revista da sociedade brasileira de ciência em animais de laboratório

RESBCALREVISTA DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CIÊNCIA EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO

Volume 3 - Número 1 - 2015São Paulo - SP

Publicação Semestral

RESBCAL São Paulo v. 3 n. 1 p. 1-62 Jun. 2015

ISSN 2238-1589

2 RESBCAL, São Paulo, v.2 n.4, pg. 232, 2014

© 2012 – Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de LaboratórioPublicação semestral/ Published two times to the year Tiragem/Print-run: 100Impresso no Brasil/Printed in BrazilProjeto Gráfico e Normalização: PoloPrinter Produção Gráfica e Impressão: PoloPrinter www.poloprinter.com.br

RESBCAL – Revista da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório é uma publicação científica trimestral voltada à Promover a educação e a atuali-zação de profissionais que atuam na área da ciência de animais de laboratório. Divulga artigos de autores nacionais e estrangeiros, selecionados com base em cri-térios de originalidade e qualidade, em um processo de Double blind review.

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ISSN 2238-1589

Catalogação-Na-PublICaçãoElaborada por Maria Cláudia Pestana CRb-8/6233

Revista da Sociedade brasileira de Ciência em animais de laboratório / Sociedade brasileira de Ciência em animais de laboratório. – v. 3, n. 1 (2015) – . – São Paulo : SbCal, 2012-

semestralISSN: 2238-1589

1. animais de laboratório. 2. Ciência dos animais de laboratório. I. Sociedade brasileira de Ciência em animais de laboratório.

CDD 619

RESBCAL, São Paulo, v.2 n.4, pg. 232, 2014 3

Os editores da Revista da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (RESBCAL) têm o prazer de publicar o primeiro número do terceiro volume da nossa publicação. Até o presente momento, somamos nove números

da nossa revista com acima de 50 artigos publicados dentre as categorias de resultados originais, revisão da literatura, breve comunicação e de um importante

relato de memórias pessoais de profissionais com longo tempo de atuação na ciência de animais de laboratório e escrito pelo mesmo, dando um sentido de

autobiografia e para nós um importante documento histórico. Estamos inserindo nesse número a categoria de Gestão de Qualidade. Dessa forma, os autores podem relatar como conseguiram implantar sistemas de qualidade em seus

biotérios e compartilhar sua experiência.

Então, nesse número, apresentamos uma interessante descrição sobre os principais testes comportamentais utilizados em camundongos para o estudo

da ansiedade. Na categoria gestão de qualidade, foi relatado, descritiva e esquematicamente um sistema de qualidade sendo colocado na rotina de um

biotério de criação e a estruturação de um sistema digitalizado para o controle de criação e fornecimento de animais de laboratório. Em relação aos artigos originais, podemos conhecer os parâmetros bioquímicos e hematológicos de

camundongos e a avaliação clínica, morfométrica e hematológica em primatas não humanos utilizados em ensaios biomédicos. Nossos artigos de revisão

abordam a avaliação da marcha normal em camundongos e o uso de animais em testes para a segurança no uso de cosméticos.

Nós do corpo editorial também gostaríamos de compartilhar com todos que importantes objetivos foram alcançados durante o período de 2014 e 2015 foi conseguir indexar a revista no sistema VetIndex da Biblioteca Virtual de

Medicina Veterinária e Zootecnia/USP no qual está acessível todos os números da revista (em PDF). Além disso conseguimos alcançar no WebQualis CAPES o estrato B4 na área de avaliação interdisciplinar e incluir a revista na lista de

periódicos permanentes da CAPES.

Gabriel Oliveira

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4 RESBCAL, São Paulo, v.3 n.1, pg. 4, 2015

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bREVE CoMuNICaçãoPaRaDIgMaS CoMPoRtaMENtaIS DE EXPERIMENtação EM RoEDoRES: EM buSCa Do ENtENDIMENto DaS INtERaçÕES SoCIaIS Na aNSIEDaDEJuciara da Costa Silva, Rodrigo Fernandes de barros, Carlos alberto avellaneda Penatti

aRtIgo DE gEStão DE QualIDaDEIMPlaNtação DE SIStEMa DE gEStão Da QualIDaDE EM uM bIotÉRIo DE CRIaçãoFrederico Vicente da Cunha Orofino, Ândrea Cordeiro dos Santos Diogo, Ingrid Daré Viana, Paulo Roberto de Souza lopes

SIStEMa WEb DE gERENCIaMENto Do bIotÉRIo Da FaCulDaDE DE CIÊNCIaS FaRMaCÊutICaS E INStItuto DE QuÍMICa Da uSPluciano antunes de almeida leite, Renata Spalutto Fontes, Flavia de Moura Prates ong, Silvânia Meiry Peris Neves

aRtIgoS oRIgINaISDETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E HEMATOLÓGICOS EM CaMuNDoNgoS (MuS MuSCuluS) Do bIotÉRIo CENtRal Da uFMSElisangela tieko Matida, alessandro Eduardo Zancanaro, tamy Ingrid Restel, Valeria Maria Wanderley gomes, telma bazzano, Claudia Madalena Cabrera Mori, Maria araújo teixeira

AVALIAÇÃO CLÍNICA, MORFOMÉTRICA E HEMATOLÓGICA DE MACACOS CYNoMolguS (MaCaCa FaSCICulaRIS) CatIVoS Lynn Barwick Cysne, Márcia Cristina Ribeiro Andrade, Miguel Ângelo Brück Gonçalves, Cláudia andréa de araújo lopes, Simone Ramos, graziela Maria Zanini, Pedro Hernán Cabello

aRtIgo DE REVISãoAVALIAÇÃO DA MARCHA NORMAL E PATOLÓGICA NO CAMUNDONGOWladimir bocca Vieira de Rezende Pinto, Paulo Victor Sgobbi de Souza, gui Mi Ko

aNÁlISE Da utIlIZação DE tEStES altERNatIVoS PaRa aValIação DE SEguRaNça DE PRoDutoS CoSMÉtICoSDaisylea de Souza Paiva, Juliana Riguetti Vitalli, Maria aparecida lima Moreira, Carla aparecida Pedriali Moraes

SuMÁRIo

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ISSN 2238-1589

PARAdigmAS ComPoRtAmEntAiS dE ExPERimEntAção Em RoEdoRES: Em BuSCA do EntEndimEnto dAS intERAçõES

SoCiAiS nA AnSiEdAdE

Juciara da Costa Silva1, Rodrigo Fernandes de Barros2 e Carlos Alberto Avellaneda Penatti3

Os transtornos de ansiedade (TA) representam importantes alterações psiquiátricas caracterizando-se por: 1) acompanha a depressão, 2) participa na distimia, 3) facilita o abuso e dependência de álcool e drogas, 4) aumenta a incidência de transtornos alimentares e 5) suicídio. Diante da necessidade de avanços e novas abordagens cien-tíficas que consolidem a experimentação e a prática médica e/ou assistência de saúde, buscamos alternativas experimentais que possam oferecer suporte para a compreensão e o desenvolvimento de novos tratamentos para o TA. Nesta breve comunicação, abordaremos paradigmas experimentais: I) campo-aberto ou ‘open field’, (II) labirinto em cruz elevado ou ‘plus-maze’, (III) ‘marble- burying’, (IV) vocalização ultrassônica, (V) teste de suspensão em cauda, testes que no seu conjunto e progressão agregam à (VI) neuroendocrinologia do comportamento social. Finalmente, propomos que estes sejam os paradigmas comportamentais de alicerce para o estudo e interpretação de distúrbios ansiosos e sua inserção social cuja relevância alcance a investigação desses transtornos no homem.

Palavras-chave: Transtorno de Ansiedade; Paradigmas Comportamentais; Intera- ções sociais.

1. Mestre em Medicina – UNINOVE – SP; 2. Aluno de Mestrado em Medicina – UNINOVE –

SP &3Professor de graduação e pós-graduação em Medicina – UNINOVE – SP.

Autor Para Correspondência: Juciara da Costa Silva Email: [email protected]

Data recebimento: 10/11/2014Aceito para a publicação: 09/03/2015Revisão: 29/05/2015

1. intRodução

transtorno de ansiedade:

O chamado comportamento ansioso surge por um descontrole nos mecanismos envolvidos na preservação dos indivíduos (em geral em todas as espécies e principalmente em mamíferos), nos quais podemos atribuir como exemplo: a fuga de predadores, a proteção da prole e o comportamen-to de territorialidade intrínseca de cada espécie. Tendo na antecipação e amplificação controladas do medo o seu sintoma seminal, o comportamento ansioso circunstancial é natural e um mecanismo adaptativo. No entanto, quando há o comprome-

timento dos mecanismos de controle do medo, o comportamento ansioso torna-se constante, cresce incontrolavelmente e pode dominar o desempenho social animal e passa à denominação de transtorno de ansiedade (TA)1,2.

Estima-se que 13% da população europeia apresentem TA e fica clara a elevação da prevalên-cia nos Estados Unidos a partir da década de 1990, no qual 18 % da população passaram por alguma experiência de ansiedade como situação médica, seja ela atribuídas por questões econômicas ou por consequências do terrorismo3. Entre as principais evoluções em TA, os prejuízos na vida cotidiana agravam-se com o desenvolvimento de depressão, distimia, abuso e dependência de álcool e drogas, suicídio e transtornos alimentares4, 5.

BREVE COMUNICAÇÃO

RESu

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Paradigmas comPortamentais de exPerimentação em roedores: em busca do entendimento das interações sociais na ansiedade

Não há diagnóstico rápido nem tratamento sim-plificado no TA. A carência para uma “revolução” diagnóstica está na busca por biomarcadores espe-cíficos que auxiliem no prognóstico e métodos de neuroimagem cerebral aplicados em ampla escala populacional apoiados em técnicas tradicionais como a ressonância nuclear magnética funcional (fMR) e tomografia funcional por emissões de pó-sitrons (PET-CT). Estas importantes ferramentas auxiliam o diagnóstico diferencial e no acompa-nhamento durante a intervenção terapêutica. Além disso, acreditamos que poderiam proporcionar o desenvolvimento de novas drogas terapêuticas ansiolíticas6,7.

Em relação à neuroendocrinologia, TA com-partilha vários dos circuitos e redes neurais en-volvidos na gênese de seus sintomas como em outros desarranjos psiquiátricos (e.g.; depressão, transtorno de humor e distúrbios esquizoafetivos). No entanto, as heterogeneidades destes também sugerem algumas peculiaridades as suas psico-patologias com grandes limitações no acesso de investigação direta aos indivíduos acometidos nas fases pré-clínica e clínica8.

2. o uSo dE modELoS ExPERimEntAiS no EStudo do tRAnStoRno dE AnSiEdAdE

No contraponto clínico e populacional de TA, diferentes espécies animais são utilizadas em laboratório para aprimorar a compreensão desses desarranjos, sendo que alguns desses achados experimentais translacionais reproduzem com relevante identidade as características farmaco-lógicas, fisiopatológicas ou comportamentais do que acontece na área clínica em humanos.

Os modelos animais relacionados ao estudo de desordens psiquiátricas podem ser utilizados para testar drogas ou outros tratamentos não far-macológicos, sendo fundamental a elaboração de uma caracterização comportamental detalhada e consistente para se estudar os aspectos etiológicos e/ou mecanismos neuroquímicos e genéticos dos transtornos de ansiedade9.

Atualmente, existem classificações para mo-delos animais com alterações sociais10. Grande parte dos trabalhos científicos utiliza preferen-cialmente o camundongo pelo benefício da ri-queza em modelos transgênicos já disponíveis e a mesma versatilidade de manipulação genética futura, no qual se avaliam os animais em condi-ções ditas ‘estressantes’ a fim de se compreender o comportamento exibido como conseqüência da condição predisponente ao agente estressor11. No entanto, salientamos a importância e relevância do modelo experimental com linhagem de ratos.

A reprodução da ansiedade patológica humana em roedores propicia uma vasta gama de paradig-mas e testes comportamentais, criados e modifica-dos de maneira muito dinâmica. Algumas técnicas compõem-se de ensaios de resposta ao medo e ao evento aversivo e outros abordam a capacidade do medo/aversão em inibir um comportamento contí-nuo que é característico para o animal12. A partir de estudos comportamentais clássicos, seria interes-sante obter um ‘roteiro experimental simplificado’ que estude a ansiedade animal, mas que também se insira no contexto social do animal estudado. Com esta prerrogativa, propomos por ordem de importância e sistematicamente seis avaliações amplamente divulgadas na literatura sendo: (I) campo-aberto ou ‘open field’, (II) labirinto em cruz elevado ou ‘plus-maze’, (III) ‘marble- burying’, (IV) vocalização ultrassônica, (V) teste em suspen-são em cauda; testes estes a compor a (VI) neuroen-docrinologia do comportamento social (Figura 1).

3 PARAdigmAS PRoPoStoS

3.1. teste do campo aberto (open field)

O paradigma de campo aberto ou ‘open field’, consiste na colocação de um animal em um am-biente desconhecido com paredes circundantes, de modo a observar aspectos comportamentais como a tendência de ficar na periferia ou na área central da arena, a fim de vislumbrar toda atividade exploratória do animal testado13.


Juciara da Costa Silva, Rodrigo Fernandes de Barros e Carlos Alberto Avellaneda Penatti

Figura 1 – Paradigmas comportamentais para os estudos dos transtornos de ansiedade em (A) campo aberto exemplificando arena de 50 cm por 50 cm, (B) labirinto em cruz elevado suspenso 38,5 cm do chão, (C) ‘marble- burying’ com 20 esferas de vidro, (D) vocalização ultrassônica com equipamento para captação do som distanciado 10 cm do animal estudado (E) teste de suspensão em cauda e (F) a neuroendocrinologia do comportamento social.

A frequência de defecação e micção pode ser quantificada para posteriores análises e a caracte-rização do escore do padrão ansioso. Para deter-minar a atividade exploratória e a movimentação espontânea, o animal permanece na arena em média 10 minutos podendo alterar conforme a necessidade do estudo e dos protocolos adotados13. O comportamento pode ser tabulado, gravado e quantificado com auxilio de softwares específi-cos que acompanham o deslocamento do animal, sendo mensurados aspectos como: tipo de movi-mentação, distância percorrida, tentativas de fugas e duração do tempo sem movimentação. O perfil de ansiedade é mensurado através do aumento na ambulação (número de cruzamentos), o qual indica redução da ansiedade14,15. Estudos realizados em camundongos da linhagem C57BL/6J submetidos ao paradigma de campo aberto observaram fenó-tipos de depressão e ansiedade distintos conforme a variação do agente estressor em que os animais tiveram contato prévio, sendo esse paradigma, portanto, uma interessante metodologia para a

triagem de atividade de locomoção e avanços e em estudos de TA16.

Nosso grupo de trabalho vem desenvolvendo estudos com camundongos da linhagem C57Bl/6 (machos a partir dos 58 dias de vida). Esses ani-mais foram inicialmente submetidos ao protocolo de agressividade residente-intruso17. Após esse teste, realizamos a aplicação do paradigma campo aberto. Os dados indicam que os machos residen-tes apresentaram menor interesse exploratório quando comparado com os animais intrusos, o que teoricamente sugere aumento de ansiedade. No entanto, podemos especular que essa expressão comportamental diferenciada ocorre pelo padrão distinto do perfil social na situação de conflito inserido no teste. Neste cenário, a exploração intensificada manifestada pelos intrusos reflete uma diminuição de territorialidade dependente do delineamento experimental, ou ainda pode-mos especular uma maior preferência e interesse exploratório nos animais intrusos. Entretanto, novas investigações tornam-se fundamentais para



o entendimento do comportamento apresentado. Temos aqui a importância de se avaliar a interde-pendência de padrões sociais em espécies animais construídos após inclusões de testes e paradigmas comportamentais específicos.

3.2. teste do labirinto em cruz elevado (plus- maze)

O paradigma labirinto de cruz elevado ou ‘plus-maze’ tem sido descrito como um método simples para avaliar as respostas de ansiedade em roedores. O aparato consiste em uma estrutura ge-ralmente desenvolvida em material acrílico cinza, com a presença de uma extensão fechada, sendo denominado ‘braço-fechado’ e uma extensão aberta denominada ‘braço-aberto’. A avaliação do comportamento/perfil de ansiedade em roedo-res pode ser realizada de maneira ampla, através da determinação do cálculo de tempo gasto nos braços abertos (caráter exploratório – indicador de baixa ansiedade) em relação ao tempo gasto nos braços fechados (caráter inibido – indicador de alta ansiedade)18.

Ao contrário de outros testes comportamentais utilizados para a avaliação de respostas de ansie-dade/aversão que dependem de apresentação de estímulos nocivos (i.e.; choques elétricos, privação de alimentos/água, ruídos altos, a exposição ao odor de predador etc.) que normalmente produzem uma resposta condicionada, o labirinto elevado depende da proclividade dos roedores para habitar e explorar ambientes escuros e de um medo não condicionado de alturas/espaços abertos19.

O estudo do comportamento de ratos da linha-gem Sprague-Dawley demonstrou diferenças no padrão de exposição ao estresse dependente da conotação em que os animais estavam inseridos. Os autores, portanto, consideram que situações de estresse interrompido exerçam maior impacto comportamental sobre a ansiedade20.

3.3. ‘marble- burying’

O paradigma ‘marble-burying’ torna fa-cilitada a investigação do comportamento com-

pulsivo, neofobia e ansiedade em roedores21,22,23. Para a realização do paradigma, preferencialmente utiliza-se uma caixa de material transparente, sendo aplicado 5 cm do material utilizado para ‘cama’, podendo ser a maravalha ou de outro ma-terial de substrato e variado conforme o critério do pesquisador. Após a disposição da maravalha na superfície, ocorre a aplicação de aproximadamente vinte pequenas esferas de vidro com cerca de um 1 cm no diâmetro (i.e.; coloquialmente conhecidas como “bolinhas de gude”), sendo formadas cinco fileiras com quatro esferas cada e com intervalos de aproximadamente 1,5 cm24.

Para a determinação do grau ansioso, o animal a ser estudado é posicionado no centro da caixa e permanece durante 20 a 30 minutos. Os dados tabulados são a quantidade de esferas cobertas: mais esferas cobertas sugerem um grau ansioso maior. Para tal acesso de significado, é necessá-rio ter o perfil basal da linhagem, sem nenhum tipo de manipulação e comparar com os espéci - mes experimentais. A quantificação pode ser realizada através de vídeos com a análise da de esferas cobertas durante o período de realização do teste, sendo atribuída a cobertura de 2/3 da esfera25.

O contexto de ansiedade dentro do paradigma ‘marble-burying’ para alguns autores deve ser adotado como uma prática experimental comple-mentar, uma vez que em a cobertura das esferas pode ser uma prática relacionada tanto à condição ansiosa da espécie ou linhagem, como também haver uma correlação dos resultados com um comportamento exploratório exibido devido à condição de novidade26.

O comportamento de enterramento em roedores qualifica-se na presença de estímulos aversivos (i.e.; fonte de choque, alimentos prejudiciais ou objetos inanimados de conotação de ameaça). A administração de ansiolíticos tende a reduzir o número de esferas enterradas neste teste. Alguns trabalhos enfatizam que a aplicação do ‘marble--burying’ possa expandir ainda mais a avaliação das propriedades ansiolíticas, portanto como uma ferramenta importante para as análises comporta-mentais em modelos farmacológicos27.



3.4. Vocalização ultrassônica

Diante da possibilidade de investigarmos as-pectos de comunicação, diferentes pesquisadores têm explorado a bioacústica. A comunicação vocal compõe um parâmetro complexo em estudos dos vertebrados que tem como caráter vislumbrar a sociabilidade e o perfil de emocionalidade nos animais estudados28.

Nos mamíferos a produção vocal ocorre através da interação do sistema nervoso central/periférico, sistema respiratório e músculos da laringe29. Em modelos murinos, a variação da frequência ultras-sônica mais comumente estudada ocorre entre 30 e 110 KHz. Os sons ultrassônicos variam conforme o contexto social em que os animais estão inseri-dos, como por exemplo, nas situações de contexto sexual macho diante da fêmea e materno quando a fêmea é separada da prole30.

As alterações significativas que ocorrem na expressão da vocalização ultrassônica com modu-lação da emissão vocal apresentam-se também em situação de ansiedade elevada31. Desta maneira, dados de bioacústica apresentam grande potencial de detectar alterações mais sutis quando compa-rado aos demais paradigmas na abordagem do TA e talvez possa permitir melhor qualificação e mensuração do estado específico do animal dentro de uma ocorrência social natural.

Estudos realizados em ratos machos da linha-gem Wistar sugerem a frequência acústica de 22 KHz, dita de uma situação de medo ou com-ponente de ansiedade32. Portanto, investigação comportamental dentro da variação ultrassônica de 22 KHz torna-se relevante para a compreensão do perfil ansioso em modelos experimentais mu-rinos. Nossa recente experiência com esta técnica reforça a janela ultrassônica de 40 – 60 KHz na captação e análise da produção vocal no contexto social em murinos.

3.5. teste de suspensão em cauda

O paradigma teste de suspensão em cauda explorado em roedores surge experimentalmente como uma ‘triagem’ entre ansiedade e depres-

são33-35. Foi introduzido em 1985, e é conside-rado fundamental para a avaliação de atividades antidepressivas em modelos experimentais36.

O objetivo da avaliação centra-se na imobilidade do animal testado, sendo o mesmo suspenso pela cauda e isolado em uma plataforma em relação ao chão. A indicação do aumento da mobilidade sugere o perfil de atividade antide-pressiva37.

A interpretação e quantificação do compor-tamento depressivo advém do tempo utilizado pelo animal imóvel durante um período de 6 minutos. Vários medicamentos antidepressivos revertem essa imobilidade e promovem a ocorrência de comportamentos relacionados à fuga38.

O paradigma induz no animal uma situ-ação dita como estressante e desencadeia uma resposta de hipertermia. Ainda, o fenótipo motor dependerá da condição real do animal a ser ava-liado. Na literatura, o teste de suspensão da cauda tem sua aplicabilidade em ensaios de depressão conhecida. Alguns são critérios propostos para o comparativo depressivo como paradigma com-portamental específico: (I) situação análoga para síndrome depressiva humana em suas manifesta-ções clínicas, (II) mudança comportamental que pode ser objetivamente monitorada, (III) atitudes dos animais apresentadas durante o teste devem ser alteradas pelo mesmo tratamento e eficientes em humanos e finalmente (IV) o sistema deve ser reprodutível em diferentes condições laboratoriais no entendimento e manejo da depressão39.

3.6. neuroendocrinologia do comportamento social - Possível compreensão do

comportamento ansioso

E quais os expoentes mecanísticos atuais na neurobiologia que já são favorecidos com uma sistemática coerente na investigação comporta-mental social?

Grandes são os esforços empregados para a determinação da compreensão dos chamados desarranjos e fatores determinantes para o desen-volvimento da neuroendocrinologia social. Estu-dos expressivos na esfera de neurociência com-



portamental e de avaliação neuroendócrina são conduzidos por diferentes investigadores40,41,42.

O foco ocorre nas interações sociais: comu-nicação, comportamento reprodutivo (cuidado especialmente parental e sexual), ações reativas (agressão e predação) e nos vertebrados (e muitos invertebrados). Quase todos estes comportamentos são influenciados por esteroides sexuais (estróge-nos e andrógenos), sendo que o mapeamento da expressão de receptores de esteróides gonadais auxilia na compreensão e identificação do chama-do comportamento social demonstrado a partir de circuitarias no sistema nervoso central43.

Alguns neuropeptídeos (e.g.; oxitocina e vaso-pressina) e hormônios esteróides (i.e.; testosterona e estradiol) têm papel central na vida social dos animais. Embora hormônio como o estradiol seja fundamental para o comportamento social animal, seus efeitos sobre o comportamento social humano ainda não são todos bem conhecidos44.

