UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

PRISCILA PEREIRA PASSOS

REPERCUSSÕES DA DEFICIÊNCIA CRÔNICA EM ÁCIDOS GRAXOS ESSENCIAIS SOBRE A DISTRIBUIÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE

NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS DA SUBSTÂNCIA NEGRA DE RATOS WISTAR

RECIFE-PE 2008

PRISCILA PEREIRA PASSOS

REPERCUSSÕES DA DEFICIÊNCIA CRÔNICA EM ÁCIDOS GRAXOS ESSENCIAIS SOBRE A DISTRIBUIÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE

NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS DA SUBSTÂNCIA NEGRA DE RATOS WISTAR

Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas – área Fisiologia - como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre.

Orientadora Profª Drª BELMIRA LARA DA SILVEIRA ANDRADE DA COSTA

Co-orientadora Profª Drª JULIANA MARIA CARRAZONE BORBA

RECIFE-PE 2008

Passos, Priscila Pereira Passos, Priscila Pereira Repercussões da deficiência crônica em ácidos graxos essenciais sobre a distribuição e diferenciação de neurônios dopaminérgicos da substância negra / Priscila Pereira Passos. – Recife: O Autor, 2008.

Repercussões da deficiência crônica em ácidos graxos essenciais sobre a distribuição e diferenciação de neurônios dopaminérgicos da substância negra / Priscila Pereira Passos. – Recife: O Autor, 2008. 70 folhas: fig.; tab. 70 folhas: fig.; tab.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Bioquímica e Fisiologia, 2008.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Bioquímica e Fisiologia, 2008.

Inclui bibliografia e anexo. Inclui bibliografia e anexo.

1. Ácidos Graxos Essenciais 2. Sistema dopaminérgico 3. Substância negra 4. Tirosina hidroxilase I Título.

1. Ácidos Graxos Essenciais 2. Sistema dopaminérgico 3. Substância negra 4. Tirosina hidroxilase I Título. 577.115.3 CDU (2.ed.) UFPE 577.115.3 CDU (2.ed.) UFPE 572.57 CDD (22.ed.) CCB – 2009- 76 572.57 CDD (22.ed.) CCB – 2009- 76

PRISCILA PEREIRA PASSOS

REPERCUSSÕES DA DEFICIÊNCIA CRÔNICA EM ÁCIDOS GRAXOS ESSENCIAIS SOBRE A DISTRIBUIÇÃO E

DIFERENCIAÇÃO DE NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS DA SUBSTÂNCIA NEGRA DE RATOS WISTAR

Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas – área Fisiologia - como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre.

Orientadora Profª Drª BELMIRA LARA DA SILVEIRA ANDRADE DA COSTA

Co-orientadora Profª Drª JULIANA MARIA CARRAZONE BORBA

Aprovada em 19/ 12/2008 BANCA EXAMINADORA

Prof. Dra. Anete Curte Ferraz Universidade Federal do Paraná

Prof. Dr. Eduardo Beltrão Universidade Federal de Pernambuco

Prof. Dr. Mohammed Saad Lahlou

Universidade Federal de Pernambuco

Aos meus pais JOSIAS e CONCEIÇÃO e a minha filha LETÍCIA, meus grandes e eternos amores

“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode

começar agora e fazer um novo fim”.

Chico Xavier (1910-2002) – Médium mineiro.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente e indubitavelmente à DEUS, pois apenas com fé conseguimos

vencer os grandes desafios e provas da vida.

A toda minha família que é a minha base, meu alicerce. Em especial aos meus

pais JOSIAS PASSOS e CONCEIÇÃO PASSOS pelo exemplo e incentivos constantes e a

minha filha LETÍCIA PASSOS razão de toda essa luta.

À prof. Dra. BELMIRA LARA pela dedicação, atenção e compreensão e

principalmente pela paciência com minhas inseguranças e imaturidade, especialmente no

aspecto científico, mas sem esquecer o lado pessoal. Agradeço de caráter fiel, puro e

incontestável por toda a ajuda e compaixão.

À prof. Dra. JULIANA CARRAZZONE, mais do que professora, amiga e

confidente, por estar tão presente no desenvolvimento do presente estudo, sempre

disponibilizando “um tempinho” para conclusão desse e por palavras encorajadoras.

Aos professores doutores RUBEM GUEDES, REGINALDO PEREIRA da

SILVA, ANA PAULA DE MELO e ÂNGELA AMÂNCIO.

Aos professores e colaboradores, da Universidade Federal do Pará, prof. Dr.

CRISTÓVAM WANDERLEY PICANÇO DINIZ e ao prof. JOÃO BENTO.

Às profas. Dra. MIRIAM STELLA MARIS DE OLIVEIRA COSTA (UFRN)

e KÁTIA MARIA MARQUES GOUVEIA (UFAL).

Aos técnicos de laboratórios ZENIRA XAVIER (em especial pela grande

proximidade), NIELSON, REJANE, MAURICÉIA SILVA e ZÉ ANTÔNIO, pelo auxílio

com suas experiências nos procedimentos, preparo de soluções e principalmente pela

dedicação e solidariedade.

Ao médico veterinário e técnico do laboratório WALDO OLIVEIRA, bem

como a HELENO por nos ajudar na criação de nossos animais. Não esquecendo do

veterinário do Departamento de Nutrição EDEONES FRANÇA.

Aos alunos de iniciação científica, DIANA ANDRADE e WALDENÍCIO

TAVARES pelo interesse e dedicação, bem como aos demais LARA NEVES, ÉRICA

SIQUEIRA e PAULO FONSECA.

Ao Departamento de Anatomia da UFPE, onde capturamos a maioria das

nossas imagens digitalizadas.

A todos meus amigos que compartilharam essa caminhada, em especial a

LEOMARI CERDEIRA e aos meus colegas de plantão pela realização das trocas de

horários e compreensão, principalmente ao meu chefe e amigo WILDBERG ALENCAR

(do RHP) e minha “chefa” e amiga ANA TEREZA ALMEIDA de ALCÂNTARA (do

HEMOPE).

Ao meu amor companheiro MÁRIO ALVES LIMA NETO neste último ano

de mestrado e primeiro de nossas vidas.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

RESUMO

Ácidos graxos essenciais (AGEs) são fundamentais para o desenvolvimento normal do cérebro especialmente durante a gestação e o aleitamento e de significância para a neurogênese, diferenciação neuronal e sinaptogênese, podendo exercer atividades anti-oxidativas e antiinflamatórias. No presente estudo investigamos se deficiência crônica em ácido linoléico e ácido alfa-linolênico por até duas gerações altera a distribuição e diferenciação de neurônios dopaminérgicos presentes na substância negra compacta (RD) e na substância negra reticulada (RV) os quais diferem do ponto de vista morfológico, neuroquímico e funcional. Ratos Wistar foram alimentados a partir do acasalamento com dieta balanceada e subdivididos, de acordo com a fonte lipídica utilizada nas suas dietas, em grupo controle (C; óleo de soja) e grupo deficiente em AGEs (DAGEs; óleo de coco). Os filhotes da primeira geração (F1) foram analisados aos 90-101 dias e os da segunda geração (F2) aos 30-42 dias. Secções sagitais do encéfalo foram processadas para identificação dos neurônios dopaminérgicos a partir da imunorreatividade à enzima tirosina hidroxilase (TH). Análises dos limites citoarquitetônicos da substância negra (SN), tamanho do soma e número total de neurônios dopaminérgicos foram realizadas ao nível medial deste núcleo. Homogenados do mesencéfalo ventral foram processados por imunoblot para análise dos níveis protéicos da TH. Os resultados evidenciaram que a deficiência crônica em AGEs reduziu o peso corpóreo de animais adultos de F1 (C: 381,18g ± 10,56 e DAGEs: 355g ± 10,84 (p<0,01) e a evolução ponderal dos animais de F2 do nascimento a 30 dias (p<0,01). Redução no número (C: 282,20 ± 6,65 e DAGEs 238,83 ± 12,02; p<0,05) e aumento na área do soma (C: 237,88µm2 ± 3,44 e DAGES: 259,25µm2 ± 3,37; p<0,01) de neurônios dopaminérgicos foram observados na RD, mas não na RV, dos animais adultos de F1. A deficiência em AGEs por duas gerações reduziu os níveis da TH em homogenados do mesencéfalo ventral (p<0,001) e a área do soma dos neurônios dopaminérgicos em ambas regiões (C: 285,07µm2 ± 3,4 (RD); 347,63 µm2 ± 3,83 (RV) e DAGEs: 257,03 µm2 ± 4,62 (RD); 331,41µm2 ± 4,89 (RV), p<0,05). No entanto, apenas na RD foi observada uma redução no número de neurônios dopaminérgicos (C: 268,57 ± 18,67 e DAGEs: 221,71 ± 6,99 p<0,05). Conclusões: Os resultados evidenciam a importância dos AGEs para o desenvolvimento da substância negra e indicam uma maior vulnerabilidade dos neurônios dopaminérgicos da pars compacta em relação aos da pars reticulada a lesões induzidas pela deficiência crônica destes macronutrientes. Além disto, os dados também reforçam a importância dos AGEs para o desenvolvimento de regiões encefálicas envolvidas com funções motoras e cognitivas bem como para a prevenção de processos neurodegenerativos.

Palavras-chave: ácidos graxos essenciais, sistema dopaminérgico, substância negra, tirosina hidroxilase

i

ABSTRACT

Essential fatty acids are fundamental to brain development especially during gestation and lactation periods in which they are involved in neurogenesis, differentiation, synaptogenesis, anti-oxidative and neuroprotective actions. In the present study we investigated whether a chronic dietary deprivation in linoleic acid and alpha-linolenic acid for until two generations is able to modify the distribution and differentiation of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compact (RD) and pars reticulada (RV), considering that these neurons differ in morphological, neurochemical and functional aspects. One (F1) or two (F2) generations of Wistar rats were fed a balanced diet and subdivided according the fatty source present in the diets in two groups: control group (C; soya oil) and essential fatty acid deficient group (DAGEs; coconut oil). In the first generation the animals were analyzed at 90-100 days and those of the second generation at 30-40 days. Brain sagital sections were processed by immunohistochemisty for the enzyme tyrosine hidroxilase (TH). Analysis of the cytoarchitectonic limits of substantia nigra, size and total number of dopaminergic neurons were assessed at the middle level of this nucleus. Ventral midbrain homogenates were processed by immunoblot for analysis of protein levels of TH. The results show that chronic essential fatty acid deficiency reduced the body weight of adult animals (90-110 dias) in F1 the body (C: 381,18g ± 10,56 e DAGEs: 355g ± 10,84 (p<0,01) and brain weights (C: 1,68 g ± 0,06 and DAGEs: 1,56 g ± 0,11 (p<0,01)) of animals in F2. A significant reduction in the number (C: 282,20 ± 6,65 e DAGEs 238,83 ± 12,02; p<0,05) and an increase in soma size (C: 237,88µm2 ± 3,44 e DAGES: 259,25µm2 ± 3,37; p<0,01) of dopaminergic neurons was detected in the RD, but not in the RV, of adult animals of F1. The AGE deficiency for two generations reduced the protein levels of TH in homogenates of ventral midbrain (p < 0,001) and the soma size of dopaminergic neurons in both regions (C: F2 = 285,07 µm2 ± 3,4 (RD) and 347,63 µm2 ± 3,83 (RV) and DAGEs: F2 = 257,03 µm2 ± 4,62 (RD) and 331,41 µm2 ± 4,89 (RV), p < 0,05). However, only in the RD it was detected a reduction in the number of dopaminergic neurons (C: 268,57 ± 18,67 e DAGEs: 221,71 ± 6,99 p<0,05). The results show the relevance of AGEs for the development of the substantia nigra and indicate a higher vulnerability of dopaminergic neurons of pars compact as compared to those of pars reticulada to lesions induced by the chronic deficiency of these macronutrients. Moreover, the dada also reinforce the importance of essential fatty acids to development of brain regions involved in motor and cognitive functions and to prevent neurodegenerative events.

Key words: Essential fatty acid deficiency, dopaminergic system, substantia nigra, Tyrosine hidroxilase

ii

LISTA DE ABREVIATURAS

AA – Ácido araquidônico (20:4n-6)

ABC – Avidina-biotina-peroxidase

AG – Ácidos graxos

AGEs – Ácidos graxos essenciais

AGPIs – Ácidos graxos essenciais poliinsaturados

AGPI-CL – Ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa

ANOVA – Análise de variância

ATV – Área tegmental ventral

BHE – Barreira hemato-encefálica

BHT – Butil-hidroxitolueno

BNDF – Fator neurotrófico derivado do cérebro C – Controle

d – dias

D0- Dia zero (dia do nascimento – ambos os sexos)

D7 – Sete dia de nascidos (ambos os sexos)

D14 – Quartoze dias de nascidos (ambos os sexos)

D21 – Vinte e um dias de nascidos (ambos os sexos)

D21M- Machos com vinte e um dias de nascidos

D21F - Fêmeas com vinte e um dias de nascidas

D30M – Machos com trinta dias de nascidos

iii

D30F – Fêmeas com trinta dias de nascidas

D60M – Machos com sessenta dias de nascidos

D90M – Machos com noventa dias de nascidos

DA - Dopamina

DAB – 3,3 – Diamino benzidine

DAGEs – Deficiente em ácidos graxos essenciais

DAT – Proteína transportadora de dopamina

DHA – Ácido docosahexaenóico (22:6n-3)

DP – Desvio padrão

DV – dorso-ventral (diâmetro menor)

PGE - Prostaglandina

EP1 - Receptor de PGE2

EP2 – Receptor de PGE2

EPA - Eicosapentaenóico (20:5n-3)

EPM – Erro padrão da média

F1 – Primeira geração

F2 – Segunda geração

FE – Fosfatidiletanolamina

FI – Fosfatidilinositol

FS – Fosfatidilserina

GABA – Ácido gama aminobutírico

GDNF – Fator neurotrófico de células gliais derivadas (Glial cell derived neurotrophic factor)

iv

i.p. - intraperitoneal

MTPT – 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine

n – número de animais (amostra)

NGF – Fator de Crescimento Neural (Nerve growth factor)

NR-2 – linhagem de células neuronais

NT3 – Neurotrofina 3

Nurr 1 – Receptor orphan nuclear

PA – Paraformaldeído

PC12 – linhagem celular derivada de um feocromocitoma da medula supra-renal de

ratos

RD – Região rostro-dorso-medial (substância negra compacta)

RC – rostro-caudal (diâmetro maior)

RNAm – Ácido ribonucléico tipo mensageiro

RR – Núcleo retro-rubral

RV – Região caudo-ventro-lateral (substância negra reticulada)

SN – Substância Negra

SNC – Sistema nervoso central

TH – Tirosina Hidroxilase

TF – Tampão fosfato

UFPE – Universidade Federal de Pernambuco

UI – Unidade internacional

ω-3 – ômega 3

ω-6 – ômega 6

v

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1. Metabolismo dos ácidos graxos essenciais ω-3 e ω-6

04

Figura 2. Vias do sistema mesoestriatal e do sistema mesolimbocortical

11

Figura 3. Papel funcional da dopamina mesocorticolímbica

12

Figura 4. Secções sagitais para análise morfométrica das dimensões (diâmetro e área) da SN

25

Figura 5. Evolução ponderal dos animais dos grupos C e DAGEs até a idade de 30 dias nos grupos experimentais F1 e F2

28

Figura 6. Pesos corpóreos de ratos Wistar machos dos grupos experimentais de F1 com 60 e 90 dias

29

Figura 7. Pesos encefálicos e razão peso encefálico / peso corpóreo dos grupos experimentais F1 e F2

30

Figura 8. Secção sagital do encéfalo de rato albino correspondente à coordenada estereotáxica utilizada para análise morfométrica ao nível medial da SN

30

Figura 9. Secções sagitais do mesencéfalo evidenciando os limites citoarquitetônicos da SN

31

Figura 10. Dimensões lineares e bidimensionais dos limites citoarquitetônicos da SN nos grupos C e DAGEs de F1 e F2

32

Figura 11. Números totais de neurônios dopaminérgicos

34

Figura 12. Campos representativos das regiões dorsal e ventral de um animal do grupo C

35

Figura 13. Neurônios dopaminérgicos em secções sagitais ao nível da SN em RD e RV

35

Figura 14. Área do soma de neurônios dopaminérgicos presentes na RD e RV dos grupos C e DAGEs de F1 e F2

36

Figura 15. Imunoblots representativos evidenciando a expressão da enzima TH e da proteína actina em homogenados de córtex cerebral e mesencéfalo ventral de F1 e F2

37

Figura 16. Níveis de enzima TH normalizados para os níveis de actina em 37

vi

vii

homogenados do córtex cerebral e mesencéfalo ventral dos grupos C e DAGEs Tabela 1. Composição da dieta utilizada para confecção de 1kg de ração 19

SUMÁRIO

RESUMO i

ABSTRACT ii

LISTA DE ABREVIATURAS iii

LISTA DE FIGURAS E TABELA vi

I. INTRODUÇÃO

I.1. Importância da nutrição e dos lipídeos durante desenvolvimento do organismo

01

I.2. Importância dos ácidos graxos essenciais no desenvolvimento do sistema nervoso

