrograma, observa-se número elevado de grupos, concordando com

Chueire et al., (2000) quando afirma que o uso desse oligonucleotídeo específico permite a

detecção de um polimorfismo suficientemente elevado para análise genética de bactérias.

Com aproximadamente 30% de similaridade são formados 14 grupos. Dentre

os grupos que apresentaram maior número de isolados está o G4, formado pela SEMIA

4077 e SEMIA 4088 e mais oito isolados, que representam 14,7% do total de isolados

avaliados. O G6 apresentou o maior número de isolados (23), representando 33,8% do total

avaliado. O G8 foi formado pela SEMIA 4080 e mais quatro isolados, representando

5,88% do total. O G9 é composto por 2 isolados e a estirpe-padrão CFN 42.

38

Figura 5. Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o

coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados

por BOX-PCR de bactérias isoladas de nódulos de feijoeiro-comum

30% G1

G2

G3

G4

G5

G6

G7

G8

G9

G10

G11

G12

G13

G14

39

No dendrograma gerado com os dados de BOX-PCR observa-se que 20,6% dos

isolados apresentam perfil para o marcador molecular BOX semelhante às estirpes padrão

de R. tropici. Três por cento dos isolados agruparam com a estirpe padrão CFN 42 de R.

etli. Além disso, o isolado PCG10A7 apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão

SEMIA 4088 e o isolado UnPaG4A9 apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão

SEMIA 4077.

O BOX-PCR tem sido freqüentemente utilizado para genotipagem de bactérias

a fim de revelar diferenças entre estirpes em estudos de diversidade (Lu et al., 2009;

Koedoeboecz et al., 2009) e também empregado na identificação de estirpes utilizadas em

inoculantes no Brasil, como ferramenta de controle de qualidade (MAPA, 2010). No caso

de rizóbio, bactérias que nodulam leguminosas, esta ferramenta tem sido muito empregada

para fins da caracterização da diversidade deste grupo de bactérias assim como na

descrição de novas espécies (Han et al., 2008).

Na Figura 6 observa-se o perfil de bandeamento dos isolados gerado pelo

marcador molecular REP-PCR, em que é verificado um alto grau de polimorfismo,

representado pela predominância de perfis únicos de DNA. Dentre os perfis visualizados

observamos no mínimo uma banda e no máximo 10 bandas para o marcador molecular

REP-PCR. O perfil de bandeamento da SEMIA 4077 apresentou-se de forma semelhante

ao da SEMIA 4088. A SEMIA 4080 apresentou um perfil semelhante ao isolado

UnPaG8A12. O isolado UbALG3A apresentou-se semelhante ao isolado JPrG6A8.

Figura 6. Perfil eletroforético de REP-PCR de isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-

comum. Linhas: 1 e 26- Marcador ladder 1 kb, 2- ALSG7A7, 3- PCG7A1, 4-

NVSG2A2, 5- PCG4A6, 6- UnPaG3A5, 8- SEMIA 4080, 11-NVSG7A11, 12-

UnPaG2A5, 14- UbALG3A5, 15- JPrG6A8, 19- UnPaG8A1, 21-UnPaG8A12,

24- SEMIA 4077, 25- SEMIA 4088

40

Pela análise de agrupamento realizada por dendrograma de similaridade

construído a partir dos perfis de bandeamento do marcador REP-PCR pode-se observar que

a escala de similaridade varia de 5 a 100%, indicando uma grande diversidade entre os

isolados avaliados (Figura 7). Com aproximadamente 30% de similaridade são formados

19 grupos. Grange (2001) constatou um grau elevado de polimorfismo entre as bactérias

investigadas de rizóbio de feijão na região do cerrado, com a presença perfis distintos,

formando uma grande quantidade de grupos com baixa similaridade.

O G1 é composto por três isolados. O G2 formado pela SEMIA 4077, SEMIA

4088 e CFN 42 além de oito isolados, representando 16,2% do total de isolados avaliados.