Destaca-se entre os nanopeptídeos a oxitoci-na: sintetizada no hipotálamo, atua de maneira periférica e também como neurotransmissor. A literatura metaforicamente a denomina “hormônio do amor” devido ao seu papel neurobiológico no comportamento materno. Atualmente, o oxitoci-na tem sido associado a efeitos pró-sociais mais amplos, incluindo o potencial para melhora da cognição e reconhecimento social, capacidade de inferir os sentimentos e emocionalidade em de-terminados contextos sociais. Estas evidências de efeitos pró-sociais ofereceram um suporte quanto à possibilidade de tratamento em disfunções neurop-siquiátricas incluindo esquizofrenia e autismo45.

Em camundongos nocaute para o gene da oxi-tocina, a avaliação da ansiedade em campo aberto e paradigmas de labirinto em cruz elevado não apresentaram diferenciação quando comparada aos animais controle. Em humanos recentemente, um polimorfismo de oxitocina foi encontrado e foi associado a vulnerabilidade ao estresse com facilitação a psicopatologias46.

Entre os neuropeptídios, a vasopressina tem pa-pel descrito e caracterizado em desajustes sociais das condições relacionadas a agressão ofensiva, cuidado parental, formação de memória social e

resposta ao estresse. A distribuição e expressão deste peptídeo cerebral mostra-se alterada ao longo da vida47. No cérebro a oxitocina e a va-sopressina são importantes reguladores da ansie-dade, embora geralmente em direções opostas e participantes, portanto, em respostas aos estímulos ansiolíticos48. A administração central de vaso-pressina em roedores produz comportamento de ansiedade e evidências em humanos a relacionam aos transtornos afetivos e do humor, nos quais pacientes deprimidos apresentam níveis elevados de concentração em amostras biológicas49.

4 ConSidERAçõES finAiS

Dentro da pesquisa translacional, os modelos animais de TA são desenvolvidos com o objeti-vo de apresentar similaridade na representação sintomática clínica em humanos, destacando-se: neofobia, estereotipia (repetição), déficits de me-mória e alterações do perfil emocional do indiví-duo no contexto de medo referido, evolução para transtorno depressivo. Na busca de avanços em unir conhecimento básico ao aplicado na ciência de TA, consideramos:

1. Os paradigmas apresentados representam importantes metodologias para estudos de TA, sendo métodos de fácil aplicação, baixo custo e com crescente divulgação na litera-tura, nos quais o complemento das técnicas comportamentais pode acrescentar dados mais consistentes para a compreensão do fenótipo de emocionalidade no modelo estudado, o que oferece fundamento para os rastreamentos comportamentais de desordens neuropsiquiá-tricas;

2. Ao recorrer a modelos experimentais, faz-se necessário a realização de uma escolha acertada baseado no conhecimento sobre o comporta-mento de uma determinada linhagem a ser uti-lizada experimentalmente dentro da formação do modelo animal testado. O pesquisador deve ter a ciência do espectro do comportamento



ABSt

RACt

dito típico (sem alterações ou manipulação) apresentado pela linhagem animal, bem como controlar suas variações em prol de uma me-lhor acurácia nos resultados, sendo primordial estabelecer um bom delineamento experimen-tal pela variação individual nos estudos de TA: consistência com a repetição de testes e a percepção de influência de um paradigma em relação ao outro. Sugerimos realizar um estu-do inicial com a linhagem sem manipulação, podendo ser alternados os testes e tabulados as informações para a melhor aplicação no modelo a ser estudado, no qual o pesquisador terá ferramentas adequadas para aprimorar o direcionamento após essa abordagem;

3. Em roedores ou em animais de criação em la-boratório, situações não previstas acontecem e afetam o grau de medo/ansiedade e podem ser atribuídas ao manejo da criação que influen-ciam diretamente nos resultados dos paradig-mas apresentados. A supervisão e planejamento necessários obrigam uma instalação apropriada e bem controlada em parâmetros físicos e de

recursos humanos para a devida condução e execução dos testes;

4. Finalmente, para qualquer estudo em TA, a dependência do sexo e idade do animal deve ser reconhecida, considerada e testada para os resultados mais fidedignos e completos.

Por fim, consideramos o TA um problema de saúde pública, com a necessidade de enfoque multidisciplinar com a pesquisa básica à clínica. Para preenchermos esta lacuna de conhecimento, o elo está nos modelos animais como paralelo e complementaridade de muitas condições neurop-siquiátricas ainda com potenciais para novas abor-dagens, sobretudo para a identificação de fatores genéticos e ambientais que não são estabelecidos ou conhecidos até o momento.

AgRAdECimEntoS

FAPESP, CAPES-PROSUP e UNINOVE

ExPERimEntAL BEhAVioRAL PARAdigmS in RodEntS: A ComPREhEnSiVE SEARCh foR SoCiAL intERACtionS in AnxiEty StAtES

Anxiety disorders (AD) comprise an important group of psychiatric disarrangements which manifests from uncontrolled fear-related conditios and often leads to: 1) major depression 2) dysthymia, 3) drug abuse and addiction, 4) increased incidence of eating disorders and 5) suicide. Many studies from basic to clinical research approaches have recently been adding light in neural mechanisms that underlie anxious states within many brain areas and circuits. Although the knowledge in anxiety has provided advances in pharmacological and behavioral management for the affected individuals, there is a gap between the displays of anxious-generated conditions in humans and the scientific assessment and interpretation coming from animal models of anxiety. In this brief communication, we discuss experimental behavioral paradigms to assessing anxiety states and their dependence on social context: (I) ‘open field’, (II) ‘plus-maze’, (III) ‘marble- burying’, (IV) ultrasonic vocalization, (V) tail suspension test, which all



favor the understanding of (VI) neuroendocrinoloy of the social behavior. Finally, we propose that these combined behavioral tests may offer a systematic and hierarchical way to harness experimental data directly related to anxiety disorders influenced by the social environment in closer settings to better understand the human condition.

Keywords: Anxiety disorders, behavioral paradigm, social context

1. Cryan JF, Holmes A. The ascent of mouse: advances in modelling human depression and anxiety. Nat Rev Drug Discov. 2005;4(9):775-90.

2. Gomes Vde C, Hassan W, Maisonnette S, Johnson LR, Ramos A, Landeira-Fernandez J. Behavioral evaluation of eight rat lines selected for high and low anxiety-related responses. Behav Brain Res. 2013;257:39-48.

3. Alonso J, Angermeyer MC, Bernert S, Bruffaerts R, Brugha TS, Bryson H, et al. Disability and quality of life impact of mental disorders in Europe: results from the European Study of the Epidemiology of Mental Disorders (ESEMeD) project. Acta Psychiatr Scand Suppl. 2004(420):38-46.

4. Brunello N, den Boer JA, Judd LL, Kasper S, Kelsey JE, Lader M, et al. Social phobia: diagnosis and epidemiology, neurobiology and pharmacology, comorbidity and treatment. J Affect Disord. 2000;60(1):61-74.

5. Frick A, Howner K, Fischer H, Kristiansson M, Furmark T. Altered fusiform connectivity during processing of fearful faces in social anxiety disorder. Transl Psychiatry. 2013;3:e312.

6. Popovic-Milenkovic MT, Tomovic MT, Brankovic SR, Ljujic BT, Jankovic SM. Antioxidant and anxiolytic activities of Crataegus nigra Wald. et Kit. berries. Acta Pol Pharm. 2014;71(2):279-85.

7. Zheng MQ, Nabulsi N, Kim SJ, Tomasi G, Lin SF, Mitch C, et al. Synthesis and evaluation of 11C-LY2795050 as a kappa-opioid receptor antagonist radiotracer

for PET imaging. J Nucl Med. 2013;54(3):455-63.

8. Lui S, Gong Q, He Y, Northoff G, Sweeney JA. Translational neuroimaging of the mood and anxiety disorders. Biomed Res Int. 2014;2014:240769.

9. Steimer T. Animal models of anxiety disorders in rats and mice: some conceptual issues. Dialogues Clin Neurosci. 2011;13(4):495-506.

10. Allsop SA, Vander Weele CM, Wichmann R, Tye KM. Optogenetic insights on the relationship between anxiety-related behaviors and social deficits. Front Behav Neurosci. 2014;8:241.

11. Bourin M, Petit-Demouliere B, Dhonnchadha BN, Hascoet M. Animal models of anxiety in mice. Fundam Clin Pharmacol. 2007;21(6):567-74.

12. Line SJ, Barkus C, Rawlings N, Jennings K, McHugh S, Sharp T, et al. Reduced sensitivity to both positive and negative reinforcement in mice over-expressing the 5-hydroxytryptamine transporter. Eur J Neurosci. 2014.

13. Liu HX, Lopatina O, Higashida C, Fujimoto H, Akther S, Inzhutova A, et al. Displays of paternal mouse pup retrieval following communicative interaction with maternal mates. Nat Commun. 4. England2013. p. 1346.

14. Sun NN, Sha LZ, Xu Q. Establishment of a Chronic Restraint Stress Model of Depression with C57BL/6J Mice. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2015;37(1):8-11.

15. Cheng JS, Craft R, Yu GQ, Ho K, Wang X, Mohan G, et al. Tau reduction diminishes spatial

learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice. PLoS One. 9. United States2014. p. e115765.

16. Yoon SH, Kim BH, Ye SK, Kim MH. Chronic non-social stress affects depressive behaviors but not anxiety in mice. Korean J Physiol Pharmacol. 2014;18(3):263-8.

17. Robinson S, Penatti CA, Clark AS. The role of the androgen receptor in anabolic androgenic steroid-induced aggressive behavior in C57BL/6J and Tfm mice. Horm Behav. 61. United States: 2011 Elsevier Inc; 2012. p. 67-75.

18. Carhuatanta KA, Shea CJ, Herman JP, Jankord R. Unique genetic loci identified for emotional behavior in control and chronic stress conditions. Front Behav Neurosci. 2014;8:341.

19. Walf AA, Frye CA. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protocols. 2007;2(2):322-8.

20. Zhang W, Hetzel A, Shah B, Atchley D, Blume SR, Padival MA, et al. Greater physiological and behavioral effects of interrupted stress pattern compared to daily restraint stress in rats. PLoS One. 2014;9(7):e102247.

21. Ho YJ, Eichendorff J, Schwarting RK. Individual response profiles of male Wistar rats in animal models for anxiety and depression. Behav Brain Res. 2002;136(1):1-12.

22. Borsini F, Podhorna J, Marazziti D. Do animal models of anxiety predict anxiolytic-like effects of antidepressants? Psychopharmacology (Berl). 2002;163(2):121-41.

REfEREnCiAS



REfE

REnC

iAS23. Gyertyan I. Analysis of the

marble burying response: marbles serve to measure digging rather than evoke burying. Behav Pharmacol. 1995;6(1):24-31.

24. Kedia S, Chattarji S. Marble burying as a test of the delayed anxiogenic effects of acute immobilisation stress in mice. J Neurosci Methods. 2014;233c:150-4.

25. Amodeo DA, Yi J, Sweeney JA, Ragozzino ME. Oxotremorine treatment reduces repetitive behaviors in BTBR T+ tf/J mice. Front Synaptic Neurosci. 2014;6:17.

26. Thomas A, Burant A, Bui N, Graham D, Yuva-Paylor LA, Paylor R. Marble burying reflects a repetitive and perseverative behavior more than novelty-induced anxiety. Psychopharmacology (Berl). 2009;204(2):361-73.

27. Pires LF, Costa LM, Silva OA, de Almeida AA, Cerqueira GS, de Sousa DP, et al. Anxiolytic-like effects of carvacryl acetate, a derivative of carvacrol, in mice. Pharmacol Biochem Behav. 2013;112:42-8.

28. Hammerschmidt K, Radyushkin K, Ehrenreich H, Fischer J. The structure and usage of female and male mouse ultrasonic vocalizations reveal only minor differences. PLoS One. 2012;7(7):e41133.

29. Hage SR, Gavrilov N, Salomon F, Stein AM. Temporal vocal features suggest different call-pattern generating mechanisms in mice and bats. BMC Neurosci. 2013;14:99.

30. Arriaga G, Jarvis ED. Mouse vocal communication system: are ultrasounds learned or innate? Brain Lang. 2013;124(1):96-116.

31. Tsai PT, Greene-Colozzi E, Goto J, Anderl S, Kwiatkowski DJ, Sahin M. Prenatal rapamycin results in early and late behavioral abnormalities in wildtype C57BL/6 mice. Behav Genet. 2013;43(1):51-9.

32. Jelen P, Soltysik S, Zagrodzka J. 22-kHz ultrasonic vocalization in rats as an index of anxiety but not

fear: behavioral and pharmacological modulation of affective state. Behav Brain Res. 141. Netherlands2003. p. 63-72.

33. Kukuia KK, Asiedu-Gyekye IJ, Woode E, Biney RP, Addae E. Phytotherapy of experimental depression: Kalanchoe integra Var. Crenata (Andr.) Cuf Leaf Extract. J Pharm Bioallied Sci. 7. India2015. p. 26-31.

34. Ozdemir A, Altintop MD, Kaplancikli ZA, Can OD, Demir Ozkay U, Turan-Zitouni G. Synthesis and Evaluation of New 1,5-Diaryl-3-[4-(methyl-sulfonyl)phenyl]-4,5-dihydro-1H-pyrazole Derivatives as Potential Antidepressant Agents. Molecules. 20. Switzerland2015. p. 2668-84.

35. Ming Z, Sawicki G, Bekar LK. Acute systemic LPS-mediated inflammation induces lasting changes in mouse cortical neuromodulation and behavior. Neurosci Lett. 2015;590:96-100.

36. Kale PP, Addepalli V, Ghadawale SR. Impact of pre-exposure of tail suspension on behavioural parameters like locomotion, exploration, and anxiety in mice. Indian J Exp Biol. 2013;51(9):732-8.

37. Cryan JF, Markou A, Lucki I. Assessing antidepressant activity in rodents: recent developments and future needs. Trends Pharmacol Sci. 23. England2002. p. 238-45.

38. Abelaira HM, Reus GZ, Quevedo J. Animal models as tools to study the pathophysiology of depression. Rev Bras Psiquiatr. 2013;35 Suppl 2:S112-20.

39. Cryan JF, Mombereau C, Vassout A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29. United States2005. p. 571-625.

40. van Anders SM, Goldey KL, Kuo PX. The Steroid/Peptide Theory of Social Bonds: integrating

testosterone and peptide responses for classifying social behavioral contexts. Psychoneuroendocrinology. 36. England: 2011 Elsevier Ltd; 2011. p. 1265-75.

41. Caldwell HK, Lee HJ, Macbeth AH, Young WS, 3rd. Vasopressin: behavioral roles of an “original” neuropeptide. Prog Neurobiol. 84. England2008. p. 1-24.

42. Lee HJ, Macbeth AH, Pagani JH, Young WS, 3rd. Oxytocin: the great facilitator of life. Prog Neurobiol. 88. England2009. p. 127-51.

43. Insel TR. The challenge of translation in social neuroscience: a review of oxytocin, vasopressin, and affiliative behavior. Neuron. 65. United States: 2010 Elsevier Inc; 2010. p. 768-79.

44. McCall C, Singer T. The animal and human neuroendocrinology of social cognition, motivation and behavior. Nat Neurosci. 15. United States2012. p. 681-8.

45. Zik JB, Roberts DL. The many faces of oxytocin: Implications for psychiatry. Psychiatry Res. 2014.

46. Kormos V, Gaszner B. Role of neuropeptides in anxiety, stress, and depression: from animals to humans. Neuropeptides. 2013;47(6):401-19.

47. Bester-Meredith JK, Fancher AP, Mammarella GE. Vasopressin Proves Es-sense-tial: Vasopressin and the Modulation of Sensory Processing in Mammals. Front Endocrinol (Lausanne). 2015;6:5.

48. Neumann ID, Landgraf R. Balance of brain oxytocin and vasopressin: implications for anxiety, depression, and social behaviors. Trends Neurosci. 2012;35(11): 649-59.

49. Hodgson RA, Mullins D, Lu SX, Guzzi M, Zhang X, Bleickardt CJ, et al. Characterization of a novel vasopressin V1b receptor antagonist, V1B-30N, In animal models of anxiety-like and depression-like behavior. Eur J Pharmacol. 2014;730:157-63.


ISSN 2238-1589

1. Coordenação de Gestão da Qualidade - Assistência Técnica de Gestão da Qualidade e Tecnologias. Centro de Criação de Animais de Laboratório. Fundação Oswaldo Cruz - Rio de Janeiro.

2. Departamento de Gestão e Desenvolvimento Institucional, Centro de Criação de Animais de Laboratório. Fundação Oswaldo Cruz - Rio de Janeiro.

Autor Para Correspondência: Frederico Vicente da Cunha Orofino E-mail: [email protected]

Data recebimento: 01/04/2015Aceito para a Publicação: 04/05/2015

ImPLAntAção dE SIStEmA dE gEStão dA quALIdAdE Em um BIotéRIo dE CRIAção

Frederico Vicente da Cunha Orofino¹, Ândrea Cordeiro dos Santos Diogo¹, Ingrid Daré Viana¹ e Paulo Roberto de Souza Lopes2

A implementação do Sistema de Gestão da Qualidade (SGQ), visando melhorias contínuas da qualidade, faz parte da estratégia do negócio de inúmeras empresas que vêm nesse processo à busca de melhor posicionamento no mercado. Os pro-gramas que viabilizam a mudança das práticas voltadas para melhoria contínua e que possibilitam melhores resultados dinamizam seus processos de trabalho após a sua efetivação. O presente estudo objetivou apresentar um modelo de implantação do SGQ e seus resultados baseado nas legislações pertinentes na norma NBR--ISO 9001. O trabalho iniciou em 2011 e foi analisado até 2014, apresentando seus primeiros resultados com 63% dos apontamentos da Auditoria Interna, solucionados em um ano. Nesse período, foram totalizadas 747 horas de capacitação com 236 participantes, inseridos nos padrões da qualidade estabelecidos, fato que viabilizou a consolidação do processo de implantação do SGQ. No primeiro ano, detectou-se 53% de evolução na implantação, culminando com um percentual de 73% em 2014, quando foram elaborados 123 mapas de processos de trabalho, o que possibilitou uma celeridade na implementação, pois tornou-se factível introduzir novas práticas nos processos de produção e na área da Qualidade destinada aos biotérios de criação. Os resultados mostraram que o SGQ foi determinante para a redução de índices críticos deste segmento, além de criar excelentes perspectivas quanto à sua permanência e ao seu franco desenvolvimento.

Palavras-chave: Sistema de gestão da qualidade. Biotério de criação. Processos de trabalho. Qualidade. Auditoria.

1. IntRodução

O Sistema de Gestão da Qualidade (SGQ) objetiva padronizar a documentação dos proces-sos de trabalho, buscando melhor eficácia dos procedimentos laborais, em conformidade com as normas atuais para o alcance da certificação, tornando-se, para tanto, necessária a capacitação dos profissionais na Norma ABNT NBR - ISO 90011 – Requisitos do SGQ. Biotérios procedentes de diversas partes do mundo já adotam esse padrão e alcançaram a certificação nesta norma, corrobo-

rando tal iniciativa que busca validar os processos de trabalho, visando atender eficazmente às pes-quisas e produtos de saúde pública. Países como Portugal2, Espanha3, França4, México5, China6 e Argentina7 vêm adotando essa norma como um padrão de eficiência de processos e eficácia nos resultados, buscando melhorar continuamente seus produtos e serviços.

Um dos métodos utilizados para aferir a con-formidade dos processos de trabalho é a Auditoria Interna (AI), que consiste em uma análise do grau de implantação do SGQ, servindo de insumo importante para a solução dos desvios e controle

ARTIGO GESTÃO DE QUALIDADE

RESumo


Frederico Vicente da Cunha Orofino, Ândrea Cordeiro dos Santos Diogo, Ingrid Daré Viana e Paulo Roberto de Souza Lopes

das melhorias que devem ser implementadas. Conforme pesquisa realizada, a AI pode constituir uma inquietação no contexto econômico-político--social, consequência da globalização. A pesquisa realizada por questionários, entrevistas e emissão de relatórios propiciam dados que refletem a con-juntura atual do sistema8.

O Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), foi fundado em 1904, quando Oswaldo Cruz idea-lizou o primeiro biotério da FIOCRUZ. Localizado em Manguinhos, no Rio de Janeiro, o lugar inicial-mente se destinava a criar pequenas quantidades de coelhos, cobaias e animais de médio e grande porte. Nos anos seguintes, com o aumento das pesquisas e da produção de vacinas, a necessidade de animais de laboratório cresceu sensivelmente, quando em 1967, construiu-se um prédio para abrigar o Depar-tamento de Biotérios (DEBI), ocupando uma área superior a 4.000 m², onde passaram a ser criados e mantidos camundongos, ratos, cobaias, coelhos, hamsters, ovinos e equinos.

Anteriormente a esse fato, entre os anos de 1928 e 1929, ocorreu a epidemia da febre amare-la no Brasil. Os estados atingidos foram Rio de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo. Os estudos da doença deram origem ao Serviço de Primatologia na FIOCRUZ com o uso de macacos Rhesus (Ma-caca mulatta), espécie que foi importada da Índia e estabelecida em uma colônia de primatas na Ilha do Pinheiro no ano de 1932. Os macacos rhesus permaneceram nessa ilha até meados de agosto de 1980, quando foram transferidos para o campus da FIOCRUZ, mudando seu sistema de criação de seminatural para grupos haréns, em cativeiro.

Em 1980 começaram os estudos para a mo-dernização das instalações do então DEBI, que já ocupava uma área de 34.200 m². A intenção era capacitar a unidade a produzir animais convencio-nais controlados, que atenderiam à demanda dos diversos programas e projetos da FIOCRUZ e de outras instituições científicas, além da expansão das colônias de primatas não humanos.

Em 1998 ocorreu a transformação do DEBI em uma unidade técnica de apoio da FIOCRUZ, pas-sando a se chamar Centro de Criação de Animais

de Laboratório (CECAL). Através da produção e fornecimento de animais de laboratório, sangue, hemoderivados, controle de qualidade e biotecno-logia animal, a unidade contribui com as ativida-des da FIOCRUZ, bem como instituições congê-neres, tanto públicas como privadas. Atualmente, o CECAL possui cinco serviços finalísticos: Serviço de Criação de Roedores e Lagomorfos (SCRL), Serviço de Hemocomponentes e Derivados Ani-mais (SHDA), Serviço de Criação de Primatas Não Humanos (SCPrim), Serviço de Biotecnologia e Desenvolvimento Animal (SBDA) e Serviço de Controle da Qualidade Animal (SCQA).

Com o desenvolvimento da referida unidade da FIOCRUZ, surgiu a necessidade de buscar padro-nização e melhoria dos procedimentos e a partir de 2010 identificou-se a necessidade de reestruturar a equipe da Gestão da Qualidade, de forma a atuar na elaboração, desenvolvimento e estabelecimento do SGQ, com base nos requisitos da ABNT NBR - ISO 9001. Neste processo de estruturação, o CECAL contou com o apoio institucional da FIO-CRUZ, por meio da Coordenação da Qualidade FIOCRUZ (CQuali), buscando o alinhamento às suas políticas de qualidade. Reestruturou-se a Assistência Técnica de Gestão da Qualidade e Tecnologias do CECAL (ATGQT-CECAL), sendo a maturidade do SGQ uma condição crucial para a evolução dos processos de trabalho, evidencian-do a melhora na cadeia de valor e nos produtos da unidade e da instituição. Esse estudo tem por finalidade apresentar a metodologia e os resulta-dos apresentados nestes quatro primeiros anos do processo de implantação do SGQ, possibilitando, assim, criar um referencial para outros pares que desejam compartilhar esta mesma experiência.

2. mEtodoLogIA

2.1 Capacitação e elaboração do manual da qualidade e documentos básicos da qualidade

Para implantar o SGQ, foram realizados 40 treinamentos com 236 profissionais nas diversas


Implantação de sIstema de gestão da qualIdade em um bIotérIo de crIação

áreas do biotério, no período de quatro anos – de 2011 a 2014, com uma carga horária total de 747 horas, nos padrões da qualidade. Dentre as capa-citações, seguiram-se as normativas: “Sistemas de gestão da qualidade – Requisitos” (ABNT--NBR-ISO-9001), “Diretrizes para auditoria de sistemas de gestão (ABNT NBR ISO 19011) 9, “nas organizações educacionais” (ABNT- ISO 15419), “Laboratórios clínicos - Requisitos de qualidade e competência” (ABNT-ISO 15189), “Sistemas da gestão ambiental - Requisitos com orientações para uso” (ABNT-ISO 14001) e “Boas Práticas de Laboratório” (BPL), Boas Práticas de Fabricação (BPF).