05

I.3. Sistemas Dopaminérgicos Mesencefálicos 10

I.4. Características funcionais dos neurônios dopaminérgicos da substância negra

12

I.5. Justificativa e hipóteses do presente estudo 14

II. OBJETIVOS

II.1. Objetivo Geral 16

II.2. Objetivos Específicos 16

III. MATERIAIS E MÉTODOS

III.1. Animais 17

III.2. Grupos 18

III.3. Confecção e composição da dieta 19

III.3.1. Preparação da dieta 20

III.4. Procedimento imunohistoquímico para visualização dos neurônios dopaminérgicos

20

III.4.1. Protocolo de fixação, pesagem e secção do tecido encefálico

21

III.4.2. Protocolo de imunohistoquímica para marcação da enzima Tirosina Hidroxilase (TH)

22

III.4.3 – Análise da imunorreatividade da enzima tirosina hidroxilase na substância negra

24

III.5. Imunoblot para enzima tirosina hidroxilase e proteína transportadora de dopamina em homogenados de córtex e mesencéfalo ventral

25

IV. RESULTADOS

IV.1. Pesos Corpóreos 27

IV.2. Pesos encefálicos absolutos e relativos ao peso corpóreo 29

IV.3. Limites citoarquitetônicos da Substância Negra 30

IV.4. Número de neurônios dopaminérgicos nas regiões dorsal e ventral da substância negra

33

IV.5. Espectro de tamanho dos neurônios dopaminérgicos 34

IV.6. Imunoblot para enzima tirosina hidroxilase e para proteína transportadora de dopamina

37

V. DISCUSSÃO 39

VI. CONCLUSÃO 49

VII. PERSPECTIVAS 50

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52

IX. ANEXOS

IX.1. Carta de aprovação emitida pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE

68

IX.2. Tabela centesimal da dieta do Grupo C (óleo de soja, corante azul) 69

IX.3. Tabela centesimal da dieta do grupo DAGEs (óleo de coco, corante rosa)

70

1

I. INTRODUÇÃO

I.1. Importância da nutrição e dos lipídios durante desenvolvimento do organismo

O desenvolvimento e a organização funcional de um ser vivo requer, dentre

outros fatores, nutrição adequada. A nutrição pode ser considerada como elo dinâmico

fundamental entre os seres vivos e seu ecossistema. Desajustes entre fatores físicos,

biológicos e sociais envolvidos com estado nutricional, refletem-se em problemas

ocasionados por excesso ou por deficiências nutricionais (BATISTA-FILHO, 1994;

GRANTHAM-MCGREGOR et al., 1998). Má nutrição representa um tipo de insulto

ambiental multifatorial, uma vez que pode induzir privação social e intelectual (MORLEY

& LUCAS, 1997; GORDON, 1997), estresse emocional (SALAS & CINTRA, 1979;

MATHIEU et. al., 2008), prejuízos da interação mãe-filho (COLOMBO et al., 1992),

déficit cognitivo (GRANTHAM-MCGREGOR, 1995) bem como alterações no

metabolismo e crescimento cerebral (GRANTHAM-MCGREGOR, 1990; MATHIEU et

al., 2008). Além disso, efeitos neurais induzidos por vários tipos de má nutrição podem se

perpetuar e ser acumulativos sobre várias gerações (DESAI & HALES, 1997; PONTES

PESSOA et al., 2000; BOURRE, 2005; YEHUDA et al., 2005).

Maior vulnerabilidade do sistema nervoso central (SNC) aos efeitos da má

nutrição ocorre especialmente durante o período crítico de desenvolvimento cerebral. Este

período em humanos começa no último trimestre de vida fetal e continua até o 3° e 4° ano

de vida pós-natal. Em ratos, se inicia na gestação e corresponde principalmente à fase de

2

lactação. Durante esse período, processos como neurogênese, gliogênese, mielinização e

sinaptogênese se realizam com intensidade máxima. No entanto, a vulnerabilidade de várias

regiões cerebrais aos efeitos induzidos pela má nutrição não são uniformes, pois as mesmas

podem apresentar períodos distintos de desenvolvimento bem como mecanismos

diferenciados de plasticidade e adaptação durante ou após o desenvolvimento do SNC

(ALMEIDA et al., 2002; XIAO et al., 2005; LEVANT et al., 2006). Assim, seqüelas

promovidas pela má nutrição dependem do momento, intensidade e duração do distúrbio

nutricional, podendo desencadear efeitos provisórios ou permanentes na morfologia,

fisiologia e neuroquímica do sistema nervoso (MORGANE et al., 1993; GUEDES et al.,

1996; ALMEIDA et al., 2002; DIJCK-BROUWER et al., 2005). Vários autores têm

enfatizado que reserva nutricional materna ulterior ao período gestacional é um dos

principais fatores envolvidos com as conseqüências do déficit alimentar durante a gestação

e o aleitamento (DESAI & HALES, 1997; KOLETZO et al., 2008). Alterações decorrentes

da deficiência nutricional prolongada são consideradas como malformações secundárias e

caracterizam-se desde pequenas imperfeições no programa de desenvolvimento até

grosseiras distorções (MORGANE et al., 1993).

Os lipídios são componentes indispensáveis de uma dieta equilibrada para o

desenvolvimento do organismo. A estrutura fundamental dos lipídios é composta de ácidos

graxos (AG) os quais exercem várias atividades fisiológicas como constituintes estruturais

das membranas celulares, favorecem o ancoramento e a interação funcional de proteínas e

cumprem funções energéticas e de reservas metabólicas. Os AG são fundamentais ao

desenvolvimento do SNC, onde atuam sobre seu crescimento, função e integridade

3

(BOURRE, 2005) sendo liberados das membranas neuronais para exercer papéis como

biomensageiros celulares nos processos de transdução de sinais (YAVIN, 2006;

SCHROEDER et al., 2008)

A grande maioria dos AG pode ser sintetizada pelo nosso organismo, porém,

os ácidos graxos essenciais (AGEs) – alfa-linolênico (precursor da série ω-3) e linoléico

(precursor da série ω-6) não o são e para suprir a demanda orgânica, a sua ingesta torna-se

vital. Vários estudos apontam que a utilização de AGEs traz benefícios para a saúde

humana, prevenindo enfermidades cardiovasculares, câncer de cólon, doenças

imunológicas e favorecendo o desenvolvimento cerebral e da retina (AGRANOFF &

HAJRA, 1994; ZIMMER et al., 1999; BOURRE, 2006; DAS, 2008).

Os AGEs são precursores dos ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa

(AGPI-CL) como os ácidos araquidônico (20:4 n-6; AA), docosahexaenóico (22:6 n-3;

DHA) e eicosapentaenóico (20:5 n-3; EPA). A síntese dos AGPI-CL depende de processos

de alongamento e dessaturação de acordo com o esquema ilustrado na figura 1 (SCHMITZ

& ECKER, 2008).

4

FIGURA 1. Metabolismo dos ácidos graxos essenciais ω-3 e ω-6, sendo o ácido alfa-linolênico precursor da série ω-3 e o ácido linoléico precursor da série ω-6. Figura extraída de SCHMITZ & ECKER, 2008.

Para suprir a demanda do SNC, a síntese de AGPI-CL pode ocorrer em órgãos

extra-neurais tais como o fígado, sendo posteriormente transportados e captados pelo

cérebro ou ocorrer no próprio SNC após captação de seus precursores do plasma

(RAPOPORT et al., 2007). A barreira hemato-encefálica (BHE) regula a atividade e

captação dos AG no SNC (YEHUDA et al, 1997). A captação é seletiva favorecendo a

entrada de AGPI-CL e excluindo a entrada de colesterol e de AG saturados e AG

monoinsaturados (AVELLINI et al, 1994). A BHE é um dos possíveis sítios de

alongamento e dessaturação dos ácidos linoléico e linolênico. Os processos de alongamento

5

na BHE são mais eficientes para os AG ω-3 que para os AG ω-6 (MOORE et al, 1990).

Quando o aporte de ácido linolênico na dieta é reduzido, o fígado aumenta seus coeficientes

para a síntese de DHA aumentando as atividades de dessaturases 5 e 6 e elongases 2 e 5,

sendo esta última envolvida com a síntese de AA. (RAPOPORT et al., 2007).

I.2. Importância dos ácidos graxos essenciais no desenvolvimento do sistema nervoso

O SNC de mamíferos, depois do tecido adiposo, constitui o sistema que possui

maior concentração de lipídios do organismo, os quais correspondem cerca de 60% do peso

seco do tecido nervoso, dos quais 40% são de AGPI-CL, e desses cerca de 10% são de AA

e 15% de DHA. (VALENZUELA & NIETO, 2003; GREEN & YAVIN, 1996;

CRAWFORT et al., 1999). Partindo do princípio de que o SNC praticamente não contém

triacilgliceróis (como depósito energético) a principal função dos lipídios cerebrais é como

componente das membranas celulares.

Grandes concentrações de DHA são encontradas nos neurônios e em frações

subcelulares tais como sinaptossomos (MCGEE et al, 1994), vesículas sinápticas

(WEISINGER et al, 1995), mitocôndrias (WILLUMSEN et al, 1996) e cones de

crescimento (MARTIN & BAZAN, 1992). O DHA é encontrado principalmente na

fosfatidilserina (FS) e fosfatidiletanolamina (FE) da substância cinzenta, sendo mais

abundante nas membranas associadas com as funções sinápticas do que nas membranas

envolvidas no isolamento neuronal, como a mielina (CONNOR et al, 1992). O AA por sua

vez é encontrado principalmente no fosfatidilinositol (FI) (SVENNERHOLM, 1968) sendo

6

de grande importância para a sinaptogênese, plasticidade cerebral e mecanismo de

sinalização de vários neurotransmissores.

Os períodos mais críticos para aquisição de AGEs envolvem as fases pré e

perinatal quando o desenvolvimento bioquímico do encéfalo está em máxima atividade. O

suprimento adequado de AGEs para o feto a partir da circulação materna é relevante, uma

vez que a plena capacidade de dessaturação e alongamento de seus precursores pelo fígado

fetal e neonatal é insuficiente (INNIS, 1991; FARQUARSON et al., 1995;

SAUERWWALD et al., 1996; KOLETZON et al., 2008). Assim como o fígado fetal, a

placenta não tem atividade biossintética de alongamento e dessaturação para formar AGPI-

CL. Durante o último trimestre da gestação em humanos, a placenta estabelece preferência

no transporte de DHA e AA, pelas maiores necessidades de sua síntese (EDMOND et al,

1998; SHI et al, 1995). O aporte dos AGPI-CL deve ser garantido pela ingesta e pelas

reservas tissulares da mãe, principalmente do tecido adiposo (AGRANOFF & HAJRA,

1994; ZIMMER et al, 1999). Além disso, a própria gestação caracteriza-se como período

vulnerável para a deficiência de AGEs, devendo a gestante ingerí-los em sua dieta para

satisfazer também as suas necessidades (OZIAS et al., 2006; LEVANT et al., 2006).

Após o nascimento, a placenta é substituída pelo leite materno como meio de

oferta de AGEs (HORROCKS & YEO, 1999), o qual contém níveis de AA e DHA

suficientes para atender as necessidades do lactente. Os neonatos mais vulneráveis para

desenvolver deficiência de AGPI-CL são os recém-nascidos pré-termo, especialmente

aqueles com pouca reserva lipídica. Pela limitada reserva calórica, os mesmos deverão

mobilizar parte dos AG para atender suas necessidades metabólicas quando o aporte

exógeno for inadequado. (EDMOND et al., 1998; KOLETZKO et al., 2008)

7

Dieta deficiente em AGEs causa alterações na composição das membranas

celulares levando ao aparecimento de distúrbios como: retardo do crescimento, lesões

epiteliais, diminuição da pigmentação da pele, diminuição da taxa metabólica, prejuízo no

equilíbrio hídrico, aumento da fragilidade e permeabilidade da membrana celular (PAIXÃO

et. al., 2002; POMPEÍA, 2002; BOURRE, 2005). Também se observou que tais dietas

induzem mudanças na síntese de eicosanóides envolvidos na regulação de plaquetas

(WEBER, 1987) e na função do sistema imune (SALMON & TERANO, 1987).

Vários trabalhos têm demonstrado clara associação entre níveis inadequados

de DHA nos fosfolipídios do encéfalo e alteraçõoes no desenvolvimento neurológico

(NEURINGER & CONNORE, 1988; DIJCK-BROUWER et al., 2005), no sistema visual,

olfativo e auditivo (GREINER et al., 2001; CRAWFORD, 2003; CHURCH et al., 2008).

Ratos alimentados com dietas deficientes em AG ω-3 apresentaram redução na capacidade

de aprendizagem, indicando a importância dos mesmos para o desempenho de funções

cognitivas (SASTRE et al., 1998; MCNAMARA & CARLSON, 2006). Deficiência de

DHA também está correlacionada com menor crescimento de neuritos em neurônios do

hipocampo (CALDERON & KIM, 2004), do córtex cerebral (CAO et al., 2005) e em

neurônios sensoriais do gânglio da raiz dorsal (ROBSON et al., 2008). Outros aspectos da

diferenciação celular também podem ser afetados pela deficiência em DHA, visto que foi

observado decréscimo no tamanho dos corpos celulares de neurônios no hipocampo,

hipotálamo, córtex piriforme e parietal (AHMAD et al., 2002a,b). Em relação às células

gliais tem sido demonstrado que DHA exerce efeito protetor sobre a viabilidade de

astrócitos corticais de hamsters mantidos em cultura (CHAMPEIL-POTOKAR et al., 2003)

bem como efeito estimulatório sobre as junções Gap presentes neste astrócitos. Estes

8

efeitos contibuem para as interações neurônio-glia, uma vez que o acoplamento de

astrócitos é importante para neuroregulação e neuroproteção (CHAMPEIL-POTOKAR et

al., 2006).

Estudos em animais têm demontrado que reduções na acumulação de DHA no

encéfalo durante o período perinatal estão associadas com múltiplos índices de patologia

sináptica ocasionando déficits neurocognitivos e elevados índices comportamentais de

ansiedade, agressão e depressão (LEVANT et al., 2008). Primatas e humanos nascidos de

forma prematura exibem comprometimentos na maturação da substância cinzenta cortical,

em atividades cognitivas, particularmente relacionadas com atenção e aumentado risco para

desenvolverem desordens de hiperatividade e déficit de atenção, além de esquizofrenia

(MACNAMARA & CARLSON, 2006). Doenças neurológicas como esclerose múltipla,

adrenoleucodistrofia, doença de Alzheimer, Mal de Parkinson e esquizofrenia vêm sendo

relacionadas com alterações no metabolismo dos AGEs (revisão em FREITAS &

KIETZER, 2002). Tais alterações envolvem, principalmente, modificações na fluidez das

membranas neurais e a geração de seus metabólitos que dependendo do AG podem ser pró

ou anti-inflamatórios (YOHIDA et al., 1998).

Evidências obtidas em camundongos transgênicos indicam que AGEs podem

ter também potencial efeito terapêutico na Doença de Huntington (CLIFFORD et al.,

2002), já que o tratamento crônico com AGPI-CL a partir do nascimento foi capaz de

prevenir déficits motores em animais que expressaram o gene para esta doença.

Dentre os vários sistemas de neurotransmissores, os sistemas serotoninérgico e

dopaminérgico são sensíveis à deficiência específica de AGEs (CHALON, 2006). No

encéfalo de ratos, a última semana de vida embrionária e as duas primeiras semanas de vida

9

pós-natal são períodos críticos para o desenvolvimento destes sistemas, tornando-os

particularmente vulneráveis a injúrias. (GALINEAU et al., 2004). L’ HIRONDEL et. al.

(1995) demonstraram, em preparaçõs de sinaptossomos estriatais, que o AA inibe a síntese

e recaptação de dopamina (DA), exercendo no entanto, um efeito estimulatório expressivo

sobre a sua liberação.

Deficiência crônica de DHA por três gerações reduz a liberação vesicular de

DA induzida por tiramina no núcleo accumbens e córtex frontal de ratos (ZIMMER et al.,

1998; ZIMMER et al., 2000). Nessa última região foi também observada redução na

densidade de vesículas sinápticas contendo DA (ZIMMER et al., 2000). Por outro lado

aumento na liberação basal de DA foi observado no núcleo acumbens, o que pode

contribuir para alterações comportamentais e cognitivas observadas nesses animais

(ZIMMER et al., 2000). Similar deficiência em DHA foi capaz de aumentar a densidade de

receptores serotoninérgicos do tipo 5-HT2 e reduzir a densidade de receptores

dopaminégicos do tipo D2 no córtex frontal de ratos adultos jovens (DELION et al., 1994).

Uma vulnerabilidade diferenciada diante de menor biodisponibilidade nos AGEs da dieta

foi evidenciada entre neurônios dopaminérgicos do córtex frontal, estriado e hipocampo

(ACAR et al., 2003). Nesse último estudo, dieta contendo a forma trans do ω-3 (ou seja,

isomerização de uma parte da dieta) diminuiu os níveis de DA endógena. Mesmo em ratos

submetidos desde a concepção a uma dieta capaz de reduzir de forma modesta os níveis de

DHA, foram observadas alterações comportamentais indicativas de disfunção

dopaminérgica, sendo algumas destas alterações revertidas pela suplementação da dieta

após o período de desmame (LEVANT et. al., 2004).