O G4 apresentou um maior número de isolados com sete isolados e a estirpe padrão

SEMIA 4080, representando 11,8% do total avaliado. O G5 formado por sete isolados,

representando 10,3% do total. Os demais grupos foram formados por 42 isolados,

representando 61,8%.

No dendrograma para REP-PCR apresentados pelos isolados e pelas estirpes

padrão, observa-se que 28% dos isolados apresentam bandeamento para o marcador

molecular REP semelhante às estirpes padrão de R. tropici. Além disso, o isolado

PCG2A2, apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão SEMIA 4088, indicando

que este isolado tem grande probabilidade de ser R. tropici. Grange (2001) observou

resultado semelhante a este, em seu trabalho com rizóbios de feijão de regiões do Cerrado

a presença de 2 isolados que apresentaram 100% de similaridade com a SEMIA 4088.

41

Figura 7. Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o

coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados

por REP-PCR de bactérias isoladas de feijoeiro-comum

Os resultados deste estudo demonstram que a análise de REP-PCR foi eficiente

para discriminá-las, embora nem sempre sejam adequadas nas avaliações filogenéticas

(Chueire et al., 2000; Fernandes et al., 2003).

G1

G2

G3

G4

G5

G6

G7

G8

G9

G10

G11

G12

G13

G14

G15

G16

G17

G18

G19

30%

42

A análise de similaridade realizada usando as matrizes de similaridade obtidas

com os dados de BOX e REP-PCR revelou, também, uma alta diversidade entre os

isolados avaliados, com a escala de similaridade variando de 8% a 100% (Figura 8). Com

aproximadamente 30% de similaridade são formados 23 grupos. O G4 representado pela

SEMIA 4077, e um isolado, representando 3% do total de isolados avaliados. O G5

apresentou cinco isolados e a estirpe padrão SEMIA 4080, representando 7,4% do total

avaliado. O G6 formado por sete isolados e a SEMIA 4088 e CFN 42 representando 10,3%

do total. Os demais grupos foram formados por 54 isolados, representando 79,4%.

No dendrograma para BOX e REP-PCR apresentados pelos isolados e pelas

estirpes padrão, observa-se que 20,6% dos isolados apresentam bandeamento para o

marcador molecular REP semelhante às estirpes padrão de R. tropici e 7,35% para R etli.

Além disso, o isolado PCG2A2 apresenta 100% de similaridade com a estirpe padrão

SEMIA 4088 e o isolado JPrG7A2 100% de similaridade com a estirpe padrão SEMIA

4077. Os resultados deste trabalho corroboraram os obtidos por Vandamme et al. (1996),

que colocam que o conhecimento polifásico deve ser aplicado à taxonomia e diversidade

bacteriana já que um consenso de resultados combinados resultará em análises bem mais

consistentes. Bala et al. (2003), estudando 414 isolados rizobianos de três leguminosas

arbóreas tropicais, identificaram 23 espécies e também observaram a importância de uma

análise polifásica.

Esses resultados conclui que os marcadores BOX e REP-PCR são importante

para avaliar a diversidade de populações bacterianas, mas pouco viável para diferenciar

espécies, sendo necessário um sequenciamento para verificar essa diversidade genética.

Pela análise de BOX e REP foram selecionados 28 isolados escolhidos pela proximidade

com as estirpes padrões para a avaliação da eficiência simbiótica em casa-de-vegetação.

43

Figura 8. Dendrograma definido pelo método de agrupamento UPGMA utilizando o

coeficiente de similaridade de Jaccard com base nos fragmentos amplificados

por REP-PCR e BOX-PCR de bactérias isoladas de feijoeiro-comum

30%

G1

G2

G3

G4

G5

G6

G7

G8

G9

G10

G11

G12

G13

G14

G15

G16

G17 G18

G19 G20

G21

G22

G23

44

4.3 AVALIAÇÃO DOS ISOLADOS EM CASA-DE-VEGETAÇÃO

O estudo da eficiência na fixação biológica de nitrogênio vem sendo realizado

em diversos trabalhos, para selecionar isolados potenciais para o desenvolvimento de

inoculantes (Carvalho et al., 2005; Zilli et al., 2006; Melloni et al., 2006). Na Tabela 3 são

apresentados os valores de parâmetros de nodulação e de crescimento de feijoeiro-comum

avaliados em casa-de-vegetação.

