Replicação de DNAReplicação de DNA

DuplaDupla--hélice composta hélice composta de de nucleotídeos ligados nucleotídeos ligados entre si entre si e e cujascujas bases bases nitrogenadas nitrogenadas de de uma uma

hélice fazemhélice fazem pontes de pontes de hidrogênio hidrogênio com bases com bases nitrogenadas nitrogenadas de de outra outra hélicehélice, , numa direção numa direção

antianti--paralelaparalela..

DNADNA

Replicação do DNAProcesso que precede a divisProcesso que precede a divisãão celular e atravo celular e atravéés do qual ss do qual sãão o geradas cgeradas cóópias pias ididêênticasnticas das moldas molééculas de DNA presentes culas de DNA presentes na cna céélulalula--mmããe, a seguir herdadas pelas duas ce, a seguir herdadas pelas duas céélulaslulas--filhasfilhas

Duplicação dos cromossomos

Divisão celular

Separação dos cromossomos

Cada vez que uma Cada vez que uma célula divide a célula divide a informação informação genética precisa genética precisa ser transmitida às ser transmitida às células filhascélulas filhas

formação de formação de gametas para gametas para transmissão da transmissão da informação informação para a próxima para a próxima geraçãogeração

Ciclo CelularCiclo Celular

Antes de iniciar a Antes de iniciar a condensação dos condensação dos

cromossomos o DNA cromossomos o DNA necessita ser duplicado : necessita ser duplicado :

é a fase S é a fase S

ExperimentoExperimento de de MeselsonMeselson & Stahl, 1958& Stahl, 1958

A perguntaA pergunta

Cultivo de bactérias Cultivo de bactérias em meio contendo em meio contendo 1515NHNH44Cl,Cl,IsótopoIsótopo pesado de Npesado de N

Transferência para Transferência para meio contendo meio contendo 1414NHNH44ClCl

Extração e purificação do DNA Extração e purificação do DNA seguida de centrifugação em seguida de centrifugação em gradiente de gradiente de CsClCsCl

Molécula parental

Primeira geração de moléculas “filhas”

Segunda geração de moléculas “filhas”

ExperimentoExperimento de de MeselsonMeselson & Stahl, 1958& Stahl, 1958

A respostaA resposta

Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas

•• Síntese de DNA é Síntese de DNA é semisemi--conservativaconservativa

Fita 1 parental

Fita 2 parental

Fita 1parental

Fita 2parental

Fita 2“filha”

Fita 1“filha”

ReplicaçãoReplicação do do cromossomocromossomo bacterianobacteriano

ExperimentoExperimento de J. Cairns, 1963de J. Cairns, 1963

Cultivo de bactérias Cultivo de bactérias em meio contendo em meio contendo Trítio (Trítio (33H),H), isótopoisótoporadioativo de Hradioativo de H

Isolamento do DNA, Isolamento do DNA, espalhamento em espalhamento em emulsão fotográficaemulsão fotográfica

Observação em Observação em microscópio eletrônicomicroscópio eletrônico

Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas

••Começa numa Começa numa origem de origem de replicação (replicação (OriOri) e é ) e é bidirecionalbidirecional

O genoma bacteriano circular constitui um O genoma bacteriano circular constitui um únicoúnico repliconreplicon

•• A velocidade da forquilha de replicação A velocidade da forquilha de replicação bacteriana é bacteriana é 50.00050.000 pb/minpb/min

•• Um única origem de replicação em Um única origem de replicação em E.E.colicoli((OriCOriC, 245 pb), 245 pb)

Forquilha de replicaçãoForquilha de replicaçãoRegião do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita duplaRegião do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as para as novas fitas filhas duplasnovas fitas filhas duplas

O genoma eucariótico possui O genoma eucariótico possui váriosvários repliconsreplicons

•• A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é 2.0002.000 pb/minpb/min•• Os Os repliconsreplicons eucarióticos tem 40eucarióticos tem 40--100 kb e são iniciados em tempos diferentes100 kb e são iniciados em tempos diferentes•• Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somáticaFase S demora ~ 6hrs em uma célula somática

RepliconRepliconUnidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicaçãoUnidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação

•• Origem + TérminoOrigem + Término

•• Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celularAtivados apenas uma única vez em cada ciclo celular

•• O genoma de uma O genoma de uma célula procarióticacélula procariótica possui um possui um único único repliconreplicon

•• Cada Cada cromossomo eucarióticocromossomo eucariótico possui possui vários vários repliconsreplicons e todos são e todos são

ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não

simultaneamentesimultaneamente

Primeiro passoPrimeiro passo: : abrir abrir o DNA (o DNA (forquilha forquilha de de replicaçãoreplicação) e ) e manter manter as as fitas separadasfitas separadas

O que dirige a escolha do nucleotídeo a ser adicionado à fita é a especificidade A-T/C-G e o alongamento ocorre somente no

sentido 5’ – 3’, devido à necessidade de um grupamento 3’OH livre para formação da ligação fosfodiéster

DNA ou iniciador RNA

DNA polimerase

Fita de DNAmolde

DesoxiribonucleosídeoDesoxiribonucleosídeo5´trifosfato 5´trifosfato (substrato)(substrato)

Fita sendo Fita sendo polimerizadapolimerizada

Fita moldeFita molde

Síntese da cadeia de DNA envolve a formação Síntese da cadeia de DNA envolve a formação das ligações das ligações fosfodiésterfosfodiéster

A ligação fosfodiéster se dá entre o grupamento 3’OH de um nucleotídeo já existentes na fita e o grupamento 5’P do

nucleotídeo livre

iniciador

trifosfatode guanosina

Fita de DNA molde

Fita de DNA molde

iniciador

Na formação da ligação fosfodiéster é liberado um grupo pirofosfato rico em energia

Fita de DNA molde

iniciadorLiberação de pirofosfato

DNA é sintetizado porDNA é sintetizado por DNA DNA polimerasespolimerases

•• DNA DNA polimerasepolimerase I foi isolada a I foi isolada a partir de E.partir de E.colicoli em 1955 por A. em 1955 por A. KornbergKornberg

•• As DNA As DNA polimerasespolimerases necessitam necessitam sempre de um sempre de um DNA moldeDNA molde e uma e uma sequênciasequência iniciadora.iniciadora.

•• O substrato da síntese é o O substrato da síntese é o desoxiribonucleosídeodesoxiribonucleosídeo 5´5´--trifosfato.trifosfato.

•• A síntese de DNA ocorre pela A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos aadição de nucleotídeos aextremidade 3´OHextremidade 3´OH da cadeia em da cadeia em crescimento.crescimento.

••Sentido da síntese Sentido da síntese sempre sempre éé

5’ 5’ →→ 3’.3’.

Replicação Replicação do DNA do DNA -- característicascaracterísticas

•• Síntese de DNA procede Síntese de DNA procede na direção 5´na direção 5´--3´3´

A replicação se dá nas duas fitas ao mesmo tempo, porém A replicação se dá nas duas fitas ao mesmo tempo, porém em sentidos opostosem sentidos opostos

DNA parental

Fita contínua

Fita descontínua

No caso da síntese da fita descontínua, iniciadores de RNA No caso da síntese da fita descontínua, iniciadores de RNA são produzidos ao longo de todo o processo pela são produzidos ao longo de todo o processo pela primaseprimase

Fita contínua

Fita descontínuaIniciador Iniciador dede RNARNA

Observe o alongamento das duas fitas em sentidos opostosObserve o alongamento das duas fitas em sentidos opostos

Fita contínua

Fita descontínua

Os fragmentos sintetizados na fita descontínua são Os fragmentos sintetizados na fita descontínua são chamados de fragmentos de chamados de fragmentos de Okazaki Okazaki e são ligados e são ligados

enzimaticamente enzimaticamente para gerar uma fita contínuapara gerar uma fita contínua

Fita contínua

Fita descontínua

Fragmento deOkazaki

Fita com síntese contínua

Fita com síntese descontínua

Fragmentos de Fragmentos de OkazakiOkazaki::Bactéria: Bactéria: 1.000 a 2.0001.000 a 2.000 pbpb

EucariotosEucariotos: : 150 a 200150 a 200 pbpb

Síntese de DNA ocorreSíntese de DNA ocorre sempresempre na direçãona direção5’ 5’ →→ 33’’ e e éé semisemi--descontdescontíínuanua

As subAs sub--unidades Beta da DNAunidades Beta da DNA--polimerasepolimerase envolvem a envolvem a dupla hélice formada durante a replicaçãodupla hélice formada durante a replicação

Dupla - hélicenascente

Sub-unidades beta da Pol

PRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAÇÃOPRINCIPAIS COMPONENTES ENVOLVIDOS NA REPLICAÇÃO

DNA polimerase

DNA polimerase

proteína ligante de DNA

Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli

DnaA Reconhece a origem oriC e abre a dupla fita em sítios específicos

DnaB (helicase) Desenrola o DNA

DnaC Auxilia a ligação de DnaB na origem

HU Proteína do tipo histona que estimula a iniciação

Primase (DnaG) Sintetiza os iniciadores de RNA

Single strand binding(SSB)