10

I.3. Sistemas Dopaminérgicos Mesencefálicos

Os sistemas dopaminérgicos atuam como moduladores da atividade neuronal

estando envolvidos em uma variedade de funções cerebrais relacionadas com motricidade,

emoção e cognição. As ações dos neurônios dopaminérgicos mesencefálicos podem ser

segregadas em diferentes circuitos neuronais denominados sistema nigroestriatal,

mesoestriatal e meso-limbo-cortical, esquematizados na Figura 2. O sistema nigroestriatal

origina-se da substância negra (SN) pars compacta e projeta-se principalmente para o

estriado dorsal constituído pelos núcleos caudado e putâmen. O sistema mesoestriatal

origina-se na SN pars compacta e área tegmental ventral (ATV) e projeta principalmente

para o núcleo accumbens que faz parte do estriado ventral ou para o caudado-putâmen. Por

fim, o sistema meso-limbo-cortical tem origem na ATV e projeção para diversas áreas

corticais como os córtices piriforme, entorrinal, pré-frontal e cíngulado anterior. Neurônios

dopaminérgicos de cada região mesencefálica podem projetar para mais de um terminal a

partir da emissão de axônios colaterais favorecendo a interação entre os vários sistemas

acima descritos, permitindo que a DA atue de forma difusa principalmente como molécula

neuromoduladora sobre a atividade de vários neurotransmissores e funções (HANTRAYE,

1998; PRENSA & PARENT, 2001).

11

FIGURA 2. Vias do sistema mesoestriatal e do sistema mesolimbocortical em cérebro humano (imagem à esquerda) e em ratos (imagem à direita, destacando localização dos receptores dopaminérgicos D2, D3 e D4). Figura adaptada de HANTRAYE, 1998.

No sistema nigro-estriatal a DA está envolvida especialmente na geração de

movimentos voluntários, através de alças fechadas entre os núcleos da base e diferentes

regiões do córtex cerebral; modulando a atividade e expressão de GABA, acetilcolina,

glutamato, encefalina, substância P e somatostatina, relacionados com controle da

motricidade ocular e corporal. Por outro lado, o sistema mesolímbico está relacionado ao

controle de várias funções cognitivas, como o sistema de recompensa, atenção,

consolidação de memória, ou mesmo na dependência de drogas como cocaína e anfetamina

(NAKANO et al., 2000).

A figura 3 ilustra alças relacionadas com funções motoras, límbicas e

cognitivas envolvendo os núcleos da base e diferentes regiões corticais, onde a DA exerce

atividade modulatória.

12

FIGURA 3. Papel funcional da dopamina mesocorticolímbica. Dopamina (DA) agindo em diversas alças modulando funções motoras, límbicas e cognitivas envolvendo os núcleos da base e diferentes regiões corticais.

A atividade da DA ao nível estriatal também exerce efeito facilitatório sobre a

expressão de genes imediatos induzidos pela estimulação sensorial, ao nível do córtex

parietal (STEINER & KITAI, 2000) e uma atividade modulatória sobre a responsividade ao

GABA em várias regiões corticais (BEAUREGARD & FERRON, 1991). A DA contribui

também para fenômenos de plasticidade sináptica ao nível cortical, exercendo especial

influência sobre a densidade sináptica no córtex pré-frontal (SUGAHARA & SHIRAISHI,

1998).

I.4. Características funcionais dos neurônios dopaminérgicos da substância negra

Na SN de ratos, neurônios dopaminérgicos estão distribuídos na região rostro

dorso-medial da substancia negra compacta (RD) e na região caudo-ventro-lateral (RV) da

SN reticulada. As conexões destes neurônios com o estriado podem ser segregadas em

divisões funcionais (motora, associativa e límbica) sendo organizadas espacialmente,

13

morfologicamente e histoquimicamente em grupos dorsal e ventral. Em ratos, neurônios da

RV projetam predominantemete para os dois terços dorsais do estriado dorsal, envolvido

principalmente com as funções motoras e neurônios da RD projetam principalmente para o

terço ventral do estriado dorsal e núcleo accumbens, envolvidos principalmente com as

funções límbicas e associativas (JOEL & WEINER, 2000).

Neurônios dopaminérgicos da RV e RD apresentam períodos distintos de

neurogênese e uma vulnerabilidade diferenciada a vários insultos. Por exemplo, em

modelos experimentais de Parkinson e em encéfalos de pacientes Parkinsonianos foi

descrito que neurônios da RV são mais vulneráveis à lesão do que os da RD (DAMIER et

al., 1999; BARROSO-CHINEA et al, 2005). A diferente vulnerabilidade entre as sub-

populações celulares tem sido atribuída a algumas características neuroquímicas

apresentadas pelas mesmas. A expressão da proteína moduladora de cálcio, calbindina

(YAMADA et al., 1990; LAVOI & PARENT, 1991; GASPAR et al., 1994) e um maior

aporte do fator trófico GDNF (glial derived neurotrophic factor) do estriado ventral

(BARROSO-CHINEA et al., 2005) vêm sendo considerados fatores que conferem maior

resistência aos neurônios da RD. Por outro lado, os maiores níveis de RNAm e para a

proteína tirosina hidroxilase (TH) e transportador de dopamina (DAT), além da baixa

expressão para calbindina e GDNF parecem estar envolvidos com a maior vulnerabilidade à

lesão observada nos neurônios da RV (SHIMADA et al., 1992; CERRUTI et al., 1993;

HURD et al., 1994; UHL et al., 1994; GONZALEZ-HERNANDEZ et al., 2004; SMIDT et

al., 2004).

14

1.5. Justificativa e Hipóteses do presente estudo

Sabe-se que os AGPI-CL são essenciais para o desenvolvimento normal do

cérebro e que sua acumulação nos fosfolipídios de membrana, especialmente durante a

gestação e o aleitamento é de significância especialmente para a neurogênese, diferenciação

neuronal e sinaptogênese, podendo exercer também atividades anti-oxidativas e

antiinflamatórias (YAVIN, 2006). AGEs da série ω-3 são potentes neuroprotetores,

associados com abertura de canais de K+ (LAURITZEN et. al., 2000); reduzem apoptose

induzida por diferentes insultos em culturas de linhagens neuronais do tipo PC12 e NR-2

(KIM et al., 2001, AKAR & KIM, 2003); bem como previnem necrose e apoptose de

neurônios motores induzidas por isquemia (LANG-LDUNZKI et. al., 2003). Experimentos

in vitro evidenciaram que o tratamento de neurônios embrionários com o DHA favorece o

crescimento de neuritos tanto em culturas primárias do hipocampo (CALDERON & KIM,

2004) como do córtex cerebral (CAO et al., 2005). Recentemente, foi também descrita uma

atividade neurotrófica do AA, DHA e EPA em neurônios sensoriais do gânglio da raiz

dorsal de ratos tanto no período perinatal como na idade adulta. Tal atividade favoreceu o

crescimento dos neuritos de forma comparável ao fator de crescimento neural (NGF)

(ROBSON et al., 2008).

Consistentemente, estudos in vivo têm também demonstrado que deficiência

crônica do DHA, a partir do período de gestação e por até duas ou três gerações é capaz de

reduzir o tamanho dos corpos celulares de neurônios em regiões diencefálicas e corticais

(AHMAD et al., 2002 a,b) além de aumentar a susceptibilidade de alguns neurônios

hipocampais ao processo de morte por apoptose (AKBAR et al., 2005).

15

Como descrito anteriormente, alterações no funcionamento das vias

dopaminérgicas mesocortical e mesolímbica, em virtude de uma deficiência crônica em

AGPI-CL foram demonstradas em regiões alvo tais como o núcleo accumbens, hipocampo

e o córtex pré-frontal. Além disso, evidências recentes indicam que deficiência específica

em DHA durante o período perinatal é capaz de aumentar a expressão de receptores

dopaminérgicos em neurônios da SN bem como no estriado e em vários outros alvos dos

sistemas dopaminérgicos centrais, o que vem sendo discutido como um mecanismo

compensatório causado por um potencial comprometimento na produção de DA durante o

desenvolvimento do cérebro (YAVIN, 2006).

Considerando a atividade anti-apoptótica e neurotrófica direta ou indireta dos

AGEs bem como sua importância para a integridade funcional das membranas neuronais, a

primeira hipótese levantada no presente estudo é a de que os neurônios dopaminérgicos

presentes na SN possam ter a sua distribuição e diferenciação afetadas diante de uma

deficiência crônica em AGEs. Um trabalho recém publicado demonstrou que a deficiência

específica em DHA, induzida por duas gestações seqüenciadas de mães alimentadas com

uma dieta deficiente em ácido linolênico é capaz de reduzir o número de neurônios

dopaminérgicos presentes na SN compacta de ratos Long Evans (LEVANT et al., 2008).

No presente estudo, utilizando ratos Wistar e considerando a vulnerabilidade diferenciada

de subpopulações de neurônios dopaminérgicos em modelos experimentais de Parkinson,

nós hipotetizamos que a subpopulação presente na pars reticulada (RV) será mais

vulnerável do que a presente na pars compacta (RD) diante de uma deficiência crônica em

ácido linoléico e alfa-linolênico por até duas gerações.

16

A segunda hipótese testada no presente estudo é que a deficiência crônica

destes AG pode reduzir os níveis protéicos da enzima TH na região do mesencéfalo ventral,

considerando a possibilidade de que lesões a neurônios dopaminérgicos possam ocorrer

também em outros núcleos dopaminérgicos mesencefálicos.

17

II. OBJETIVOS

II.1. Objetivo Geral

Investigar em ratos Wistar as repercussões de uma deficiênia crônica em ácido

linoléico e ácido alfa-linolênico, por até duas gerações, sobre neurônios dopaminérgicos da

substância negra.

II.2. Objetivos Específicos

1) Avaliar a evolução ponderal até a idade de 30 dias dos grupos experimentais da

primeira (F1) e segunda (F2) gerações bem como os massas corpóreas e encefálicas nas

idades de 30 a 42 dias (F1 e F2) e de 90 a 101 dias (F1).

2) Averiguar se a deficiência crônica em AGEs é capaz de alterar os limites

citoarquitetônicos da substância negra pars compacta (RD) e pars reticulada (RV) onde

estão distribuídos os neurônios dopaminérgicos

3) Realizar análise morfométrica bidimensional dos neurônios dopaminérgicos da

pars compacta e pars reticulada da substância negra através dos seguintes parâmetros:

Número total de neurônios e área dos corpos celulares destes neurônios

4) Quantificar a partir de Imunoblot a expressão da enzima tirosina hidroxilase no

mesencéfalo ventral e córtex cerebral.

18

III. MATERIAIS E MÉTODOS

III.1. Animais

Foram utilizados ratos albinos Wistar provenientes da colônia do biotério do

Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e criados no

biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia sob ciclo claro-escuro de 12 horas

(com início às 6 horas), temperatura de 22 ± 3°C, umidade relativa do ar de

aproximadamente 65%, ração e água ad libitum. Todos os procedimentos experimentais

adotados com os animais, desde a sua procriação até o momento da eutanásia, foram

aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências

Biológicas da UFPE (Anexo 1).

Três ratos compunham a gaiola para o acasalamento, sendo duas fêmeas

nulíparas (idade de 90-120 dias) e um macho (idade superior a 90 dias), uma vez que

gestações freqüentes e múltiplas podem diminuir consideravelmente as reservas de AGPI-

CL. (SILVA et al., 2007) Decorrido o período de 10 dias, as fêmeas eram separadas,

possivelmente prenhas, em gaiolas individuais (gaiolas-maternidade). O dia do nascimento

dos filhotes foi considerado dia zero (D0). No mesmo dia ou até 24 horas depois, a ninhada

era reduzida para 06 filhotes. Os filhotes descartados, durante a redução da ninhada, foram

sacrificados por congelamento, acondicionados em sacos plásticos, de acordo com o

recomendado como forma de eutanásia para animais recém-nascidos. Essa redução foi

usada como padrão para que não ocorresse competição pelas mamas e o modelo de

19

desnutrição adotado assumisse papel único como desencadeador das possíveis alterações

induzidas pela dieta.

O desmame para todos os ratos experimentais foi feito no 21° dia de vida, e os

filhotes passaram a ser alimentados ad libitum com as mesmas dietas que vinham sendo

fornecidas às mães, até a idade estabelecida para o sacrifício. Os filhotes foram separados

em gaiolas diferentes de acordo com o sexo. Para o acasalamento da segunda geração

foram utilizados animais com idade a partir de 90 dias, gerados no primeiro acasalamento,

evitando-se o acasalamento entre “irmãos”.

Todos animais foram pesados ao nascer, aos 7, 14, 21 e 30 dias bem como no

dia da realização do experimento. Os experimentos com os animais da primeira geração

(F1) foram realizados aos 90-101 dias de vida, enquanto que para os animais da segunda

geração (F2) aos 30-42 dias. Não foram utilizados mais de três irmãos da mesma gaiola. O

sacrifício destes animais justifica-se pelo fato de não existirem métodos alternativos para

obtenção das informações almejadas pelo presente projeto.

III.2. Grupos

Os animais foram divididos em dois grupos de acordo com a dieta

administrada partir do acasalamento: (1) grupo controle (C) – recebeu dieta equilibrada

contendo como fonte protéica a caseína e fonte lipídica o óleo de soja; (2) grupo deficiente

em ácidos graxos essenciais (DAGEs) – recebeu dieta semelhante, exceto a fonte lipídica, a

qual foi substituída pelo óleo de coco.

20

III.3. Confecção e Composição da Dieta

A dieta com carência em AGEs foi confeccionada seguindo o protocolo

adotado por ALESSIO et al. (1994) com pequenas modificações, sendo constituída de

caseína, amido de milho, sacarose, celulose, mistura mineral, mistura vitamínica, butil-

hidroxitolueno (BHT), L-cistina e óleo de coco. Para a dieta controle, o óleo de coco foi

substituído pelo óleo de soja pela sua constituição equilibrada em ácido linoléico e

linolênico. A quantidade dos ingredientes utilizados para cada quilograma de ração

encontra-se descrita na tabela 1.

TABELA 1: Composição da dieta utilizada na confecção de 1kg de ração para os grupos C (óleo de soja) e DAGEs (óleo de coco).

Amostras de ambas as dietas, confeccionadas no Laboratório de

Neurofisiologia da UFPE, foram analisadas pelo Laboratório de Experimentação e Análise

de Alimentos do Departamento de Nutrição da UFPE. As composições centesimais

21

encontram-se detalhadas nos anexos 2 (dieta consumida pelo grupo C) e 3 (dieta consumida

pelo grupo DAGEs).

III.3.1. Preparação da Dieta

A celulose deve ser misturada com o óleo (de coco ou de soja), alternando

com porções de amido, caseína, sacarose, mistura vitamínica e mistura mineral. O produto

resultante passa pela peneira, acrescenta-se BHT e L-cistina e em seguida é colocado, de

forma uniforme, em uma bandeja. Dois copos de água morna com corante (rosa para dieta

deficiente em AGEs e azul para dieta controle) eram adicionados à mistura. Essa pasta era

perfurada, com garfo, para melhor penetração da água, obtendo assim maior consistência.

Utilizando uma espátula a ração era “cortada” em formato de pequenos quadrados e

submetida à temperatura de 60°C dentro da estufa (FANEM-Ltda). A ração permanecia

nessa temperatura durante 24 horas, e após esfriar, era servida aos animais ou armazenada

em geladeira.

III.4. Procedimento Imunohistoquímico para visualização dos Neurônios Dopaminérgicos

Para o procedimento imunohistoquímico foram utilizados total de 25 animais

distribuídos da seguinte forma: F1grupo C, n=05; F1 grupo DAGEs, n=06; F2 grupo C,

n=07, e; F2 grupo DAGEs, n=07. Os ratos wistar utilizados nesta etapa foram

compartilhados com o Departamento de Nutrição da UFPE de modo que, anteriormente a

perfusão, foram obtidos registros eletrofisiológicos para depressão alastrante sem a

aplicação de qualquer droga a não ser o anestésico. O anestésico administrado, via

22

intraperitoneal (i.p.), foi cloralose 0,4% com uretana 10% na dose 10mL/kg. Todavia,

alguns animais foram submetidos à perfusão diretamente no Departamento de Fisiologia da

UFPE. Nesse caso, o anestésico utilizado foi pentobarbital (CrystaliaR, São Paulo, Brasil)

na dosagem de 60-100mg/kg também administrado via i.p..

III.4.1 - Protocolo de Fixação, Pesagem e Secção do Tecido Encefálico

Perfusão: Sob anestesia profunda, os animais foram submetidos à toracotomia, para

aplicação transcardíaca de 0,02 mL de heparina sódica (Bérgamo, 5000 UI/ml).

Imediatamente, procedeu-se perfusão de 50 ml de NaCl a 0,9% (salina), seguida de solução

fixadora de paraformaldeído 4% (PA) em tampão fosfato (TF) 0,1 M e pH 7,4. A perfusão

foi realizada com auxílio de uma bomba de infusão contínua (Harvard Apparatus 11) com

fluxo de 3,82 e 7,64 ml/min para animais de 30-42 dias e 90-101 dias, respectivamente. Os

ratos jovens receberam um total de 250 ml de PA 4% enquanto que os adultos tiveram 500

ml de solução fixadora perfundidos.