Para número de nódulos (NN) ocorreu diferença significativa pelo teste de

Scott-Knott (p < 0,05) entre os tratamentos inoculados. Entre os isolados, 46%

apresentaram maiores valores que os demais e o isolado PCG3A3 apresentou maior NN do

que as estirpes padrão (SEMIA 4077, SEMIA 4080 e SEMIA 4088). O maior número de

nódulos foi observado para o isolado PCG3A3 com 117,6 e o menor para JPrG9A9 com

apenas um nódulo. Os tratamentos nitrogenados e o tratamento sem inoculação não

apresentaram nódulos. Souza et al. (2003) trabalhando com estirpes para o feijoeiro-

comum, em substrato esterilizados em casa-de-vegetação, também verificaram ausência de

nodulação para os tratamentos nitrogenado e testemunha absoluta (sem N e sem

inoculação), indicando que houve esterilização eficiente e assepsia na condução destes

experimentos.

O número e a massa dos nódulos são indicativos de nodulação (Ferreira &

Castro, 1995; Araújo et al., 2007). Entretanto, a massa dos nódulos é mais útil na avaliação

da nodulação, em virtude da melhor correlação com o desempenho simbiótico (Döbereiner,

1966; Bohrer & Hungria, 1998; Hungria & Bohrer, 2000).

Para massa seca de nódulos (MSN), os isolados PCG2A5; NVSG7A9;

JPrG8A7 e JPrG8A6 apresentaram diferença significância (p < 0,05) em relação à estirpe

padrão SEMIA 4077. O isolado com maior massa seca de foi o JPrG8A7 com 456 mg

planta-1

e a menor para UnPaG8A7 com 3 mg planta-1

. Nogueira (2005) observou pequena

variação para a matéria seca dos nódulos entre rizóbios de feijoeiro-comum. Quanto a

massa específica de nódulos (MEN), os tratamentos JPrG8A7 e JPrG8A6 obtiveram

melhor desempenho em relação à estirpe comercial SEMIA 4077.

45

Tabela 3. Número de nódulos (NN), Massa seca de nódulos (MSN), Massa específica de

nódulos (MEN), Massa seca da parte aérea (MSPA), Massa seca de raíz

(MSR), Relação raiz/parte aérea (R/PA), N-Total acumulado na parte aérea (N-

Total) e área foliar (AF) de plantas de feijoeiro-comum inoculadas com

diferentes isolados obtidos de nódulos de feijoeiro-comum

*Valores seguidos de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Skott-Knott (p < 0,05).

Tratamento NN MSN MEN MSPA MSR R/PA N-TOTAL AF

Nº planta -1 mg planta -1 mg planta -1 mg planta -1 mg planta -1 mg planta -1 g Kg planta -1 m² planta -1