Como primeiro documento basilar da Quali-dade, em 2012 foi elaborado o Manual da Quali-dade do CECAL (MQ-CECAL)10 pela equipe da ATGQT-CECAL de forma colaborativa com todas as equipes do CECAL. Paralelamente, foram ela-borados os procedimentos básicos, exigidos pela norma ISO 9001: “Controle de documentos do Sis-tema de Gestão da Qualidade”, que inclui o con-trole de registros (POP_ATGQT_004_Rev_00), “Tratamento de não conformidade - ação corretiva e preventiva”, (POP_ATGQT-005_Rev_00) e Auditoria Interna (POP_ATGQT_019_Rev_00).

No processo de capacitação, estabeleceu-se um cronograma de ações, incluindo as etapas de implementação do SGQ, os documentos básicos que aportam o sistema através do referido MQ--CECAL. Trata-se de um documento norteador para o sistema, que formaliza os processos de trabalhos, infraestrutura e responsabilidades, baseados na missão e visão organizacional da unidade, assumindo o compromisso com o SGQ de formalizar a sua política e objetivos da Qualidade. Foi possível, desta forma, implantar, manter e aprimorar o sistema, de acordo com os requisitos da norma.

2.2 mapeamento dos processos de trabalho:

Para mapear os processos de trabalho, adotou--se a notação “Business Process Modeling No-tation” (BPMN), que consiste em uma notação metodológica de gerenciamento de processos de

negócio (http://www.bpmn.org/). Para aplicar a regra fundamentada nos preceitos que versam o BPMN, utilizou-se o software BizAgi™, seguindo as orientações do GESPÚBLICA11, que introduz a conceitos de gerência de processos de negó-cio, desde o planejamento até a sua maturidade, utilizando a visão CBOK12, para compreensão e início da documentação dos processos de trabalho organizacionais. O software Bizagi™ segue o pa-drão do sistema “Business Process Management System” (BPMS), que se reflete em um conjunto de sistemas que automatiza a gestão de processos de negócio (modelagem, execução, controle e monitoração). O BPM-CBOK12 (Business Pro-cess Management-Commom Body of Knowledge) incide na documentação mantida pela associação internacional ABPMP (Association of Business Process Management Professionals) e contém uma visão sobre todas as fases para a realização de um projeto de BPM ideal (http://www.abpmp--br.org/index.php).

2.3 Auditoria interna (AI) do sistema:

Com o andamento dos processos de trabalho, realizou-se a primeira auditoria interna (AI) no sistema da qualidade, utilizando os parâmetros da ABNT NBR ISO 190119 - Diretrizes para auditoria de sistemas de gestão (http://www.abntcatalogo.com.br/norma.aspx?ID=90603). Esta norma fornece orientação sobre auditoria de sistemas de gestão, incluindo os princípios de auditoria, a gestão de um programa de auditoria e a realização de auditorias de sistema de gestão.

O processo de auditoria se deu em consonância com um programa que continha as áreas a serem auditadas, o escopo de abrangência e o crono-grama, em consenso com as partes, e dentro das normas ISO 9001, ISO 19011 e normativas legais que suportam os processos de trabalho como: leis, normativas institucionais e boas práticas.

2.4 Sistema de gestão da qualidade – Sgq:

Em síntese, para implementar o SGQ no CE-CAL-FIOCRUZ, seguiram-se as seguintes etapas:



1. Levantamento das capacitações necessárias: foram definidas as capacitações que deveriam ser realizadas para a implantação e manuten-ção do Sistema.

2. Confecção de documentos básicos: foram confeccionados seis documentos básicos da Qualidade: i) Procedimento de AI; ii) Controle de Procedimentos Documentais; iii) Controle de Registros; iv) Produto Não Conforme; v) Ação Corretiva e vi) Ação preventiva.

3. Agenda de treinamentos: foi elaborada a agen-da de treinamentos da equipe da Qualidade nos requisitos para implantação do sistema e dos procedimentos básicos da qualidade para iniciar a implantação.

4. Agendamento para treinamentos: foram agendados os treinamentos das equipes, evi-denciando a participação de cada colaborador dentro dos requisitos da atividade.

5. Treinamento das equipes: foram proferidas as capacitações de todas as equipes do CECAL, obedecendo às prerrogativas da Norma.

6. Levantamento dos processos de trabalho: Foi realizado com as áreas um brainstorming, para que fosse desenvolvida uma lista com os principais processos, visando atender identificar os processos fundamentais a serem mapeados.

7. Mapeamento dos processos de trabalho: foram mapeados os processos diagramados, diagnos-ticado sua importância, seus impactos e suas inter-relações.

8. Confecção dos procedimentos: foram confec-cionados os procedimentos documentados, obedecendo aos padrões estabelecidos pelo sistema da qualidade.

9. Implantação dos procedimentos: os procedi-mentos foram treinados pelos colaboradores, que são responsáveis pelos processos de tra-balho anteriormente confeccionados.

10. Agendamento de auditoria (AI): foi criada uma agenda para realização da primeira AI da unidade.

11. Realização de auditoria: foram apontadas não conformidades e atestadas conformidades do sistema e suas possibilidades de melhorias.

12. Confecção de Relatório de Auditoria: elabo-rado e divulgado o relatório, onde constam registrados, apontamentos e o cronograma de ações de atendimento, as não conformidades e as oportunidades de melhorias.

13. Identificação da necessidade de implantação de melhoria: a partir da etapa anterior, foram tratadas as não conformidades e as oportuni-dades de melhorias.

14. Acompanhamento da implantação das me-lhorias: acompanhada a implantação das melhorias, fechando o Ciclo do PDCA (Ciclo Plan-Do-Check-Act = “Planejar-Fazer-Verifi-car-Ajustar”, também conhecido como o Ciclo de Deming (http://iacbe.org/qa-cqi.asp).

3 RESuLtAdoS

A partir dos treinamentos, foi formado o gru-po de auditores internos com capacitação para avaliar o sistema dentro do biotério de criação. Uma vez capacitados, a primeira AI realizada em 2013, resultou em 63% das não conformidades apontadas atendidas no período de um ano, o que demonstrou a intenção da conformidade com o SGQ. Nos demais treinamentos, os colaboradores foram distribuídos de acordo com a necessidade das áreas, resultando em um melhor entendimento normativo, que buscou a construção de processos de trabalho, melhor ajustados e obedecendo aos preceitos normativos; todos adaptados à realidade do biotério e dos clientes, diminuindo o retrabalho, aumentando a segurança no trabalho, prevenindo acidentes e criando padrões de homogeneidade para o produto final.

Dentro desta perspectiva, o mapa de processo de trabalho foi fundamental para diagramar e co-nhecer de forma ilustrada suas atividades, o que propiciou maior clareza das suas etapas, buscando o refinamento das práticas laborais e possibilitan-do uma documentação dos processos de trabalho mais condizentes com a sua prática, ajustados às normativas e com possibilidade de uma melhor mensuração.



Outro ganho digno de menção foi a instau-ração do grupo para governança do processo de implantação e manutenção do SGQ. A criação do Comitê da Qualidade, formado por um colegiado de profissionais com representatividade de todas as áreas do biotério, propiciou a discussão, de forma transversal, sobre os rumos do SGQ, ar-bitrando sobre os problemas e diretrizes a serem alcançados, para melhoria contínua dos processos, compartilhando experiências, dirimindo dúvidas e propondo soluções. Esses encontros mensais, com pautas pré-definidas, delegam e compartilham com seu grupo executivo as ações a serem implementa-das, bem como os controles e resultados, na busca do compartilhamento dos processos da Qualidade por toda a organização.

4 dISCuSSão

A implementação do SGQ evidenciou um avan-ço do sistema, com base nos resultados obtidos na

Figura 1: Total de colaboradores treinados nas normas da Qualidade como base para implementação do Sistema de Gestão da Qualidade (SGQ) em um biotério de criação.

Figura 2: Carga horária de treinamento de pessoal no período de 2011 a 2014, nas normas da Qualidade como base para implementação do Sistema de Gestão da Qualidade (SGQ) em um biotério de criação.

primeira AI, uma vez que foram atendidas 63% das não conformidades em um ano. Em um estudo anterior, foi constatado que o conhecimento dos auditores não refletia o conhecimento necessário da organização, por não haver uma convergência entre os partícipes, que não detém as informações estratégicas do negócio8. É valido mencionar que a falta de participação dos auditores limita o seu conhecimento acerca do planejamento e das diretrizes da entidade. Neste estudo, foram detec-tadas divergências e convergências em relação aos auditores, fato que possibilitou o crescimento dos processos, pois a identificação desses contrastes permitiu um melhor planejamento para o aprimo-ramento dos próximos eventos.

A padronização dos processos vem aprimorando consideravelmente a interação entre as pessoas, a capacitação dos nossos colaboradores, viabilizando a gestão do conhecimento organizacional, que é um fator preponderante para a melhoria contínua dos processos. O objetivo principal dessa transforma-ção é a elevação do nível global de competitivida-de, onde a centralidade do papel da capacitação e da produção do conhecimento é reconhecida por todos13. O grande desafio consiste na quebra do paradigma, em que a cultura organizacional está baseada no conhecimento tácito das pessoas, onde a formalização dos processos do trabalho é sua



Figura 4: Total de processos e atividades de mapeadas, Sistema de Gestão da Qualidade (SGQ) em um biotério de criação.

Figura 3: Mapeamento do processo de implantação do Sistema de Gestão da Qualidade (SGQ) em um biotério de criação.

Fonte: Coordenação da Qualidade da FIOCRUZ.

Figura 5: Percentual de evolução de implementação do SGQ.

explicitação consolidada no conhecimento orga-nizacional, podendo ser disponibilizado e com-partilhado por toda a organização. Tais mudanças corroboraram outros relatos14 que demonstraram que com o comprometimento no desempenho dos colaboradores do biotério de criação para alcançar o autocontrole, em parceria com a ATGQT e aliado ao aprimoramento dos processos, possibilitaram iniciar uma mudança cultural desta organização. As relações internas tornam-se mais participativas, a estrutura mais descentralizada, e aperfeiçoa o sistema de controle14.

A cultura da organização baseada no SGQ se define pela busca da satisfação dos clientes através

de um sistema integrado de ferramentas, técnicas e treinamento, envolvendo a melhoria contínua dos processos de trabalho da organização resultando em produtos e serviços de alta qualidade15.

5 ConCLuSõES

Os primeiros resultados da implementação do SGQ no biotério de criação em questão, vem demonstrando importante mudança na cultura organizacional, documentando procedimentos e criando a memória organizacional, possibilitando, assim, um ganho direto na capacitação, organiza-ção dos processos de trabalho na busca da melhora das entregas e no atendimento aos clientes.



ABStRACt

REFERênCIAS

AgRAdECImEntoS

Os autores agradecem à Dra. Márcia C.R. An-drade, pela revisão deste trabalho; à Coordenação da Qualidade da FIOCRUZ, pelo aporte técnico

à ATGQT-CECAL; à Direção do CECAL, pelo constante incentivo à implementação da Qualidade na unidade e a todos os colaboradores partícipes do processo de implementação, que viabilizaram o desenvolvimento deste trabalho.

ImPLAntAtIon oF quALIty mAnAgEmEnt SyStEm In A LABoRAtoRy AnImAL houSE BREEdIng

Implementation of the Quality Management System (QMS) to continuous improvement of quality is part of the business strategy of several companies that are in the process of seeking better market position. Programs that enable the change of practices ai-med at continuous improvement and that enable better results streamline their work processes after it becomes effective. This study aimed to present a QMS deployment model based on the relevant legislation in the NBR- ISO 9001. Work began in 2011 and was analyzed until 2014, presenting the first results with 63% of the notes from Internal Audit that were solved within one year. In this period, 747 hours of training with 236 participants were performed, included in the established quality standards, which enabled the consolidation of the QMS implementation process. In the first year, 53% of improvement in this implementation were detected, culminating with a percentage of 73 % in 2014, when 123 maps of work rocess were prepared, enabling a speed in this implementation since it became feasible allowing introduce new practices in production processes and the quality of the area for the animal house breeding . Results showed that the QMS was crucial to the reduction of critical contents of this segment, and create excellent prospects for their stay and their full development.

Keywords: Quality management system. Animal house breeding. Work processes. Quality. Auditing.

1. Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT). Sistema de gestão da qualidade: requisitos. NBR ISO 9001. Rio de Janeiro. 2008. 20-28p.

2. Instituto de Medicina Molecular (IMM) da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa. [online]. Lisboa, Portugal; 2015, [Acessado em 30 março de 2015] Disponível em: http://www.justnews.pt/noticias/imm-recebe-certificacao-de-qualidade-iso-9001#.VQm3-dLF9ht.

3. Servicio General de Apoyo a la Investigación (SEGAI) de la Universidad de La Laguna. [online]. Laguna, Espanha; [Acessado em 30 março de 2015] Disponível em: http://www.segai.ull.es/staticpages/presentacion.

4. Institut Jacques-Monod. The Animal House at the Institut Jacques-Monod. [online]. Paris, França; [Acessado em 30 março de 2015] Disponível em:

http://www.ijm.fr/en/facilities/ animal-house/

5. Universidade autônoma del Estado de Hidalgo. [online]. Pachuca. México; [Acessado em 30 março de 2015] Disponível em: http://www.uaeh.edu.mx/bioterio/bienvenida.html;.

6. The Laboratory Animal Services Center. The Chinese University of Hong Kong, [online] Hong Kong,



China; [Acessado em 30 março de 2015] Disponível em: http://www.lasec.cuhk.edu.hk/ quality-control.html.

7. Instituto Biológico Argentino SAIC Bioterio Biol. [online]. Buenos Aires, Argentina; [Acessado em 31 março de 2015] Disponível em: http://www.biol.com.ar/bioterio.php.

8. PAULA, MGMA. Auditoria Interna: Embasamento Conceitual e Suporte Tecnológico. Artigo baseado na Dissertação de Mestrado da autora, defendida na USP, 1998, p.79-110.

9. Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT). Diretrizes para auditoria do sistema de gestão: requisitos. NBR 19011.2012. Rio de Janeiro: 53p.

10. Centro de Criação de Animais de Laboratório- CECAL –FIOCRUZ. Manual da Qualidade do Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) . Rio de Janeiro: FIOCRUZ, 2012. 26 p.

11. Brasil. Ministério do Planejamento Orçamento e Gestão. GESPÚBLICA. “Guia de Gestão de Processo do Governo” [online] Brasilia, Brasil; [Acessado em 28 novembro de 2015] Disponível em: http://www.gespublica.gov.br/Tecnologias/pasta.2010-04-26.0851676103/Guia%20de%20Gestao%20de%20Processos%20de%20Governo.pdf.

12. Association of Business Process Management Professionals (ABMP) – CBOK. Guia de Gerenciamento

de Processos de Negócio Corpo Comum do Conhecimento. [online]. Brasilia, Brasil; [Acessado em 28 novembro de 2015] Disponível em: http://www.abpmp-br.org/index.php?option=com_content&view=article&id=69&Itemid=150.

13. CEPAL/UNESCO. Educación y conociemiento: eje de la transformación productiva con equidad. — Santiago de Chile: Naciones Unidas, 1992.

14. Longo RMJ. A revolução da qualidade total: histórico e modelo gerencial. - Brasília: IPEA, 1994 (RI IPEA/CPS, n.31/94)

15. Sashkin M, Kiser KJ. Gestão da Qualidade Total na Prática. Consultoria Lingüística. Rio de Janeiro: Ed. Campus, 1994.

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IAS


ISSN 2238-1589

1. Fanpix Artes Visuais – São Paulo2. Biotério da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas e Instituto de Química da Universidade de São Paulo.

Autor Para Correspondência: Renata Spalutto Fontes E-mail: [email protected]

Data Recebimento: 04/05/2015Aceito para a Publicação: 20/05/2015

SiStEmA wEB dE gEREnCiAmEnto do BiotéRio dA fACuLdAdE dE CiênCiAS fARmACêutiCAS E inStituto dE químiCA dA uSP

Luciano Antunes de Almeida Leite1, Renata Spalutto Fontes2, Flavia de Moura Prates Ong2 e Silvânia Meiry Peris Neves2

O Biotério da Faculdade de Ciências Farmacêuticas e do Instituto de Química da Universidade de São Paulo possui uma gestão compartilhada entre as duas unidades. Com o objetivo de garantir uma melhor gestão nos procedimentos envolvendo o uso de animais de Laboratório, visando à ética e o bem-estar animal, e respeitando os Princípios dos 3 Rs (Replace, Reduce and Refine), houve a necessidade de aprimorar o formato de gestão até então utilizado no Biotério. Com isso, visando aprimorar, informatizar e criar uma dinâmica de trabalho houve a necessidade da implantação de um sistema web de gestão para a interação entre as seções e confiabilidade nos trabalhos realizados. O sistema foi desenvolvido por um programador em contato direto com a equipe gestora do Biotério para que pudesse atender as necessidades específicas do local. Este controle e gerenciamento permite alocar dados relativos ao Biotério e pesquisadores de forma direcionada, para as demandas e atividades, facili-tando e otimizando os trabalhos e melhoria no fluxo de procedimentos. Demonstramos nesse trabalho, os detalhes destas ferramentas do sistema, suas funcionalidades e o que o sistema ainda permite desenvolvimento. Uma vez implantado o sistema, o programa está em constante adaptação, visando à adequação do software com alinhamento sobre as atividades desenvolvidas no dia-a-dia, bem como alterações e atendimento às normas e leis específicas para o trabalho consciente na utilização de animais de laboratório. Palavras-chave: Biotério, gestão da qualidade, sistema Web - Software

O Biotério possui um sistema de gestão único, atendendo aos pesquisadores de duas instituições, Faculdade de Ciências Farmacêuticas -FCF e Instituto de Química- IQ. A produção anual do biotério é de 12.000 animais, que atendem a condições genéticas, nutricionais e ambientais definidas e padronizadas. São desenvolvidos anualmente cerca de 90 projetos de pesquisa pela comunidade multiusuária FCF-IQ/USP5. Apresenta um modelo de gestão compartilhado pelas três seções (Produção, Experimentação e Higiene e Esterilização) que visa à manutenção do padrão de qualidade onde há o processo de

1. intRodução

O Biotério da Faculdade de Ciências Farma-cêuticas e Instituto de Química da Universidade de São Paulo sempre se pautou por garantir atendimento visando à ética e o bem-estar ani-mal, atendendo a Lei Arouca1, as normativas do CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal)2, a CTNBio (Comis-são Técnica Nacional de Biossegurança)3 e os Princípios dos 3 Rs4, buscando na qualidade a excelência.

ARTIGO GESTÃO DE QUALIDADE

RESumo


Luciano Antunes de Almeida Leite, Renata Spalutto Fontes, Flavia de Moura Prates Ong e Silvânia Meiry Peris Neves

planejamento, execução, controle das atividades que é discutido entre as seções, executado, mo-nitorado e registrado.

Com o intuito de promover um controle seguro entre as seções do biotério, para uma otimização do tempo e a eficiência na produtividade, houve a necessidade da implantação de um sistema de gerenciamento, que permitisse a informatização da gestão do Biotério de forma dinâmica, promo-vendo a interação entre as seções do biotério, os pesquisadores e as tesourarias das duas unidades em tempo real.

O sistema fornece plataforma padronizada de gerenciamento, que armazena dados referentes à produção e utilização de animais pelos usuários da FCF e do IQ. Visando transparência, padroni-zação de procedimentos e controle na utilização de animais, o sistema apresenta base de dados com acesso restrito para controle de atividades e assun-tos administrativos do Biotério, permitindo visua-lização precisa dos projetos em andamento e dados sobre número de animais solicitados, produzidos, fornecidos e hospedados na seção de experimenta-ção. Com a implantação da Lei 11.794/20081, foi introduzido no portal no ano de 2013 o controle de projetos aprovados pela CEUA (Comissão de Ética do Uso de Animais), em conformidade com as normativas do CONCEA2, para realização do controle interno do Biotério a fim de produzirmos e fornecermos animais de acordo com as caracte-rísticas de cada projeto. O biotério recebe uma via do protocolo aprovado pela CEUA da FCF e pela CEUA do IQ, esse é registrado no sistema com o objetivo de facilitar o controle de fornecimento dos animais com o número registrado no protocolo, além de possibilitar ao pesquisador a visualização (em tempo real) do número solicitado e do número fornecido. Esse procedimento foi implantado para facilitar o controle e gerenciamento interno no biotério para que não haja fornecimento de animais além da cota aprovada em cada projeto. Dessa forma, os pesquisadores possuem acesso livre e seguro aos dados concernentes aos seus projetos.

Novas ferramentas de gestão estão em processo de implantação para melhor aproveitamento do sistema como: controle de almoxarifado, controle

das colônias de fundação, controle das colônias de expansão, controle de acasalamento, nascimento e desmane de cada colônia.

2. mEtodoLogiA

O desenvolvimento do software do Biotério foi realizado por um programador orientado ao projeto com suas particularidades, e todas as ne-cessidades de controle, sendo cada etapa e módulo de desenvolvimento acompanhado pela equipe de gestão do biotério. Desta forma, o software foi direcionado às demandas e necessidades dos usuários do Biotério, não tendo vínculo ou base em softwares comerciais no setor. O sistema foi desenvolvido em linguagem ASP, utilizando o conceito de Desenvolvimento orientado a projetos, com base de dados estruturada seguindo fluxos e normas de funcionalidades exigidas para o bom gerenciamento do Biotério.

O software foi elaborado de forma a propiciar diferentes níveis de acesso ao sistema, possuindo acesso restrito através de senha específica para cada tipo de usuário do sistema, sendo definidos como: Pesquisadores, Funcionários do Biotério, Funcionários da Tesouraria e Administradores do Sistema.

O gerenciamento do Biotério foi dividido em partes ou seções determinadas pelos usuários e fluxos de trabalhos desenvolvidos, sendo:

a) Seção de Produção; Proporciona controle e gestão da produção de

animais;

b) Seção de Experimentação; Proporciona controle e gestão dos ensaios bio-

lógicos;

c) Pesquisadores e/ou Docente; Destina-se aos usuários e pesquisadores que uti-

lizam animais de laboratório, podendo efetuar a solicitação através de formulário que pode ser preenchido online. Através desse formulário o


SiStema web de gerenciamento do biotério da faculdade de ciênciaS farmacêuticaS e inStituto de química da uSP

usuário poderá fornecer todos os detalhes técni-cos necessários para a análise do Biotério. Após o preenchimento, o formulário é submetido para o Sistema de forma a encaminhar e-mail de con-firmação com o número do registro da Solicita-ção. Neste momento, a solicitação é direcionada para os especialistas do Biotério, mantendo um fluxo o qual é atualizado para o solicitante com as próximas ações. À partir desta solicitação, o acesso é restrito aos funcionários do biotério e contém as ferramentas de software necessárias para a gestão, sendo: produção, experimentação, relatórios gerenciais e fluxo da programação do Biotério;

d) Tesouraria. Proporciona controle e gestão de pagamentos

com permissão para emissão de relatórios de cada docente da unidade;

O conceito do sistema foi dimensionar uma base de dados para armazenar registros das seções do biotério, de forma a permitir acessos simul-tâneos para o perfil determinado no acesso, que poderão ser classificados em diferentes ambientes de navegação, sendo esses demonstrados abaixo. Descrevemos sua estrutura da seguinte forma:

1) Home page: consiste de uma área de acesso livre a toda comunidade interessada, onde o usuário poderá obter informações sobre assun-tos diversos da Área de Ciências de Animais de Laboratório (História, Animais: modelos produzidos, nutrição, taxonomia, biologia; Ex-perimentação; Biossegurança; Ética; Artigos; Links e fale conosco) , registrar a solicitação de animais e sala experimental por meio de um formulário padronizado e acessar gratuitamente o e-book “Manual de Cuidados e Procedi-mentos com Animais de Laboratório” que foi elaborado pela equipe do Biotério (Figura 1).

