INTRODUO Queijo minas frescal ou simplesmente queijo minas um queijo brasileiro. Segundo o Regulamento Tcnico MERCOSUL de Identidade e Qualidade n145/96, "entende-se por Queijo Minas Frescal o queijo fresco obtido por coagulao enzimtica do leite com coalho e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou no com ao de bactrias lcticas especficas (MERCOSUL, 1996). Os alimentos que so contaminados com maior frequncia so as carnes processadas, cremes de leite, queijos, saladas de batata e sorvetes. Uma vez contaminado, se o alimento permanecer sem refrigerao ( temperatura ambiente ou estufa), ocorrera o crescimento da bactria. As amostras de S. aureus que contaminam os alimentos so geralmente provenientes de indivduos que manuseiam esses alimentos, podendo ser portadores assintomticos ou indivduos que apresentam algum tipo de infeco. Os sintomas da intoxicao alimentar estafiloccica consistem de nuseas, vmitos, diarreia e dores abdominais. Geralmente, tem incio em torno de quatro horas aps a ingesto do alimento e duram em mdia 12 horas. Como as enterotoxinas so termoestveis, a coco dos alimentos no as destri (TRABULSI, 2008). Mastite uma inflamao da glndula mamria; a mastite bovina uma inflamao do bere. Sob o ponto de vista econmico, a doena mais importante do gado leiteiro, por causa da baixa quantidade e da pobre qualidade do leite produzido pelos animais infectados. A mastite pode resultar na destruio das glndulas produtoras de leite e, em alguns casos, a vaca pode vir a morrer. Os agentes etiolgicos das mastites podem ocasionar doena nos individuo que consomem o leite contaminado. Diversos tipos de bactrias podem causar mastite; o mais comum Staphylococcus aureus. A mastite bovina , em geral, o resultado de cuidados imprprios dos animais e pode ser prevenida pela adoo de boas prticas de higiene (PELCZAR, 1981). Os estafilococos foram descritos por Robert Kock em 1878, em secreo purulenta proveniente de seres humanos. Foi cultivado em meio lquido em 1880 por Pasteur. Ogston (1881), demostrou sua patogenicidade para camundongos, e em 1884, Rosenbach caracterizou o gnero com duas espcies. Atualmente so conhecidas 32 espcies, e dessas, 16 so encontradas em seres humanos e podem provocar diferentes sndromes clnicas, incluindo infeces cutneas, infeces oportunistas, infeces das vias urinrias e infeces sistmicas (JORGE, 2008). Embora encontrado com relativa frequncia como membro da microbiota normal do corpo humano, o Staphylococcus aureus uma das bactrias patognicas mais importantes, uma vez que atua como agente de uma ampla gama de infeces, variando desde aquelas localizadas, geralmente superficiais, at algumas disseminadas com elevada gravidade (TRABULSI, 2008). O gar Baird Parker pode ser utilizado para o plaqueamento direto de alimentos processados ou in natura, tanto na enumerao com finalidades indicativas como na enumerao com finalidades de sade pblica. Por outro lado, o gar BP, no capaz de suprimir completamente o crescimento de competidores de S. aureus, particularmente outras espcies no patognicas do gnero Staphylococcus, que produzem colnias semelhantes, havendo necessidade de submeter as colnias tpicas a testes adicionais para confirmao definitiva (SILVA, 2001). Suas colnias em meio slido geralmente so lisas, brilhantes, circulares e translucidas. S. aureus e algumas outras espcies formam colnias amarelas, acinzentadas ou laranja, em funo da presena de grande quantidade de pigmentos carotenoides localizados na membrana celular. Os estafilococos esto entre as mais resistentes de todas as bactrias no formadoras de esporos (JORGE, 2008). Os estafilococos apresentam-se como clulas esfricas de 0,5 a 1,5 um de dimetro, isoladas aos pares ou mais, caracteristicamente com a disposio de cachos irregulares. So imveis e no formam esporos, Gram-positivos, anaerbios facultativos e geralmente produzem catalase (JORGE, 2008). Prova da catalase destina-se verificao da presena da enzima catalase. usada para diferenciao de estafilococos, micrococos e estomatococos dos estreptococos que so catalase-negativos. A catalase uma enzima que decompe o peroxido de hidrognio em oxignio e gua (JORGE, 2008). Prova da coagulase verifica a capacidade de um microrganismo coagular o plasma atravs da enzima coagulase. Geralmente usada para identificao de estafilococos catalase-positiva, sendo frequentemente critrio de virulncia e patogenicidade (JORGE, 2008). Prova da DNAse a enzima difunde-se pelo meio de cultura, produzindo hidrlise do DNA presente no meio. Quando da evidenciao com cido clordrico, o mesmo precipita o DNA presente no meio. Assim, se o microrganismo produzir DNAse, ocorre um halo transparente ao redor da colnia, onde a enzima atuou sobre o DNA (JORGE, 2008).

