UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

ANALISTA

GUSTAVO

COLORAÇÃO DE GRAM

MOGI DAS CRUZES

SETEMBRO, 2015

UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES

ANALICE SIMÕES TORRES

GUSTAVO CARVALHO DANTAS ZUCCHINI

MATHEUS ALVES MIRANDA

COLORAÇÃO DE GRAM

Relatório apresentado à disciplina de Microbiologia do

Curso de Farmácia da Universidade de Mogi das Cruzes,

como parte das exigências para aprovação na disciplina.

Professor Orientador : Marcelo Cortina

MOGI DAS CRUZES

SETEMBRO, 2015

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................4

2. OBJETIVOS.........................................................................................................5

3. DESENVOLVIMENTO.......................................................................................6

4. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................7

4.1. Procedimentos:......................................................................................................7

4.2. Preparo do esfregaço:............................................................................................7

4.3. Método de Coloração de Gram:............................................................................7

5. DISCUSSÃO DE RESULTADOS.......................................................................8

6. CONCLUSÃO......................................................................................................9

REFERENCIA..........................................................................................................................10

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1. INTRODUÇÃO

A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico

dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias

adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-

las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e

as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Após descrição do método,

inúmeras propostas de modificação foram feitas. Nas bactérias Gram-positivas a parede

celular é formada principalmente por ácidos teicóicos e nas bactérias Gram-negativas, é

formada principalmente por lipídeos. Por possuírem grande quantidade de ácidos teicóicos,

após a coloração, as Gram-positivas formam um complexo corado azul intenso, que não é

removido facilmente com álcool-acetona. As Gram-negativas não retêm a coloração após o

tratamento com álcool-acetona e são reveladas posteriormente com solução de fucsina ou

safranina, apresentando-se na coloração avermelhada.Consiste no tratamento sucessivo do

esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentescristal violeta, iodo, etanol - acetona

e fucsina básica.Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo diferente à coloração de

Gram, porquediferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou liberação

de umacombinação de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I).

Entre outrasdiferenças, as bactérias gram-positivas têm uma parede celular mias espessa de

peptideoglicana(dissacarídeos e aminoácidos) que as bactérias gram-negativas. Além disso, as

bactérias gram-negativas contêm uma camada de lipo-polissacarídeos (lipídeos e

polissacarídeos) como parte desua parede celular. Quando aplicada a células gram-positivas e

gram-negativas, a violeta degenciana e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro as

mesmas, a violeta de genciana e oiodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é

maior que a molécula CV que entrou nacélula e, devido ao seu tamanho, não pode ser

removido da camada intacta de peptideoglicanodas células gram-positivas pelo álcool. Nas

células gram-negativas o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é removido

através da camada fina de peptideoglicano, que não consegue reter o complexo. Como

resultado, as células gram-positivas retêm o corante epermanecem de cor púrpura. As células

gram-negativas não retêm o corante e ficam incolores atéserem contracoradas com um corante

vermelho, após o que adquirem cor rosa. O método deGram é uma das mais importantes

técnicas de coloração em microbiologia médica. Porém, osresultados da coloração de Gram

não são universalmente aplicáveis, pois algumas célulasbacterianas coram-se fracamente ou

não adquirem cor.

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2. OBJETIVOS

Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para

o métodode coloração de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactérias de acordo com a

coloração obtida e relacionando-as à composição química da parede celular das mesmas e

também desenvolver a habilidade para utilizar o microscópio óptico, observando as bactérias

após a coloração de GRAM.

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3. DESENVOLVIMENTO

A Escherichia coli (E. coli) assume a forma de um bacilo e pertence à família

das Enterobacteriaceae. São aeróbias e anaeróbias facultativas. O seu habitat natural é o

lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente. Possui

múltiplos flagelos dispostos em volta da célula. A E. coli é um dos poucos seres vivos capaz

de produzir todos os componentes de que é feita, a partir de compostos básicos e fontes de

energia suficientes. Ela é lactase positiva, uma enzima fermentadora de açucares que é

grandemente responsável pela flatulência de cada pessoa, especialmente após o consumo

de leite e seus derivados. Possuem fímbrias ou adesinas que permitem a sua fixação,

impedindo o arrastamento pela urina ou diarréia. Muitas produzem exotoxinas. São

susceptíveis aos ambientes secos, aos quais não resistem. Possuem lipopolissacarídeo (LPS),

como todas as bactérias Gram-negativas. Esta molécula externa ativa o sistema imunitário de

forma desproporcionada e a vaso dilatação excessiva provocada pelas citosinas produzidas

pode levar ao choque séptico e morte em casos desepticémia. Na E. coli, o genoma tem quase

5 milhões de pares de bases e vários milhares de genes codificando mais de 4000 proteínas (o

genoma humano tem 3 mil milhões de pares de bases e cerca de 27.000 proteínas.