PCG3A3 117,6 a* 244 b 2,07 b 1,63 c 0,45 b 0,48 b 12,56 c 0,014 b

PCG1A6 75,6 a 55 c 0,72 c 0,53 c 0,38 b 0,73 b 12,09 c 0,007 b

PCG4A6 43,6 b 85 c 1,94 b 0,5 c 0,51 b 0,02 b 17,06 b 0,011 b

ALSG9A8 81 a 226 b 2,79 b 1,21 b 0,56 b 0,571b 10,92c 0,017 b

PCG2A5 95 a 336 a 3,53 b 1,53 b 0,45 b 0,36b 13,28 b 0,023 b

ALSG10A8 18,6 b 32 c 1,72 b 0,46 c 0,47b 1,16 a 8,76 c 0,005 b

NVSG7A9 98 a 316 a 3,22 b 1,84 b 0,58 b 0,53b 19,56 b 0,025 b

NVSG4A5 0 b 0 c 0 c 0,6 c 0,77 b 1,33 a 8,21 c 0,007 b

NVSG5A3 31,6 b 27 c 0,85 c 0,39 c 0,49 b 1,48 a 14,79 b 0,004 b

UnPaG6A7 94 a 157 b 1,67 b 1,12 b 0,41 b 0,43b 13,19 b 0,015 b

UnPaG3A17 56 a 64 c 1,14 c 1,18 b 0,49 b 0,55 b 11,06 c 0,013 b

UnPaG8A7 1,6 b 3 c 1,87 c 0,67 c 0,94 b 1,48 a 11,42 c 0,007 b

UnPaG8A1 18 b 19 c 1,05 c 0,56 c 0,89 b 1,88ª 11,53 c 0,006 b

SEMIA 4077 110 a 260 b 2,36 b 1,58 b 0,47 b 0,39 b 21,61 b 0,026 b

UnPaG8A8 25,3 b 9c 0,35 c 0,39 c 0,4 b 1,19 a 6,89 c 0,006 b

UnPaG1A1 106,6 a 182 b 1,70 b 1,23 b 0,44 b 0,46 b 9,04 c 0,014 b

NVSG2A6 75,3 a 196 b 2,60 b 0,69 c 0,72 b 2,32 a 16,08 b 0,022 b

NVSG7A7 81 a 271 b 3,34 b 1,4 b 0,51 b 0,47 b 11,05 c 0,020 b

JPRG8A7 98,3 a 456 a 4,63 a 1,55 b 0,63 b 0,41 b 13,05 b 0,026 b

JPrG6A2 4,3 b 4c 0,93 c 0,5 c 0,74 b 1,48 a 9,48 c 0,006 b

JPrG9A9 1 b 4 c 4 c 0,56 c 0,59 b 1,09 a 11,24 c 0,006 b

JPrG8A6 60 a 331 a 5,51 a 0,93 c 0,55 b 0,63 b 9,22 c 0,015 b

NVSG6A2 13,3 b 13 c 0,97 c 0,47 c 0,68 b 1,51 a 8,65 c 0,006 b

UnPaG2A5 13,3 b 22 c 1,65 c 0,43 c 0,74 b 1,64 a 9,8 c 0,005 b

UnPaG3A2 74 a 138 b 1,86 b 0,63 c 0,33 b 0,63 b 11,18 c 0,008 b

UbALG8A1 0 b 0 c 0 c 0,48 c 0,66 b 1,53 a 6,91 c 0,007 b

UnPaG4A6 0 b 0 c 0 c 0,51 c 0,87 b 2,04 a 10,56 c 0,005 b

JPrG1A1 28,6b 30 c 1,04 c 0,64 c 0,67 b 1,09 a 13,68 b 0,010 b

UbALG6A3 16,6 b 16 c 0,96 c 0,45 c 0,43 b 0,99 b 9,71 c 0,005b

SEMIA4080 52,6 a 96 b 1,82 b 0,58 c 0,31 b 0,77 b 12,31 c 0,008 b

SEMIA 4088 96 a 150 b 1,56 c 1,21 b 0,52 b 0,43 b 13,01 c 0,010 b

S/inoculação 0 b 0 c 0 c 0,38 c 0,49 b 1,27 a 14,84 b 0,006 b 60 Kg N ha-1 0 b 0 c 0 c 1,63 b 0,65 b 0,4 b 32,95 a 0,024 b 120 Kg N ha-1 0 b 0 c 0 c 3,23 a 1,98 b 0,83 b 37,5 a 0,032 a

46

Quando avaliados NN, MSN e MEN em conjunto verifica-se que os isolados

JPrG8A7 e JPrG8A6 apresentaram melhor desempenho que as SEMIAs 4077, 4080 e 4088

e devem ser analisadas mais criteriosamente quanto a eficiência simbiótica.