2) Acesso restrito: O Sistema possui uma área res trita com utilização de usuário e senha in-dividual para acesso aos formulários de regis-tros, emissão de relatórios e gráficos referentes

Figura 1: Pagina inicial do portal (www.usp.br/bioterio) com acesso livre às informações sobre assuntos diversos da Área de Ciências de Animais de Laboratório, Links, fale conosco, registro de solicitação de animais e sala experimental.

Figura 2: Formulário técnico de solicitação de animais. Permite ao usuário especificar sua solicitação online para envio ao Biotério.

à produção e à experimentação, apresentado em ambientes diferentes para cada usuário (Figura 2).



Definição dos perfis de acesso:a) Administradores: O perfil de administrador

permite ao usuário ter acesso ao banco de dados com as opções de consultar, registrar, editar e excluir dados no Sistema. O administrador é responsável por manter a integridade das in-formações, solicitações e relatórios, efetuando somente alterações que não comprometem a confiabilidade e informações inseridas pelos usuários no Sistema.

b) Funcionários: O perfil de funcionário pro-porciona acesso aos formulários de registro e consulta das seções definido pelos fluxos de trabalho, possibilitando inserir informações de acordo com cada área de atuação: Experimenta-ção, Produção e Administração. O funcionário será responsável em seguir os procedimentos de preenchimento de forma a manter a atualização de informações de cada seção do biotério.

Nas figuras 3 e 4 é possível visualizar o menu para registros da seção, divididos por categoria de atividades e o menu para acesso aos relatórios ge-renciais e individuais de todos os pesquisadores do IQ e FCF. O sistema gera gráficos personalizados de acordo com os filtros disponíveis. c) Pesquisador: permite o acesso aos próprios re-

latórios referentes ao fornecimento e utilização de animais com detalhes como: data de forne-

cimento, aluno, quantidade de gaiolas manti-das na experimentação, linhagem, quantidade de animais e valores. Cada pesquisador deve acompanhar seus relatórios, imprimir o extrato de débitos e efetuar o pagamento na tesouraria da unidade (Figuras 5 e 6). Poderá acompanhar o andamento de seus projetos aprovados pala CEUA com informações quanto ao número de animais aprovados e utilizados (Figura 7).

d) Tesouraria: O sistema permite senha específica para os funcionários da tesouraria com acesso aos relatórios referentes aos pesquisadores da unidade a que pertence, com permissão para registrar pagamentos efetuados por cada pes-quisador (Figuras 8 e 9).

3 RESuLtAdoS E diSCuSSão

Buscando estabelecer um programa de gestão do Biotério e levando em consideração o pouco investimento e conhecimento sobre o assunto na área de Ciências de Animais de Laboratório, houve a necessidade do desenvolvimento de um sistema de gerenciamento próprio, que pudesse realizar de maneira prática e transparente a interface entre as

Figura 3: Acesso restrito aos funcionários com utilização de usuário e senha.

Figura 4: Acesso aos relatórios de utilização de animais e sala experimental, emissão de relatórios e gráficos em tempo real.


SiStema web de gerenciamento do biotério da faculdade de ciênciaS farmacêuticaS e inStituto de química da uSP

Figura 5: Menu de acesso restrito ao pesquisador com utilização de usuário e senha.

Figura 6: Modelo de relatório gerado pelo sistema, com utilização de senha individual de pesquisador, apresentando detalhes da utilização de animais e sala experimental.

Figura 7: Modelo de relatório gerado pelo sistema, com utilização de senha individual de pesquisador, para acompanhamento dos projetos aprovados pela CEUA.

Figura 8: Acesso aos relatórios e ao menu de registro de pagamento pela tesouraria de cada unidade.

Figura 9: Emissão de relatório individual e registros de pagamento.

três seções do Biotério, otimizando o trabalho e garantindo a precisão no fornecimento e experi-mentação de animal.

O programa implantado no Biotério permite o gerenciamento de forma interativa, facilitando a dinâmica e desempenho de trabalho entre Seções (Administração vs Produção vs Experimentação) e gerencia os projetos desenvolvidos por pesqui-sadores das duas unidades envolvidas. O sistema permite a administração e emissão de relatórios em tempo real, além de emitir gráficos personalizados para controle interno das atividades desenvolvidas ou até mesmo para confecção de qualquer relatório solicitado.

O fato de ser uma ferramenta online permi-te que vários usuários possam registrar dados, consultar e emitir relatórios simultaneamente em qualquer computador ou dispositivo móvel que tenha acesso à internet.



ABSt

RACt

4 ConCLuSõES

Os resultados da implantação deste sistema no ano de 2010 proporcionaram, além do refinamento do gerenciamento, aprimoramento profissional,

confiabilidade, transparência e segurança nas informações prestadas aos usuários, disponibili-zando recursos avançados para a equipe de forma a obter resultados instantâneos na aplicação, além de possibilitar a implantação de outras ferramentas para controle de processos de gestão.

wEB-BASEd mAnAgEmEnt SyStEm of thE LABoRAtoRy AnimAL fACiLity of thE fACuLty of PhARmACEutiCAL SCiEnCES And inStitutE of ChEmiStRy of thE univERSity of São PAuLo

The Animal Unit of the Faculty of Pharmaceutical Sciences and Institute of Chemistry of the University of São Paulo is jointly managed by these two institutions. With the aim of assuring a better management of the procedures involving laboratory animals in terms of ethical and well-being aspects and taking into consideration the 3Rs (Replace, Reduce and Refine) Principles, the Animal Unit management format was improved. For that, a web-based management system was developed to promote interaction between sections and procedure reliability. The system was developed by a programmer in close collaboration with the Animal Unit management in order to comply with its specific requirements. The system was designed based on tools that allowed optimization of the activities and needs of our procedures. This management and control allow allocation of data of the Animal Unit and its researchers, improving procedures and work flow. We show in this study details on tolls of the system, its features and future applications. Each system´s module development was based on close interaction between the developer and sector specialists and this was key for the outcome. After the system implementation, the software is being constantly adapted to reflect daily activities, new requirements as well as to comply with the legislation on work with laboratory animals.

Keywords: Laboratory animal facility, managment, Web-based – Software

REfE

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iAS1. Lei No. 11.794, de 08 de

outubro de 2008. [citado 30 abr. 2015] Disponível em: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2007-2010/2008/Lei/L11794.htm.

2. Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação. Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). [citado 30 abr. 2015] Disponível em: http://www.mct.gov.br/index.php/content/view/310553.html.

3. Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio). Resolução Normativa n. 2, de 27 de novembro de 2006. [citado 30 abr. 2015]. Disponível em: http://www.ctnbio.gov.br/index.php/content/view/3913.html.

4. Russel WM, Burch RL. The principles of human experimental technique. London: UFAW; 1992. [citado 30 abr. 2015]. Disponível em http://altweb.jhsph.edu/publications/

humane exp/het-toc.htm.

5. Neves SMP. Histórico e Evolução do Biotério da FCF-Q/USP. In: e-book: Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratório do Biotério de Produção e Experimentação da FCF-IQ/USP. São Paulo, 2013. [citado 30 abr. 2015]. Disponível em: http://interactivepdf.uniflip.com/2/81637/296210/pub/index.html.


ISSN 2238-1589

1. Biotério-UT/CCBS - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS

2. CCBS - Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal, Campo Grande, MS

3. Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, SP, Iniciação Cientifica – UFMS – CNPq – Campo Grande, MS.

Autor para Correspondência: Maria Araújo Teixeira E-Mail: [email protected]


DEtERminAção DE PARâmEtRoS BioquímiCoS E hEmAtoLógiCoS Em CAmunDongoS (muS muSCuLuS) Do BiotéRio CEntRAL DA uFmS

Elisangela Tieko Matida1, Alessandro Eduardo Zancanaro1, Tamy Ingrid Restel1, Valeria Maria Wanderley Gomes2, Telma Bazzano1, Claudia Madalena Cabrera Mori3 e Maria Araújo Teixeira1

Este estudo teve como objetivo avaliar os perfis bioquímicos e hematológicos de camundongos Swiss Webster do Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Foram utilizados 18 animais de 180 dias de idade (10 machos e 8 fêmeas) e 16 de 60 dias (8 machos e 8 fêmeas), todos de padrão sanitário convencional monitorizado, dos quais se coletou sangue para a realização de provas bioquímicas e hematológicas. Os parâmetros hematológicos analisados foram: contagem de hemá-cias, hemoglobina, volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular média, con-centração de hemoglobina corpuscular média, contagem de plaquetas, contagem total de leucócitos e diferencial de células. Os parâmetros bioquímicos foram: proteína total, albumina, fosfatase alcalina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase. A maioria dos valores obtidos situou-se dentro da faixa de variação normal para a espécie. A importância de determinar valores de referência para exames laboratoriais de cada colônia animal deve ser considerada, pois os resultados podem ser influenciados por sexo, linhagem, genótipo, idade, dieta, manuseio e ambiente, entre outros fatores.

Palavras-chave: Camundongos Swiss Webster, hematologia, bioquímica.

1. intRoDução

O aprimoramento das técnicas de investigação necessárias para responder perguntas cada vez mais complexas, levou ao conceito de padroniza-ção de animais de laboratório associada à criação e a manutenção de modelos animais controlados sob o ponto de vista genético, sanitário e ambiente, além de atender os aspectos éticos da experimen-tação animal.

Tal colocação deve ser considerada, pois mo-dernamente, entende-se o animal de laboratório como um reagente biológico. Sendo assim, de pouco adiantaria um excelente estado sanitário na

vigência de condições que implicassem em outras alterações fisiológicas que impedissem a correta interpretação dos resultados.

Dessa forma, torna-se relevante, dentre outros, os traçados dos perfis bioquímico e hematológico, uma vez que os valores de referência determina-dos para provas bioquímicas e constituintes do hemograma, como discutido na literatura, podem não representar precisamente aqueles de certa população ou espécie animal e, por esta razão, devem ser interpretados cuidadosamente1,2, uma vez que existe uma ampla faixa de variação fi-siológica para tais avaliações. Além deste fato, é importante considerar-se que essas determinações estão sujeitas à influência das condições ambien-

ARTIGO ORIGInAl

RESumo


Elisangela Tieko Matida, Alessandro Eduardo Zancanaro, Tamy Ingrid Restel, Valeria Maria Wanderley Gomes, Telma Bazzano, Claudia Madalena Cabrera Mori e Maria Araújo Teixeira

tais3, sexo3, idade3,4, local de coleta4, procedência, sistema de criação, dieta e linhagem3, entre outras, que podem intervir nos resultados5,10 obtidos nestas provas.

A importância de determinar os valores dos pa-râmetros fisiológicos dos animais e suas possíveis variações torna-se evidente quando se observa que camundongos têm, por exemplo, uma taxa muito alta de linfócitos11,12 comparada aos valores em humanos13. Vale ressaltar ainda que camundongos apresentam proteinúria em condições normais12 e polimorfismo das proteínas séricas14,15, desta forma, estudos realizados com esses animais pre-cisam considerar tais condições.

Assim sendo, o recomendado para a adequada interpretação dessas análises seria que, para cada biotério, fossem estabelecidos os próprios valores de referência de avaliações laboratoriais.

O presente trabalho teve como objetivo esta-belecer os valores de referência de parâmetros bioquímicos e hematológicos de camundongos Swiss Webster do Biotério Central da Universi-dade Federal Mato Grosso do Sul.

2. mAtERiAiS E métoDoS

Animais: Para a realização do experimento foram utilizados 16 camundongos Swiss Webster, sendo 8 machos e 8 fêmeas jovens (60 dias de idade) e 18 adultos (180 dias de idade), 10 machos e 8 fêmeas de padrão sanitário convencional16, com barreiras sanitárias de pouca segurança, provenientes do Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Aos animais foram fornecidos: fotoperiodos de 12 horas de claro e 12 horas de escuro; alojamento em gaiolas plásticas de acordo com recomendações internacionais de densidade populacional17; ração comercial Nuvi-lab CR-1® (Nuvital Curitiba, PR); água ad libitum, cama de maravalha de Pinnus sp peneirada e as condições de climatização existente neste Biotério, ou seja, ar condicionado de parede e ventilação natural efetuada pelas janelas permanentemente

abertas e teladas para impedir a entrada de insetos e animais indesejáveis.

Os animais, após jejum de quatro horas, foram levados ao laboratório, pesados e anestesiados por via intraperitoneal com solução de pentobarbital sódico a 5%, na dose de 25mg/kg. Em seguida foi realizada punção cardíaca e coletado sangue para as dosagens bioquímicas e para os exames hematológicos.

A alteração da técnica de coleta de sangue por punção da artéria aorta abdominal 10,18, para as dosagens bioquímicas e os exames hematológi-cos, pela técnica acima descrita, fez-se necessário devido à relação peso corpóreo/volume de sangue do camundongo2, bem como, pela facilidade de coleta. Após este procedimento os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia.

Para os exames bioquímicos foram coletados dos camundongos cerca de 0,5 ml de sangue, sem anticoagulante para obtenção do soro, e foram re-alizadas dosagens bioquímicas de proteínas totais, albumina sérica, alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), utilizando kits LABTEST. A leitura espectrofotométrica foi reali-zada em sistema de fluxo contínuo em analisador de bioquímica semiautomático modelo MICRO-LAB 100, no laboratório de Análises Clínica da Empresa Matter Clínica e Diagnósticos.

Para os exames hematológicos foram coletados 0,5ml de sangue com anticoagulante EDTA K3 onde foram realizadas: a contagem manual na câ-mara de Neubauer das hemácias, dos leucócitos e das plaquetas, a determinação do microhematócrito (Hct) pela centrifugação do sangue em tubos capi-lares de vidro a dosagem de hemoglobina (Hb) no espectrofotômetro e esfregaços sanguíneos, fixados e corados pelo método de Rosenfeld, para contagem diferencial de células. Os índices hematimétricos: o volume corpuscular médio (VCM), a hemoglo-bina corpuscular média (HCM), a concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram calculados. Tais procedimentos foram realizados no laboratório de controle sanitário do Biotério. Os procedimentos desse protocolo foram realizados sob licença número 21/2002 da Comissão de Ética para o Uso de Animais (CEUA/UFMS).


Determinação De parâmetros bioquímicos e hematológicos em camunDongos (mus musculus) Do biotério central Da uFms

3 RESuLtADoS E DiSCuSSão

De acordo com a recomendação da Interna-tional Federation of Clinical Chemistry (IFCC) a amostra adequada para estabelecer o perfil de referrência para o Bioterio seria acima de 120 animais saudavéis de ambos os sexos, idade e linhagem.

Os parâmetros determinados nesse trabalho são apenas uma caracterização preliminar dos camundongos Swiss Webster mantidos em colônia de padrão sanitário convencional no Biotério da UFMS,

Os valores apresentados nas Tabelas 1, 2 e 3 referem-se respectivamente, aos elementos cons-tituintes do hemograma, à contagem diferencial de células, e aos parâmetros bioquímicos de ca-

mundongos Swiss Webster machos e fêmeas de 60 e 180 dias de idade.

Devido à relação peso corpóreo/volume de sangue de camundongo obteve-se quantidade de soro insuficiente para realização dos parâmetros bioquímicos em todas as amostras, desse modo alguns parâmetros estão representados por número muito pequeno.

Uma comparação exata dos resultados obtidos no presente trabalho com os resultados de outros autores não é possível, devido à falta de referências precisas das linhagens, sexo, idade, entre outras, dos animais usados para obtenção dos dados des-critos na literatura. Fernandez e cols4 avaliando duas técnicas de coleta de sangue, plexo retro orbital e veia submandibular em camundongos C57BL/6J, observou diferenças significativas em oito dos 9 parâmetros bioquímicos analisados.

Tabela 1 – Valores (média ± desvio-padrão) hematológicos obtidos em camundongos machos e fêmeas de 60 e 180 dias do Biotério Central/UFMS mantidos em sistema de criação convencional.

Diferencialhematológico

CamundongosMachos Fêmeas

60 dias 180dias 60 dias 180 dias

Hemácias (x106/mm3) 5,16±0,72n=8

7,10±1,75n=9

8,06±0,60n=7

7,69±1,55n=8

Hemoglobina (g/dl) 12,28±2,64n=8

14,48±1,38n=10

15,78±1,00n=7

13,48±2,29n=8

Hematócrito (%) 44±2,83n=8

40,09±3,78n=10

45,71±2,56n=7

40,87±4,52n=8

VCM (fl) 86,39±10,65n=8

63,31±24,17n=9

56,78±2,31n=7

54,95±10,46n=8

HCM (pg) 24,06±5,51n=8

22,38±8,65n=9

19,62±1,41n=7

17,85±2,78n=8

CHCM (g/dl) 27,90±5,41n=8

35,82±2,35n=10

34,53±1,56n=7

31,82±5,86n=8

Plaquetas (x106/mm3) 298,75±47,64n=8

593,70±222,68n=10

394,28±101,30n=7

510,86±108,15n=7

VCM - Volume Corpuscular Médio;HCM - Hemoglobina Corpuscular Média;CHCM - Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média.



Tabela 2 – Valores (média + desvio-padrão) da contagem diferencial de células obtidos por leitura de lâminas de camundongos machos e fêmeas de 60 e 180 dias do Biotério Central/UFMS mantidos em sistema de criação convencional.

Diferencial de células

CamundongosMachos Fêmeas

60 dias 180dias 60 dias 180 diasLeucócitos(x 103/ mm3)

2,74±0,92n=8

2,28±1,06n=9

2.50±0.81n=7

2,99±3,30n=8

Linfócitos (%) 77,37±5,07n=8

74,14±6,72n=7

78,43±3,73n=7

76,50±6,41n=6

Neutrófilos (%) 19,12±4,52n=8

18,71±5,59n=7

16,71±4,88n=7

19,33±5,61n=6

Monócitos (%) 1,75±1,03n=8

2,43±1,62n=7

3,43±2,07n=7

2,5±1,05n=6

LEosinófilos (%) 0,87±0,64n=8

4,71±3,04n=7

1,43±0,78n=7

1,66±1,03n=6

Tabela 3 – Valores (média ± desvio - padrão) das provas bioquímicas obtidas em camundongos machos e fêmeas de 60 e180 dias do Biotério Central/UFMS mantidos em sistema de criação convencional.

Provas BioquímicasCamundongos

Machos Fêmeas60 dias 180dias 60 dias 180 dias

Proteínas Totais (g/dl) 5,00±0,17 n=3

4,13±0,27 n=9

5,67±0,46 n=3

4,17±0,15 n=8

Albumina Sérica (g/dl) 2,62±0,27 n=3

2,38±0,11 n=9

2,60±0,04 n=2

2,53±0,14 n=8

ALT (U/l) 33,50±4,09n=6

23,09±5,03 n=10

31,17±5,57n=6

38,37±18,01 n=8

AST (U/l) 87,75±37,28n=4

88,73±35,97 n=10

79,00±17,35n=3

128,75±69,94 n=8

Fosfatase Alcalina (U/I)

282,37±103,68n=8

271,40±91,16n=5

231,33±133,90n=6

321,00±120,62n=6

Uréia (mg/dl) 85,00n=1

52,44±22,46n=5

43,00±7,07n=2

39,90±12,66n=5

Creatinina (mg/dl) 0,38n=1

0,42±0,07n=2

0,52±0,22n=2

ALT - Alanina aminotransferase;AST - Aspartato aminotransferase.


Determinação De parâmetros bioquímicos e hematológicos em camunDongos (mus musculus) Do biotério central Da uFms

Como relatado na introdução, os parâmetros de referência determinados para os constituintes do hemograma e para as provas bioquímicas podem não representar precisamente aqueles de certa po-pulação ou espécie animal e, por esta razão devem ser interpretados cuidadosamente1,2, uma vez que existe uma ampla faixa de variação fisiológica para tais avaliações.

Embora tenham sido constatadas diferenças entre alguns autores, o confronto comparativo da maioria desses resultados com aqueles descritos na literatura indica que os parâmetros fisiológicos encontrados neste trabalho estão dentro da faixa de variação normal para a espécie 1,2,7,19.

Os linfócitos foram às células predominantes na circulação periférica, cerca de 76% para todos os grupos, os quais também estão em concordância com a literatura 2,19.

Na presente investigação o valor de volume corpuscular médio encontrado para machos de 60 e 180 dias, apresentou-se um pouco acima do descrito por Sanderson e Phiips19.

Menendez20 relata que camundongos podem apresentar variações dos parâmetros fisiológicos, relacionados com sexo, linhagem, genótipo idade, dieta, manuseio, ambiente, entre outros fatores, apesar de apresentarem mecanismos próprios de controle dos mesmos. Yoshida e cols.21 trabalhan-do com camundongos da linhagem Swiss Webster Webster com 60 dias encontrou valores maiores de leucócitos do que nos camundongos de 60 dias

do presente trabalho. Estes resultados diferentes podem ser explicados uma vez que no trabalho de Yoshida e cols.21, a coleta foi realizada em local diferente ou seja por punção retro-orbital e a dieta alimentar não foi especificada. Sendo assim, tais parâmetros dos animais experimentais podem variar de acordo com as condições a que estão submetidos nos diferentes locais de criação.

4 ConCLuSõES

Os parâmetros determinados nesse trabalho são referencia de perfis bioquimicos e hematologicos de camundongos Swiss Webster Webster, machos e fêmeas de 60 e 180 dias de idade, mantidos em colônia de padrão sanitário convencional no Bio-tério da UFMS, que poderão ser úteis aos usuários que utilizam estes animais com os mais diversos objetivos experimentais.

De acordo com os dados obtidos nesse estudo e os descritos na literatura, sugerimos que o re-comendado para a adequada interpretação dessas análises seria que, para cada biotério, fossem estabelecidos os próprios valores de referência de avaliações laboratoriais, devido a ampla faixa de variação e dos parâmetros fisiológicos que podem ser alterados em função das condições em que os animais estão submetidos o que poderia inviabi-lizar resultados experimentais.

BioChEmiCAL AnD hEmAtoLogiCAL PARAmEtERS in miCE (muS muSCuLuS) FRom thE uFmS CEntRAL LABoRAtoRy

AnimAL FACiLitiES

This study evaluated the biochemical and hematological profiles of Swiss Webster mice reared at the Central Laboratory Animal Facilities of the Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Blood samples were drawn from 18 animals (10 males, 8



ABSt

RACt

females) aged 180 days and 16 animals (8 males, 8 females) aged 60 days, all of them of monitored conventional sanitary status. The hematological variables inves-tigated were RBC count, hemoglobin, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, platelet count, and total and differential WBC counts. The biochemical variables were total protein, albumin, alkaline phosphatase, urea, creatinine, alanine aminotransferase, and aspartate aminotransferase. Most results lay within the normal range for the species. Bioche-mical and hematological reference values for each colony are important because the results of exams can influenced by sex, strain, genotype, age, diet, handling, and environment, among other factors.

Keywords: Swiss Webster mice, hematology, biochemistry.

1. Bihun C. Basic anatomy, physioology, husbandry, and clinical techniques. In: Hillyer EV, Quesenberry KE. Ferrets, rabbits, and rodents: clinical medicine and surgery. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1997. p.295-306.

2. Hrapkiewicz k, Medina L, Holmes DD. Clinical laboratory animal medicine an introduction. 2nd ed. Ames: Iowa State University Press; 1998. 277p.

3. Spinelli MO, Cruz RJ, Godoy CMS, Motta MC. Comparação dos parâmetros bioquímicos de camundongos criados em diferentes condições sanitárias. Scientia Plena [periódico na internet]. 2012 Jan [acesso em 2014 Mai 9]; 8(1): Disponível em: http://www.scientia plena.org.br

4. Fernández I, Peña A, Del Teso N, Pérez V, Rodrígues-Cuesta J. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. J. Am. Assoc. Anim. Sci. 2010; 49(2): 202-6.