Pesagem dos encéfalos: Após a perfusão, os encéfalos foram removidos, imersos em PA

4% com TF (0,1 M) por período adicional de 02 horas e em seguida transpostos para

pequenos potes individuais, contendo apenas TF (0,1 M), identificados e mantidos à

temperatura de 4°C. Ulterior à remoção dos bulbos olfatórios, cócleas e medula espinhal

(secção realizada no limite inferior do bulbo), cada encéfalo foi pesado em balança analítica

(Mettler). Previamente à pesagem, os encéfalos foram colocados sobre papel toalha durante

40 minutos para retirada do excesso de água do tecido.

23

Crioproteção e secção do encéfalo: Para crioproteção os encéfalos foram colocados em

soluções de sacarose a 10, 20 e 30% em TF 0,1 M para finalmente serem congelados e

seccionados no plano sagital em micrótomo de congelação (Leitz Weitzlar), utilizando gelo

seco. Secções sagitais foram feitas com espessura de 50 µm, no sentido latero-medial,

separadas em 5 séries. Cada série em seguida foi colocada em solução crioprotetora (para

preparar 500 ml de solução: 150 ml de glicerol, 150 ml de etileno glicol, 150 ml de água e

50 ml de TF 0,2 M) e mantida a -20°C para posterior procedimento imunohistoquímico.

Alternativamente, alguns encéfalos foram cortados em vibrátomo (Vibratomes series 1000

tedpella incorporation, Califórnia, EUA) contendo TF (0,1 M). Nesse caso todas as etapas

eram semelhantes, exceto a utilização das soluções de sacarose que não se faziam

necessárias.

III.4.2 - Protocolo de Imunohistoquímica para marcação da Enzima Tirosina Hidroxilase

1) Lavagens dos cortes em TF 0,1 M durante 10 minutos cada

2) Tratamento inicial para recuperação antigênica: Ao término da terceira lavagem,

incubar cortes obtidos por congelação contendo SN em tampão citrato 0,01 M e pH 6.0

durante 04 horas em estufa (FANEM-Ltda) a 60°C.

3) Lavagens dos cortes em TF 0,1 M durante 10 minutos cada.

4) Pré-incubação em soro normal de cabra 10%: solução preparada com TF 0,1 M + 0,3%

de Triton. Procedimento com duração de 30 minutos.

24

5) Incubação no anticorpo primário: Para anti-TH (anti-tirosina hidroxilase): diluição de

1:500 com soro normal de cabra 1% em TF Triton 0,3% durante pelo menos 12 horas

(overnight), à temperatura de 4°C.

6) Lavagens dos cortes em TF 0,1 M durante 10 minutos cada.

7) Incubação no anticorpo secundário: anticorpo biotinilado contra a espécie em que foi

obtido o anticorpo primário (cabra x coelho) na concentração 1:200 em TF Triton 0,3%

durante 02 horas à temperatura ambiente.

8) Lavagens dos cortes em TF 0,1 M durante 10 minutos cada.

9) Incubação no complexo ABC (Avidina-Biotina-Peroxidase): Diluição 1:100 em TF

Triton 0,3%. Tempo de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente.

10) Lavagens dos cortes em TF 0,1 M durante 10 minutos cada.

11) Reação para evidenciar a peroxidase: As secções sagitais foram colocadas em peneiras

imersas em 100 ml de TF 0,1 M contendo 0,25 g de DAB (3,3’ – Diamino Benzidine)

diluído previamente em 01 ml de TF 0,1M. Tempo de reação de 20 minutos, quando em

seguida foi acrescido peróxido de hidrogênio por mais 10 minutos. Etapa realizada na

capela de exaustão.

12) Lavagens dos cortes em TF 0,1 M durante 10 minutos cada.

13) Montagem em lâminas gelatinizadas: Os cortes foram recolhidos do TF 0,1 M e

posicionados nas lâminas gelatinizadas. Após secagem, os cortes foram montados em meio

de glicerol. Esmalte foi utilizado para fixação das lamínulas.

25

III.4.3 – Análise da Imunorreatividade da Enzima Tirosina Hidroxilase na Substância Negra

Utilizando-se microscópio trinocular World Precision Instruments (WPI),

munido de microcâmera Target TG-400 color CCD, foram obtidas imagens digitalizadas

das secções sagitais para análise morfométrica das dimensões da SN (objetiva de 4X), do

soma dos neurônios (objetiva de 20x) e do número total destes neurônios (objetiva de 10x)

presentes nas RD e RV deste núcleo imunoreativos à TH, conforme podemos visualizar nas

figura 4, 15 e 16, respectivamente.

FIGURA 4. Secções sagitais para análise morfométrica das dimensões (área e diâmetro) da SN, neurônios imunoreativos à TH. Imagens digitalizadas.

O estudo duplo cego ocorreu a partir das imagens de cada grupo experimental

obtidas com o mesmo nível de iluminação e comparadas entre si, para que mantivessem a

mesma proporção de densidade óptica global nas cores azul e verde. O programa Image J

versão 1.39u (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA;

http://rsb.info.nih.gov/ij/) foi utilizado para análise morfométrica, ou seja, para análise do

número e da área do soma dos neurônios, bem como para as dimensões da SN.

26

III.5. Imunoblot para Enzima Tirosina Hidroxilase e Proteína Transportadora de Dopamina em homogenados de córtex cerebral e mesencéfalo ventral

Para realização do imunoblot foram utilizados total de 24 animais distribuídos

da seguinte forma: F1grupo C, n=06; F1 grupo DAGEs, n=06; F2 grupo C, n=06, e; F2

grupo DAGEs, n=06.

Após serem submetidos à anestesia via i.p. com pentobarbital (CrystaliaR, São

Paulo, Brasil) na concentração 60-100 mg/kg, os animais foram decapitados e os encéfalos

rapidamente removidos e colocados em solução salina 0,9% gelada para retirada dos

hemisférios corticais e mesencéfalo ventral. Cada região foi colocada em 1 ml de solução

homogeneizada contendo: Tris-Base (20 mM), MgCl2 (10 mM), CaCl2 (0.6 mM), EGTA

(0.5 mM), DTT (1 mM), PMSF (1 mM), Aprotinin (5 µg/ml), Leupeptin (2 µg/ml) e Triton

x-100 (0.05%).

Tanto os córtices quanto o mesencéfalo ventral foram pesados, separadamente,

em balança analítica (Mettler) antes de serem homogeneizados. Todo procedimento de

homogeneização ocorreu em gelo e foi procedida para cada região de interesse de modo

que cada tubo contivesse tecido do córtex ou mesencéfalo ventral de 6 animais de cada

grupo. Após homogeneização, os tubos foram centrifugados, em centrífuga refrigerada

(Sorval RC2B), por 30 minutos (12.000 rpm).O sobrenadante foi recolhido e colocado em

eppendorfs (cerca de 6-8 eppendorfs para cada região, por grupo de animais).

Um dos eppendorfs representativos de cada grupo foi utilizado para efetuar

dosagem de proteína pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). Amostras contendo

1.5 mg/ml foram preparadas para a corrida no gel. Para cada 110 µL de amostra foram

adicionados 90 µL do tampão de amostra contendo: Tris-HCl 62.5 mM (pH 6.8 - 756.88

27

mg), Glycerol 10%v/v (10 ml), beta-mercapto-ethanol 10%v/v (10 ml), SDS 4%w/v (4 g) e

Bromophenol blue 0.002% w/v (0.5).

A eletroforese foi realizada em gel de poli-acrilamida 10% contendo 0,1% de SDS

O tampão de corrida era composto por 0,192 M de glicina, 0,025 M de Tris Base, 0,1% de

SDS e 0,01% de azul de brometo. Após separação, as proteínas foram transferidas para

membranas de nitrocelulose (poro de 0,2 mm – Biorad) de acordo com protocolo similar ao

descrito por Towbin et al. (1979). .. Para imunomarcação utilizaram-se anticorpos

primários policlonais anti-TH AB152, (Chemicon; 1:500), obtido em coelho. Os valores

obtidos foram normalizados para os valores de actina usados como padrão endógeno de

proteína. Tais valores representam a razão entre os níveis de TH e os níveis de actina.

Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando-se o teste t de Student ou

ANOVA para as massas encefálicas e corpóreas, parâmetros morfométricos da substancia

negra e número total de neurônios. Análise de variância three-way ANOVA foi adotada

para comparação do espectro de tamanho dos neurônios dopaminérgicos entre os grupos

experimentais. Tal análise foi seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey.

Diferenças foram consideradas significativas quando P ≤ 0,05.

28

IV. RESULTADOS IV.1. Massas Corpóreas

A Figura 5 ilustra a evolução ponderal dos grupos experimentais de F1 e F2

até a idade de 30 dias. Considerando que até esta idade não há diferenças entre as massas

corpóreas de machos e fêmeas, os valores apresentados representam a média ± desvio

padrão (dp) de todos os animais de cada grupo. Em relação ao grupo C, uma redução

significativa de massa corpórea (p < 0.01 ou 0.05) foi observada no grupo DAGEs apenas

de F2. Os valores médios ± EPM de cada grupo para cada idade, são apresentados no

capítulo de anexos IX.4. como Tabela 1.

Figura 5 - Evolução ponderal dos animais dos grupos C (soja) e DAGEs (coco) até a idade de 30 dias nos grupos experimentais da primeira (F1) e segunda (F2) gerações. Os valores representam média ± EPM. Teste T de Student e ANOVA, *(p<0.05). .

As massas corpóreas dos animais, apenas machos, de F1 60 dias e F1 90-101

dias (no dia dos experimentos) estão apresentados na Figura 6. Como pode ser observado,

houve diferença significativa entre os grupos experimentais de F1, uma vez que o grupo

DAGEs possui menor massa corporal quando comparado com o grupo C em ambas as

idades (p < 0.01 ou 0.05). Os valores médios ± EPM de cada grupo são apresentados no

capítulo de anexos como Tabela 2.

Controle Controle

DAGESDAGES

29

Controle

DAGES

Figura 6. Massas corpóreas de ratos wistar machos dos grupos experimentais de F1 com 60 e 90 (90 a 101) dias. O grupo DAGEs (coco) apresenta menor massa corporal quando comparado com o grupo C (soja). Os valores representam média ± EPM. Teste T de Student. *(p<0.05). **(p<0.31).

IV.2. Pesos Encefálicos Absolutos e Relativos ao Peso Corpóreo

Na figura 7 e tabela 3 de anexos, estão apresentados os pesos encefálicos

médios dos animais jovens e adultos de F1 e dos animais jovens de F2, avaliados no dia do

experimento. Como pode ser observado, os valores obtidos nos animais de F1 do grupo C

não diferiram daqueles encontrados nos animais do grupo DAGEs. Porém uma redução

significativa (p < 0,01) no peso encefálico foi observada no grupo DAGEs em relação ao

grupo C em F2.

Os valores médios do índice peso encefálico/ peso corpóreo também

encontram-se ilustrados na figura 7 e no capítulo de anexo como tabela 4. Os valores dos

animais adultos do grupo C de F1 não diferiram dos observados no grupo DAGEs de idade

similar. Também não foi evidenciada diferença significativa entre os grupos C e DAGEs de

F2, sugerindo que as reduções nos pesos corpóreos e encefálicos dos animais deficientes

em AGEs por duas gerações foram proporcionais.

30

Figura 7 –Pesos encefálicos (à esquerda) e razão peso encefálico / peso corpóreo (à direita) dos grupos experimentais F1 e F2. Há redução significativa na massa encefálica apenas no grupo DAGEs, em relação ao grupo C, de F2. Os valores representam média ± dp. Teste T de Student. ** (p<0.01).

IV.3. Limites citoarquitetônicos da Substância Negra

Os limites citoarquitetônicos da SN foram analisados ao nível medial deste

núcleo. A figura 8 ilustra secção sagital do encéfalo que representa a coordenada

estereotáxica utilizada para a análise morfométrica realizada no presente estudo.

31

Figura 8 - Secção sagital do encéfalo de rato albino correspondente à coordenada estereotáxica utilizada para análise morfométrica ao nível medial da SN. O círculo em vermelho delimita a localização da SN bem como os limites citoarquitetônicos deste núcleo em relação a outros núcleos mesencefálicos. Figura reproduzida do Atlas “The rat brain in stereotaxic coordinates”, Paxinos, G. e Watson C (1986); Plate 81

Na Figura 9 estão apresentadas secções sagitais do encéfalo representativas de cada

grupo experimental de F1 e F2, imunomarcadas para a enzima TH ao nível medial da SN.

O padrão de imunorreatividade observado ilustra a distribuição de neurônios

dopaminérgicos presentes na SN compacta (RD) e reticulada (RV) bem como no núcleo

retro-rubral (RR), sendo esse último localizado fora dos limites citoarquitetônicos da SN.

Figura 9 - Secções sagitais do mesencéfalo evidenciando os limites citoarquitetônicos da SN definidos pelo padrão de imunorreatividade à enzima TH em animais representativos dos grupos experimentais de F1 e F2. Animais adultos dos grupos C (A) e DAGEs (B) de F1. Animais jovens dos grupos C (C) e DAGEs (D) de F2. Barra de calibração = 1 mm.

32

Análise comparativa das dimensões lineares, diâmetros no sentido rostro-caudal

(diâmetro menor) e no dorso-ventral (diâmetro maior) de toda a SN dos animais jovens de

30 dias, em relação aos animais adultos de 90 dias, evidenciou aumento na extensão rostro-

caudal e concomitante redução da extensão dorso-ventral deste núcleo em ambos os grupos

experimentais. No entanto, tais modificações lineares ocorridas durante este período de

desenvolvimento pós-natal não alteraram a área total ocupada pelos limites

citoarquitetônicos da SN (p < 0,01; Figura. 10 e tabela 5 de anexos).

Figura 10. Dimensões lineares e bidimensionais dos limites citoarquitetônicos da SN nos grupos C e DAGEs de F1 e F2. Figura à esquerda: dados de áreas (mm2) e figura à direita dados de diâmetros. (mm): Análise comparativa entre os grupos de cada geração evidenciando diferenças nos diâmetros da SN tanto na RD quanto na RV deste núcleo quando comparado as idades de 30 (30-42) e 90 (90-101) dias. Diâmetro menor = diâmetro rostro-caudal; diâmetro maior = diâmetro dorso ventral. Os valores representam média ± dp (p < 0,01).

Os valores médios das dimensões lineares e bidimensionais, dos diâmetros

no sentido dorso-ventral (RC = diâmetro maior) e rostro-caudal (DV = diâmetro menor), de

toda a SN encontram-se ilustrados na figura 10 e na Tabela 6 de Anexos. Animais adultos

do grupo C de F1 não diferiram dos observados nos grupos DAGEs de idade similar. Há

diferença significativa entre os grupos C e DAGEs de F2, sugerindo que a deficiência

33

crônica em AGEs não alterou o desenvolvimento normal dos limites citoarquitetônicos da

SN (p < 0,01). A área total ocupada pela SN bem como das suas regiões RD e RV não

foram modificadas pela deficiência em AGEs.

IV.4. Número de neurônios dopaminérgicos nas regiões dorsal e ventral da substância negra

Na região RD os neurônios de cada secção sagital de 50 µm estavam distribuídos

em duas camadas e a análise foi realizada em cerca de 8 campos de amostragem. Já a região

RV, como os neurônios são menos numerosos e esparsamente distribuídos, foram utilizados

cerca de 5 campos de amostragem. Os resultados obtidos na análise do número total de

neurônios dopaminérgicos, marcados com a enzima TH, estimado ao nível medial da SN

tanto na região RD como na RV estão apresentados na figura 11 e na Tabela 7 de anexos.

Como pode ser observado, a deficiência em AGEs reduziu de forma significativa (p< 0.05)

em cerca de 15 a 17% o número de neurônios da RD tanto nos animais adultos de F1 como

nos animais jovens de F2 respectivamente. No entanto, nenhuma diferença entre os grupos

foi observada para os valores estimados na RV tanto em F1 como em F2.

34

Figura 11- Números totais de neurônios dopaminérgicos estimados ao nível medial da SN em RD e RV dos grupos C e DAGEs de F1 e F2. Uma redução significativa no número destes neurônios foi observada na RD tanto em F1 como em F2. Os valores representam média ± dp. Teste T de Student *(p < 0,05).

IV.5. Espectro de tamanho dos neurônios dopaminérgicos

Para cada lâmina de um animal foram analisados 50 áreas do soma da RD e outras

50 da RV. O grupo C de F1 foi composto por n=05, totalizando 250 áreas do soma

analisadas em cada região da SN de F1. Enquanto o grupo DAGEs de F1, com n=06, teve

averiguado 300 áreas do soma dos neurônios tanto para RD quanto para RV. No referente a

F2 os grupos experimentais C (n=07) e DAGEs (n=07) compuseram total de 350 áreas do

soma dos neurônios analisadas para cada região da SN estudada.

35

Figura 12 - Campos representativos das regiões dorsal e ventral de um animal do grupo C evidenciando como os neurônios dopaminérgicos destas regiões são desiguais quanto ao padrão de diferenciação. Barra de calibração = 20 µm

Figura 13. Neurônios dopaminérgicos em secções sagitais ao nível da SN em RD de ratos submetidos a dieta controle (A e B) e a dieta deficiente em AGEs (C e D); A e C objetiva 10x; B e D objetiva de 25x. Secções sagitais ao nível da SN em RV de animais submetidos a dieta controle (E e F) e a dieta deficiente em AGEs (G e H); E e G objetiva 10x; F e H objetiva de 25x. Escala 50 mm

A figura 14 e a tabela 8 de Anexos ilustram os valores médios ± erro padrão

da média (EPM) estimados para área do soma em cada uma das regiões da SN, nos grupos

experimentais de F1 e F2. Análise de variância seguida do teste Tukey (p<0.05) evidenciou

uma redução significativa no tamanho dos neurônios dopaminérgicos em RD e RV da SN

36

de animais do grupo DAGEs de F2 quando comparados ao grupo C. Nenhuma diferença

entre os grupos C e DAGEs foi observada nos animais adultos de F1.