A avaliação da MSPA representa um bom indicativo do estado nutricional das

plantas, sendo importante para proporcionar à cultura grande potencial de produção

(Xavier et al., 2006; Souza et al., 2008). Essa característica vem sendo utilizada na seleção

de estirpes para composição de inoculantes (Zilli et al., 2006; Souza et al., 2008). Os

tratamentos nitrogenados demostraram melhores resultados para massa seca da parte aérea

(MSPA), o que é explicado pela grande quantidade de nitrogênio prontamente disponível

para a planta. A estirpe padrão SEMIA 4077 obteve 1,58 g de MSPA, sendo inferior aos

tratamentos PCG3A3, NVSG7A9 e tratamento nitrogenado (60 Kg/ha). O menor valor de

MSPA foi para o tratamento sem inoculação. Segundo Antunes (2011) os resultados de

MSPA, em condições de vasos de Leonard, podem indicar um crescimento satisfatório das

plantas (Tabela 3).

Quanto à massa seca de raiz (MSR) o tratamento que apresentou melhor

resultado foi o nitrogenado com 120 Kg ha-1

, já para os demais tratamentos não diferiram

estatisticamente (Tabela 3). Antunes (2011), trabalhando com feijão-fava em vasos de

Leonard e inoculação com diferentes isolados de rizóbio também não encontrou diferença

de MSR entre os tratamentos. Sugerindo que os isolados não exercem influência sobre o

crescimento radicular do feijoeiro.

Para relação raiz/parte aérea (R/PA) foi encontrada diferença significativa entre

os tratamentos, sendo 50% dos isolados superiores às estirpes padrão (Tabela 3).

Os valores de área foliar (AF) apresentaram diferenças significativas (p < 0,05)

entre os tratamentos avaliados, sendo que o tratamento nitrogenado apresentou uma maior

área foliar (Tabela 3). Isso pode ser explicado pela fase em que se deu a coleta aos 35 DAE

onde os nódulos ainda estavam começando a fornecer nitrogênio para a planta, estando as

plantas ainda pouco desenvolvidas, com isso não apresentaram desenvolvimento

considerável para haver diferença entre os tratamentos.

Os valores de N-Total foram maiores para os tratamentos nitrogenados, e a

estirpe padrão foi melhor que alguns tratamentos (Tabela 3).

A MSN apresentou correlação positiva com massa seca da parte aérea (MSPA),

nitrogênio total (N) e área foliar (AF) (Figura 9). Pode-se observar que 35,25% dos

isolados apresentaram maior MSPA e MSN, podendo ser considerados isolados

47

competitivos, fazendo parte do grupo da SEMIA 4088 e SEMIA 4077. Já o isolado que

apresentou melhor eficiência foi o UnPaG3A17 (seta), pois este apresentou maior valor de

MSPA com menor MSN, demonstrando-se superior à melhor estirpe padrão, a SEMIA

4077. Já a SEMIA 4080 apresentou baixa eficiência nesse ensaio, uma vez que resultou em

baixa MSPA e MSN, agrupando-se com 50% dos isolados.

Figura 9. Análise de correlação correlação de Pearson entre a MSPA e MSN de feijoeiro

comum inoculado com novos isolados e com as estirpes padrão. Barra

pontilhada representa a tendência da correlação e as barras vermelhas as

médias de cada parâmetro avaliado. ** significativo (p < 0,01)

As estirpes padrão SEMIA 4077 e SEMIA 4088 agruparam com 21,87% dos

isolados apresentaram alto teor de nitrogênio e MSN. Já a SEMIA 4080 agrupou-se com

12,5% dos isolados que apresentaram alto teor de nitrogênio e baixa MSN demostrando

serem isolados eficientes, já que apresentam boa eficiência simbiótica, com uma pequena

MSN produziu um aumento no N-Total (Figura 10).

48

Figura 10. Análise de correlação de Pearson entre a N-Total e massa seca de nódulos

(MSN de feijoeiro-comum inoculado com novos isolados e com as estirpes

padrões. Barra pontilhada representa a tendência da correlação e as barras

vermelhas as médias de cada parâmetro avaliado. ** significativo (p < 0,01)

De acordo com a Figura 11, 37,5% dos isolados agruparam-se com a SEMIA

4077 apresentando MSN e AF acima da média sendo considerados isolados competitivos e

eficientes. O grupo da SEMIA 4088 apresentou boa MSN e pouca AF. O isolado

UnPaG3A17 (seta) proporcionou que a planta desenvolvesse maior AF com menor MSN,

sendo considerado um isolado mais eficiente.