5. Ringler DH, Dabich L. Hematology and clinical biochemistry. In: Baker HJ, Lindsey JR, Weisbroth SH. The laboratory rat. New York: Academic Press; 1979. p.105-18.

6. Birgel EH Jr., Benesi FJ, Birgel EH. Estudo das variações do quadro hemático de ratos (Rattus norvegicus). 41ª Conferência Anual da Sociedade Paulista de Medicina

Veterinária; 5-9 mai. 1986; São Paulo, BR. São Paulo: Sociedade Paulista de Medicina Veterinária; Resumo.

7. Loeb WF. Clinical biochesmistry of laboratory rodents and rabbits. In: Kaneko JJ. Clinical biochemistry of domestic animals. 4th ed. London: Academic Press; 1989. p.866-75.

8. CCAC – Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. 2nd ed. Ottawa; 1993; 1:37–48.

9. Teixeira MA, Sinhorini IL, Souza NL, Merusse JLB. Microenvironmental ventilation system for laboratory animals facilities with air distribution by means of plennum chambers. Anim Technol. 1999; 50(3):187-94.

10. Teixeira MA, Chaguri LCAA, Carissimi AS, Souza NL, Mori CMC, Gomes VMW, e cols. Hematological and biochemical profiles of rats (Rattus norvegicus) kept under microenvironmental ventilation system. Braz J Vet Res Anim Sci. 2000; 37(5).

11. Heinecke H. Das blutbild der maus (eine übersicht) in das normale qualitative blutbild. Z. Versuchstierk. 1961; 1: 16-37.

12. Thung PJ. Physiological proteinuria in mice. Acta Physiol. Pharmacol. Neer. 1962; 10: 248-261.

13. Schroeder SA, Tierney Junior LM, Mcphee SJ, Papadakis MA, Krupp MA, editors. Current medical diagnosis and treatment. 31st ed.

Norwalk: Appleton & Lange; 1992. 95-108.

14. Cinader B, Dubinski S. An alphaglobulin allotype in the mouse. Nature. 1963; 200: 781.

15. Wunderlich JR, Herzenberg LA. A second gamma-globulin isoantigen (allotype). Genetics. 1962 Mai; 47: 995.

16. Lushbough CH, Moline SW. Improved terminal bleeding method. In: Loeb WF, Quimby FW, editors. The clinical chemistry of laboratory animals. Oxford: Pergamon Press; 1999. p.3-32.

17. ILAR- Guide for the care and use of laboratory animals. Institute of laboratory animal resources. National Research Council; 1996.125 p.

18. ILAR NEWS. Long-term holding of laboratory rodents. 1976; 19(4): L7.

19. Sanderson JH, Philips CE. An atlas of laboratory animal hematology. New York: Oxford University Press; 1981. 473p.

20. Menendez RC. Animales de laboratorio en las investigaciones biomedicas. La Habana : Editorial Ciencias medicas; 1985. 205p.

21. Yoshida HS, Spinelli MO, Guedes R, Cruz RJ, Damy SB, Takano JO e cols. Valores hematológicos e bioquímicos em linhagens de camundongos isogênicas. A/SNELL,BALB/c,C57BL/6 e heterogênica . R. Bras. Med. Vet. 2000; 22 (3): 122-124.

REFE

RênC

iAS


ISSN 2238-1589

AvALiAção CLíniCA, moRfométRiCA E hEmAtoLógiCA dE mACACoS CynomoLguS (mACACA fASCiCuLARiS) CAtivoS

Lynn Barwick Cysne1, Márcia Cristina Ribeiro Andrade1, Miguel Ângelo Brück Gonçalves2, Cláudia Andréa de Araújo Lopes1, Simone Ramos3, Graziela Maria Zanini4 e Pedro Hernán Cabello5,6

A caracterização de parâmetros biológicos é imprescindível para avaliar as condições sanitárias de uma criação animal, principalmente quando se trata de colônias fecha-das, como a do referido estudo. Assim, com o intuito de avaliar os dados fisiológicos de primatas cativos mantidos neste sistema de criação, o trabalho aqui exposto avaliou dados biométricos, semiológicos e hematológicos de um total de 72 macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis) no período de dois anos consecutivos, visando garantir as características originais intrínseca da espécie. Os dados provenientes da biometria, avaliação semiológica e hematológica foram comparadas entre sexos e faixas etárias. Os animais adultos se tornaram de estatura menos longelínea ao longo dos anos em cativeiro e as fêmeas adultas se mostram consideravelmente menores e mais leves que os machos adultos. As caudas dos machos foram signi-ficativamente maiores nos machos adultos. A média da temperatura foi de 38.5ºC. A frequência cardíaca manteve-se homogênea nas três faixas etárias de ambos os sexos e não apresentou variação entre as faixas etárias como observado na frequ-ência respiratória (FR), fato que pode ter sido em decorrência da contenção física e da anestesia com cloridrato de cetamina. A FR foi significativamente mais elevada em animais juvenis. Com exceção da eosinofilia, presente nos adultos, todos os resultados hematológicos estiveram dentro dos parâmetros de normalidade. Estes dados indicam que a condição de cativeiro da colônia “fechada” sob estudo, bem como o manejo adotado não produz resultados anômalos ou insatisfatórios sobre os parâmetros clínicos e biométricos analisados.

Palavras-chave: Macaca fascicularis. Parâmetros fisiológicos. Biometria. Hematologia.

1. Serviço de Criação de Primatas não Humanos, Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL/FICRUZ) – Rio de Janeiro;

2. Centro de Experimentação Animal do Instituto Oswaldo Cruz (CEA/IOC) – Rio de Janeiro;

3. Serviço de Controle da Qualidade Animal (CECAL/FIOCRUZ) – Rio de Janeiro;

4. Laboratório de Parasitologia, Instituto Nacional de Infectologia (INI/FIOCRUZ) – Rio de Janeiro;

5. Laboratório de Genética Humana (IOC/FIOCRUZ) – Rio de Janeiro;

6. Laboratório de Genética da UNIGRANRIO – Rio de Janeiro.

Autor Para Correspondência: Lynn Barwick Cysne E-Mail: [email protected]


1. intRodução

Como animais de laboratório, os primatas são prioritários no campo da experimentação, não existindo dúvidas quanto ao seu valor nas pesqui-sas científicas, no ensino, na produção e no con-trole da qualidade de imunobiológicos, fármacos e de outros produtos correlatos1.

Os macacos Cynomolgus (Macaca fascicula-ris, família Cercopithecidae) são considerados

excelentes animais de laboratório, capazes de simular de forma satisfatória, o curso de diversas doenças. Atualmente a colônia de Cynomolgus da Fundação Oswaldo Cruz/Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil, tem seus exemplares destinados a pesquisas principalmente na área de doenças infecciosas, com ênfase em tuberculose e hepatite. Também são os modelos de primatas mais comumente utilizados na hematologia experimental, com sig-nificativa contribuição nos avanços terapêuticos. Conseqüentemente deve-se ao uso desses modelos

ARTIGO ORIGInAL

RESumo


Lynn Barwick Cysne, Márcia Cristina Ribeiro Andrade, Miguel Ângelo Brück Gonçalves, Cláudia Andréa de Araújo Lopes, Simone Ramos, Graziela Maria Zanini, Pedro Hernán Cabello

na pesquisa à segurança e o benefício clínico dos novos protocolos biomédicos2.

O estabelecimento de uma criação animal sau-dável representa o prelúdio imprescindível para o sucesso da experimentação animal e para a preven-ção de doenças. Os animais devem manter-se em condições que favoreçam seu crescimento natural, seu desenvolvimento e bem-estar3. Quando se trata de primatas não humanos (PNH) mantidos em cativeiro para fins de pesquisa, a negligência do monitoramento sanitário pode acarretar danos irreparáveis na produção e interferir nos resultados experimentais. Uma investigação clínica detalhada dos animais de todo o plantel, com determinação de parâmetros biométricos, fisiológicos e hema-tológicos auxilia consideravelmente no acompa-nhamento clínico-sanitário da colônia.

Desta forma, foi feita uma investigação clínica detalhada dos animais oriundos de uma colônia fechada, determinando parâmetros clínico-labo-ratoriais quali/quantitativos.

Com o intuito de verificar se o manejo adotado produz resultados anômalos ou insatisfatórios sobre os parâmetros clínicos e biométricos anali-sados, foi estudada a possibilidade de existência de correlação entre os sexos e as faixas etárias com os parâmetros avaliados. De posse dos re-sultados hematológicos que mostraram alterações de origem possivelmente infecciosa, a produção de macacos Cynomolgus sanitariamente definidos para pesquisa foi otimizada.

Os valores de normalidade hematológicos e bioquímicos vêm sendo estipulados para maca-cos Cynomolgus desde 1971, época em que esses animais começaram a ser utilizados em pesquisa biomédica, principalmente em substituição aos macacos rhesus4-15. Alguns índices hematológicos de macacos rhesus e Cynomolgus podem sofrer alteração em função da idade e sexo14,15. Com base nesses dados buscamos distribuir os resulta-dos hematológicos obtidos de acordo com sexo e faixa etária, o que pode auxiliar na interpretação dos resultados laboratoriais e no exercício de uma atividade clínica mais individualizada, além de contribuir para fins comparativos nas criações de macacos Cynomolgus.

2. mAtERiAiS E métodoS

Animais: A população de 72 macacos Cy-nomolgus estudada foi oriunda do Serviço de Criação de Primatas Não Humanos (SCPrim) do Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) da Fundação Oswaldo Cruz (FIO-CRUZ). O estudo foi realizado no decorrer de dois anos consecutivos (2005 e 2006), durante o manejo médico anual.

A criação foi iniciada em 1987 com a impor-tação desta espécie das Filipinas. A partir daí não houve introdução de novos exemplares nesta colônia. A manutenção dessa colônia encontra-se em conformidade com os protocolos de proce-dimentos para licenciamento junto à Comissão de Ética no Uso de Animais da Fiocruz (sob o número de licença LW-24/09) e de acordo com a legislação brasileira, com registro no IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis) sob o protocolo de número 77933.

Foram analisados todos os espécimes do plantel, de ambos os sexos e três faixas etárias: 13 juvenis machos e 6 juvenis fêmeas (12 a 36 meses), 5 sub-adultos machos e 12 sub-adultas fêmeas (36 a 60 meses) e 17 adultos machos e 19 adultas fêmeas (acima de 60 meses).

Os animais eram mantidos, na sua maioria, em recintos coletivos (9.40 m2), em um sistema de acasalamento poligâmico. Apenas 14 indivíduos estavam sendo mantidos em gaiolas individuais (0.42 m2). A distribuição de espaço está de acor-do, com a recomendação para PNH com peso até 10kg, descrita no Manual sobre Cuidados e Usos de Animais de Laboratório16.

Colheita das amostras biológicas: Cada animal de gaiola coletiva foi capturado com auxílio de puçá para que pudesse então, ser contido farma-cologicamente com cloridrato de cetamina (10mg/kg) por via intramuscular, para análises clínicas e biométricas. Os animais de gaiolas individuais foram contidos fisicamente com uso do dispositivo squeeze back para posterior contenção farmacoló-gica mencionada anteriormente.


AvAliAção clínicA, morfométricA e hemAtológicA de mAcAcos cynomolgus (mAcAcA fAsciculAris) cAtivos

Amostras sanguíneas foram colhidas em única punção venosa, de 2 a 5 mL de sangue por indiví-duo, obedecendo ao volume previamente preco-nizado17, foram colhidas pela veia femoral para hemograma completo, pesquisa de fibrinogênio, bioquímica do sangue para dosagem de eletrólitos cloro (Cl-), sódio (Na+) e potássio (K+), amilase e lipase, proteínas totais e frações. Esfregaços san-güíneos foram feitos para leitura da leucometria específica em microscópio óptico.

Avaliação semiológica e morfométrica: Para a obtenção dos dados biométricos, os animais foram pesados em uma balança digital e foi feita a mensuração corporal com fita métrica (perímetro torácico, comprimento do corpo em conjunto com a cabeça - medida compreendida entre a tubero-sidade occipital e o final do osso sacro – e com-primento da cauda)5. A avaliação clínica incluiu a determinação das freqüências respiratória e cardí-aca/minuto e aferição de temperatura corpórea18.

Análise laboratorial: Foi utilizada a automa-ção para a realização de hemograma, bioquímica de amilase, lipase, fibrinogênio, proteína total e frações e eletrólitos (Na+, Cl-, K+). A análise de bioquímica seca foi feita pelo sistema Vitros 750XRC da Jhonson & Jhonson, enquanto que o hemograma foi realizado fazendo uso do aparelho ABC vet da ABX Diagnostic™.

Os exames laboratoriais foram realizados no Serviço de Controle da Qualidade Animal / SCQA do CECAL/FIOCRUZ e Serviço de Hematologia do Departamento de Patologia Clínica do Instituto Nacional de Infectologia / INI-Fiocruz.

Análise estatística: Para avaliação das variáveis quantitativas, foi feita inicialmente uma análise descritiva através do cálculo das médias, desvios padrões e intervalos de confiança. Para a com-paração entre grupos foram empregados o teste t-Student e a ANOVA. Associações e correlações entre variáveis puderam ser feitas através da análi-se de regressão linear simples ou múltipla. Quando as variáveis não apresentaram distribuição normal, os testes alternativos utilizados foram os testes não paramétricos Mann Whitney, Kruskal-Wallis e correlação Spearman. A análise dos dados qua-litativos foi realizada basicamente fazendo uso do

teste de Qui-quadrado. Em todos os casos, o nível de significância utilizado foi p ≤ 0.05.

3 RESuLtAdoS

A análise de variância feita sobre as medidas corporais aferidas durante a avaliação biométrica nas três faixas etárias, tanto para machos, quanto para fêmeas (p< 0.01 em ambos os casos). As fê-meas adultas foram consideravelmente menores (corpo-cabeça: t = 5.673 e p < 0.001 perímetro torácico: t = 2.407 e p = 0.027 cauda: t = -5.943 e p < 0.001) e mais leves (t = 3.201 e p < 0.005) que os machos adultos. As caudas dos machos foram significantemente maiores na categoria adulta (t = 6.018 e p < 0.001) (Tabela 1).

A média da temperatura, FC e FR estão descri-tas na tabela 2. O teste SNK, feito após a ANOVA, mostrou diferenças significativas da FR nas três categorias etárias, tanto para machos quanto para fêmeas, com p< 0.01 e p<0.05, respectivamente.

Os valores hematológicos e bioquímicos tam-bém foram definidos de acordo com sexo e faixas etárias (Tabelas 3, 4 e 5). A ANOVA e o teste SNK, para alguns dados hematológicos, tais como: he-matócrito, hemoglobina e globulina para fêmeas, e VGM e linfócitos para machos, foi significativa (p<0.05) entre as três categorias etárias.

A análise dos dados pelo Qui-quadrado de Pearson revelou uma correlação significativa (p≤0.05) entre a categoria etária adulta de ambos os sexos com o achado hematológico de leuco-citose e eosinofilia. A mesma análise estatística mostrou uma correlação significativa (p≤0.05) entre os achados hematológicos alterados com a presença de diarreia em animais de ambos os sexos dessa categoria etária.

Em função da alta prevalência dos enteroproto-zoários Entamoeba sp.e Balantidium sp. isolados ou em associação, neste momento encontrados, tam-bém foi investigada a possibilidade de correlação entre a presença de diarreia com esses protozoários nas três faixas etárias. O teste Qui-quadrado de Pearson não identificou correlação significativa.



4 diSCuSSão

Nesse estudo, as fêmeas adultas foram conside-ravelmente menores e mais leves que os machos adultos, o que é totalmente natural e esperado no caso de animais saudáveis. Em estudos prévios, foi possível observar que o cativeiro proporcionou

uma pequena diminuição da estatura de animais adultos (mensuração corpo/cabeça de machos adultos 43.50cm ± 5.35cm e fêmeas adultas 39cm ± 2.14cm)5, mas não houve alteração do peso na mesma categoria etária em cativeiro (peso dos machos adultos 6.41 kg ± 1.73 kg e das fêmeas adultas 4.49 kg ± 1.05 kg)5 e em vida livre (peso dos machos 7.47 ± 1.20 kg e das fêmeas 4.36 ±0.69

Tabela 1: Parâmetros biométricos de macacos Cynomolgus do CECAL/FIOCRUZ

ParâmetroJuvenis Sub-adultos Adultos

Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeasn X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP

Peso (Kg) 13 1,91±0,49 6 1,75

±0,26 5 3,67±1,11 12 2,89

±0,45 17 5,88±2,08 19 4,10

±0,99Corpo-cabeça (cm) 13 26,53

±3,43 6 25,33±1,25 5 35,00

±2,93 12 32,25±2,66 17 37,97

±2,56 19 33,81±1,68

Perímetro Torácico (cm) 13 23,50

±2,92 6 22,41±2,06 5 29,60

±2,60 12 27,04±2,43 17 35,14

±6,72 19 30,81±3,31

Cauda (cm) 13 46,26±4,22 6 46,50

±5,05 5 47,40±12,74 12 51,79

±3,48 17 59,97±4,30 19 53,57

±2,96

n: número de animais; juvenis:12-36 meses; sub-adultos: 36-60 meses; adultos: > 60 meses; corpo-cabeça: medida entre a tuberosidade occipital e o final do osso sacro; perímetro torácica: circunferência torácica medida na região do mamilo; cauda: medida entre a base do sacro e a última vértebra caudal.

Tabela 2: Parâmetros fisiológicos de macacos Cynomolgus do CECAL/FIOCRUZ

ParâmetroJuvenis Sub-adultos Adultos

Machos Fêmeas Machos Fêmeas Machos Fêmeasn X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP

ºC1 13 38,2±0,8 6 38,1

±0,6 5 38,7±0,6 12 38,7

±0,8 17 39,1±0,8 19 38,5

±0,8FC2

BPM3 13 206,9±52,6 6 193,3

±23,8 5 196,8±42,2 12 168,2

±32,8 17 179,8±38,6 19 186,8

±28,7 FR4

MPM5 13 56,9±12,8 6 52,7

±21,9 5 45,6±6,1 12 46,3

±13,6 17 35,1±10,5 19 36,4

±11,6

n: número de animais; 1TºC: temperatura corporal; 2FC: frequência cardíaca; 3BPM: batimentos por minuto; 4FC: frequência cardíaca; 5MPM: movimento por minuto; juvenis:12-36 meses; sub-adultos: 36-60 meses; adultos: >60 meses.



Tabela 3: Valores hematológicos (série vermelha) encontrados em macacos Cynomolgus do CECAL/FIOCRUZ

ParâmetroFêmeas Machos

Juvenis Sub-adultas Adultas Juvenis Sub-adultos Adultosn X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP

H (x106µL) 6 6.69±0.85 12 6.07

±0.40 19 6.12±0.58 13 6.35

±0.52 5 6.61±0.67 17 6.32

±0.44

Ht (%) 6 41.25±5.26 12 36.44

±2.88 19 38.05±3.51 13 37.6

±3.27 5 38.96±3.07 17 40.62

±4.04

Hb (g/dL) 6 12.41±1.56 12 10.80

±0.93 19 11.36±1.01 13 11.30

±1.23 5 11.96±1.06 17 12.11

±1.27

VGM (fl) 6 61.66±3.20 12 60.08

±3.05 19 62.05±1.84 13 59.30

±2.17 5 59.20±3.03 17 64.11

±3.46

CHGM (g/dL) 6 30.11±0.38 12 29.65

±0.96 19 29.88±0.93 13 29.98

±0.99 5 30.66±1.10 17 29.81

±0.81

n: número de animais; juvenis:12 a 36 meses; sub-adultos: 36 a 60 meses; adultos: acima de 60 meses; H: hemácias; Ht: hematócrito; Hb: hemoglobina; VGM: volume globular médio; CHGM: concentração de hemoglobina globular média.

kg)10. Fêmeas foram significantemente menores do que machos adultos em todas as outras men-surações. A população máxima de indivíduos por gaiola coletiva em 2006 era de 14 animais por gaiola (9.40 m2) enquanto em 2000, os grupos sociais de cynomolgus, mais populosos, possuí-am até 27 animais por gaiola (70 m2), porém em ambos estavam de acordo com a distribuição de espaço, recomendado para PNH com peso até 10kg16. Após a transferência e o reagrupamento dos animais de gaiolas medindo 70 m2 para gaiolas medindo 9.40 m2 que ocorreu em 2001, o espaço sobressalente nas gaiolas diminuiu. É possível que apesar dos animais terem apresentado uma curva de crescimento satisfatória, a redução de espaço mencionada tenha implicado na redução de sua estatura. O resultado final é um animal adulto com peso aceitável, embora com aparência menos longilínea. Outra hipótese seria de estar ocorrendo uma seleção natural, não proposital, para animais de porte menor.

A mensuração das caudas das fêmeas adultas da Fiocruz se manteve próxima às mensurações descritas em estudos de vida livre realizados no

Vietnã, entretanto as caudas dos machos mantidos no SCPrim foram significativamente maiores na categoria etária adulta medindo 59.97 ± 4.3 cm enquanto a mensuração das caudas dos machos de vida livre no Vietnã foi de 53.98 ± 5.66 cm10.

A FR foi significativamente mais elevada em animais juvenis, tanto para machos (p<0.01) quanto para fêmeas (p<0.05), o que é considerado fisiológico. A FC não apresentou variação entre as faixas etárias como observado na FR, fato que pode ter sido em decorrência da anestesia com cloridrato de cetamina.

Com exceção dos valores de amilase, cloro, leucometria global e contagem de eosinófilos, os valores hematológicos e bioquímicos encontrados estavam de acordo com as referências de norma-lidade 4-15.

Os valores de amilase em todas as faixas etárias dos animais testados, estavam abaixo do estipulado em estudos com indivíduos oriundos de vida livre 4,13. Entretanto, outro estudo revelou taxas igualmente menores em animais cativos6. Como não houve correlação entre a presença de diarreia, que era na ocasião, o único sinal de



Tabela 4: Valores hematológicos (série branca) encontrados em macacos Cynomolgus do CECAL/FIOCRUZ

Fêmeas MachosJuvenis Sub-adultas Adultas Juvenis Sub-adultos Adultos

n X_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP

LG(x103µL) 6 8166.66

±2300.14 12 12475.00±6154.10 19 11036.84

±4506.68 13 10730.76±3442.71 5 9180.00

±3687.41 17 9400.00±3251.53

M(%) 6 0.00

±0.00 12 0.00±0.00 19 0.00

±0.00 13 0.00±0.00 5 0.00

±0.00 17 0.00±0.00

Mm(%) 6 0.00

±0.00 12 0.00±0.00 19 0.00

±0.00 13 0.00±0.00 5 0.00

±0.00 17 0.00±0.00

Bt(%) 6 0.16

±0.40 12 0.66±1.23 19 1.21

±1.54 13 0.61±1.32 5 0.00

±0.00 17 0.70±1.31

Seg (%) 6 52.33

±12.81 12 65.75±19.21 19 66.89

±15.87 13 48.69±18.64 5 62.40

±7.70 17 65.76±15.16

Linf (%) 6 43.33±12.11 12 31.08

±18.96 19 28.57±14.51 13 49.23

±17.81 5 36.00±7.84 17 31.17

±14.83

Eosin (%) 6 1.16±1.47 12 0.58

±0.79 19 0.63±0.76 13 0.53

±0.96 5 1.00±0.70 17 0.94

±1.24Bas (%) 6 0.167

±0.40 12 0.16±0.57 19 0.26

±0.65 13 0.23±0.43 5 0.00

±0.00 17 0.05±0.24

Mon (%) 6 2.83±2.22 12 1.75

±1.42 19 1.89±1.48 13 1.46

±1.98 5 0.80±0.44 17 1.35

±1.49

Plaq (%) 6 335.00±62.59 12 397.50

±106.99 19 383.84±88.50 13 379.84

±59.33 5 418.60±27.14 17 370.47

±64.58

n: número de animais; juvenis:12 a 36 meses; sub-adultos: 36 a 60 meses; adultos: acima de 60 meses; LG: leucometria global; M: mielócitos; Mm: meta mielócitos; Bt: bastões; Seg: segmentados; Linf: linfócitos; Eosin: eosinófilos; Bas: basófilos; Mon: monócitos; Plaq: plaquetas.

enfermidade de alguns animais, com os valores encontrados para esse parâmetro, consideramos o resultado normal.