Figura 14 - Área do soma dos neurônios dopaminérgicos presentes na RD e RV dos grupos C e DAGEs de F1 e F2. Uma redução significativa no tamanho dos neurônios regiões RD e RV foi observada no grupo DAGEs de F2. Dados representam média ± EPM. Análise de variância seguida de Tukey test (p < 0.05).

IV.6. Imunoblot para Enzima Tirosina Hidroxilase

Os resultados obtidos na análise de imunoblot para a enzima TH em homogenados

do córtex cerebral e mesencéfalo ventral, contendo amostras de 6 animais por grupo, estão

apresentados nas figuras 15 e 16. Quando normalizados para os níveis de actina endógena,

não houve diferença entre os grupos nos homogenados de córtex tanto em animais adultos

de F1 quanto em animais jovens de F2. No entanto uma expressiva redução nos níveis de

TH foi observada nos homogenados do mesencéfalo ventral do grupo DAGEs de F2

comparado aos valores obtidos no grupo C (p < 0,001).

37

Figura 15. Imunoblots representativos evidenciando a expressão da enzima TH e da proteína actina em homogenados de córtex cerebral e mesencéfalo ventral de animais de F1 (98-101 dias) e F2 (35-38 dias). Observar uma redução expressiva nos níveis da TH em amostras do mesencéfalo ventral do grupo DAGEs (p < 0,001).

Figura 16. Níveis da enzima TH normalizados para os níveis de actina em homogenados do córtex cerebral e mesencéfalo ventral dos grupos C e DAGEs. Os homogenados de cada grupo contém material encefálico de seis animais. Há redução expressiva nos níveis de TH nos homogenados do mesencéfalo ventral do grupo DAGEs de F2 Os valores obtidos representam a média ± dp de três experimentos realizados com cada homogenado. Teste T de Student. ***(p < 0.001).

38

V. DISCUSSÃO

No presente estudo investigamos se deficiência específica em AGEs por até

duas gerações é capaz de alterar a distribuição e diferenciação de neurônios dopaminérgicos

da SN, envolvidos com aspectos motores, límbicos e cognitivos do comportamento,

também implicados na fisiopatologia da doença de Parkinson.

A análise das massas corporais mostrou que a deficiência crônica em ácido

linoléico e alfa-linolênico reduziu o ganho de massa corporal dos animais machos de F1

com idades de 60 e 90 a 101 dias bem como alterou a evolução ponderal dos ratos de F2

desde o nascimento até a idade de 30 dias. Tais resultados reforçam a relevância destes AG

para o desenvolvimento de vários órgãos e sistemas e corroboram dados obtidos em outros

estudos utilizando diferentes linhagens de ratos experimentais. Baixos níveis de AA durante

o período de gestação e lactação vem sendo relacionados ao reduzido crescimento corporal

de ratos durante o período perinatal (AMUSQUIVAR et al., 2000). Tem sido também

demonstrado que reduzidos níveis de AGEs na dieta induzem má absorção de gorduras

(WERNER et al., 2002), uma disfunção na regulação do hormônio de crescimento

(SOARES et al., 1995) bem como reduzidos níveis plasmáticos de leptina (KOROTKOVA

et al 2002) e sua expressão (RNAm) no tecido adiposo. Embora no presente estudo não

tenham sido investigadas as causas da reduzida taxa de crescimento dos animais da geração

F2, bem como a reduzida massa corporal dos animais adultos de F1, é possível que alguns

dos mecanismos acima citados possam estar envolvidos nos resultados ora apresentados.

39

Redução na massa corpórea sem alterações na massa encefálica foi observada

em ratos Long Evans aos 21 e 68 dias, alimentados por três gerações com dieta deficiente

apenas em ácido alfa linolênico (AHMAD et al., 2002). É possível que a redução na massa

encefálica, ora evidenciada nos animais jovens da geração F2, seja devida à deficiência de

AA associada à de DHA, considerando a importância conjunta destes dois AGPIs na

composição dos fosfolipídios de membrana durante o desenvolvimento do sistema nervoso.

Além disto deve ser considerado que a biossíntese de AA e DHA para suprir o crescimento

cerebral é relativamente lenta e depende fundamentalmente do aporte nutricional

(PARKINGTON, 1998; LIA et al., 2006; YAVIN, 2006). Tem sido descrito que

deficiências dietéticas em AGEs que induzem reduzidos níveis de AA são acompanhadas

de uma redução expressiva na proporção de cerebrosídeos e esfingomielina, sendo a

redução na massa encefálica de aproximadamente 33% em ratos submetidos a uma dieta

deficiente em AGPIs por até 37 semanas, o que representa uma deficiência de fato por um

período de 24 semanas (ODUTUGA (1977, 1979). Os dados obtidos no presente estudo

não evidenciaram uma redução na massa encefálica dos animais adultos da geração F1,

analisados aos 90-101 dias e que apresentaram uma redução de aproximadamente 11% no

peso corpóreo. Tais resultados sugerem uma relativa proteção do encéfalo em relação aos

fatores que determinam o seu crescimento durante o período crítico de desenvolvimento,

principalmente considerando o estado nutricional favorável das mães da geração F1 durante

o período ulterior à gestação e uma transferência materno-placentária capaz de garantir o

acúmulo de AG no cérebro dos filhotes durante o período gestacional e perinatal. Embora

fatores distintos podem estar envolvidos com o crescimento cerebral e corporal, uma

redução de cerca de 10 % no peso encefálico dos animais jovens da geração F2 foi apenas

40

ligeiramente menor que a redução no peso corporal médio dos mesmos animais, estimada

como de aproximadamente 15% em relação ao grupo C. Tal similaridade fez com que a

razão peso encefálico/peso corpóreo não fosse modificada nos animais do grupo DAGEs,

quando comparada aos valores obtidos para o grupo controle.

A despeito das alterações observadas na massa encefálica, a deficiência em

AGEs por até duas gerações não modificou as dimensões bidimensionais dos limites

citoarquitetônicos da SN, ao nível medial deste núcleo, nem as alterações morfométricas

que ocorrem nas suas dimensões lineares durante o período pós-natal de 30 a 90 dias.

Entretanto, esta deficiência reduziu de forma significativa o número de neurônios

imunorreativos à TH ao nível medial da substancia negra compacta (RD) tanto nos animais

adultos de F1 (cerca de 16%) como nos animais jovens de F2 (cerca de 18%), sem alterar o

número destes neurônios na RV. Os mecanismos responsáveis por este efeito não foram

investigados no presente estudo, todavia,algumas considerações serão feitas. Como

componentes dos fosfolipídios de membrana, a percentagem de AGPIs influenciam as

propriedades fisicoquímicas da membrana, com repercussões sobre a função de uma

variedade de proteínas incluindo receptores de alguns neurotransmissores (WITT &

NIELSEN, 1994; FONG & MCNAMEE, 1986). DHA e AA também servem como

precursores para sinais inter e intracelulares envolvendo a síntese de prostaglandinas e

neuroprotectina D1, sendo esta última de importância para a proteção de neurônios

cerebrais e retinianos contra injúria induzida por estresse oxidativo (BAZAN, 2005) bem

como modulam a expressão gênica através da ativação de fatores de transcrição (SALEM et

al., 2001). Deficiências em AGEs estão sendo relacionadas a processos neurodegenerativos

relacionados principalmente a modificações na fluidez das membranas neuronais e a uma

41

maior vulnerabilidade a lesões e apoptose (BOURRE et al., 1989; KIM et al.,2001). AGEs

da série ω-3 são considerados agentes neuroprotetores, associados também com abertura de

canais de K+ (LAURITZEN et al., 2000); reduzem apoptose induzida por diferentes

insultos em culturas de linhagens neuronais do tipo PC12 e NR-2 (KIM et al., 2001,

AKBAR & KIM, 2002); bem como previnem necrose e apoptose, induzidas por isquemia,

em neurônios motores (LANG-LDUNZKI et al., 2003). DHA pode ser de particular

importância para neurônios dopaminérgicos uma vez que se liga ao receptor retinoid X que

heterodimeriza com o receptor Nurr1 o qual promove diferenciação e sobrevivência de

neurônios dopaminérgicos, modulando a síntese e a função da DA durante o

desenvolvimento bem como na vida adulta (JANKOVIC et al., 2005). Tem sido

recentemente demonstrado que uma redução na expressão de receptores do tipo Nurr1

aumenta a vulnerabilidade de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos à injuria induzida

pelo inibidor do complexo mitocondrial I, MPTP (LE et al., 1999) e que a suplementação

dietética com ácidos graxos da série ω-3 reverte o efeito deletério do MPTP sobre a

expressão destes receptores (BOUSQUET et al., 2008). Neste mesmo trabalho foi também

demonstrado que a suplementação alimentar com óleo de peixe, rico em DHA e EPA foi

capaz de reduzir de forma expressiva a perda de neurônios dopaminérgicos induzida pelo

tratamento com MPTP, sugerindo um importante papel neuroprotetor destes AGPIs.

Embora não tenhamos realizado uma análise estereológica para avaliar o

impacto da deficiência crônica em DHA e AA sobre a distribuição da população neuronal

total da SN, os dados obtidos no nosso estudo estão de acordo com os recentemente

publicados por Ahmad et al., 2008, corroborando a hipótese de uma ação neuroprotetora

dos AGPIs sobre neurônios dopaminérgicos da SNcompacta. No trabalho de Ahmad et al.

42

2008, a deficiência específica em DHA leva a um aumento compensatório de AA. Recentes

estudos in vitro têm demonstrado que a prostaglandina PGE2, derivada do AA, pode

induzir lesões em neurônios dopaminérgicos da SN, em condições de baixos níveis de

estresse oxidativo, por ativação do receptor EP1 (CARRASCO et al., 2007) ou

neuroproteção por ativação de receptores EP2 (CARRASCO et al., 2008). Assim, embora o

AA possa estar envolvido com efeitos benéficos ou maléficos induzidos por estresse

oxidativo sobre as células dopaminérgicas da SN, os resultados obtidos no nosso estudo

mostram que mesmo na ausência deste AGPI, tais células podem ser comprometidas pela

deficiência crônica em DHA.

Por outro lado os dados ora apresentados também evidenciam que o número

dos neurônios dopaminérgicos presentes na pars reticulada (RV) foi aparentemente não

comprometida pela deficiência crônica de AGEs. Tais resultados parecem paradoxais se

comparados à conhecida maior vulnerabilidade à lesão dos neurônios dopaminérgicos da

pars reticulada em modelos experimentais de Parkinson ou mesmo em cérebros de

pacientes Parkinsonianos (LAVOI & PARENT, 1991; GASPAR et al., 1994; DAMIER et

al., 1999).

Além de funcionalmente distintos quanto às projeções e características

neuroquímicas, os neurônios da RD e RV diferem quanto aos períodos de neurogênese e

aos padrões de diferenciação e há evidências de que os neurônios da RD recebem um maior

aporte do fator neurotrófico derivado da glia (GDNF) via transporte retrógrado a partir do

estriado ventral, o que vem sendo discutido com um dos fatores envolvidos na sua maior

resistência à lesão diante do insulto induzido por 6-hidroxi-dopamina (BARROSO-

CHINEA et al., 2005). Sabe-se que um aumento na expressão de fatores neurotróficos

43

como GDNF e BDNF no estriado representa um dos mecanismos compensatórios

acionados pela lesão expressiva de células dopaminégicas da SN, principalmente em

animais jovens (YUREK & FLETCHER-TURNER, 2001). De acordo com este último

estudo, a expressão do BDNF foi também aumentada na SN lesionada, não sendo restrita

aos neurônios dopaminérgicos. Estudos in vitro mostraram que DHA promove e o AA

suprime o crescimento neurítico induzido pelo NGF em células PC12 (IKEMOTO et al.,

1997). Por outro lado, recentes evidências indicam que a deficiência em ácido alfa-

linolênico por duas gerações pode reduzir a expressão do NGF no hipocampo bem como

aumentar tal expressão no córtex piriforme (IKEMOTO et al., 2000). Tal deficiência pode

também reduzir os níveis de RNAm para o BDNF no córtex cerebral (RAPOPORT et al.,

2007). Assim, mesmo considerando que os efeitos de uma deficiência em AGEs sobre a

expressão de neurotrofinas pode variar entre regiões encefálicas, acreditamos que uma

redução nos níveis de fatores tróficos do estriado ventral ou mesmo da SN pode ser um dos

potenciais mecanismos envolvidos com a redução do número de neurônios dopaminérgicos

na RD, considerando a importância dos mesmos para garantir a sobrevivência e os

mecanismos reativos destes neurônios diante de vários tipos de insultos neurodegenerativos

(CONNOR et. al., 2001). Os neurônios da RV que projetam para o estriado dorsal são mais

vulneráveis à lesão induzida pela inibição do complexo mitocondrial I pela 6-

hidroxidopamina (BARROSO-CHINEA et al., 2005), mas não transportam GDNF. Assim,

os resultados obtidos no present estudo não corroboram a nossa primeira hipótese de que os

neurônios dopaminérgicos da pars reticulada seriam mais vulneráveis à lesão do que os da

pars compacta. Futuros estudos tornam-se necessários para investigar mecanismos

44

envolvidos na vulnerabilidade diferencial das duas subpopulaçõeos de neurônios

dopaminérgicos aos efeitos da deficiência crônica em AGEs.

Os resultados obtidos a partir da análise de imunoblot em homogenados do

mesencéfalo ventral corroboram a nossa segunda hipótese, evidenciando uma redução

expressiva nos níveis protéicos desta enzima. Considerando que os nossos homogenados

contêm outros núcleos dopaminérgicos como a ATV, núcleo retrorubral bem como alguns

núcleos da formação reticular, os resultados obtidos sugerem que os efeitos observados na

SN são apenas parte das alterações induzidas pela deficiência crônica em AGES. De fato, o

trabalho recém publicado de Ahmad et AL., 2008 relata que a deficiência de até 45% nos

níveis de DHA cerebral induzida por acasalamentos sucessivos, dentro de uma mesma

geração, reduz o número total de neurônios imunorreativos à TH tanto na SN compacta

como na ATV. Considerando que o modelo experimental adotado no presente estudo, de

uma deficiência crônica por até duas gerações, pode reduzir de forma mais expressiva os

níveis de DHA no mesencéfalo (AHMAD et al. 2002a) a expressiva redução nos níveis

protéicos de TH pode representar de fato efeitos deletérios mais difusos sobre o sistema

dopaminérgico mesencefálico.

A deficiência em AA e DHA nos animais adultos de F1 aumentou a área do

soma dos neurônios presentes na RD e reduziu de forma significativa esta dimensão

neuronal tanto na RD como na RV nos animais jovens de F2. Mecanismos distintos podem

estar envolvidos com estas alterações. Aumento nas dimensões do soma neuronal vem

sendo descrito em modelos experimentais de doenças neurodegenerativas como um índice

de disfunção metabólica induzida pelo aumento na atividade celular nas fases iniciais de

insultos que levam ao estresse oxidativo (CASADESUS et al., 2007). A deficiência em

45

AGEs pode estar associada a uma vulnerabilidade maior a processos pro-inflamatórios e

oxidativos. Evidências recentes indicam que o DHA exerce um efeito neuroprotetor por

aumentar as respostas antioxidantes melhorando a capacidade de tamponamento de radicais

livres (YAVIN, 2006). Considerando que nenhuma alteração nas dimensões do soma foi

observada nos neurônios dopaminérgicos da RV, estes resultados mais uma vez indicam

um processo reativo diferenciado destes neurônios diante da deficiência em AGEs.

A redução significativa observada nas dimensões de neurônios

dopaminérgicos em animais jovens do grupo DAGEs em F2 não foi restrita a uma das

subpopulações estudadas e se assemelha ao previamente descrito para neurônios do

hipocampo, hipotálamo, córtex piriforme e parietal, em animais submetidos à carência

específica em DHA por duas ou três gerações (AHMAD et al., 2002a,b). Considerando que

em relação às regiões acima citadas, a SN apresenta períodos distintos de neurogênese,

diferenciação e sinaptogênese, os dados do presente estudo sugerem que os efeitos sobre a

diferenciação neuronal induzidos pela deficiência crônica em AGEs por várias gerações

podem ocorrer de forma inespecífica entre regiões encefálicas, o que poderá se refletir

sobre diversos aspectos funcionais do cérebro. A favor desta hipótese devemos considerar

que as projeções nigro-estriatais a partir das regiões RD e RV da SN diferem também

quanto à influência sobre aspectos motores e motivacionais do comportamento, sendo a

região ventral mais envolvida com a motricidade e a dorsal com aspectos emocionais e

cognitivos (BARROSO-CHINEA et al., 2005). Evidências recentes também indicam que

estes neurônios diferem quanto aos aspectos eletrofisiológicos (LAMMEL et. al., 2008).