49

Figura 11. Análise de correlação correlação de Pearson entre a AF e MSN de feijoeiro-

comum inoculado com novos isolados e com as estirpes padrão. Barra

pontilhada representa a tendência da correlação e as barras vermelhas as

médias de cada parâmetro avaliado. ** significativo (p < 0,01)

Conforme Figura 9, 10 e 11 o isolado UnPaG3A17 apresentou maior

eficiencia, já que com pouca MSN produziu uma maior MSPA e AF, para salinidade e

temperatura apresentou resultado melhor que a estirpe padrão. Os isolados JPrG8A7;

PCG2A5; NVSG7A9; PCG3A3; NVSG2A6; UnPaG4A9 e UnPaG6A7 foram

competitivos e eficientes em relação aos demais, fazendo parte do grupo da SEMIA 4077.

Estes isolados apresentaram para salinidade e temperatura resultados iguais ou inferiores à

estirpe padrão SEMIA 4077. A SEMIA 4080 apresentou resultados inferiores às demais

estirpes-padrão para todos os parâmetros avaliados, mas dentre as estirpes padrão

apresentou melhores resultados para salinidade e temperatura crescendo em condições

mais restritivas que as demais estirpe padrão. O isolado UnPaG3A2 apresentou uma MSN

considerável com uma baixa AF e para salinidade e temperatura apresentou bons

resultados, superior às estirpes padrão.

5 CONCLUSÃO

Do total de isolados, 45 apresentam maior tolerância à salinidade e temperatura

do que as estirpes padrão SEMIA 4077, SEMIA 4080 e SEMIA 4088, crescendo a 48ºC e

a 4% de NaCl, e podem apresentar bom potencial para inoculação no feijoeiro-comum.

Os perfis BOX-PCR e REP-PCR apresentaram grande diversidade genética

entre os isolados avaliados, se fazendo necessária uma análise com maior número de

marcadores e avaliações fenotípicas para obtenção de melhor caracterização.

O isolado UnPaG3A17 apresenta alta eficiência simbiótica, produzindo grande

área foliar e massa seca de parte aérea a partir de pequena massa seca de nódulos. Além

desse isolados, outros 7 apresentaram desenpenho semelhante ao da SEMIA 4077, estirpe

padrão com melhor desempenho.

Alguns isolados apresentam características competitivas iguais ou superiores às

estirpes padrão comerciais, apresentando resultados que podem melhorar o processo de

simbiose entre a planta e a bactéria, gerando assim uma maior produtividade para a cultura

do feijoeiro-comum.

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Mossoró, v.20, n.4, p.01-09, 2007.

XAVIER, G.R., S.M.V. MARTINS, M.C.P. NEVES & N.G. RUMJANEK. Edaphic

factors as determinants for the distribution of intrinsic antibiotic resistance in a cowpea

rhizobia population. Biology and Fertility of Soils, New York, v. 27, n. 4, p. 446-447,

1998.

XAVIER, G.R.; MARTINS, L.M.V.; RIBEIRO, J.R.A. & RUMJANEK, N.G.

Especificidade simbiótica entre rizóbios e acessos de feijão-caupi de diferentes

nacionalidades. Caatinga, Mossoró, v. 19, n. 1, p. 25-33, 2006.

YOUNG, J. P. W.; HAUKKA, K. E. Diversity and phylogeny of rhizobia. New

Phytologist, New York, v.133, n. 1, p.87-94, 1996.

ZILLI, J.E.; VALICHESKI, R.R.; RUMJANEK, N.G.; SIMÕES-ARAÚJO, J.L.; FREIRE

FILHO, F.R.; NEVES, M.C.P. Eficiência simbiótica de estirpes de Bradyrhizobium

isolados de solo do Cerrado em caupi. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 41,

n. 5, p. 811-818, 2006.

ANEXO

Anexo A. Isolados bacterianos obtidos de nódulos de feijoeiro-comum utilizados nos

estudos de caracterização polifásica.