Embora o valor de cloro seja considerado ele-vado ao ser comparado com estudos anteriores4,6,7 há um relato8 de valores próximos aos encontrados e descritos na tabela 5. Devido à controvérsia de valores de normalidade para o cloro e por não ter ocorrido correlação com a presença de diarreia, não consideramos que os animais apresentavam uma hipercloremia, com conseqüente acidose me-tabólica. Neste caso seria de grande valia a reali-zação de gasometria sangüínea, com determinação

de íons H+ livres, pois se em acidose metabólica, o animal precisa de cuidados específicos.

A leucometria global revelou-se normal de acordo com estudos anteriores8,9,12 Todavia, discreta leucocitose foi observada em fêmeas sub-adultas e adultas de acordo com relatos mais recentes5,7,10,13. A aplicação intramuscular de clo-ridrato de cetamina (10 mg/kg) causa uma redução significativa do valor da leucometria global7, portanto é possível que a leucocitose observada fosse mais significativa e que os valores obtidos estivessem mascarados pelo uso deste fármaco durante a contenção química.



Ocorreu linfocitose não correlacionada com a presença de diarreia nos machos juvenis. Esse aumento pode ser em resposta ao primeiro contato com vírus ou outro antígeno não identificado que tenha circulado na colônia. A contagem de linfó-citos se normalizou nas faixas etárias seguintes, o que revela estabilização dos animais perante o antígeno que sensibilizou a categoria juvenil20.

A eosinofilia esteve presente apenas em casos individuais, mas a média geral se manteve dentro do intervalo de normalidade, para animais em cativeiro5. Em Cynomolgus, a contagem de eosi-nófilos diminui com o passar da idade em ambos os sexos13, o que torna a eosinofilia um achado significativo para Cynomolgus senis. O presente es-

tudo classificou apenas como macacos adultos, os animais com idade acima de 60 meses, excluindo assim a categoria senil. Por esse motivo, o resultado da contagem de eosinófilos poderia ter sido mais fidedigno e significativo se tivéssemos sido mais rigorosos na determinação das categorias etárias.

Quanto aos valores de globulina, proteína plasmática produzida por linfócitos e células plas-máticas que contêm imunoglobulinas, observou-se também uma variação nas três faixas etárias, sendo maior em fêmeas adultas, novamente concordando com dados já apresentados20. Não determinamos qual imunoglobulina aumentou especificamente em fêmeas, entretanto houve aumento da leu-cometria global e eosinofilia correlacionada à

Tabela 5: Valores bioquímicos encontrados nos macacos Cynomolgus do CECAL/FIOCRUZ

ParâmetroMachos Fêmeas

Juvenis Sub-adultos Adultos Juvenis Sub-adultoss Adultosn X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP n X

_ ± DP

Am 13 235.15±58.10 2 291.50

±106.77 15 268.06±185.12 5 259.40

±53.0 11 261.36±51.59 16 216.12

±69.87

Lip 13 55.92±23.51 2 42.00

±8.48 15 38.53±14.28 5 44.00

±11.50 11 62.90±62.42 16 43.25

±21.58

PT 11 6.76±0.65 2 6.90

±0.28 15 6.96±0.35 5 6.86

±0.08 11 6.81±0.42 16 6.97

±0.53

Alb 13 3.53±0.21 2 3.45

±0.35 15 3.48±0.37 5 3.68

±0.21 11 3.38±0.31 16 3.23

0.44

Glob 11 3.20±0.59 2 3.45

±0.07 15 3.48±0.20 5 3.18

±0.14 11 3.43±0.29 16 3.74

±0.24

Fib 12 193.66±80.58 5 163.02

±57.73 17 166.33±58.19 6 179.90

±25.04 11 174.06±51.53 19 209.19

±61.60

na+ 13 159.53±12.79 2 150.50

±10.60 15 149.80±11.31 5 160.00

±19.90 11 160.09±15.23 16 159.12

15.23

Cl- 13 129.53±5.42 2 133.50

±3.53 15 124.33±6.71 5 128.00

±10.63 11 131.45±3.44 15 129.26

±7.73

K+ 12 3.89±0.50 2 4.050

±0.071 15 4.01±0.65 5 4.52

±0.52 11 4.14±0.38 15 4.18

±0.49

n: número de animais; juvenis:12 a 36 meses; sub-adultos: 36 a 60 meses; adultos: acima de 60 meses; Am: amilase; Lip: lipase; PT: proteína total; Alb: albumina; Glob: globulina; Fib: fibrinogênio; Na+: sódio; Cl-: Cloro; K+: potássio.



ABSt

RACt

presença de diarreia em adultos. O aumento de globulina pode estar relacionado a um aumento de IgE pois se sabe que uma resposta imunológica local de hipersensibilidade tipo I, com presença de IgE específica ocorre na presença de parasitas (helmintos e protozoários), de reação alérgica/inflamatória local21-25 e também na tentativa de retardar a amebíase hepática causada por Enta-moeba histolytica24. Uma grande quantidade de macacos Cynomolgus, independente de sexo e faixas etárias, foram positivos para Entamoeba histolytica e Balantidium sp., o que justifica a resposta imunológica descrita. Doenças crônicas também podem estar associadas a níveis aumenta-dos de gamaglobulinas26-28 e esse achado é com-patível com a enterite diarréica crônica constatada em alguns indivíduos.

Os machos possuem um volume globular médio (VGM) maior apenas na fase adulta, o que parece ser normal nesta espécie símia. Como o hematócrito não variou em conjunto como o VGM, descartamos a possibilidade de aumento da

produção de eritroblastos pela medula decorrente de anemias. Da mesma forma, a concentração de hemoglobina globular média (CHGM) e os outros índices também não variaram na idade adulta.

Os valores de hematócrito e hemoglobina va-riaram de forma significativa entre as três faixas etárias em fêmeas. O decréscimo desses parâme-tros em fêmeas juvenis ocorre provavelmente em função da maturidade sexual, com aparecimento da menarca, corroborando os resultados apresen-tados20.

5 ConCLuSão

Estes dados indicam que a manutenção de uma colônia “fechada” em cativeiro não produz resultados clínicos e biométricos anômalos ou insatisfatórios, o que nos permite a utilização do referido modelo experimental satisfatório para estudos biomédicos.

CLiniC, moRPhomEtRiC, And hAEmAtoLogiC EvALuAtion of CAPtivE CynomoLguS mACAquES (mACACA fASCiCuLARiS)

Characterization of biological parameters is essential to assess the sanitary condi-tions of animal breeding, especially when it comes to closed colonies, such as this study. Data from biometrics, semiologic and hematological evaluation were compared between sex and age groups. Adult animals have become longer in stature over the years in captivity and adult females show considerably smaller and lighter than adult males. The tails of males were significantly higher in adult males. The average temperature was 38.5°C. Heart rate remained homogeneous in the three age groups of both sexes and did not vary among age groups as observed in respiratory rate (RR), which may have been due to physical restraint and anesthesia with ketamine hydrochloride. The RR was significantly higher in juvenile animals. With the exception of eosinophilia, present in adults, all hematologic findings were within normal limits. These data indicate that the condition of the captive colony “closed” under study, as well as the adopted management does not produce anomalous results or unsatisfactory on clinical parameters and biometric analysis. Keywords: Macaca fascicularis. Physiology. Biometric. Hematology.



1. Andrade MCR. Determinação de parâmetros biológicos de primatas não humanos e do status sanitário e genético da colônia de macacos Rhesus (Macaca mulatta) da Fundação Oswaldo Cruz [Tese de Doutorado]. Rio de Janeiro: Fiocruz, Instituto Oswaldo Cruz; 2003.

2. Hérodin F, Thullier P, Garin D, Drouet M. Nonhuman primates are relevant models for research in hematology, immunology and virology. Eur Cytokine Netw. 2005; 2 (16): 104-16.

3. Jolly DN, Heywood R. Prevención de enfermidades. In: Hime JM, O’ Donoghe PN. Patologia de los animales de laboratorio, diagnostico y tratamento. Zaragoza: Acribia; 1979.

4. Altshuler HL, Stowell RE, Lowe RT. Normal serum biochemical values of Macaca arctoides, Macaca fascicularis, and Macaca radiata. Lab An Sci. 1971; 21 (6): 916-26.

5. Andrade MCR, Ribeiro CTR, Silva VF, Molinaro EM, Gonçalves MAB, Marques MAP et al. Biologic data of Macaca mulatta, Macaca fascicularis and Saimiri sciureus used for research at the Fiocruz primate center. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004; 99 (6): 581-89.

6. Bogin E. Guia de referência veterinário, um resumo dos intervalos de referência usados com os produtos VITROS®. Ortho-Clinical Diagnostics – Israel:Johnson&Johnson company; 1989.

7. Kim CY, Lee HS, Han SC, Heo JD, Kown MS, Han SS. Hematological and serum biochemical values in Cynomolgusmonkeys anesthezied with ketamine hydrochloride. J Med Primatol. 2005; 34 (96-100).

8. Matsumoto K, Akagi H, Ochiai T, Hagino K, Sekita K, Kawasaki Y et al. Comparative blood values of Macaca mulatta and Macaca fascicularis. Exp Anim. 1980; 29(3): 335-40.

9. Payne BJ, Lewis HB. Hematology of laboratory animals. In: Melby Jr EC, Altman NH editors. Handbok of Animal Science 03 ed. Cleveland: CRC Press, 1976.

10. Son VD. Morphology of Macaca fascicularis in a Mangroove forest, Vietnan. LPN-L. 2003; 39 (3) 363-371.

11. Terry M, Morrow AC. Hematologic and Blood Chemical Values for Macaca fascicularis Tabulated From the Literature. Seattle Primate Information Center, Regional Primate Research Center University of Washington, 1976.

12. Vogin EE, Oser F. Comparative blood values in several species of nonhuman primates. Lab Anim Sci. 1971; 21 (6):937-41.

13. Yoshida T, Katsuta A, Cho F. Reference of hematological, serum biochemical and hormonal examinations in female Cynomolgus monkeys (Macaca fasciclaris) of feral origin. Exp Anim. 1989; 38 (3):259-62.

14. Smucny DA, Allison DB, Ingram DK, Roth GS, Kemnitz JW, Kohama SG et al. Changes in blood chemistry and hematology variables aging in captive Rhesus macaques (Macaca mulatta). J Med Primatol. 2001; 30:161-73.

15. Yoshida T, Suzuki K, Cho F, Honjo S. Age-related changes in hematological and serum biochemical values in Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) bred and reared using the indoor individually-caged system. Jikken Dobutsu. 1986; 35 (3): 329-38.

16. Manual sobre Cuidados e Usos de Animais de Laboratório Institute of laboratory animal resources/ Commission of life science/ National research council. Goiânia-Goiás/Brasil pela AAALAC e COBEA, 2003.

17. Morton DB, Abbot D, Barclay R, Close BS, Ewbank RD, Gask D

REfERênCiAS

et al. Laboratory animals – Removal of blood from laboratory mammals and birds. London:Royal Society of Medicine Press, 1993.

18. Bistner SI, Ford RB. Manual de procedimentos veterinários & tratamentos de emergências segundo Kirk e Bistner. São Paulo: Editora Roca, 1997.

19. Son VD. Hematological values of Macaca fascicularis in a Mangroove forest, Vietnam. LPN-L. 2002; 41(4): 1-4.

20. Swenson RB. Protozoal parasites of great apes In: Zoo and Wild Medicine: Current Therapy 03. Philadelphia:WB Saunders, 1993.

21. Geller M, Geller M. Flaherty DK. Serum IgE levels in amoebiasis. Clin Allergy. 1978; 8 (6):565-7.

22. Navarro-Garcia F, Lopez-Revilla R, Veja-Lopez MA, Dominguez-Robles MC, Enriquez-Ricon F, Tsutsumi V. Intragastric immunization of rats with Entamoeba histolytica trophozoites induces cecal mucosal IgE, eosinophilic infiltration, and type 1 hypersensitivity. Clin. Immunol. Immunopathol. 1997; 83 (3): 221- 9.

23. Tizard I. Introdução a Imunologia Veterinária. São Paulo: Editora Roca, 1985.

24. Trissl D. Immunology of Entamoeba histolytica in human and animal hosts. Rev. Infect. Dis. 1982; 4 (6):1154-84.

25. Weller PF, Flier JS, Underhill LH. The immunobiology of eosinophil. N Engl J Med. 1991; 324 (16):1110-18.

26. Kantek GNCE, Pachaly JR. Manual de hematologia veterinária. São Paulo: EditoraVarela; 1994.

27. Meyer DJ, Coles EH, Rich LJ. Medicina de laboratório veterinária, interpretação e diagnóstico. São Paulo: Editora Roca; 1995.

28. Varela ME. Fundamentos de hematologia. Buenos Aires: El Ateneo; 1965.


ISSN 2238-1589

1. Médico do Programa de Residência Médica em Neurologia Clínica – UNIFESP;

2. Aluno de Graduação em Medicina – UNIFESP;

3. Laboratório de Experimentação Animal, Instituto Nacional de Farmacologia (INFAR) – UNIFESP.

Autor para Correspondência: Wladimir Bocca Vieira de Rezende Pinto Email: [email protected]


AvALiAção dA mARChA noRmAL E PAtoLógiCA no CAmundongo

Wladimir Bocca Vieira de Rezende Pinto1, Paulo Victor Sgobbi de Souza2 e Gui Mi Ko3

A análise da marcha representa importante ferramenta semiológica para a caracteri-zação de alterações ortopédicas, neuromusculares e neurológicas na prática médica. A marcha patológica representa via final comum de manifestações de doenças neu-rológicas (síndromes parkinsonianas, ataxias cerebelares e sensitivas, paraparesias espásticas e doenças neuromusculares), reumatológicas (artrites nas colagenoses e vasculites) e ortopédicas (lesões degenerativas articulares e ligamentares), podendo a compreensão de seus elementos modificados fornecer dados fundamentais para o entendimento da fisiopatogenia e da topografia de lesões neuro-ortopédicas. Este artigo de revisão objetiva resumir os principais métodos de avaliação para a caracterização da marcha em modelos experimentais animais.

Palavras-chave: Modelos animais, exame neurológico, distúrbios da marcha, ataxia cerebelar.

1. intRodução

O estudo de modelos experimentais animais depende fundamentalmente da caracterização fenotípica detalhada, do ponto de vista físico, comportamental e motor. Neste contexto, o estudo da marcha e a avaliação e conhecimento de cada um dos seus componentes é essencial para a com-preensão adequada de possíveis sítios anatômicos comprometidos em cada um dos modelos. Altera-ções neurológicas, ortopédicas e reumatológicas representam os principais grupos de patologias acometendo a fisiologia da marcha.

Em termos gerais, a marcha fisiológica normal depende da integridade neurológica (sistemas pro-prioceptivos centrais e periféricos, nervos e raízes periféricos, sistema extrapiramidal, aferências e eferências cerebelares, sistema piramidal com neurônios motores superior e inferior) e ortopé-dica (ligamentos, tendões, articulações e músculo

estriado esquelético) para a elaboração da marcha fisiológica. O ciclo da marcha normal compreende diferentes fases para cada um dos membros: fase de apoio (ou stance phase), correspondente a 60% do ciclo todo, com três componentes (contato ini-cial, período médio e despegue); e fase de balanço ou oscilação (ou swing phase), correspondente a 40% do ciclo da marcha fisiológica, com três componentes (inicial, fase média e terminal ou final). A fase de apoio se inicia com o contato do calcanhar com o solo e termina com o desprendi-mento do antepé, sendo altamente rápida durante a corrida e em atletas de elite, com maior tempo relativo da fase de swing. Compreende quatro períodos básicos: fase de resposta de carga (su-porte inicial), fase média (braking), fase terminal e pré-swing ou propulsiva (pré-balanço). A fase de balanço corresponde ao período do fim do despren-dimento até a fase de contato inicial novamente com o plano. Compreende três períodos básicos: fase inicial, fase média e fase terminal. Assim, em

ARTIGO DE REVISÃO

RESu

mo


AvAliAção dA mArchA normAl e pAtológicA no cAmundongo

qualquer que seja o animal avaliado em bipedia ou tetrapedia, o passo completo de um membro é representado pela soma das fases de apoio e de balanço. Diferentes comprometimentos ortopédi-cos e neurológicos originam comprometimentos de um ou mais componentes do ciclo da marcha, conforme cada caso.

O objetivo desta revisão é apontar a impor-tância da avaliação da marcha do camundongo, seus principais métodos e alguns dos modelos representativos de alterações patológicas vistas, conforme o nível de comprometimento de siste-mas neurológico e ortopédico. Muitos dos dados experimentais obtidos em camundongos e ratos são alvo de sobreposição nesta revisão, portanto estu-dos com ratos também são incluídos neste estudo.

1. métodos de avaliação da marcha em modelos animais

A avaliação da marcha e de cada um dos seus componentes e fases depende fundamentalmente do processo de observação. A maior parte dos dis-túrbios neurológicos e ortopédicos são revelados à inspeção estática e dinâmica simples do animal no plano. Contudo, em casos de alterações discretas, o exame pode ser sensibilizado através do uso de outros métodos ou de manobras mais específi-cas. Isso não significa que testes importantes na caracterização fenotípica de um modelo animal não devam ser empregados adicionalmente, como os testes de natação, labirinto em cruz elevado e Rotarod (barra rotatória)1-4.

O estudo da marcha é indicado para casos de doenças neurodegenerativas com componente motor significativo (destacando os parkinsonis-mos, a doença de Huntington, outros distúrbios de movimento, ataxias cerebelares, doenças do neurônio motor, paraparesias espásticas heredi-tárias), doenças sem comprometimento motor de origem conhecida, neuropatias periféricas (incluindo neuropatias traumáticas), trauma ra-quimedular, doenças cerebrovasculares, doenças osteoarticulares (destacando osteoartrose e mono e poliartrites), dentre outros.

Os métodos de avaliação exclusivamente da marcha incluem o teste de footprinting digital (método indireto) ou através de método mecânico (direto). A estrutura de avaliação do teste consiste em barra horizontal plana, sem elevação, livre de potenciais fatores de vieses (guias, fatores lu-minosos ou olfatórios), que possibilite o registro simultâneo das faces ventral e lateral do animal. É importante, portanto, que as paredes de proteção na contenção dos animais avaliados sejam transpa-rentes, especialmente nos casos de registro digital videográfico. Os registros diretos consistem na marcação com tinta (de uma ou mais cores) das patas traseiras e dianteiras dos animais. Não há padronização quanto ao comprimento e largura dos suportes de teste, porém a mesma deve oferecer espaço suficiente para três ou mais comprimentos corporais totais ou para adequado registro dos animais em regimes com velocimetria (contínua e com aceleração ou progressiva). A plataforma de testes geralmente apresenta comprimento entre 15 e 25 cm, com uma extremidade escura (ambas as extremidades fechadas durante o exame) e largura média entre 3,0 e 5,0 cm. A duração média das avaliações se dá entre 15 e 60 segundos de registro, conforme o objetivo principal do estudo. Diferentes softwares foram criados com o objetivo de oferecer avaliação completa, sistematizada e simples para o examinador, com registros gráficos diretos (de parâmetros espaciais e temporais). A avaliação videográfica possibilita o estudo de parâmetros não vistos pelo método direto, especialmente em relação às variáveis temporais, comparação em modelos animais pré e pós-lesões mecânicas ou químicas, pré ou pós-tratamento e as diferentes fases de evolução de doenças do sistema motor. Há no mercado nacional e internacional diferentes sistemas e programas eletrônicos para os registros, mas a representação básica dos registros em cores geralmente é a mesma (Figura 1).

Vários são os parâmetros avaliados na marcha do camundongo e envolvem diferentes catego-rias: (i) parâmetros espaciais relacionados a um membro isoladamente; (ii) parâmetros espaciais relacionados entre dois membros ou patas simé-tricas; (iii) parâmetros de coordenação motora


Wladimir Bocca Vieira de Rezende Pinto, Paulo Victor Sgobbi de Souza e Gui Mi Ko

entre membros; (iv) parâmetros temporais (Tabela 1)5-9. O significado real de cada um dos parâme-tros depende fundamentalmente dos objetivos da realização do teste.

A interpretação adequada da avaliação da marcha depende de diversos fatores, incluindo fatores ambientais, sexos dos mutantes estudados, uniformidade das amostras, idade dos animais avaliados10, e linhagens isogênicas e mutantes utilizados. Estudos prévios já estabeleceram as di-ferenças entre as linhagens isogênicas em relação aos parâmetros1. Não há diferenças significativas entre as linhagens em relação à largura da base das patas dianteiras e traseiras e ao comprimento dos passos, excetuando-se a linhagem C57BL/6J com menor base das patas dianteiras. Contudo, a velocidade para percorrer o sistema estático foi menor na linhagem 129S2/Sv e maior nas linhagens DBA/2, C57BL/6J e BALB/c. Há que diferenciar também os padrões de marcha normal nas circunstâncias sem velocidade própria e nas plataformas aceleradas e inclinadas, em que na velocidade constante da plataforma geralmente a

frequência dos passos tende a aumentar nos casos de aceleração.

Dentro do processo de avaliação da marcha, a sugestão de alteração cerebelar permite avalia-ção pormenorizada dos déficits através do uso de protocolo definido na literatura11,12. Da mesma forma, avaliações complementares à marcha são importantes também nas suspeitas de défi-cits visuais (retinianos e corticais), vestibulares (otoneurológicos) e proprioceptivos (medulares e espinocerebelares)13.

Exemplos de distúrbios da marcha em modelos animais

Serão descritos brevemente aqui achados refe-rentes a modelos animais neurológicos (doenças neurodegenerativas centrais e periféricas, lesões isquêmicas e traumáticas encefálicas e medulares), ortopédicos e reumatológicos (artrites). A maior parte dos estudos passou por avaliação videográ-fica tornando os estudos mais completos que os estudos mais antigos.

Figura 1. (A) Registro gráfico em cores da marcha do camundongo comumente utilizado de forma eletrônica (digital). (B) Exemplo de registro eletrônico em cores em animal pré-desmame.



Tabela 1. Principais grupos de parâmetros experimentais avaliados na marcha do camundongo em métodos computacionais e gráficos.5-9

Grupos de parâmetros experimentais Parâmetros

Parâmetros espaciais relacionados a uma pata/membro isoladamente

Intensidade, área máxima de impressão, largura de impressão, comprimento de impressão, comprimento do passo (distância percorrida pelo mesmo membro nas fases de swing e suporte), ângulo absoluto da pata (ângulo que cada pata faz no seu maior eixo com o eixo longitudinal de movimentação do animal)

Parâmetros espaciais relacionados entre patas/membros (relativos)

Base de suporte, posição relativa da pata (planos X e Y), largura do suporte (distância perpendicular entre centroides das patas dianteiras ou traseiras no pico da fase de suporte)

Coordenação entre membrosPadrão de marcha, índice de regularidade (número de patas posicionadas de forma irregular em relação ao padrão de regularidade)

Parâmetros temporais

Duração da fase de swing, duração da fase de suporte, duração de propulsão (tempo da fase propulsiva até antes da fase de swing), duração do passo (para uma pata), cadência (número de passos por minuto), velocidade de marcha, frequência de passos (número de passos por segundo), relação temporal entre fases

Outros parâmetros avaliados

Fator de suporte, coeficiente da ataxia, índice funcional do isquiático, pedobarografia, análise descritiva da marcha e de coordenação motora, distâncias de pontos de referência anatômica em relação à superfície

No estudo do modelo de artrite induzida por colágeno (induzido por injeção intradérmica de colágeno tipo II articular bovino liofilizado misturado com adjuvante completo de Freund em camundongos de linhagem DBA/1LacJ), em registro ventral videográfico, observou-se impor-tante correlação entre gravidade clínica da artrite e parâmetros da marcha6. Neste estudo, piora clínica da artrite se associou à presença de aumento na área da pata, aumento da frequência de passos, diminuição no comprimento do passo, diminui-ção no ângulo absoluto de posicionamento das patas traseiras e redução dos tempos de braking, suporte e no passo total. Desta forma, este repre-senta importante modelo de estudo em casos pré e pós tratamento de casos de artrite reumatoide,

além de mostrar as alterações na marcha próprias das doenças articulares. Outro modelo, em ratos adultos Sprague-Dawley após lesão neuromus-cular induzida por alongamento repetitivo de alta tensão dos músculos dorsiflexores (monomélicos) com secção direta do tronco dos nervos fibulares, evidenciou também o mesmo perfil de alterações mas restritos ao membro acometido14, assim como nos casos de doença monoarticular por aplicação intra-articular de carrageenan tipo IV no joelho de ratos Crl:CD5. Resumidamente observam-se redução do comprimento do passo, da área de contato da pata e maior proporção da fase e swing em relação ao passo no membro acometido, além de redução da relação da fase de suporte para a de swing e menor duração do passo nas patas



dianteiras e menor swing e maior propulsão na pata traseira contralateral de forma compensatória.