Tem sido demonstrado que a deficiência em DHA diminui a concentração de PS em

membranas neuronais o que pode alterar as propriedades das membranas,

46

subseqüentemente levando a alterações funcionais (DAS UN, 2006). Vale salientar que a

deficiência de DHA por várias gerações induz uma redução diferenciada nos níveis deste

ácido graxo em várias regiões do sistema nervoso, sendo o mesencéfalo e a medula

espinhal regiões com menores níveis de redução (65% e 53% respectivamente) quando

comparadas ao córtex cerebral, por exemplo, cuja depleção chega a ser de até 85% (XIAO

et al., 2005, LEVANT et al., 2006).

Mudanças no tamanho de neurônios dopaminégicos da SN vêm sendo

relacionadas com o aporte de fatores tróficos do estriado em modelos experimentais de

Parkinsonismo apenas quando o número de neurônios lesionados ultrapassa cerca de 65%,

tendo sido observado neste caso, um aumento na área do soma (LING et al., 2004). No

hipocampo, especula-se que a redução na expressão do NGF, induzida pela carência em

DHA, seja um dos fatores envolvidos com a redução de tamanho observada nos neurônios

da região CA1 (AHMAD et al., 2002b). No sentido de melhor interpretar os resultados

obtidos no nosso estudo, acreditamos que será importante investigar se a deficiência em AA

e DHA é capaz de modificar a expressão de fatores tróficos no estriado e SN, como um dos

potenciais mecanismos envolvidos nos efeitos observados nos animais de F2.

As alterações induzidas pela deficiência em AGEs na distribuição e

diferenciação de neurônios dopaminérgicos do sistema nigroestriatal reforçam a relevância

destes AG durante o desenvolvimento do sistema nervoso bem como em processos

degenerativos tardios, especialmente em regiões envolvidas com o desempenho motor, e

cognitivo. Independente dos mecanismos através dos quais a deficiência em AGEs induziu

alterações na distribuição e em características morfométricas dos neurônios dopaminérgicos

da SN, é possível que tais alterações possam contribuir para as mudanças comportamentais

47

observadas em animais alimentados com dietas similares, tais como alterações na atividade

motora e comportamento exploratório em ratos e aumentado comportamento estereotipado

em primatas (ENSLEN ET AL., 1991; FEDOROVA & SALEM, 2006). Tais alterações

podem também contribuir para as modificações em aspectos neuroquímicos do sistema

dopaminérgico descrito em prévios estudos, tais como densidade de terminais, níveis de

liberação de dopamina e de receptores D2, as quais diferiram entre alvos mesencefálicos

(DELION et AL., 1996; ZIMMER et AL., 2000). No entanto, vale salientar que tanto a

densidade como a funcionalidade dos transportadores de dopamina não foram alterados no

estriado diante de uma deficiência em DHA por até três gerações (KODAS et al. 2002). É

possível que a magnitude dos efeitos ora observados não sejam suficientes para produzir

alterações significantes nos parâmetros previamente descritos para a distribuição e

funcionalidade do DAT em terminais neuronais, o que corrobora a conhecida plasticidade

do sistema dopaminérgico nigroestriatal. Talvez um aspecto mais importante a ser

considerado seja o de que a deficiência em DHA e AA, por alterar os mecanismos de

proteção dos neurônios dopaminérgicos possam contribuir para aumentar a vulnerabilidade

destes neurônios a insultos e processos patológicos que contribuem para o desenvolvimento

da doença de Parkinson. A etiologia de tal doença vem sendo bastante estudada e dentre as

várias hipóteses levantadas para explicar a lesão dos neurônios dopaminérgicos, discute-se

a importância de eventos oxidativos e inflamatórios, os quais poderão ser acentuados com a

deficiência crônica em AGEs.

Os dados ora obtidos também reforçam a importância do aleitamento materno,

principalmente em crianças pré-termo, onde o acúmulo de AGEs no cérebro não ocorre

adequadamente no último trimestre da gestação (NEURINGER & CONNORE, 1988;

48

DIJCK-BROUWER et al., 2005). Os prematuros alimentados com fórmulas enriquecidas

com AGPIs apresentaram concentrações elevadas de DHA e AA nos eritrócitos e no

plasma quando comparados com aqueles alimentados com fórmulas convencionais (sem

adição de AGPI-CL), mas apresentaram concentrações ainda inferiores em relação aos

prematuros alimentados com leite humano (SILVA et al., 2007).

Assim, o presente estudo reforça a importância dos AGEs para o desenvolvimento

encefálico bem como para a prevenção de doenças neurodegenerativas de interesse

crescente do ponto de vista epidemiológico, pelo impacto social e econômico que causam.

Por outro lado, apontam para a complexidade do sistema nervoso, estimulando a realização

de futuros estudos no sentido de elucidar potenciais mecanismos envolvidos com os

resultados obtidos, e melhor entender a reatividade diferenciada de algumas regiões

encefálicas diante da deficiência específica de macronutrientes essenciais.

49

VI. CONCLUSÃO

1) A deficiência dietética crônica em ácido linoleico e ácido alfa-linolênico foi

eficaz em reduzir o ganho de peso de animais da primeira geração na fase adulta, bem

como afetou o desenvolvimento corporal e encefálico da prole na segunda geração, a julgar

pelas alterações ponderais detectadas

2) A despeito das alterações observadas no peso encefálico, o desenvolvimento

citoarquitetônico da substancia negra não foi afetado pelo distúrbio nutricional.

3) Os neurônios dopaminérgicos da substancia negra pars compacta (RD)

apresentaram uma maior vulnerabilidade aos efeitos da deficiência crônica em AGEs, tanto

na sua distribuição como nas mudanças observadas em suas dimensões.

4) A redução no tamanho neuronal observado nas regiões RD e RV sugerem que

os efeitos da deficiência crônica em AGEs ocorre de forma inespecífica em regiões

encefálicas com diferentes características neuroquímicas e funcionais

5) A deficiência dietética crônica em AGEs compromete a expressão da enzima

tirosina hidroxilase no mesencéfalo ventral

50

VII. PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que os neurônios

dopaminérgicos presentes na pars compacta e pars reticulada da substancia negra

apresentam uma vulnerabilidade diferenciada diante de uma deficiência nutricional crônica

em ácido linoléico e ácido alfa-linolênico. Tais resultados indicam uma reatividade

diferenciada destes neurônios em relação à previamente descrita a partir de paradigmas

experimentais capazes de induzir moderado nível de estresse oxidativo pela utilização de

inibidores do complexo mitocondrial. Acreditamos que será de importância realizar futuros

estudos no sentido de investigar potenciais mecanismos envolvidos com as alterações ora

descritas. Assim, algumas perspectivas são sugeridas para a continuidade do presente

estudo:

1) Realizar uma análise estereológica ao longo de toda a extensão da substância negra para a

população total de neurônios e subpopulações de neurônios dopaminérgicos e GABAérgicos

presentes na pars compacta e reticulada

2) Investigar se a deficiência crônica em AGEs induz estresse oxidativo na substancia negra e

estriado, analisando também a reatividade glial a partir da população de astrócitos e microglia

reativa

3) Avaliar se a deficiência crônica em AGEs é capaz de induzir apoptose nos neurônios

dopaminérgicos da pars compacta

4) Analisar os níveis de RNAm e proteína para os fatores tróficos GDNF e BDNF e para o

receptor Nurr1 em homogenados da substancia negra e estriado nos grupos experimentais

controle e DAGEs

51

5) Investigar por imunohistoquímica a distribuição do receptor Nurr1 nos neurônios da pars

compacta e reticulada

6) Dosar os níveis de dopamina e seu metabólito DOPAC ao nível estriatal.

52

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACAR N, CHARDIGNY JM, DARBOIS M, PASQUIS B, SÉBÉDIO JL. Modification of the dopaminergic neurotransmitters in striatum, frontal cortex and hippocampus of rats fed for 21 months with trans isomers of alpha-linolenic acid. Neurosci Res. 2003 Apr;45(4):375-82. AGRANOFF BW, HAJRA AK. Lipids. In: Basic Neurochemistry: molecular, cellular and medical aspects, Eds Siegel GJ, Alberts RW, Agranoff BW, Katzman R, New York: Raven Press, p.97-115, 1994. AHMAD SO, PARK JH, RADEL JD, LEVANT B. Reduced numbers of dopamine neurons in the substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area of rats fed an n-3 polyunsaturated fatty acid-deficient diet: a stereological study. Neurosci Lett. 2008 Jun 27;438(3):303-7. Epub 2008 Apr 25. AHMAD A, MURTHY M, GREINER RS, MORIGUCHI T, SALEM N JR. A decrease in cell size accompanies a loss of docosahexaenoate in the rat hippocampus. Nutr Neurosci. 2002 Apr;5(2):103-13. AHMAD A, MORIGUCHI T, SALEM N Decrease in neuron size in docosahexaenoic acid-deficient brain. Pediatr Neurol. 2002 Mar;26(3): 210-8.

AKBAR M, CALDERON F, WEN Z, KIM HY. Docosahexaenoic acid: a positive modulator of Akt signaling in neuronal survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 2;102(31):10858-63. Epub 2005 Jul 22. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Sep 6;102(36):12997. AKBAR M, KIM KY. Inhibition of neuronal apoptosis by polyunsaturated fatty acids. J Mol Neurosci. 2001 Apr-Jun;16(2-3):223-7. AKBAR M, KIM KY. Protective effects of docosahexaenoic acid in staurosporine-induced apoptosis: involvement of phosphatidylinositol-3 kinase pathway. J Neurochem. 2002 Aug;82(3):655-65.

ALÉSSIO ML, LÉGER CL, RASOLONJANAHARY R, WANDSCHEER DE,CLAUSER H, ENJALBERT A, KORDON C. Selective effect of a diet-induced decrease in the arachidonic acid membrane-phospholipid content on in vitro phospholipase C and adenylate cyclase-mediated pituitary response to angiotensin II. Neuroendocrinology. 1994 Oct;60(4):400-9.

53

ALMEIDA SS, DUNTAS LH, DYE L, NUNES ML, PRASAD C, ROCHA JB, WAINWRIGHT P, ZAIA CT, GUEDES RC. Nutrition and brain function: a multidisciplinary virtual symposium. Nutr Neurosci. 2002 Oct;5(5): 311-20.

ALMLI CR, HENAULT MA, VELOZO CA, MORGANE PJ. Ontogeny of electrical activity of main olfactory bulb in freely-moving normal and malnourished rats. Brain Res. 1985 Feb;350(1-2):1-11. AMUSQUIVAR E, RUPÉREZ FJ, BARBAS C, HERRERA E. Low arachidonic acid rather than alpha-tocopherol is responsible for the delayed postnatal development in offspring of rats fed fish oil instead of olive oil during pregnancy and lactation. J Nutr. 2000 Nov;130(11):2855-65 ANDRADE JP, MADEIRA MD, PAULA-BARBOSA MM. Effects of long-term malnutrition and rehabilitation on the hippocampal formation of the adult rat. A morphometric study. J Anat. 1995 Oct;187 ( Pt 2):379-93. AVELLINI L, TERRACINA L, GAITI A. Linoleic acid passage through the blood-brin barrier and a possible effect of age. Neurochem Res 19: 129-33, 1994. BARROSO-CHINEA P, CRUZ-MUROS I, AYMERICH MS, RODRÍGUEZ-DÍAZ M, AFONSO-ORAMAS D, LANCIEGO JL, GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ T. Striatal expression of GDNF and differential vulnerability of midbrain dopaminergic cells. Eur J Neurosci. 2005 Apr;21(7):1815-27. BASS NH, NETSKY MG, YOUNG E. Effect of neonatal malnutrition on developing cerebrum. II. Microchemical and histologic study of myelin formation in the rat. Arch Neurol. 1970 Oct;23(4):303-13. BASS NH, NETSKY MG, YOUNG E. Effects of neonatal malnutrition on developing cerebrum. I. Microchemical and histologic study of cellular differentiation in the rat. Arch Neurol. 1970 Oct;23(4): 289-302. BAZAN N.G. Neuroprotectin D1 (NPD1): a DHA-derived mediator that protects brain and retina against cell injury-induced oxidative stress. Brain Pathol. 15 (2005) 159–166. BAYER SA, WILLS KV, TRIARHOU LC, GHETTI B. Time of neuron origin and gradients of neurogenesis in midbrain dopaminergic neurons in the mouse. Exp Brain Res. 1995;105:191-199. BEAUREGARD M, FERRON A. Dopamine modulates the inhibition induced by GABA in rat cerebral cortex: an iontophoretic study. Eur J Pharmacol. 1991 Dec 3;205(3):225-31.

54

BODNAR, L. M.; WISNER, K. L.. Nutrition and Depression: Implications for Improving Mental Health Among Childbearing-Aged Women. Biological Psychiatry, v. 58, p. 679–685, 2005. BOUSQUET M, SAINT-PIERRE M, JULIEN C, SALEM N JR, CICCHETTI F,CALON F. Beneficial effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acid on toxin-induced neuronal degeneration in an animal model of Parkinson's disease. FASEB J. 2008 Apr;22(4):1213-25. Epub 2007 Nov 21 BOURRE JM, FRANCOIS M, YOUYOU A, DUMONT O, PICIOTTI M, PASCAL G, DURAND G. The effects of dietary alpha-linolenic acid on the composition of nerve membranes, enzymatic activity, amplitude of electrophysiological parameters, resistance to poisons and performance of learning tasks in rats. J Nutr. 1989 Dec;119(12):1880-92. BOURRE JM. Effects of nutrients (in food) on the structure and function of the nervous system: update on dietary requirements for brain. Part 1: micronutrients. J Nutr Health Aging. 2006 Sep-Oct;10(5):377-85. BOURRE JM. Effects of nutrients (in food) on the structure and function of the nervous system: update on dietary requirements for brain. Part 2: macronutrients.J Nutr Health Aging. 2006 Sep-Oct;10(5):386-99. BRONWEN CONNOR, B.; DOROTHY A. KOZLOWSKI, JAMES R. UNNERSTALL, JOHN D. ELSWORTH, JENNIFER L. TILLERSON, TIMOTHY SCHALLERT, AND MARTHA C. BOHN. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) gene delivery protects dopaminergic terminals from degeneration. Experimental Neurology. 169, 83–95 (2001) CALDERON F, KIM HY. Docosahexaenoic acid promotes neurite growth in hippocampal neurons. J Neurochem. 2004 Aug;90(4):979-88. Erratum in: J Neurochem. 2004 Sep;90(6):1540. CAO, D., XUE, R., LIU, Z. Effects of docosahexaenoic acido n the survival and neurite outgrowth of rat cortical neurons in primary cultures. J. Nutr. Biochem. 2005, 16, 538-546. CARRASCO E, WERNER P, CASPER D. Prostaglandin receptor EP2 protects dopaminergic neurons against 6-OHDA-mediated low oxidative stress. Neurosci Lett. 2008 Aug 15;441(1):44-9. Epub 2008 Jun 6. CARRASCO E, CASPER D, WERNER P. PGE(2) receptor EP1 renders dopaminergic neurons selectively vulnerable to low-level oxidative stress and direct PGE(2) neurotoxicity. J Neurosci Res. 2007 Nov 1;85(14):3109-17.

55

CASADESUS G, MOREIRA PI, NUNOMURA A, SIEDLAK SL, BLIGH-GLOVER W, BALRAJ E, PETOT G, SMITH MA, PERRY G.Indices of metabolic dysfunction and oxidative stress. Neurochem Res. 2007 Apr-May;32(4-5):717-22. CERRUTI C, WALTHER DM, KUHAR MJ, UHL GR. Dopamine transporter mRNA expression is intense in rat midbrain neurons and modest outside midbrain. Brain Res Mol Brain Res. 1993 Apr;18(1-2):181-6. CHALON S. Omega-3 fatty acids and monoamine neurotransmission. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2006 Oct-Nov;75(4-5):259-69. Epub 2006 Sep 11. CHAMPEIL-POTOKAR G, CHAUMONTET C, GUESNET P, LAVIALLE M,DENIS I. Docosahexaenoic acid (22:6n-3) enrichment of membrane phospholipids increases gap junction coupling capacity in cultured astrocytes. Eur J Neurosci. 2006 Dec;24(11):3084-90. CHAMPEIL-POTOKAR G, DENIS I, GOUSTARD-LANGELIER B, ALESSANDRI JM, GUESNET P, LAVIALLE M. Astrocytes in culture require docosahexaenoic acid to restore the n-3/n-6 polyunsaturated fatty acid balance in their membrane phospholipids. J Neurosci Res. 2004 Jan 1;75(1):96-106. CHEN N, APPELL M, BERFIELD JL, REITH ME Inhibition by arachidonic acid and other fatty acids of dopamine uptake at the human dopamine transporter. Eur J Pharmacol. 2003 Oct 8;478(2-3):89-95. CHURCH MW, JEN KL, DOWHAN LM, ADAMS BR, HOTRA JW. Excess and deficient omega-3 fatty acid during pregnancy and lactation cause impaired neural transmission in rat pups. Neurotoxicol Teratol. 2008 Mar-Apr;30(2):107-17. Epub 2008 Jan 5. CLIFFORD JJ, DRAGO J, NATOLI AL, WONG JY, KINSELLA A, WADDINGTON JL, VADDADI KS. Essential fatty acids given from conception prevent topographies of motor deficit in a transgenic model of Huntington's disease. Neuroscience. 2002;109(1):81-8. COLOMBO JP, CERVANTES H, KOKOROVIC M, PFISTER U, PERRITAZ R. Effect of different protein diets on the distribution of amino acids in plasma, liver and brain in the rat. Ann Nutr Metab. 1992; 36(1): 23-33. CONFALONI A, AVELLINO C, CAMPEGGI LM, SALVATI S. Accelerated myelinogenesis induced by dietary lipids in rats. Dev Neurosci. 1993;15(2):94-9. CONNOR WE, NEURINGER M. The effects of n-3 fatty acid deficiency and repletion upon the fatty acid composition and function of the brain and retina. Prog Clin Biol Res. 1988;282:275-94.