OBJETIVO

Analisar a presena e/ou ausncia de Staphylococcus aureus em amostras de queijo minas frescal atravs do meio de cultivo Baird Parker seletivo diferencial, com confirmao por provas bioqumicas.

MATERIAIS E MTODOSPipetas graduadas de diversos tamanhos (1, 5 e 10mL)ErlenmeyerBasto de vidroTudos com roscaBico de Bunsen Tela de amiantoPlacas de petriAla de DrigalskiBalana analtica e semi-analticaEsptulaFluxo laminarAutoclavePipetadoresRecipiente de plstico estrilEstante para tubosEstufaLaminaTubo FalconCentrifugaMaterial de coleta sangunea gua peptonadaPeroxido de HidrognioPlasma SanguneoEDTAHCL 1 Mol

Meios de Cultura:gar Baird Parkergar DNAseEmulso de gema de ovo/ soluo salina 0,9%Telurito de potssio 1%

METODOLOGIA: Preparao da amostra e diluies seriadas, foi extrado 10 gramas da amostra (cone trufado), adicionou-se 90ml de gua peptonada totalizando a diluio, foi extrado 1,0 ml da diluio e adicionou-se em um tubo com rosca estril contendo 9ml de gua peptonada, formando a diluio . Da diluio foi extrado 1ml e inoculado em outro tubo com rosca estril contendo 9ml de gua peptonada, formando a diluio . Preparao da emulso de gema de ovo/ soluo salina 0,9%: colocou-se o ovo submerso em lcool 70% por 10 minutos, em seguida em fluxo laminar separou-se a gema da clara, no qual a gema foi pesada em balana semi-analtica, foi pipetado a mesma quantidade de soluo salina 0,9% (1/1). Pipetou-se telurito de potssio 1% no gar Baird Parker, em seguida foi adicionado a emulso no mesmo, que foi vertida em placa de petri. Aps a solidificao do gar BP pipetou-se 0,1 mL do inculo em trs placas formando as diluies, espalhou-se o inoculo com uma ala de Drigalski e aguardou-se a completa absoro do liquido e incubou-se as placas invertidas, a 37C/ 48 horas.Provas Bioqumicas: Selecionou-se as placas com presena de colnias tpicas de S. aureus para realizao das provas bioqumicas:

Prova da Catalase. Em uma lamina adicionado 3 gotas de peroxido de hidrognio 3%, em seguida adicionado uma alada contendo uma colnia isolada do inoculo. Observou-se se ocorre o borbulhamento imediato (teste positivo) ou no (teste negativo).

Prova da Coagulase: A prova realizada colocando-se uma ala de cultura de estafilococos em 0,5 mL de plasma humano contendo anticoagulante (EDTA). A seguir incubou-se a 37 C de 2/4 horas e, observou-se coagulao, o que indica prova positiva.Prova da DNAse: Em meio de cultura contendo DNA (gar DNAse), foi estriado uma alada de inoculo verticalmente, em seguida incubou-se a 37 C durante 48 horas. Aps o perodo de incubao, a placa foi coberta com HCL 1 mol. E observou se ocorreu a formao do halo transparente em volta da rea de crescimento. Contagem das colnias selecionou-se as placas 20 a 200 colnias no qual foram contadas e calculou-se o numero de unidades formadoras de colnias (UFC) por grama da amostra, multiplicou-se o numero de colnias pelo inverso da diluio inoculada e volume semeado (10). Usou-se notao exponencial e apenas uma casa decimal depois da vrgula para apresentar o resultado.