Para avaliação da marcha em diferentes con-textos neurológicos, foram utilizados modelos conhecidos de indução química e transgênicos. Camundongos de linhagem C57BL/6J rece-beram isoladamente injeções da neurotoxina dopaminérgica MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6--tetrahidropiridina) e da toxina mitocondrial 3NP (ácido 3-nitropropiônico) para indução fenotípi-ca, respectivamente, de modelos para doença de Parkinson e para doença de Huntington15. Para o modelo de Parkinson, foram observados redução de comprimento do passo, aumento da frequência dos passos (dose-dependente), redução da duração do passo por menor duração da fase de swing das patas traseiras e menor duração da fase de suporte das patas dianteiras, e aumento da variabilidade da largura do passo das patas dianteiras. Sinais diretos de instabilidade postural não foram vistos neste modelo, apesar de terem sido previamente descritos em outras induções de degeneração do-paminérgica nigro-estriatal. Também não foi vista diferença em relação ao ângulo das patas traseiras em relação ao eixo longitudinal da marcha. Outros modelos utilizando mesmo sistema de registros já haviam demonstrado base de suporte da marcha menor com patas mais próximas, principalmente nas dianteiras.

Para o modelo de Huntington, houve importan-te incoordenação motora evidenciada pela incapa-cidade das patas traseiras em manter regularidade nos passos, enquanto houve preservação relativa das patas dianteiras, além de base pouco alargada em relação aos demais15. Notou-se também efei-to dose-dependente em relação ao ângulo maior (mais aberto) das patas traseiras em relação ao eixo longitudinal da marcha, à variabilidade na largura do passo das patas dianteiras e à maior largura do passo das patas traseiras, sem outras alterações para as patas traseiras em relação às diferentes doses. Também ficou clara a maior duração da fase de propulsão e da fase de suporte.

Os dois modelos (Huntington e Parkinson) des-critos também mostraram importante variabilidade nos passos, fundamentalmente pelo componente

da pata dianteira, o que comparativamente não ocorreu no estudo comparativo com o modelo transgênico SOD1 com mutação humana G93A (B6SJL-Tg[SOD1-G93A]1Gur) representativo da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), apesar dos passos serem maiores em comprimento e terem menor frequência e maior duração15,16. Deste modo, tais modelos foram amplamente represen-tativos das marchas características da doença de Parkinson e da doença de Huntington. O mesmo modelo para ELA também demonstrou aumento significativo e progressivo no tempo da fase de propulsão do passo das patas traseiras e diminui-ção marcante no ângulo das patas traseiras com o eixo longitudinal da marcha.

Alterações de marcha também já foram carac-terizadas em modelos de doença cerebrovascular isquêmica focal. No estudo das lesões corticais protrombóticas induzidas em ratos Wistar (através da combinação de injeção intravenosa de Rosa Bengala fotoativa com irradiação do córtex sen-sitivo-motor esquerdo), após verificada assimetria de desempenho das patas dianteiras contralaterais ao sítio de lesão, foi realizada a análise da mar-cha, mostrando aumento da área máxima da pata traseira direita e da largura de registro de forma assimétrica em relação à esquerda, sem diferenças entre patas dianteiras17. Outro modelo também foi induzido em ratos Wistar através da cateterização com filamento de Nylon da artéria carótida comum e posteriormente da interna com posterior eletro-coagulação permanente do sistema com lesões estabelecidas do córtex sensitivo e motor18. Em tal modelo, houve redução importante da cadência, aumento da largura da base das patas traseiras, aumento da duração da fase de suporte, aumento na duração do swing na pata dianteira esquerda, velocidade de swing aumentada nas quatro patas, redução do comprimento do passo.

No caso de modelos de lesões medulares, animais C57BL/6 foram submetidos a diferen-tes graus de lesão medular via pneumática após laminectomia posterior na altura de T9. Foram notados, além de distância maior entre patas tra-seiras, menor tempo de swing nas patas traseiras e aumento no comprimento dos passos das patas



traseiras. Achados de assimetria entre patas tra-seiras também foram comuns19.

Estudo envolvendo o modelo animal Lurcher (transgênico para mutação no gene Grid2, loca-lizado no cromossomo 6, 29,77 cM, codificador do receptor inotrópico delta 2 do glutamato) para estudo de ataxias cerebelares também caracterizou a marcha nas ataxias cerebelares. Neste mode-lo, observaram-se redução da regularidade dos

passos, menor velocidade de deambulação, sem alteração no ângulo das patas, menor tamanho das passadas, alargamento da base das patas traseiras sem diferença nas patas dianteiras. A maior parte das diferenças observadas nos parâmetros neste modelo foi altamente dependente da velocidade empregada na marcha20. Diferentes graus de com-prometimento motor podem ser vistos em casos de ataxia cerebelar (Figura 2).

Figura 2. Representação do registro gráfico da marcha do camundongo. (A) Marcação correspondente às patas dianteiras e traseiras do camundongo. (B-C) Registro da marcha normal (fisiológica) do camundongo com padrão regular e constante, dentro da normalidade para os animais avaliados. (D-F) Registro de marcha patológica em modelo animal de ataxia cerebelar com diferentes graus de comprometimento motor, mostrando irregularidade no padrão, instabilidade e disbasia da marcha (D: leve; E: moderado; F: grave).

2 ConCLuSão

A caracterização da marcha em modelos ani-mais representa importante ferramenta no estudo de doenças neurológicas, ortopédicas e reumatoló-gicas, possibilitando sua análise minuciosa ofere-

cer informações detalhadas sobre achados semio-lógicos despercebidos. Deste modo, a avaliação da marcha deve figurar como etapa fundamental no desenvolvimento de modelos animais, espe-cialmente nos casos em que reconhecidamente as mutações induzidas acometam genes relacionados a distúrbios da marcha no homem.



ABSt

RACt

EvALuAtion of noRmAL And PAthoLogiCAL gAit of miCE

Gait analysis represents an important semiotic tool for the characterization of orthopedic, neuromuscular and neurological disorders in clinical practice. The pathological gait is the common final pathway of manifestations of neurological diseases (parkinsonian syndromes, cerebellar and sensory ataxia, spastic paraparesis and neuromuscular disease), rheumatologic disorders (arthritis in cases of collagen-related disorders and vasculitis) and orthopedic disturbances (joint and ligament degenerative lesions), allowing the understanding of its modified elements the proper comprehension of pathogenesis and topography of neuro-orthopedic injuries. This review article aims to summarize the main evaluation methods for the characterization of gait in experimental animal models.

Keywords: Animal models, neurological examination, gait disturbances, cerebellar ataxia.

1. Brooks SP, Pask T, Jones L, Dunnett SB. Behavioural profiles of inbred mouse strains used as transgenic backgrounds. I: motor tests. Genes Brain Behav. 2004;3(4):206-15.

2. Brooks SP, Dunnett SB. Tests to assess motor phenotype in mice: a user’s guide. Nat Rev Neurosci. 2009;10(7):519-29.

3. Rogers DC, Peters J, Martin JE, Nicholson SJ, Witherden AS, Hefezparast M, et al. SHIRPA, a protocol for behavioral assessment: validation for longitudinal study of neurological dysfunction in mice. Neurosci Lett. 2001;306(1-2):89-92.

4. Crawley JN. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 2008;57(6):809-18.

5. Berryman ER, Harris RL, Moalli M, Bagi CM. Digigait quantiation of gait dynamics in rat rheumatoid arthritis model. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2009;9(2):89-98.

6. Vincelette J, Xu Y, Zhang LN, et al. Gait analysis in a murine model of collagen-induced arthritis. Arthritis Res Ther. 2007;9(6):R123-R129.

7. Clarke KA, Still J. Gait analysis in the mouse. Physiol Behav. 1999;66(5):723-9.

8. Neumann M, Wang Y, Kim S, Hong SM, Bilgen M, Liu J. Assessing gait impairment following experimental traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 2009;176(1):34-44.

9. Gasparini ALP, Barbieri CH, Mazzer N. Correlação entre diferentes métodos de avaliação funcional da marcha de ratos com lesão por esmagamento do nervo isquiático. Acta Ortop Bras. 2007;15(5):285-9.

10. Clarke KA, Still J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiol Behav. 2001;73(1-2):159-64.

11. Pinto WBVR, Souza PVS. Modelos animais de ataxias cerebelares humanas. Rev Soc Bras Cienc Anim Lab. 2012;1(4):344-54.

12. Guyenet SJ, Furrer AS, Damian VM, Baughan TD, La Spada AR, Garden GA. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. J Vis Exp. 2010;39. Pii: 1787. Doi: 10.3791/1787

13. Herbin M, Hackert R, Gasc JP, Renous S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behav Brain Res. 2007;181(2):173-9.

14. Tang W, Lovering RM, Roche JA, Bloch RJ, Neerchal NK, Tasch U. Gait analysis of locomotor impairment in rats before and after neuromuscular injury. J Neurosci Methods. 2009;181(2):249-56.

15. Amende I, Kale A, McCue S, Glazier S, Morgan JP, Hampton TG. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. J Neuroeng Rehabil. 2005;2:20-32.

16. Mancuso R, Oliván S, Osta R, Navarro X. Evolution of gait abnormalities in SOD1(G93A) transgenic mice. Brain Res. 2011;1406:65-73.

17. Vandeputte C, Taymans JM, Casteels C, et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neurosci. 2010;11:92.

19. Beare JE, Morehouse JR, DeVries WH, Enzmann GU, Burke DA, Magnuson DS, et al. Gait analysis in normal and spinal contused mice using the TreadScan system. J Neurotrauma. 2009;26(11):2045-56.

20. Cendelín J, Voller J, Vozeh F. Ataxic gait analysis in a mouse model of the olivocerebellar degeneration. Behav Brain Res. 2010;210(1):8-15.

REfE

RênC

iAS


ISSN 2238-1589

1. Farmacêutica Especialista em Cosmetologia – Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Cosméticos, Instituto Racine – São Paulo – SP e Doutoranda em Neurociências pela Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP);

2. Farmacêutica Especialista em Cosmetologia – Pesquisa e Desenvolvimento de Produtos Cosméticos, Instituto Racine – São Paulo - SP;

3. Química Especialista em Administração Industrial, docente do Instituto Racine – São Paulo - SP;

4. Doutora e farmacêutica em Ciências na área de Produção e Controle Farmacêuticos – USP – São Paulo, docente da Fatec de Diadema – Luigi Papaiz, Diadema, SP e SENAC – São Paulo - SP.

Autor para Correspondência: Carla Aparecida Pedriali Moraes. E-mail: [email protected]

Data Recebimento: 30/03/2014Aceito para p Publicação: 18/05/2015

AnáLiSE dA utiLizAção dE tEStES ALtERnAtivoS PARA AvALiAção dE SEguRAnçA dE PRodutoS CoSmétiCoS

Daisylea de Souza Paiva1, Juliana Riguetti Vitalli2, Maria Aparecida Lima Moreira3 e Carla Aparecida Pedriali Moraes4

Atualmente observa-se uma crescente movimentação por parte de algumas agências regulatórias, organizações não governamentais (ONGs) e até mesmo indústrias de cosméticos no sentido de tentar diminuir o uso de animais de laboratório em ensaios biológicos. Este trabalho teve como objetivo a realização de uma breve revisão bi-bliográfica da descrição dos métodos de avaliação da segurança in vivo e a possível substituição por métodos alternativos in vitro e in silico pela indústria cosmética no âmbito nacional. Isto foi feito correlacionando a posição de diversos órgãos reguladores referente ao uso de técnicas alternativas. Constatou-se que ainda não é possível subs-tituir totalmente o uso de animais para determinação de novos ativos ou formulações cosméticas, mas os testes alternativos estão contribuindo para reduzir o número de animais utilizados na pesquisa científica.

Palavras-chave: Testes alternativos, segurança, produtos cosméticos.

1. intRodução

O Brasil é o terceiro maior mercado no mundo em consumo de cosméticos e, como consequência, houve um aumento na variedade de matérias--primas de diferentes origens e pureza disponí-veis para este fim. Com isso, os fabricantes têm a obrigação de garantir a segurança e a eficácia dos cosméticos aos consumidores, fazendo com que os riscos de aparecimento das reações adversas (irritação, sensibilização e efeitos sistêmicos) a algum produto seja cada vez menor.

Por outro lado, nos últimos anos várias meto-dologias que não utilizam animais como modelo experimental vêm sendo validadas e recebendo aprovação regulatória na União Europeia, e há incentivo em sua substituição por métodos alter-nativos in vitro1, conforme a introdução da Sétima

Alteração às Diretrizes de Cosméticos (do inglês, Seventh Amendment to the Cosmetics Directive)2,3.

Uma vez havendo a utilização de animais, o uso de técnicas bioestatísticas é crucial para deter-minação do cálculo da amostra a ser utilizada, no planejamento do desenho experimental apropriado, na deteminação da hipótese estatística a ser testada e na escolha do método para análise de dados4.

O Comitê Coordenador Interagência na Validação de Métodos Alternativos (ICCVAM) (do inglês, Interagency Coordinating Commit-tee on the Validation of Alternative Methods) é responsável pela validação dos testes in vitro desenvolvidos, que são posteriormente aprovados pelo Laboratório de Referência da União Europeia para Alternativas aos Testes em Animais (EURL ECVAM, do inglês, European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing). Nos Estados Unidos, o Programa Nacional de

ARTIGO DE REVISÃO

RESumo


Daisylea de Souza Paiva, Juliana Riguetti Vitalli, Maria Aparecida Lima Moreira e Carla Aparecida Pedriali Moraes

Toxicologia (NTP, do inglês National Toxicology Program) do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, por meio do Centro Interagências para Avaliação de Métodos Toxicológicos Alternativos (NICEATM, do inglês NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Metho-ds) trabalha em conjunto com o ICCVAM e aceita as validações feitas pelo mesmo. Dessa forma, as metodologias criadas pela comunidade científica são validadas pelo ICCVAM e publicadas como de guia ou TG (do inglês, Test Guidelines) pela OECD (do inglês Organisation for Economic Co--operation and Development, Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico).

A partir desse contexto, realizamos neste artigo uma breve exposição sobre os métodos conven-cionais utilizados para determinar segurança de produtos cosméticos, bem como revisamos os principais e recentes métodos alternativos publi-cados em revistas científicas, e se estes podem vir a substituir o uso de animais estritamente na área cosmética, tendo como base os aspectos éticos, eficiência e harmonização de resultados.

2. métodoS in SiLiCo dE AnáLiSE dE novAS moLéCuLAS

O termo in silico refere-se aos métodos de análise baseados em modelos computacionais. São capazes de predizer as características de moléculas e a interação destas com proteínas co-nhecidas, além de dados toxicológicos. O uso de ferramentas computacionais para prever respostas biológicas vem sendo usado desde meados de 19605. Incluídos nos métodos in silico, temos o SAR6 (do inglês, Structure-activity Relationship, Correlação estrutura-atividade e identifica gru-pos reativos), QSAR 2D (do inglês, Quantitative Structure-activity Relationship, Correlação quan-titativa estrutura-atividade), QSAR 3D (considera a tipologia tridimensional) e QSAR 4D (considera as dinâmicas de interações).

Os métodos QSAR são os mais utilizados atu-almente, principalmente no ramo da “toxicologia

in silico”, chamados QSTR (do inglês, Quantita-tive Structure-toxicity Relationship, Correlação quantitativa estrutura-toxicidade). Esses modelos podem predizer endpoints contínuos (doses letais) ou categóricos (genotóxico ou não genotóxico)6,7.

Uma nova abordagem in silico denominada CADD (do inglês Computer-Aided Drug Design, Desenho de Drogas Feito por Computador) leva em conta a ligação da molécula ao receptor, pode prever ou melhorar o metabolismo, farmacociné-tica e toxicidade5,8.

O sucesso de um método in silico vai depender da infraestrutura químico-informática que com-bine diversas fontes de dados para compreender melhor a atividade biológica dos compostos. Esses sistemas preditivos estão em constante mudança, o que implica que novos dados devem ser conti-nuamente incorporados ao sistema na medida em que novos conhecimentos estejam disponíveis. Assim, a validação desses métodos apresenta difi-culdades, uma vez que o sistema está em constante mudança9.

3. utiLizAção dE téCniCAS in vitRo E in vivo PARA AnáLiSE dE ingREdiEntES E

foRmuLAçõES CoSmétiCAS

irritação ocular

O teste proposto por Draize10 ainda é padrão quando se trata de irritação ocular, pois vários estudos de validação concluíram que nenhum teste in vitro sozinho é capaz de substituí-lo, uma vez que ainda seria incapaz de modelar toda a resposta imunológica, bioquímica e celular à ir-ritação ocular. No entanto, quando utilizados em conjunto fornecem valiosas informações sobre irritação ocular11.

No teste ICE (do inglês, Isolated Chicken Eye test ou Teste de olho de galinha isolado) desen-volvido por Prinsen e Koeter12 os efeitos tóxicos causados por uma substância são medidos pela análise qualitativa da opacidade, pela retenção de fluoresceína e danos macroscópicos na morfologia


Análise dA utilizAção de testes AlternAtivos pArA AvAliAção de segurAnçA de produtos cosméticos

da superfície do olho, além da determinação quan-titativa do aumento da espessura da córnea12,13.

A proposta do teste BCOP (do inglês, Bovine Corneal Opacity and Permeation test ou Teste de Permeabilidade e opacidade de córnea bovina)14 é avaliar o potencial de risco para o olho de uma substância teste medida pela habilidade em indu-zir a opacidade e aumentar a permeabilidade em córnea bovina, sendo que a medição é feita pela diminuição na transmissão da luz15.

O Teste do Ovo de Hen - Membrana Co-rioalantoide (HET-CAM, do inglês, Hen’s Egg Test - Chorioallantoic Membrane) é um modelo organotípico utilizado para avaliar os efeitos das substâncias (visualização de reações irritantes como hemorragia, lise e coagulação) nos tecidos conjuntivais do olho, uma vez que a membrana corioalantóide do ovo embrionado (Leghorn com 10 dias de fecundação) de galinha possui tecidos de mucosa vascularizados semelhantes aos encon-trados nos olhos humanos e de coelhos16,17.

Os métodos in vitro ICE e o BCOP são valida-dos pela União Europeia (ICCVAM e aprovados pelo ECVAM) e preconizados pelo Programa Nacional de Toxicologia, nos Estados Unidos, para predição de irritação ocular severa13,15, e também para distinguir substâncias irritantes de categoria 1 e 2.

Os ensaios de citoxicidade têm como objetivo determinar a porcentagem de morte celular por meio de corantes vitais como o MTT (ou 3-(4,5 dimethyl thiazole-2yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) ou vermelho neutro, que são incorpo-rados pelas células vivas. A adição de solvente solubiliza os cristais e a mudança na coloração para púrpura é quantificada por meio de medição da absorbância17,18. No Brasil, a ANVISA aceita este teste18.

Existe ainda vários novos protocolos, como o EpiOcular™ e o SkinEthic™, que estão em fase de validação e utilizam tecidos humanos reconsti-tuídos para avaliação de toxicidade ocular. Dentre eles, o sistema EpiOcular™ utiliza epitélio corneal humano e consiste na exposição do epitélio à subs-tância a ser testada, verificando-se a diminuição na viabilidade celular por meio do método MTT3.

Corrosividade Cutânea

A corrosividade cutânea refere-se à produção de dano irreversível (necrose visível) à pele, causa-do pela aplicação de uma determinada substância num período de 4 horas. O teste in vivo consiste em colocar um patch semi-oclusivo em contato com a pele de coelhos albinos e verificar as re-ações manifestadas19. Apesar da corrosividade não ser um fator de risco para cosméticos, pode acontecer após algum erro na fabricação ou mal uso de consumidores.

Nos últimos anos algumas metodologias in vitro já foram validadas pelo ICCVAM e são aceitas como substitutas para o teste de Draize. Dentre elas, podemos citar o TER, EpiSkin™, EpiDerm™, Skin Ethic™, Corrositex™ e EST-1000.

O Teste de Resistência Elétrica Transcutânea (do inglês Transcutaneous Electrical Resistance Test Method, conhecido como TER) é validado pela OECD e diferencia substâncias e misturas corrosivas e não corrosivas à pele20. O método utiliza discos de pele acoplados a um sistema de dois compartimentos, onde o disco é a separação entre compartimentos. O potencial corrosivo é testado aplicando-se uma substância por 24 horas para verificar a perda da integridade do estrato córneo, que é medida como uma redução na TER para abaixo de 5Ω20.

Outros métodos para avaliação da corrosivi-dade de substâncias são baseados em Epiderme Humana Reconstituída (RhE), sendo denominados comercialmente como SkinEthic™, EpiSkin™ e EpiDerm™21,22. Tais modelos se baseiam na pre-missa de que substâncias corrosivas penetram no estrato córneo por difusão e que são tóxicas para as células. Dessa forma, a viabilidade celular é medida por adição de corante MTT e identificadas pela capacidade de reduzir em 50% a viabilidade celular2,21,22.

Um outro modelo que utiliza epiderme recons-tituída é o Teste de Epiderme 1000 (do inglês Epidermal Skin Test 1000, EST-1000). A camada submersa de queratinócitos humanos encontra-se em uma interface ar-líquido, que estimula a dife-



renciação das células. O protocolo é baseado na TG 43121, que é o mesmo utilizado para os testes EpiDerm™, EpiSkin™ e SkinEthic™23.

Para avaliação do potencial de corrosividade de ácidos, bases e derivados ácidos utiliza-se o en-saio Corrositex®. Tal ensaio consiste em colocar a substância teste em um tubo contendo solução indicadora de pH separada por uma membrana semipermeável composta de queratina, de forma que, se a substância atravessar a membrana, ocor-rerá a alteração no pH da solução24,25,26.

irritação dérmica

Irritação dérmica é caracterizada pelo apareci-mento de dano reversível à pele em decorrência da aplicação de uma determinada substância por mais de 4 horas. Para determinação de irritação dérmica, os testes de epiderme humana reconsti-tuída (RHE) validados pela ECVAM (TG 439)27 são: EpiDerm™ SIT (EPI-200), SkinEthic™ RHE e EpiSkin™. O EpiSkin™ foi validado como um método que pode ser utilizado sozinho para distinguir substâncias não irritantes de irritantes, substituindo o tradicional teste in vivo de Draize10 para irritação dérmica. Além destes últimos, os testes EpiDerm™ e SkinEthic™ também pode ser utilizados para identificação de substâncias irritantes. O teste de Epiderme Humana recons-tituída (RHE) é feito com base na formação de edema e eritema, como resultado de uma cascata de eventos de irritação da pele, começando pela penetração pelo estrato córneo27.

Sensibilização cutânea

Para determinação da sensibilização dérmica não existe nenhum teste in vitro validado pela ECVAM como alternativa para os testes em ani-mais, devido à complexidade e diversidade dos mecanismos biológicos de sensibilização e a gran-de quantidade de substâncias disponíveis28. No teste de Maximização em Guinea pig (conhecido como porquinho-da-índia)28, a sustância-teste é injetada intradermicamente na região dorsal com um adjuvante em cobaias, e a duração do teste

é de aproximadamente 35 dias. Para o teste de oclusão de Buehler não é necessária a utilização de adjuvantes e, nesse caso, o processo de sen-sibilização ocorre quando a pele fica em contato com um patch oclusivo que contém a substância teste18,29.