56

CONNOR WE, NEURINGER M, REISBICK S. Essential fatty acids: the importance of n-3 fatty acids in the retina and brain. Nutr Ver 50: 21-9, 1992.

CONNOR B, KOZLOWSKI DA, UNNERSTALL JR, ELSWORTH JD, TILLERSON JL, SCHALLERT T, BOHN MC. Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) gene delivery protects dopaminergic terminals from degeneration.Exp Neurol. 2001 May;169(1):83-95. CRAWFORD MA, GOLFETTO I, GHEBREMESKEL K, MIN Y, MOODLEY T, POSTON L, PHYLACTOS CUNNANE S, SCHMIDT W. The potential role for arachidonic and docosahexaenoic acids in protection against some central nervous system injuries in preterm infants. Lipids. 2003; 38:303-15. CRAWFORD MA, BLOOM M, BROADHURST CL, SCHMIDT WF, CUNNANE SC, GALLI C, GEHBREMESKEL K, LINSEISEN F, LLOYD-SMITH J, PARKINGTON J. Evidence for the unique function of docosahexaenoic acid during the evolution of the modern hominid brain. Lipids. 1999;34 Suppl:S39-47. DAMIER, P, HIRSCH, EC, AGID, Y, GRAYBIEL, AM. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson´s disease. Brain, 1999; 122: 1437-1448. DAS UM. Essential fatty acids: biochemistry, physiology and pathology. Biothechnol. J. 2006. DAS UN. Perinatal supplementation of long-chain polyunsaturated fatty acids, immune response and adult diseases. Med Sci Monit. 2004 May;10(5):HY19-25. Epub 2004 Apr 28. DE LA PRESA OWENS S, INNIS SM. Docosahexaenoic and arachidonic acid prevent a decrease in dopaminergic and serotoninergic neurotransmitters in frontal cortex caused by a linoleic and alpha-linolenic acid deficient diet in formula-fed piglets. J Nutr. 1999 Nov: 129(11): 2088-93. DE LA PRESA OWENS S, INNIS SM. Diverse, region-specific effects of addition of arachidonic and docosahexanoic acids to formula with low or adequate linoleic and alpha-linolenic acids on piglet brain monoaminergic neurotransmitters. Pediatr Res. 2000 Jul;48(1):125-30.

DE ONÍS M, MONTEIRO C, AKRÉ J, GLUGSTON G .The worldwide magnitude of protein-energy malnutrition: an overview from the WHO Global Database on Child Growth. Bull World Health Organ. 1993;71(6): 703-12.

57

de VRIESE, S.R.; CHRISTOPHE, A.B.; MAES, M.. Lowered serum n-3 polyunsaturated fatty acid (PUFA) levels predict the occurrence of postpartum depression: Further evidence that lowered n-PUFAs are related to major depression. Life Sciences, v. 73, 3181-3187, 2003. DELION S, CHALON S, GUILLOTEAU D, BESNARD JC, DURAND G. alpha-Linolenic acid dietary deficiency alters age-related changes of dopaminergic and serotoninergic neurotransmission in the rat frontal cortex. J Neurochem. 1996 Apr; 66 (4): 1582-91. DELION S, CHALON S, HÉRAULT J, GUILLOTEAU D, BESNARD JC, DURAND G. Chronic dietary alpha-linolenic acid deficiency alters dopaminergic and serotoninergic neurotransmission in rats. J Nutr. 1994 Dec;124(12):2466-76. DESAI M, HALES CN. Role of fetal and infant growth in programming metabolism in later life. Biol Rev Camb Philos Soc. 1997 May; 72 (2): 329-48. DIÁZ-CINTRA S, CINTRA L, GALVÁN A, AGUILAR A, KEMPER T, MORGANE PJ. Effects of prenatal protein deprivation on postnatal development of granule cells in the fascia dentata. J Comp Neurol. 1991 Aug 15; 310 (3): 356-64. DIJCK-BROUWER DA, HADDERS-ALGRA M, BOUWSTRA H, DECSI T, BOEHM G, MARTINI IA, BOERSMA ER, MUSKIET FA. Lower fetal status of docosahexaenoic acid, arachidonic acid and essential fatty acids is associated with less favorable neonatal neurological condition. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2005 Jan;72(1):21-8. EDMOND J, HIGA TA, KORSAK RA, BERGNER EA, LEE WN. Fatty acid transport and utilization for the developing brain. J Neurochem 70: 1227-34, 1998. ENSLEN M., MILON H., MALNOE A. Effect of low intake of n-3 fatty acids during development on brain phospholipid fatty acid composition and exploratory behavior in rats, Lipids 26 (1991) 203–208. FARQUHARSON J, JAMIESON EC, LOGAN RW, PATRICK WJ, HOWATSON AG, COCKBURN F. Age- and dietary-related distributions of hepatic arachidonic and docosahexaenoic acid in early infancy. Pediatr Res. 1995 Sep;38(3):361-5. FEDOROVA I., SALEM JR N. Omega-3 fatty acids and rodent behavior, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 75 (2006) 271–289. FISH I, WINICK M. Effect of malnutrition on regional growth of the developing rat brain. Exp Neurol. 1969 Dec;25(4):534-40. FONG T.M,.MCNAMEE M.G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochem. J. 25 (1986) 830–840.

58

FORBES WB, STERN WC, TRACY CA, RESNICK O, MORGANE PJ. Effect of chronic protein malnutrition on experimentally induced seizures in the rat. Exp Neurol. 1978 Nov; 62 (2): 475-81. FREITAS, JJS; KIETZER, KS. Entendendo a gordura os ácidos graxos. 2002; 469-488.Capítulo 34. GALINEAU L, KODAS E, GUILLOTEAU D, VILAR MP, CHALON S. Ontogeny of the dopamine and serotonin transporters in the rat brain: an autoradiographic study. Neurosci Lett. 2004 Jun 17;363(3):266-71. GASPAR P, BEN JELLOUN N, FEBVRET A. Sparing of the dopaminergic neurons containing calbindin-D28k and of the dopaminergic mesocortical projections in weaver mutant mice. Neuroscience. 1994 Jul;61(2):293-305. GORDON D. A new approach to insect-pest control--combination of neurotoxins interacting with voltage sensitive sodium channels to increase selectivity and specificity. Invert Neurosci. 1997 Sep-Dec;3(2-3):103-16. Review.

GRANTHAM-MCGREGOR S. A review of studies of the effect of severe malnutrition on mental development. J Nutr. 1995 Aug;125(8 Suppl):2233S-2238S.

GRANTHAM-MCGREGOR SM, LIRA PI, ASHWORTH A, MORRIS SS,ASSUNÇÃO AM. The development of low birth weight term infants and the effects of the environment in northeast Brazil. J Pediatr. 1998 Apr;132(4):661-6. GREEN P, YAVIN E. Fatty acid composition of late embryonic and early postnatal rat brain. Lipids. 1996 Aug;31(8):859-65. GREINER RS, MORIGUCHI T, SLOTNICK BM, HUTTON A, SALEM N. Olfactory discrimination deficits in n-3 fatty acid-deficient rats. Physiol Behav. 2001 Feb;72(3):379-85.

GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ T, BARROSO-CHINEA P, DE LA CRUZ MUROS I, DEL MAR PÉREZ-DELGADO M, RODRÍGUEZ M. Expression of dopamine and vesicular monoamine transporters and differential vulnerability of mesostriatal dopaminergic neurons. J Comp Neurol. 2004 Nov 8; 479(2):198-215.

GUEDES RC, MONTEIRO JS, TEODÓSIO NR. Malnutrition and brain function: experimental studies using the phenomenon of cortical spreading depression. Rev Bras Biol. 1996 Dec;56 Su 1 Pt 2:293-301. GUREVICH EV, JOYCE JN. Dopamine D(3) receptor is selectively and transiently expressed in the developing whisker barrel cortex of the rat. J Comp Neurol. 2000 Apr 24; 420(1): 35-51.

59

HANTRAYE P. Modeling dopamine system dysfunction in experimental animals. Nucl Med Biol. 1998 Nov;25(8):721-8. HERRERA-MARSCHITZ M, GOINY M, UTSUMI H, UNGERSTEDT U. Mesencephalic dopamine innervation of the frontoparietal (sensorimotor) cortex of the rat: a microdialysis study. Neurosci Lett. 1989 Feb 27;97(3):266-70. HIBBELN JR, UMHAU JC, LINNOILA M, GEORGE DT, RAGAN PW, SHOAF SE, VAUGHAN MR, RAWLINGS R, SALEM N JR. A replication study of violent and nonviolent subjects: cerebrospinal fluid metabolites of serotonin and dopamine are predicted by plasma essential fatty acids. Biol Psychiatry. 1998 Aug 15;44(4):243-9. HORROCKS LA, YEO YK. Health benefits od docosahexaenoic acid (DHA). Pharmacol Res 40: 211-25, 1999. HURD YL, PRISTUPA ZB, HERMAN MM, NIZNIK HB, KLEINMAN JE. The dopamine transporter and dopamine D2 receptor messenger RNAs are differentially expressed in limbic- and motor-related subpopulations of human mesencephalic neurons. Neuroscience. 1994 Nov;63(2):357-62. INNIS, S.M. The role of dietary n-6 and n-3 fatty acids in the developing brain. Developmental Neuroscience, v.22, p.474-480, 2000. INNIS SM. Essential fatty acids in growth and development. Prog Lipid Res. 1991;30(1):39-103. IKEMOTO A, NITTA A, FURUKAWA S, OHISHI M, NAKAMURA A, FUJII Y, OKUYAMA H. Dietary n-3 fatty acid deficiency decreases nerve growth factor content in rat hippocampus. Neurosci Lett. 2000 May 12; 285(2): 99-102.

IKEMOTO A, KOBAYASHI T, WATANABE S, OKUYAMA H. Membrane fatty acid modifications of PC12 cells by arachidonate or docosahexaenoate affect neurite outgrowth but not norepinephrine release. Neurochem Res. 1997 Jun;22(6):671-8. ITOKAZU, N.; IKEGAYA, Y.; NISHIKAWA, M.; MATSUKI, N. Bidirectional actions of docosahexaenoic acid on hippocampal neurotransmissions in vivo. Brain Research, v.862, p.211-216, 2000.

JANKOVIC J, CHEN S, LE WD. The role of Nurr1 in the development of dopaminergic neurons and Parkinson's disease. Prog Neurobiol. 2005 Sep-Oct;77(1-2):128-38. JOEL D, WEINER I. The connections of the dopaminergic system with the striatum in rats and primates: an analysis with respect to the functional and compartmental organization of the striatum. Neuroscience. 2000;96(3):451-74

60

KIM HY, AKBAR M, KIM KY. Inhibition of neuronal apoptosis by polyunsaturated fatty acids. J Mol Neurosci. 2001 Apr-Jun;16(2-3):223-7; discussion 279-84. KODAS E., PAGE G, ZIMMER L., VANCASSEL S., GUILLOTEAU D., DURAND G., CHALON S. Neither the density nor function of striatal dopamine transporters were influenced by chronic n-3 polyunsaturated fatty acid deficiency in rodents. Neurosci.Lett. 321 (2002) 95–99. KOLETZKO B, LIEN E, AGOSTONI C, BÖHLES H, CAMPOY C, CETIN I,DECSI T, DUDENHAUSEN JW, DUPONT C, FORSYTH S, HOESLI I,HOLZGREVE W, LAPILLONNE A, PUTET G, SECHER NJ, SYMONDS M,SZAJEWSKA H, WILLATTS P, UAUY R; World Association of Perinatal Medicine Dietary Guidelines Working Group. The roles of long-chain polyunsaturated fatty acids in pregnancy, lactation and infancy: review of current knowledge and consensus recommendations. J Perinat Med. 2008;36(1):5-14.

KOROTKOVA M, GABRIELSSON B, HANSON LA, STRANDVIK B. Maternal dietary intake of essential fatty acids affects adipose tissue growth and leptin mRNA expression in suckling rat pups. Pediatr Res. 2002 Jul;52(1):78-84

LAMMEL S, HETZEL A, HÄCKEL O, JONES I, LISS B, ROEPER J. Unique properties of mesoprefrontal neurons within a dual mesocorticolimbic dopamine system. Neuron. 2008 Mar 13;57(5):760-73 LANG-LAZDUNSKI L., BLONDEAU N., JARRETOU, G., LAZDUNSKI, M., HERUTEAUX, C. Linolenic acid prevents neuronal cell death and paraplegia after transient spinal cord ischemia in rats. J. Vasc. Surg. 38: 564-575, 2003.

LAURITZEN I, BLONDEAU N, HEURTEAUX C, WIDMANN C, ROMEY G, LAZDUNSKI M.Polyunsaturated fatty acids are potent neuroprotectors. EMBO J. 2000 Apr 17;19(8):1784-93. LAVOIE B, PARENT A. Dopaminergic neurons expressing calbindin in normal and parkinsonian monkeys. Neuroreport. 1991 Oct;2(10):601-4. LE, W., CONNEELY, O. M., HE, Y., JANKOVIC, J., AND APPEL, S. HReduced Nurr1 expression increases the vulnerability of mesencephalic dopamine neurons to MPTP-induced injury.J. Neurochem. .1999 73, 2218–2221 LEVANT, B.; RADEL, S.E., CARLSON, S.E. Decreased brain DHA during development alters dopamine-related behaviors in adult rats that are differentially affected by dietary remediation. Behav. Brain. Res. 152: 49-57, 2004.

61

LEVANT B, OZIAS MK, JONES KA, CARLSON SE. Differential effects of modulation of docosahexaenoic acid content during development in specific regions of rat brain. Lipids. 2006 May;41(5):407-14. LEVANT, B.; OZIAS, M.K.; DAVIS, P.F.; WINTER, M.; RUSSELL, K.L.; CARLSON, S.E.; REED, G.A.; McCARSON, K.K. Decreased brain docosahexaenoic acid content produces neurobiological effects associated with depression: Interactions with reproductive status in female rats. Psychoneuroendocrinology, v. 33, p.1279-1292, 2008. LEWIS PD, BALÁZS R, PATEL AJ, JOHNSON AL. The effect of undernutrition in early life on cell generation in the rat brain. Brain Res. 1975 Jan 10;83(2):235-47. LEWIS DA, MELCHITZKY DS, SESACK SR, WHITEHEAD RE, AUH S, SAMPSON A. Dopamine transporter immunoreactivity in monkey cerebral cortex: regional, laminar, and ultrastructural localization. J Comp Neurol. 2001 Mar 26;432(1):119-36. LIA D, WEISINGERB HS, WEISINGERC RS, MATHAID M, ARMITAGEB JÁ, VINGRYSB AJ, SINCLAIRE AJ. Omega 6 to omega 3 fatty acid imbalance early in life leads to persistent reductions in DHA levels in glycerophospholipids in rat hypothalamus even after long-term omega 3 fatty acid repletion. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 2006; 391–399. LING, ZD; CHANG, Q, LIPTON, JW; TONG, CW; LANDERS, TM; CARVEY, PM. Combined toxicity of prenatal bacterial endotoxin exposure and postnatal 6-hydroxydopamine in the adult rat midbrain. Neuroscience. 2004; 124:619-628. L'HIRONDEL M, CHÉRAMY A, GODEHEU G, GLOWINSKI J. Effects of arachidonic acid on dopamine synthesis, spontaneous release, and uptake in striatal synaptosomes from the rat. J Neurochem. 1995 Mar;64(3):1406-9. MATHIEU G, DENIS S, LAVIALLE M, VANCASSEL S. Synergistic effects of stress and omega-3 fatty acid deprivation on emotional response and brain lipid composition in adult rats. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2008 Jun;78(6):391-401. Epub 2008 Jun 24. MARTIN RE, BAZAN NG. Changing fatty acid content of growth cone lipids prior to synaptogenesis. J Neurochem. 59: 318-25, 1992. MCGEE CD, GREENWOOD CE, CINADER B. Dietary fat composition and age affect synaptosomal and retinal phospholipid fatty acid composition in C57BL/6 mice. Lipids. 29: 605-10, 1994. MCNAMARA RK, CARLSON SE. Role of omega-3 fatty acids in brain development and function: potential implications for the pathogenesis and prevention of psychopathology.