RESULTADO E DISCUSSO:

Tabela 1: Resultados obtidos atravs da contagem padro em placas.Inoculao

Resultado 31 11 5

Formula: n colnias x 10 x .= 31 x 10 x 10= 3,1 x UFC/ g.

Provas Bioqumicas

Catalase Tabela 2: Resultados obtidos atravs da prova bioqumica catalase.Inoculao

Resultado Positivo Positivo Positivo

Figura 1: Imagem ilustrativa demonstrando a reao positiva da catalase podendo ser visualizado a formao de bolhas.

Coagulase:Tabela 3: Resultado obtido atravs da prova bioqumica coagulase.Inoculao

Resultado Negativo Positivo Negativo

Figura 2: Imagem ilustrando a formao de coagulo em plasma sanguneo, positivando para S. aureus.

DNAse:Tabela 4: Resultado obtido atravs da prova bioqumica DNAse.Inoculao

Resultado Negativo Positivo Negativo

Figura 3: Imagem ilustrando a formao do halo transparente em torno da rea de crescimento.DISCUSSO

Atravs dos resultados obtidos podemos observar a presena de S. aureus em nmero elevado evidenciando uma contaminao prejudicial a sade humana. Komatsu (2008) analisou a presena de estafilococos coagulase positiva em queijo minas, onde verificou que 88% das amostras encontraram-se contaminadas com nveis inaceitveis de estafilococos coagulase positiva. Segundo Brant et al., (2007) a contaminao da maioria das amostras de queijos artesanais por estafilococos coagulase positiva podem ser explicadas pelo fato de as principais fontes de contaminao do queijo serem a matria-prima e a manipulao por pessoas portadoras desse micro-organismo. Assumpo et al, (2003) verificando as fontes de contaminao por Staphylococcus aureus em linhas de processamento de queijo prato, constataram contagens elevadas nas mos ou nos antebraos dos manipuladores. Apesar de o tratamento trmico ter eliminado a populao de Staphylococcus sp. no leite, as etapas posteriores pasteurizao comprometeram a qualidade microbiolgica do produto final. Com esse embasamento demonstramos que nossos resultados foram de acordo com os dados anlisados anteriormente por outros pesquisadores. Nos quais foi encontrado a bactria S. aureus.

CONCLUSO

Conclumos atravs dos resultados apresentados que a amostra de alimento anlisada estava imprpria para consumo pois entrava em desacordo com a legislao RDC N. 12, de 2 de janeiro de 2001 por conter uma quantidade acima do numero permitido pela legislao 10. Contendo uma quantidade de microrganismos , nmero muito acima do permitido pela legislao acima citada.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

RESOLUO MERCOSUL/GMC/RES.N145/96. Regulamento Tcnico MERCOSUL de Identidade e Qualidade de Queijo Minas Frescal. Disponvel em: http://www.agais.com/normas/leite/queijo_minas_frescal.htm. Acesso em: 16, abril de 2014.

JORGE, O.C. Microbiologia: atividades prticas. 2 ed. So Paulo: Santos 2008.

TRABULSI, L. R. Microbiologia. 5 ed. So Paulo: Atheneu 2008.

PELCZAR, J.R. Microbiologia: conceitos e aplicao. 2 ed. So Paulo: McGraw-Hill, 1981

SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. 2 ed. So Paulo: Varela/ 2001. 31-39 p.

ASSUMPO, E.G.; PICCOLI VALLE, R.H.; HIRSCH, D.; ABREU, L.R. Fonte de contaminao por Staphylococcus aureus na linha de processamento de queijo prato. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, Lavras MG, v.55, n. 3, p.366-370, 2003.

KOMATSU, R.S. Origem dos Queijos Minas artesanal produzidos em Uberlndia-MG e ocorrncia de Staphylococcus Coagulase Positiva. 2008. 11p. Dissertao (Mestrado em Cincias Veterinria, Sade Animal) Faculdade de Medicina Veterinria Universidade Federal de Uberlndia, 2008.

BRANT, L.M.F.; FONSECA, L.M.; SILVA,M.C.C. Avaliao da qualidade microbiolgica do queijo-de-Minas artesanal do Serro-MG. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia, Belo horizonte MG, v.59, n. 6, p. 1570-1574, 2007.