No intuito de diminuir o número de animais utilizados, foi desenvolvido o teste LLNA descri-to na TG 42930. Tal método é baseado no princí-pio de que os agentes sensibilizadores induzem proliferação de linfócitos no local de aplicação e é proporcional à concentração da substância analisada30.

O Ensaio de Reatividade Direta de Peptídeo (DPRA, do inglês Direct Peptide Reactivity Assay) foi desenvolvido pela Procter & Gamble. Verifi-ca o processo de haptenação, que é a ligação de substâncias de baixo peso molecular (haptenos) à proteínas da pele consideradas iniciadoras dos processos de sensibilização dérmica31. Já o teste KeratinoSens™ avalia a ativação da via dependen-te do elemento de resposta antioxidante (ARE) em queratinócitos, um mecanismo-chave conhecido na sensibilização dérmica. KeratinoSens™ é uma linhagem celular que contém a sequência ARE do gene envolvido com a ativação dessa via, e o resultado do teste é dado pela determinação da ativação da enzima luciferase32.

Adicionalmente, o teste RBC (Sistema de célu-las vermelhas, do inglês Red Blood Cell System) é aceito pela Anvisa e permite quantificar e ava-liar os efeitos de substâncias sobre a membrana plasmática de hemácias, bem como a consequente liberação da hemoglobina (hemólise) e ainda, o índice de desnaturação da hemoglobina que são quantificados por espectrofotometria33.

fototoxicidade

A fototoxicidade ou fotoirritação é defini-da como uma resposta tóxica induzida após a primeira exposição da pele ou administração sis-têmica de uma substância química e subsequente exposição à luz18. No teste de fototoxicidade, o produto é aplicado na pele do animal, seguido por exposição à radiação UVA e UVB. Após



48 horas, são feitas observações macroscópicas comparando-se com a área controle onde não houve exposição18.

O 3T3 – NRU – PT (Teste de Fototoxicidade pela captação de Vermelho Neutro pela linhagem de células 3T3, do inglês Neutral Red Uptake Phototoxicity Test) é o teste de fototoxicidade in vitro validado e publicado na TG 43234. 3T3 é uma linhagem de células obtidas a partir do tecido de embrião de camundongo. Esse teste é realizado após a exposição a uma dose de radiação UVA em comparação com a ausência de exposição. A citotoxicidade é expressa com uma redução da con-centração da captação do corante vermelho neu-tro35. Apesar de utilizar uma linhagem de células de camundongos, o uso de animais foi diminuído drasticamente após a adoção desse teste.

Vermelho neutro (NR, do inglês Neutral Red) é um corante catiônico que se difunde rapidamente através das membranas celulares e acumula-se nos lisossomas celulares. Uma vez no meio ácido do lisossoma, o NR é oxidado, tornando-se carregado positivamente e preso dentro do lisossoma. A me-nos que a célula ou o lisossoma seja danificado, o corante vermelho permanece preso35.

toxicocinética

A Anvisa define toxicocinética como os proces-sos de resposta do nosso organismo frente a uma substância química, em função da dose e do tempo, em termos de ADME (Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção)36. De todos os mecanis-mos ADME, apenas a absorção dérmica pode ser avaliada in vitro, conforme a TG 42834. O método consiste em um aparato de difusão constituído por uma câmara doadora e um compartimento recep-tor, entre os quais a pele é posicionada. Aplica-se a substância na pele por um período de até 24 horas. Durante esse período, a pele é lavada e o líquido dos dois compartimentos é recolhido para determinar o quanto de substância penetrou na pele34. Este teste é muito difícil de ser mensurado in vitro. Encontra-se em fase de desenvolvimento um teste que tenta mimetizar a metabolização in vitro. No entanto, como os sistemas de metabo-

lização em humanos e animais são diferentes, desenvolver métodos alternativos torna-se um desafio. Nos Estados Unidos, o FDA recomenda a avaliação metabólica em humanos. Devido a essas limitações, tem crescido o uso de ferramentas in silico para predição da toxicocinética. Um dos modelos in silico utilizados é o “Toxicocinética Fisiologicamente Fundamentada” (PBTK, do inglês Physiologically-Based ToxicoKinetics), que avalia os parâmetros físico-químicos das substâncias e prediz como será o comportamento nos processos ADME.

o posiciomento das agências regulatórias quanto aos métodos alternativos in vitro

A ANVISA determina que sejam utilizados métodos alternativos sempre que for possível, mas não impõe restrição quanto ao uso de animais. Nos Estados Unidos, o FDA exige, para produtos que contenham substâncias em escala nano, que sejam feitos testes em animais. Já na União Europeia, os testes em animais para avaliar a segurança cosmética são proibidos. Porém, na China, o uso de animais em testes de segurança e eficácia em cosméticos é obrigatório. Dessa forma, um outro aspecto que deve ser levado em conta é se existe no briefing do produto a intenção de venda em algum país onde é obrigatório o uso de animais para determinação de segurança, como na China. Essa decisão deve ser tomada antes mesmo de escolher uma substância nova como ingrediente de um produto cosmético.

4. ConSidERAçõES finAiS

A comunidade científica, no Brasil e no exte-rior, na maioria de seus membros, vem declarando que, devido à complexidade em representar em culturas de células o funcionamento de um sis-tema, e até mesmo em obter de forma alternativa um organismo completo, não é possível substituir totalmente o uso de animais para determinação de alguns atributos (Toxicocinética, por exemplo).



ABSt

RACt

REfE

RênC

iAS

Por outro lado, a partir dos dados apresentados, podemos inferir que para a pesquisa de desen-volvimento em cosméticos, foco deste artigo, existem várias alternativas validadas e aceitas pela ANVISA, FDA e COLIPA para diminuir ou até mesmo eliminar o uso de animais, dependendo da complexidade da nova molécula apresentada.

Embora ainda existam vários desafios a serem cumpridos, a capacidade de predizer o risco de determinada substância sem a utilização de novos testes em animais provavelmente será possível nos próximos anos, principalmente se houver um grande esforço das empresas e da comunidade científica mundial.

AnALySiS of thE uSE of ALtERnAtivE tEStS foR CoSmEtiC PRoduCtS SAfEty EvALuAtion

Currently there has been a growing movement by regulatory agencies, non--governmental agencies and even cosmetics industries in order to reduce the use of laboratory animals in biological tests. This study aimed to hold a brief literature review of methods for the assessment of in vivo safety and the possible use of in vitro and in silico alternative methods by the national cosmetic industry. This was done to correlate the position adopted by the various regulatory agencies concerning the use of alternative methods. It was found that still can not completely replace the use of animals for determination of new actives or cosmetic formulations, but the alternative tests contributed to reduce the number of animals used in scientific research.

Keywords: Alternative tests, safety, cosmetics products.

1. Baumans V. Ethical aspects of the use of animals in experimental research. In: Tufik MLAS, editors. Animal Models as Tools in Ethical Biomedical Research. São Paulo; 2010. p. 563.

2. Alepee N, Bessou-Touya S, Cotovio J, de Smedt A, de Wever B, Faller C, et al. Cosmetics Europe multi-laboratory pre-validation of the SkinEthicTM reconstituted human corneal epithelium test method for the prediction of eye irritation. Toxicol. In Vitro 2013; 27(5):1476-1488.

3. Pfannenbecker U, Bessou-Touya S, Faller C, Harbell J, Jacob T, Raabe H, et al. Cosmetics Europe multi-laboratory pre-validation of the EpiOcularTM reconstituted human

tissue test method for the prediction of eye irritation. Toxicol. In Vitro 2013; 27(2):619-626.

4. Puopolo M. Biostatistical approaches to reducing the number of animals used in biomedical research. Ann Ist Super Sanita. 2004; 40(2):157-163.

5. Kien GA, Heller FN. Simulation of biologic systems by digital computer. Arch Phys Med Rehabil. 1967; 48(9):456-462.

6. Hartung T, Hoffmann S. Food for thought ... on in silico methods in toxicology. Altex. 2009; 26(3):155-166.

7. Winkler DA, Mombelli E, Pietroiusti A, Tran L, Worth A,

Fadeel B, et al. Applying quantitative structure-activity relationship approaches to nanotoxicology: current status and future potential. Toxicology. 2013; 313(1):15-23.

8. Sliwoski G, Kothiwale S, Meiler J, Lowe EW, Jr. Computational methods in drug discovery. Pharmacol Rev. 2014; 66(1):334-395.

9. Vedani A, Smiesko M. In silico toxicology in drug discovery - concepts based on three-dimensional models. Altern Lab Anim. 2009; 37(5):477-496.

10. Draize JH, Woodard G, Calvery HD. Methods for study of irritation and toxicology of substances applied topically to the skin and mucous



membrane. J Pharmacol. Exp.Ther. 1944; 83:377-390.

11. Verstraelen S, Jacobs A, De Wever B, Vanparys P. Improvement of the Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) assay as an in vitro alternative to the Draize rabbit eye irritation test. Toxicol. In Vitro 2013; 27(4):1298-1311.

12. Prinsen MK, Koeter HB. Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Food Chem Toxicol. 1993; 31(1):69-76.

13. OECD (2009a): Guidelines for the Testing of Chemicals 438. The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants. Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development.

14. Muir CK. A simple method to assess surfactant-induced bovine corneal opacity in vitro: preliminary findings. Toxicol Lett. 1984; 22(2):199-203.

15. OECD (2009b): Guidelines for the Testing of Chemicals 437. The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants. Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development.

16. Barile FA. Validating and troubleshooting ocular in vitro toxicology tests. J Pharmacol Toxicol Methods. 2010; 61(2):136-145.

17. ICCVAM (2007): Test Method Evaluation Report - In vitro test methods for identifying ocular severe irritants and corrosives. Interagency Coordinating Committe on the Validation of Alternative Methods.

18. ANVISA (2003): Guia para Avaliação de Segurança e Eficácia de Produtos Cosméticos. In. Brasilia; Agência Nacional de Vigilância Sanitária, p. 47.

19. OECD (2002): Test Guideline 404: Acute Dermal Irritation/Corrosion.

Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development.

20. OECD (2013a): Test Guideline 430: In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test Method (TER). Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development. p. 20.

21. OECD (2013b): Test Guideline 431: In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Method. Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development. p.34.

22. Tornier C, Roquet M, Fraissinette Ade B. Adaptation of the validated SkinEthic Reconstructed Human Epidermis (RHE) skin corrosion test method to 0.5 cm2 tissue sample. Toxicol. In Vitro 2010; 24(5): 1379-1385.

23. Hoffmann J, Heisler E, Karpinski S, Losse J, Thomas D, Siefken W, et al. Epidermal-skin-test 1,000 (EST-1,000)--a new reconstructed epidermis for in vitro skin corrosivity testing. Toxicol. In Vitro 2005; 19(7):925-929.

24. Gordon VC, Harvell JD, and Maibach, HI. 1994. Dermal corrosion, the Corrositex® System: A DOT accepted method to predict corrosivity potential of test materials. In: In vitro Skin Toxicology - Irritation, Phototoxicity, Sensitization. Alternative Methods in Toxicology. Rougier A, Goldberg AM, Maibach, HI, eds. 1994; 10: 37-45. Mary Ann Liebert, New York.

25. ICCVAM (1999): Corrositex. An In Vitro Test Method for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. Interagency Coordinating Committe on the Validation of Alternative Methods.

26. OECD (2006): Test Guideline 435: In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development. p.15.

27. OECD (2013c). Test Guideline 439: In Vitro Skin Irritation:

Reconstructed Human Epidermis Test Method. Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development. p. 20.

28. Magnusson B, Kligman AM. The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test. J Invest Dermatol. 1969; 52(3):268-76.

29. Lachapelle JM. Toxicidade orgânica e geral. In: Pruniéras M. Manual de cosmetologia dermatológica. 2.ed. São Paulo; Andrei; 1994.

30. OECD (2010). Test Guideline 429: Skin Sensitisation Local Lymph Node Assay. Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development. p. 20.

31. Ahlfors SR, Sterner O, Hansson C. Reactivity of contact allergenic haptens to amino acid residues in a model carrier peptide, and characterization of formed peptide-hapten adducts. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. 2003, 16(1):59-68.

32. Andreas N, Caroline B, Leslie F, Frank G, Kimberly N, Allison H, et al. The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 2011; 25(3):733-744.

33. ROMANOWSKI P, SCHUELLER R. Fundamentals of cosmetic product safety testing. Cosmet Toilet. 1996; 111(10):79-86.

34. OECD (2004a). Test Guideline 428: Skin Absorption: in vitro Method. Paris, Organisation for Economic Co-operation and Development.

35. KOETER HBWM (2003): Development, implementation and use of alternative test methods in regulatory hazard assessment in OECD member countries.

36. BRASIL (2010): Guia para a Condução de Estudos Não Clínicos de Segurança Necessário ao Desenvolvimento de Medicamentos.

REfERênCiAS

Os artigos devem ser redigidos na ortografia oficial, em uma só face, utilizando o programa Word, em es-paço duplo, em folhas formato A4 (21 cm x 29,7 cm), com fonte tamanho 12, com margens de 3 cm em cada um dos lados e numeradas em algarismos arábicos no canto inferior direito da folha.

Indicativos para SubmissãoO conteúdo do material enviado para publicação na

RESBCAL não pode ter sido publicado anteriormente em outros veículos. Os custos de publicação envolvem revisão em português e tradução para o inglês. Os artigos e correspondência deverão ser enviados inicial-mente por meio eletrônico para o seguinte endereço: [email protected]. No item assunto deverá ser colocado: Artigo RESBCAL. Ele deverá ser anexado em um único arquivo.

Carta de apresentaçãoÉ importante que o trabalho venha acompanhado

de uma carta, indicando os pontos relevantes para ajudar no encaminhamento da avaliação preliminar de revisão pelos pares.

Carta de autorizaçãoDeve conter a assinatura de todos os autores,

responsabilizando-se pelo conteúdo do trabalho.

Carta dos autoresIndicar se existem eventuais conflitos de interesse

(profissionais, financeiros e benefícios diretos ou in-diretos) que podem ter influenciado os resultados da pesquisa ou o conteúdo do trabalho.

Considerações éticasTodos os trabalhos submetidos para publicação

deverão estar acompanhados do Certificado de Apro-vação do Projeto pelo Comitê de Ética e Pesquisa da instituição à qual estão vinculados os autores.

Os procedimentos experimentais aplicados deverão apresentar conformidade com os princípios previstos na Lei 11.794 e pelo Conselho Nacional de Cuidado na Experimentação Animal (CONCEA) para trabalhos produzidos no Brasil; previstos na Convenção Euro-peia para a Proteção dos Animais Vertebrados Utiliza-

dos para Fins Experimentais e Outros Fins Científicos e seus anexos, para artigos de origem internacional.

Se o desenho experimental ou a metodologia do trabalho apresentado levantar preocupação com a ética ou o bem-estar, o Conselho Editorial fará uma análise para interpretação segundo publicações recentes com as diretrizes nacionais e internacionais adotadas.

Os artigos podem ser: originais, revisão e ponto de vista, breve comunicação, seção memórias:

a) originais: divulgam resultados de pesquisas que possam ser replicados ou generalizados. Devem ter acima de 5.500 palavras, incluindo o resumo. O texto pode ser apresentado em português ou inglês;

b) revisão: Artigos de Revisão dispensam resumo es-truturado. Tamanho máximo: 15 páginas, podendo conter figuras, tabelas ou gráficos. Ponto de vista: esta seção tem por objetivo receber artigos que con-tenham opiniões de autores a respeito de assuntos polêmicos e de interesse para a ciência em animais de laboratório. O texto pode ser apresentado em português ou inglês;

c) breve comunicação: Caso original estudado de relevância com aproximadamente 1.500 palavras, incluindo resumo com não menos que 200 palavras. O texto pode ser apresentado em português ou inglês;

d) seção memórias: relatos sobre a memória da área. Serão convidados os autores para comporem essa seção. O texto pode ser apresentado em português ou inglês.

PaginaçãoOs artigos devem conter no máximo 10 laudas

(cada lauda = 1.250 caracteres sem espaço), incluindo--se as referências – seguir normas de publicação.

Folha de Rosto (Identificação)a) título e subtítulo – em português e inglês;b) nome e sobrenome de cada autor; filiação a qual

instituição pertence;c) nome do departamento onde o trabalho foi realiza-

do;d) nome e endereço eletrônico do autor para corres-

pondência;

INSTRUÇÕES AOS AUTORESNORmAS PARA PUblICAÇãO

e) se foi baseado em Tese, indicar o título, ano e ins-tituição onde foi apresentada;

f) se foi apresentado em reunião científica, indicar o evento, local e data de realização;

g) se foi subvencionado, indicar o tipo de auxílio, nome do agente financeiro e o número do processo;

h) agradecimentos:- contribuições (assessoria científica, coleta e

dados, revisão crítica da pesquisa),- instituições (apoio econômico, material e ou-

tros).

Estrutura do TextoIntrodução: deve ser curta, definindo o problema

estudado sintetizando sua importância.Material e Métodos: deve conter os critérios de

amostragem e a descrição, breve e clara, dos métodos usados, que permita a compreensão e repetição do trabalho. Processo e Técnicas já publicados devem ser referidos, por citação, a menos que tenham sido modificados. Relatar informações detalhadas sobre os animais e suas condições de criação e manutenção; a eutanásia dos animais deve ser coerente com recomen-dações contidas nos Guias de Cuidados nacionais e internacionais reconhecidos oficialmente.

Resultados: deve se limitar a descrever os resul-tados encontrados sem incluir interpretações/compa-rações.

Discussão: deve começar apreciando as limitações do estudo, seguida da comparação com a literatura e a interpretação dos autores, extraindo conclusões, indicando novos caminhos para pesquisa.

Conclusão: para os artigos originais. Deve ser fundamentada pela discussão feita sobre os resultados obtidos.

Resumo e Palavras-Chavea) português e inglês (até 250 palavras). Deverá

conter objetivo, métodos, resultados e conclusões. Os trabalhos enviados em língua portuguesa terão resumo em língua inglesa e vice-versa;

b) descritores (usar o vocabulário): Descritores em Ciências da Saúde (DeCS) - http://decs.bvs.br/.

Ilustrações (figuras, quadros, fotografias, desenhos, gráficos, entre outros)

As ilustrações deverão vir logo após as referências (numeradas em ordem consecutiva ao longo do texto); Legendas à parte.

Deverão ser apresentadas, priorizando a compre-ensão do texto e dos dados. As figuras deverão ser originais em formato jpeg com tamanho 7 cm de largura por 9,5 cm de altura ou 170 pixels de largura por 269 pixels de altura com até 250 Kb. As letras e símbolos devem estar na legenda. As legendas das ilustrações devem permitir sua perfeita compreensão, independentemente do texto.

As ilustrações deverão ser numeradas separadamen-te, usando algarismo arábico, na ordem de aparecimento no texto. Cada ilustração deverá conter o seu respectivo número e estrutura em discussão, indicada com seta.

TabelasAs tabelas também devem ser incluídas no mesmo

arquivo, logo após as referências (numeradas em ordem consecutiva ao longo do texto) devem ter título breve.

As legendas das tabelas devem permitir sua perfeita compreensão, independentemente do texto.

As tabelas deverão ser numeradas separadamente, usando algarismo arábico, na ordem de aparecimento no texto. Cada tabela deverá conter o seu respectivo número e estrutura em discussão, indicada com seta.

Obs: não usar traços horizontais ou verticais internos.

UnidadesSeguir as normas do Instituto Nacional de Metro-

logia, Normalização e Qualidade Industrial (Inmetro) no endereço eletrônico: www.inmetro.gov.br.

Abreviaturas e Siglasa) forma padrão da língua portuguesa e inglesa;b) não usar no título e no resumo.

Agradecimentos ver Folha de RostoA quem colaborou de modo significativo na reali-

zação do artigo, devem vir antes das referências.

Citações no TextoPara citação no texto, utilizar o sistema numérico

remetendo à lista de referências ao final do trabalho. A indicação da fonte é feita por uma numeração única e consecutiva, em algarismos arábicos, situada pouco acima da linha do texto em sobrescrito, após a pontu-ação que encerra a citação.

Exemplo:“Os animais de laboratório são definidos por di-

ferentes espécies que são mantidas, ou criadas, em

viveiros como cobaias, chamados biotério”.1. Podem ser coelhos, ratos, hamsters, entre outros.

Quando for necessário citar o autor, indicar apenas o autor e o número da citação.

Exemplo:Para Mendes2 esses animais são de extrema impor-

tância para a ciência.

Referências (Vancouver)a) a elaboração da lista de referências é feita pelo sis-

tema numérico na mesma ordem em que aparecem no texto;

b) o título do periódico deverá ter seu nome abreviado de acordo com a List of Journals Index in Index Medicus: acessar o endereço eletrônico: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nlmcatalog/journals;

c) devem ser citados todos os autores, quando até seis; acima deste número, citam-se os seis primeiros seguidos de et al., separados por vírgula (,).Exemplos:1 Silva EM, Pereira AS, Santos AA, Mendonça

RM, Mendes AL, Arruda LJ.2 Santos AA, Arruda LJ, Couto LP, Mendes AL,

Viana BP, Rocha RS, et al.d) a exatidão das referências é de responsabilidade

dos autores.

Para exemplos de referências que não forem con-templadas nestas instruções, acessar o International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) no endereço http://www.icmje.org.

Exemplos:

Artigo de Periódico

Sans-Coma V, Carmen Fernández M, Fernández B, Durán AC, Anderson RH, Arqué JM. Genetically alike Syrian hamsters display both bifoliate and trifoliate aortic valves. J Anat. 2012 Jan;220(1):92-101. doi: 10.1111/j.1469-7580.2011.01440.x.

Datta S, Adak R, Chakraborty P, Haldar AK, Bhat-tacharjee S, Chakraborty A, et al. Radio-attenuated leishmanial parasites as immunoprophylactic agent against experimental murine visceral leishmaniasis. Exp Parasitol. 2012 Jan;130(1):39-47.

livro

Mesmo Autor da Obra no TodoHawk CT, Leary SL, Morris TH. Formulary for

laboratory animals. 3rd ed. Oxford: Blackwell; 2005. 203 p.

Autor distinto da obra no todoPhillips SJ, Whisnant JP. Hypertension and stroke.

In: Laragh JH, Brener BM, editors. Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management. 2nd ed. New York: Raven Press; 1995.p. 655-8.

Dissertações/TesesLeite DP. Padrão de prescrição para pacientes

pediátricos hospitalizados: uma abordagem farmacoe-pidemiológica [dissertação]. Campinas: Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas ; 1998.

Dissertações/Teses on-lineChaguri LCAG. Estudo de um sistema de análise

de preferências climáticas para animais convencionais de laboratório por tecnologia de ventilação microam-biental e avaliações biológicas. I. Avaliação da efici-ência de um protótipo, para o estudo de parâmetros ambientais, resultados parciais verificados em ratos (Rattus norvegicus). [tese na Internet]. São Paulo (Brasil): Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia; 2009 [citado 22 fev. 2011]. 109 p. Disponível em: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10133/tde-07122009-113246/pt-br.php.

Trabalho Apresentado em EventoCosta MSD. Aspectos éticos relacionados à infra-

estrutura de biotérios em universidades públicas. 28ª. Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Odontológica; 3-6 set. 2011; Águas de Lindoia, BR. São Paulo: Sociedade Brasileira de Pesquisa Odonto-lógica; 2011. Resumo PE024.

Trabalho de evento publicado em periódicoCosta MSD. Aspectos éticos relacionados à in-

fraestrutura de biotérios em universidades públicas. Apresentado à 28ª. Reunião Anual da Sociedade Bra-sileira de Pesquisa Odontológica; 3-6 set. 2011; Águas de Lindoia, BR. Anais. (Braz Oral Res. 2011;25:57. Resumo PE024.

revista da sociedade brasileira de ciência em animais de laboratório

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