62

Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2006 Oct-Nov;75(4-5):329-49. Epub 2006 Sep. MOORE SA, YODER E, SPECTOR AA. Role of the blood-brain barrier in the formation of long-chain omega-3 and omega-6 fatty acids from essential fatty acid precursors. J Neurochem 55: 391-402, 1990. MORGANE PJ, AUSTIN-LAFRANCE R, BRONZINO J, TONKISS J, DÍAZ-CINTRA S, CINTRA L, KEMPER T, GALLER JR. Prenatal malnutrition and development of the brain. Neurosci Biobehav Rev. 1993 Spring;17(1):91-128. MORLEY R, LUCAS A. Nutrition and cognitive development. Br Med Bull. 1997 Jan;53(1):123-34. NAKANO H, KOBAYASHI K, OHUCHI S, SEKIGUCHI S, YAMANE T. Single-step single-molecule PCR of DNA with a homo-priming sequence using a single primer and hot-startable DNA polymerase. J Biosci Bioeng. 2000;90(4):456-8. NEURINGER, M; ANDERSON, GJ; CONNOR, WE. The essentiality of n-3 fatty acids for the development and function of the retina and brain. Annu Rev Nutr. 1988; 8: 517-41. O'CONNOR DL, HALL R, ADAMKIN D, AUESTAD N, CASTILLO M, CONNOR WE, CONNOR SL, FITZGERALD K, GROH-WARGO S, HARTMANN EE,JACOBS J, JANOWSKY J, LUCAS A, MARGESON D, MENA P, NEURINGER M, NESIN M, SINGER L, STEPHENSON T, SZABO J, ZEMON V; ROSS PRETERM LIPID STUDY. Growth and development in preterm infants fed long-chain polyunsaturated fatty acids: a prospective, randomized controlled trial Pediatrics. 2001 Aug;108(2):359-71. ODUTUGA AA. Long-term deficiency of essential fatty acids in rats and its effect on brain recoveryClin Exp Pharmacol Physiol. 1979 Jul-Aug;6(4):361-6. ODUTUGA AA. Effects of low-zinc status and essential fatty acid deficiency on growth and lipid composition of rat brain. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1982 Mar-Apr;9(2):213-21. OZIAS MK, CARLSON SE, LEVANT B. Maternal parity and diet (n-3) polyunsaturated fatty acid concentration influence accretion of brain phospholipid docosahexaenoic acid in developing rats. J Nutr. 2007 Jan;137(1):125-9. PAIXÃO P, COSTA P, BUGALHO T, FIDALGO C, PEREIRA LM. Simple method for determination of paraquat in plasma and serum of human patients by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2002 Jul 25;775(1):109-13.

63

PARKINGTON JE. The impact of the systematic exploitation of marine foods on human evolution. Colloquia of the dual congress of the International Association of the study of human biologists, Sun City, South Africa, June 28 – July 4, 1998. PAXINOS, G. E WATSON C. Atlas “The rat brain in stereotaxic coordinates”, (1986); Plate 81 POMPEIA C, FREITAS JJ, KIM JS, ZYNGIER SB, CURI R. Arachidonic acid cytotoxicity in leukocytes: implications of oxidative stress and eicosanoid synthesis. Biol Cell. 2002 Sep;94(4-5):251-65.

PRENSA L, PARENT A. The nigrostriatal pathway in the rat: A single-axon study of the relationship between dorsal and ventral tier nigral neurons and the striosome/matrix striatal compartments. J Neurosci. 2001 Sep 15; 21(18): 7247-60.

RAPOPORT SI, RAO JS, IGARASHI M. Brain metabolism of nutritionally essential polyunsaturated fatty acids depends on both the diet and the liver. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2007 Nov-Dec;77(5-6):251-61. Epub 2007 Dec 3.

ROBAIN O, PONSOT G. Effects of undernutrition on glial maturation. Brain Res. 1978 Jun 30; 149 (2): 379-97.

ROBSON, L.G., DYALL, S., SIDLOFF, D., MICHAEL-TITUS, A.T. Omega-3 polyunsaturated fatty acids increase the neurite outgrowth of rat sensory neurons throughout development and in aged animals. Neurobiology of aging, 2008 (article in press). SALAS M. Neonatal nutritional deprivation and cerebral development: morphological, behavioral and electrophysiological aspects. Bol Estud Med Biol. 1978 Oct; 30(4): 111-24. SALEM N, JR., LITMAN B, KIM H-Y, GAWRISCH K. Mechanisms of action of docosahexaenoic acid in the nervous system. Lipids. 2001;36:945–60. SASTRE M, GALEA E, FEINSTEIN D, REIS DJ, REGUNATHAN S. Metabolism of agmatine in macrophages: modulation by lipopolysaccharide and inhibitory cytokines. Biochem J. 1998 Mar 15;330 ( Pt 3):1405-9. SAUERWALD TU, HACHEY DL, JENSEN CL, CHEN H, ANDERSON RE, HEIRD WC. Effect of dietary alpha-linolenic acid intake on incorporation of docosahexaenoic and arachidonic acids into plasma phospholipids of term infants. Lipids. 1996 Mar;31 Suppl:S131-5. SCHMITZ G, ECKER J. The opposing effects of n-3 and n-6 fatty acids. Prog Lipid Res. 2008 Mar;47(2):147-55. Epub 2007 Dec 25.

64

SHARMA SK, NAYAR U, MAHESHWARI MC, SINGH B. Effect of undernutrition on developing rat cerebellum. Some electrophysiological and neuromorphological correlates. J Neurol Sci. 1987 May; 78(3): 261-72. SHI F, CAVITT J, AUDUS KL. 21 – aminosteroid and 2 – (aminomethyl) chromans inhibition of arachidonic acid-induced lipid peroxidation and permeability enhancement in bovine brain microvessel endothelial cell monolayers. Free Radic Biol Med 19: 349-57, 1995. SMIDT MP, SMITS SM, BURBACH JP. Homeobox gene Pitx3 and its role in the development of dopamine neurons of the substantia nigra. Cell Tissue Res. 2004 Oct;318(1):35-43. Epub 2004 Aug 6. SOARES MC, ALÉSSIO ML, LÉGER CL, BLUET-PAJOT MT, CLAUSER H,ENJALBERT A, KORDON C, WANDSCHEER DE. Effect of essential fatty acid deficiency on membrane fatty acid content and growth hormone stimulation of rat pituitaries during postnatal development. J Lipid Res. 1995 Jun;36(6):1401-6. STEINER H, KITAI ST. Regulation of rat cortex function by D1 dopamine receptors in the striatum. J Neurosci. 2000 Jul 15;20(14):5449-60. SUGAHARA M, SHIRAISHI H. Synaptic density of the prefrontal cortex regulated by dopamine instead of serotonin in rats. Brain Res. 1998 Dec 14;814(1-2):143-56. SVENNERHOLM L. Distribution and fatty acid composition of phosphoglycerides in normal human brain. J Lipid Res 9 : 570, 1968. H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon, Electrophortic transfer of proteins from

polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Prog. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1979) 4350–4354 UHL GR, WALTHER D, MASH D, FAUCHEUX B, JAVOY-AGID F. Dopamine transporter messenger RNA in Parkinson's disease and control substantia nigra neurons. Ann Neurol. 1994 Apr; 35 (4): 494-8. VALENZUELA AB, NIETO SK. Ácidos grasos omega-6 y omega-3 en la nutrición perinatal: su importância em el desarrolo del sistema nervioso y visual. Rev Chil Pediatr. 2003; 74: 149-57. WEBER PC. Dietary (n-3) fatty acids and eicosanoid formation. Bibl Nutr Dieta. 1987;(40):42-50.

WERNER A, MINICH DM, HAVINGA R, BLOKS V, VAN GOOR H, KUIPERS F, VERKADE HJ. Fat malabsorption in essential fatty acid-deficient mice is not due to

65

impaired bile formation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002 Oct;283(4):G900-8. WEISINGER HS, VINGRYS AJ, SINCLAIR AJ. Dietary manipulation of long-chain polyunsaturated fatty acids in the retina and brain of guinea pigs. Lipids 30: 471-3, 1995.

WEST CD, KEMPER TL. The effect of a low protein diet on the anatomical development of the rat brain. Brain Res. 1976 May 7;107(2):221-37.

WILLUMSEN N, VAAGENES H, LIE O, RUSTAN AC, BERGE RK. Eicosapentaenoic acid, increases mitochondrial fatty acid oxidation and upregulates 2,4-dienoyl-CoA reductase gene expression in rats. Lipids 31: 579-92, 1996. WITT M.R, NIELSEN M. Characterization of the influence of unsaturated free fatty acids on brain GABA/benzodiazepine receptor binding in vitro, J. Neurochem. 62 (1994) 1432–1439. XIAO P, ZHANG S, CHEN Z, LU Z. Post-hybridisation by Electrophoresis for Reinforcing the Hybridization Result. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2005;7:7118-21. YAMADA A, ISHII N, TAKAHASHI K. Direction and speed of actin filaments moving along thick filaments isolated from molluscan smooth muscle. J Biochem. 1990 Sep;108(3):341-3. YAVIN E. Versatile roles of docosahexaenoic acid in the prenatal brain: from pro- and anti-oxidant features to regulation of gene expression. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2006 Sep;75(3):203-11. Epub 2006 Jul 12. YEHUDA S, RABINOVITZ S, MOSTOFSKY DI. Mixture of essential fatty acids lowers test anxiety. Nutr Neurosci. 2005 Aug;8(4):265-7. YEHUDA S, RABINOVITZ S, MOSTOFSKY DI. Effects of essential fatty acid preparation (SR-3) on brain lipids, biochemistry, physiology and behavioural neurobiology, Eds Yehuda S, Mostofsky DI, Totowa NJ, New York: Humana Press, p.427-52, 1997. YOSHIDA S, SATO A, OKUYAMA H. Pathophysilogical effects of dietary essential fatty acid balance on neural systems. Jpn J Pharmacol 77: 11-22, 1998. YUREK DM, FLETCHER-TURNER A. Differential expression of GDNF, BDNF, and NT-3 in the aging nigrostriatal system following a neurotoxic lesion. Brain Res. 2001 Feb 9; 891(1-2):228-35. ZIMMER, L.; VACANSSEL, S.D.; DURAND, G.; GUILLOTEAU, D.; BODARD, S.; BESNARD, J.C.; CHALON, S.. Modification of dopamine neurotransmission in the

66

nucleus accumbens of rats deficient in n-3-polyunsaturated fatty acids. Journal of Lipid Research, v. 41, p. 32-40, 2000. ZIMMER L, DURAND G, GUILLOTEAU D, CHALON S. n-3 polyunsaturated fatty acid deficiency and dopamine metabolism in the rat frontal cortex. Lipids. 1999;34 Suppl:S251. ZIMMER L, HEMBERT S, DURAND G, BRETON P, GUILLOTEAU D, BESNARD JC, CHALON S. Chronic n-3 polyunsaturated fatty acid diet-deficiency acts on dopamine metabolism in the rat frontal cortex: a microdialysis study. Neurosci Lett. 1998 Jan 16;240(3):177-81. ZIMMER L., VANCASSEL S., CANTAGREL S., BRETON P., DELAMANCHE S.,. GUILLOTEAU D,DURAND G., CHALON S.. The dopamine mesocorticolimbic pathway is affected by deficiency in n-3 polyunsaturated fatty acids, Am. J. Clin. Nutr. 75 (2002) 662–667. ZIMMER, L; DELPAL, S; GUILLOTEAU, D; AÏOUN, J; DURAND, G; CHALON, SC. Chronic n-3 polyunsaturated fatty acid diet-deficiency alters dopamine dopamine vesicle density in the rat frontal cortex. Neurosci Lett. 2000; 284: 25-28.

67

IX. ANEXOS

68

IX. 1. Carta de aprovação emitida pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE

69

IX. 2. Tabela centesimal da dieta do Grupo C (óleo de soja, corante azul)

70

IX 3. Tabela centesimal da dieta do grupo DAGEs (óleo de coco, corante rosa)

71

IX.4. TABELAS TABELA 1. Resultados Massas Corpóreas (evolução ponderal) GRUPOS Ao nascer 07 dias 14 dias 21 dias 30 dias

(machos) 30 dias

(fêmeas) F1 Controle

6,49 g ± 0,63; n=77

14,72 g ± 2,31; n=89

28,37 g ± 3,42; n=89

47,89 g ± 5,54; n=67

85,58 g ± 11,32; n=42

79,32 g ± 10,20; n=38

F1 DAGEs

6,72 g ± 0,91; n=90

16,87 g ± 5,17; n=83

30,07 g ± 7,73; n=89

43,98 g ± 5,04;

n=65**

82,13 g ± 8,55; n=29

83,13 g ± 6,96; n=18

F2 Controle

6,53 g ± 0,62; n=35

20,94 g ± 3,63; n=35

33,77 g ± 2,98; n=35

54,18 g ± 8,47; n=30

85,67 g ± 14,12; n=18

86,66 g ± 13,61; n=10

F2 DAGEs

5,68 g ± 0,72; n=50**

16,26 g ± 5,02; n=36**

29,04 g ± 5,38; n=36**

46,8 g ± 9,92; n=42**

74,41 g ± 5,90; n=13**

68,04 g ± 10,34; n=05*

Massas corpóreas dos animais dos grupos C e DAGEs até a idade de 30 dias nos grupos experimentais da primeira (F1) e segunda (F2) gerações. Os valores representam média ± dp. Teste T de Student., *(p<0.05). **(p<0.01).

TABELA 2. Resultados das massas corpóreas de animais com 60 e 90 dias.

GRUPOS 60 dias 90 dias F1 Controle 284,50 g ± 65,58; n=18 381,18 g ± 39,53; n=14 F1 DAGEs 205,28 g ± 79,01; n=27* 355 g ± 40,55; n=14** Massas corpóreas de ratos wistar machos dos grupos experimentais de F1 com 60 e 90 (90 a 101) dias. O grupo DAGEs apresenta menor peso corporal quando comparado com o grupo C. Os valores representam média ± dp. Teste T de Student. *(p<0.05). **(p<0.01). TABELA 3. Resultados das Massas Encefálicas

GRUPOS F1 - 30 dias F1 - 90 dias F2 – 30 dias Controle 1,63 g ± 0,11; n=12 1,81 g ± 0,15; n=08 1,68 g ± 0,06; n=12 DAGEs 1,62 g ± 0,10; n=15 1,93 g ± 0,14; n=09 1,56g ±0,11; n=08** Massas encefálicas dos grupos experimentais F1 e F2.. Os valores representam média ± dp. Teste T de Student. ** (p<0.01).

72

TABELA 4. Resultados do índice massa encefálica/ massa corpórea

GRUPOS F1 - 90 dias F2 – 30 dias Controle 0,0061 g ± 0,0014; n=08 0,0158 g ± 0,0029; n=12 DAGEs 0,0059 g ± 0,0008; n=09 0,0148 g ± 0,0020; n=08 TABELA 5. Resultados das dimensões lineares e bidimensionais dos limites citoarquitetônicos da substância negra.

ÁREA SN GRUPOS SN total SN RD SN RV

F1 Controle (n=05) 1,488 mm2 ± 0,108 0,282 mm2 ± 0,042 0,270 mm2 ± 0,024 F1 DAGEs (n=06) 1,649 mm2 ± 0,137 0,310 mm2 ± 0,061 0,337 mm2 ± 0,068 F2 Controle (n=08) 1,399 mm2 ± 0,174 0,261 mm2 ± 0,041 0,277 mm2 ± 0,039 F2 DAGEs (n=07) 1,464 mm2 ± 0,242 0,296 mm2 ± 0,044 0,279 mm2 ± 0,062 Dimensões lineares e bidimensionais dos limites citoarquitetônicos da SN nos grupos C e DAGEs de F1 e F2.. Os valores representam média ± dp (p < 0,01). TABELA 6. Resultados do diâmetro dorso-ventral (maior) e do diâmetro rostro-caudal (menor) da substância negra.

DIÂMETRO SN GRUPOS DORSO-VENTRAL

(MAIOR) ROSTRO-CAUDAL

(MENOR) F1 Controle (n=05) 2,126 mm ± 0,037 1,035 mm ± 0,130 F1 DAGEs (n=06) 2,185 mm ± 0,115 1,111 mm ± 0,0072 F2 Controle (n=08) 1,898 mm ± 0,110 1,062 mm ± 0,097 F2 DAGEs (n=07) 1,868 mm ± 0,093 1,115 mm ± 0,141 TABELA 7. Resultados Número de Neurônios Dopaminérgicos na Substância Negra ao nível medial

N° NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS DA SN GRUPOS SN RD SN RV

F1 Controle (n=05) 282,20 ± 16,31 131 ± 17,56 F1 DAGEs (n=06) 238,83 ± 26,88* 110,66 ± 15,98 F2 Controle (n=07) 268,57 ± 49,29 109,57 ± 15,53 F2 DAGEs (n=07) 221,71 ± 18,47* 112,57 ± 41,22 Números totais de neurônios dopaminérgicos estimados ao nível medial da SN em RD e RV dos grupos C e DAGEs de F1 e F2. Os valores representam média ± dp. Teste T de Student *(p < 0,05).

73

TABELA 8. Resultados do Espectro de Tamanho dos Neurônios Dopaminérgicos da Subtância Negra.

ÁREA DO SOMA DE NEURÔNIOS DOPAMINÉRGICOS DA SN

GRUPOS

SN RD SN RV F1 Controle (n=250) 237,88 µm2 ± 3,44 288,45 µm2 ± 4,40 F1 DAGEs (n=300) 259,25 µm2 ± 3,37* 292,36 µm2 ± 3,50 F2 Controle (n=350) 285,07 µm2 ± 3,4 347,63 µm2 ± 3,83 F2 DAGEs (n=350) 257,03 µm2 ± 4,62* 331,41 µm2 ± 4,89* Área do soma dos neurônios dopaminérgicos presentes na RD e RV dos grupos C e DAGEs de F1 e F2. Dados representam média ± EPM. Análise de variância seguida de Tukey test (p < 0.05).