Número Isolado Genótipo do Feijão Estado Cidade Local de Coleta

1 PCG4A2 G12912 PR Prudentópolis Campi

2 PCG7A8 G23460 PR Prudentópolis Campi

3 ALSG2A9 G23490 PR Araucária Lagoa Suja

4 ALSG6A1 G12858 PR Araucária Lagoa Suja

5 PCG1A2 G23499A PR Prudentópolis Campi

6 PCG2A6 G23490 PR Prudentópolis Campi

7 ALSG5A1 G23475 PR Araucária Lagoa Suja

8 ALSG5A6 G23475 PR Araucária Lagoa Suja

9 ALSG2A5 G23490 PR Araucária Lagoa Suja

10 ALSG3A5 G23500A PR Araucária Lagoa Suja

11 ALSG2A3 G23490 PR Araucária Lagoa Suja

12 PCG4A8 G12912 PR Prudentópolis Campi

13 PCG3A3 G23500A PR Prudentópolis Campi

14 PCG5A8 G23475 PR Prudentópolis Campi

15 PCG1A6 G23499A PR Prudentópolis Campi

16 ALSG2A10 G23490 PR Araucária Lagoa Suja

17 ALSG7A7 G23460 PR Araucária Lagoa Suja

18 PCG8A2 G12904 PR Prudentópolis Campi

19 PCG4A6 G12912 PR Prudentópolis Campi

21 ALSG11A2 PHA VUL 8122 PR Araucária Lagoa Suja

22 ALSG9A8 PHA VUL 8169 B PR Araucária Lagoa Suja

23 PCG10A7 PHA VUL 8141 PR Prudentópolis Campi

24 PCG2A5 G23490 PR Prudentópolis Campi

25 PCG7A1 G23460 PR Prudentópolis Campi

26 PCG1A3 G23499A PR Prudentópolis Campi

27 ALSG10A8 PHA VUL 8141 PR Araucária Lagoa Suja

28 ALSG5A4 G23475 PR Araucária Lagoa Suja

30 PCG2A2 G23490 PR Prudentópolis Campi

31 NVSG7A1 NVSG7A1 GO Nova Veneza Souza

32 NVSG7A9 G23460 GO Nova Veneza Souza

33 JPrG4A10 G12912 GO Jussara Primavera

34 NVSG2A1 G23490 GO Nova Veneza Souza

35 PCG5A6 G23475 PR Prudentópolis Campi

Continua...