Liga a fita simples de DNA

RNA polimerase Facilita a ação da DnaA

DNA girase(topoisomerase)

Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita

Dam Metilase Metila as sequências GATC na OriC

Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas

Pol I Pol II Pol IIIPolimerização 5’ → 3’ + + +Exonuclease 3’ → 5’ + + +Exonuclease 5’ → 3’ + - -Número de subunidades 1 ≥4 ≥ 10Velocidade de Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1.000

Processividade 3-200 1.500 ≥ 500.000(nt adicionados antesda dissociação da fita-molde)

Reparo (Pol IV e V) Principal enzima dereplicação em E.coli

Atividade exonuclease 5’ → 3’,responsável pelo processo de remoção dos iniciadores de RNA

A DNAA DNA--polimerasepolimerase III é III é multiméricamultimérica, formada por mais , formada por mais de 10 cadeias, com uma simetria de 10 cadeias, com uma simetria diméricadimérica

Fita na qual ocorreFita na qual ocorrea síntese contínuaa síntese contínua

Fita na qual ocorre aFita na qual ocorre asíntese descontínuasíntese descontínua

As subAs sub--unidades unidades ττ mantmantéém a m a estrutura estrutura dimdimééricarica

6 sub6 sub--unidadesunidades6 sub6 sub--unidadesunidades

IniciaIniciaçãção o -- 11ºº estestáágiogio dada replicareplicaçãçãoo emem E.E.colicoli

Estrutura da origem de replicação bacteriana Estrutura da origem de replicação bacteriana orioriCC

•• A origem de replicação A origem de replicação OriOriCC é é extremamente conservadaextremamente conservada..•• sequênciassequências repetidas com 9 e 13 bases, repetidas com 9 e 13 bases, ricas em Aricas em A--TT são são reconhecidas por > 9 enzimas diferentes.reconhecidas por > 9 enzimas diferentes.•• enriquecidaenriquecida na na sequênciasequência palindrômicapalindrômica GATC, alvo de GATC, alvo de metilaçãometilaçãoenzimática enzimática na adenina .na adenina .

Origem de Replicação em bactériasOrigem de Replicação em bactériasSomente origens completamente Somente origens completamente metiladasmetiladas podem iniciar a replicaçãopodem iniciar a replicação

Elongação Elongação -- 22º º estágioestágio dada replicaçãoreplicação

Replicação do DNA Replicação do DNA -- ResumoResumo

• Replicação do DNA é semi-conservativa

• Replicação é bi-direcional.

• Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 replicon,

cromossomos eucariotos possuem vários amplicons.

• O DNA é sintetizado por DNA polimerase, uma enzima multimérica,

• A síntese ocorre sempre no sentido 5´ - 3’, com atividade revisora

3´- 5´.

• A síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita oposta

• Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação,

elongação e terminação da replicação.

•• Replicação do DNA é semiReplicação do DNA é semi--conservativaconservativa

•• Replicação é biReplicação é bi--direcional.direcional.

•• Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 Cromossomos bacterianos possuem apenas 1 repliconreplicon, ,

cromossomos cromossomos eucariotoseucariotos possuem vários possuem vários ampliconsamplicons..

•• O DNA é sintetizado por DNA O DNA é sintetizado por DNA polimerasepolimerase, uma enzima , uma enzima multiméricamultimérica, ,

•• A síntese ocorre sempre no sentido 5´ A síntese ocorre sempre no sentido 5´ -- 3’, com atividade revisora 3’, com atividade revisora

3´3´-- 5´.5´.

•• A síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita opA síntese é contínua em uma das fitas e descontínua na fita opostaosta

•• Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação, Um complexo de mais 9 enzimas está envolvido na iniciação,

elongação e terminação da replicação.elongação e terminação da replicação.

Geometria do pareamento das Geometria do pareamento das bases contribui para a fidelidade bases contribui para a fidelidade da replicação do DNAda replicação do DNA

Pareamento correto

Pareamento incorreto

TT

AA

CC GG

TT

AA

AA

CC

GG

GG

Atividade revisora (atividade Atividade revisora (atividade exonucleaseexonuclease 3’ 3’ →→ 5’) 5’) garante a fidelidade da replicaçãogarante a fidelidade da replicação

ReparoReparo do DNAdo DNA

-- ““Mismatch repairMismatch repair””

-- Reparo por ExcisReparo por Excisãão de Baseso de Bases

-- Reparo por ExcisReparo por Excisãão de Nucleoto de Nucleotíídeosdeos

-- Reparo DiretoReparo Direto

-- Reparo por RecombinaReparo por Recombinaçãçãoo

““Mismatch repairMismatch repair”” ::Corrige erros de replicaCorrige erros de replicaçãçãoo

ReparoReparo do DNAdo DNA

Reparo por ExcisReparo por Excisãão o de Bases:de Bases:Remove a UracilaRemove a Uracila(citosina alterada)(citosina alterada)

ReparoReparo do DNAdo DNA

UracilaUracilaCitosinaCitosina

Reparo por Reparo por ExcisExcisãão de o de NucleotNucleotíídeos :deos :Remove o Remove o nucleotnucleotíídeodeo

ReparoReparo do DNAdo DNA

Reparo Direto :Reparo Direto :NNãão ho háá remoremoçãção de nucleoto de nucleotíídeosdeos

ReparoReparo do DNAdo DNA

Reparo por Reparo por RecombinaRecombinaçãção :o :UsaUsa--se uma outra se uma outra molmoléécula de DNA cula de DNA

ReparoReparo do DNAdo DNA

Célula Célula NormalNormal CâncerCâncer

estimaestima--se que 6se que 6--7 eventos devem ocorrer (em ~207 eventos devem ocorrer (em ~20--40 anos) para indução do câncer 40 anos) para indução do câncer

em certos casos a propensão ao câncer é hereditáriaem certos casos a propensão ao câncer é hereditária

Recombinaçãoconstitui na troca ou constitui na troca ou

incorporação de uma incorporação de uma seqüência de DNA com seqüência de DNA com (à) outra(à) outra

na meiose ocorre a na meiose ocorre a recombinação homóloga recombinação homóloga (troca de trechos)(troca de trechos)

a recombinação a recombinação somática é responsável somática é responsável pelo rearranjo de BCR e pelo rearranjo de BCR e TCRTCR

DNA de bactérias e DNA de bactérias e virus virus também sofrem também sofrem recombinaçãorecombinação

recombinase RecA recombinase RecA e e Rec Rec BCDBCD

recombinação homólogarecombinação homóloga

cadeia leve cadeia leve λλ

cadeia leve cadeia leve κκ

cadeia pesadacadeia pesada

Recombinação SomáticaRecombinação Somática

recombinase recombinase RAG1 e RAG2RAG1 e RAG2

RSS: a regra de recombinaçãoRSS: a regra de recombinação

há a formação há a formação de alças durante de alças durante o rearranjoo rearranjo

e parte do e parte do DNA DNA genômico genômico é é perdidoperdido

Repertório ImunológicoRepertório ImunológicoRepertório Imunológico

EventosEventos

VVDDJJinserções inserções

TOTALTOTAL

HH

515130305522

κκ + + λλ

69690055(1)(1)

10101616

ImunoglobulinasImunoglobulinasDNA germinativoDNA germinativo

DNA DNA rearranjadorearranjado

mRNAmRNA maduromaduro

proteínaproteína

A A hipermutaçãohipermutação somática ocorre após a somática ocorre após a ativação do linfócito B no centro ativação do linfócito B no centro germinativo e leva a maturação por germinativo e leva a maturação por afinidade. afinidade.

taxa de mutação neste processo : 1/1000 taxa de mutação neste processo : 1/1000 bpbp(normal : 1/ 10(normal : 1/ 106 6 ou menos)ou menos)

a cada divisão 1/2 linfócitos modificam suaa cada divisão 1/2 linfócitos modificam suaseqüênciaseqüência

mutação ocorre nas regiões V mutação ocorre nas regiões V rearranjadasrearranjadas

conseqüência da grande proliferação e conseqüência da grande proliferação e hipermutaçãohipermutação

na fase após infecção de uma bactéria pode ocorrer a recombinação (integração) do DNA do fago no DNA da bactéria

Ciclo de vida de um bacteriófago lambdaCiclo de vida de um bacteriófago lambda

na fase após infecção de uma bactéria ocorre a recombinação (integração) sítio-específica (att) do DNA do fago no DNA da

bactéria

Há replicação do DNA do fago, formação de novas partículas e o ciclo de fecha

os fagos permanecem dentro das bactérias e assim podem ser usados para formar bibliotecas de DNA