63

Anexo A. Continuação

Número Isolado Genótipo do Feijão Estado Cidade Local de Coleta

37 NVSG5A3 G23475 GO Nova Veneza Souza

38 JPrG1A9 G23499A GO Jussara Primavera

39 NVSG4A1 NVSG4A1 GO Nova Veneza Souza

40 NVSG8A2 G12904 GO Nova Veneza Souza

41 JPrG2A5 G23490 GO Jussara Primavera

42 NVSG2A4 G23490 GO Nova Veneza Souza

43 JPrG7A5 G23460 GO Jussara Primavera

44 JPrG7A2 G23460 GO Jussara Primavera

45 JPrG8A3 G12904 GO Jussara Primavera

46 JPrG3A3 G23500A GO Jussara Primavera

47 JPrG3A4 G23500A GO Jussara Primavera

48 JPrG10A10 PHA VUL 8141 GO Jussara Primavera

49 JPrG3A7 G23500A GO Jussara Primavera

50 NVSG8A9 NVSG8A9 GO Nova Veneza Souza

51 UnPaG7A3 G23460 MG Unaí Paris

52 UnPaG3A6 G23500A MG Unaí Paris

53 UnPaG6A7 G12858 MG Unaí Paris

54 UnPaG3A5 G23500A MG Unaí Paris

55 UnPaG4A12 G12912 MG Unaí Paris

56 UnPaG3A17 G23500A MG Unaí Paris

57 UnPaG4A9 G12912 MG Unaí Paris

58 UnPaG7A6 G23460 MG Unaí Paris

59 UnPaG8A7 G12904 MG Unaí Paris

60 UnPaG11A9 PHA VUL 8122 MG Unaí Paris

61 UnPaG3A19 G23500A MG Unaí Paris

62 UnPaG6A12 G12858 MG Unaí Paris

63 UnPaG8A1 UnPaG8A1 MG Unaí Paris

64 UnPaG1A1 G23499A MG Unaí Paris

65 UnPaG11A5 PHA VUL 8122 MG Unaí Paris

67 UnPaG8A2 G12904 MG Unaí Paris

68 UnPaG1A9 G23499A MG Unaí Paris

69 UnPaG2A9 G23490 MG Unaí Paris

70 UbALG7A7 G23460 MG Uberlândia Água Limpa

71 UnPaG6A2 G12858 MG Unaí Paris

72 UnPaG2A4 G23490 MG Unaí Paris

73 UnPaG8A8 G12904 MG Unaí Paris

74 UnPaG8A4 G12904 MG Unaí Paris

75 UnPaG1A1 G23499A MG Unaí Paris

76 NVSG7A11 G23460 GO Nova Veneza Souza

77 NVSG2A6 G23490 GO Nova Veneza Souza

Continua...

64

Anexo A. Continuação

Número Isolado Genótipo do Feijão Estado Cidade Local de Coleta

78 NVSG7A7 G23460 GO Nova Veneza Souza

79 JPrG8A7 G12904 GO Jussara Primavera

80 JPrG10A8 PHA VUL 8141 GO Jussara Primavera

81 JPrG10A6 PHA VUL 8141 GO Jussara Primavera

82 JPrG6A2 G12858 GO Jussara Primavera

83 NVSG3A3 G23500A GO Nova Veneza Souza

84 JPrG9A9 PHA VUL 8169 B PR Araucária Lagoa Suja

85 JPrG4A9 G12912 GO Jussara Primavera

86 JPrG5A7 G23475 GO Jussara Primavera

87 JPrG8A6 G12904 GO Jussara Primavera

88 JPrG4A4 G12912 GO Jussara Primavera

89 NVSG3A4 G23500A GO Nova Veneza Souza

90 JPrG9A3 PHA VUL 8169 B PR Araucária Lagoa Suja

91 NVSG11A3 PHA VUL 8122 PR Araucária Lagoa Suja

92 NVSG2A2 G23490 GO Nova Veneza Souza

93 NVSG6A2 G12858 GO Nova Veneza Souza

94 JPrG1A1 G23499A GO Jussara Primavera

95 UnPaG2A5 G23490 MG Unaí Paris

96 UnPaG8A12 G12904 MG Unaí Paris

97 UnPaG3A2 G23500A MG Unaí Paris

98 UnPaG6A5 G12858 MG Unaí Paris

99 NVSG1A1 G23499A GO Nova Veneza Souza

100 UbALG4A6 G12912 MG Uberlândia Água Limpa

101 UnPaG1A12 G23499A MG Unaí Paris

102 UbALG8A1 G12904 MG Uberlândia Água Limpa

103 UbALG8A9 G12904 MG Uberlândia Água Limpa

104 UbALG3A4 G23500A MG Uberlândia Água Limpa

105 UnPaG1A2 G23499A MG Unaí Paris

106 UnPaG10A3 PHA VUL 8141 GO Jussara Primavera

107 UnPaG11A10 PHA VUL 8122 PR Araucária Lagoa Suja

108 UnPaG4A6 G12912 MG Unaí Paris

109 UnPaG6A3 G12858 MG Unaí Paris

110 UnPaG1A10 G23499A MG Unaí Paris

111 NVSG4A6 G12912 GO Nova Veneza Souza

112 UbALG3A5 G23500A MG Uberlândia Água Limpa

113 JPrG6A8 G12858 GO Jussara Primavera

114 JPrG1A1 G23499A GO Jussara Primavera

115 NVSG2A2 G23490 GO Nova Veneza Souza

116 JPrG7A2 G23460 GO Jussara Primavera

117 JPrG11A7 PHA VUL 8122 PR Araucária Lagoa Suja

Fonte: Sampaio, 2012.