Staphylococcus aureus, também conhecido como estafilococo dourado,é

uma espécie de estafilococo coagulase-positivos. É uma das espécies patogênicas mais

comuns, juntamente com a Escherichia coli. É a mais virulenta espécie do seu gênero. Têm

forma esférica, cerca de 1 micrometro de diâmetro, e formam grupos com aspecto de cachos

de uvas com cor amarelada, devido à produção de carotenóides, sendo daí o nome de

"estafilococo dourado". Cresce bem em ambientes salinos. Cerca de 15% dos indivíduos são

portadores de S. aureus, na pele ou nasofaringe. A infecção é freqüentemente causada por

pequenos cortes na pele.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1.Procedimentos:

Preparou-s esfregaços a partir de culturas puras de Escherichia

coli, Staphylococcus aureus.Corou-se os esfregaços pelo método de coloração de

Gram e observou-s ao microscópio óptico, sob imersão e foi identificadoa morfologia

deste microrganismos e sua reação frente ao método de Gram.

4.2.Preparo do esfregaço:

Identificou-se o lado da lamina que seria feito o esfregaço e em seguida

flambou-se a alça bacteriológica e deixamos esfriar e colocamos na lâmina uma gota

de água estéril.Flambou-se a agulha bacteriológica novamento , deixou-se esfriar

próximo a chama, abriu a placa  com a cultura teste e tocou a colônia escolhida para

retirada da amostra,   Esfregou o material com movimentos de rotação da alça

bacteriológica.Deixamos secar nas proximidades da chama E fixou-se o esfregaço

passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 3 vezes na  chama

 4.3.Método de Coloração de Gram:

Cobrimos toda a lâmina com solução cristal violeta,e aguardamos um minuto.

Em seguida cobrimos a lâmina com solução de Iugol por um minuto. Lavamos em fio

d’água. Gotejamos álcool absoluto (cerca de 10 segundos). Lavamos novamente a

lâmina em fio d’água. Cobrimos com fucsina e aguardamos 30 segundos. Lavamos a

lâmina em fio d’água e secamos (sem esfregar).Colocamos uma gota de óleo de

imersão sobre a lâmina e observamos em objetiva de imersão (IOOX)

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5. DISCUSSÃO DE RESULTADOSDurante o experimento, o objetivo era identificar a coloração de Gram, caracteristicas

de cada tipo, positivas e negativas. Primeiramente a lâmina foi preparada corretamente, seguindo o procedimento

demonstrado em laboratório, que consistia em coletar a bactéria designada, fixa-la na lâmina e, utilizando os corantes, determinar a coloração das mesmas.

Na primeira amostra de Staphylococcus Aureus, notamos uma coloração arroxeada com os núcleos em tons mais fortes, determinando que a bactéria era Gram Positiva.

Na segunda amostra de Escherichia coli , notamos uma coloração avermelhada, com núcleos igualmente em tons mais fortes, como na primeira amostra, porém a cor vermelha determina a bactéria Gram Negativa.

Logo, o experimento atendeu às expectativas solicitadas, pois determinamos com sucesso as características de cada bactéria.

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6. CONCLUSÃOCom base em observações feitas na atividade realizada em laboratóri, pode-se notar a

coloração das bactérias em cores avermelhadas e roxas, devido a laminas conterem bactérias

gram positivas e gram negativas. As bactérias possuem diferente afinidade pelos corantes

utilizados, fazendo com a sua distinção seja observada e classificada e o que faz com que elas

se corem diferentes, é que as bactérias gram positivas têm sua parede celular composta por

peptidioglicano, e as gram negativas por lipopolissacaridios.

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REFERENCIARibeiro, M. C.; Soares, M. M. S. R.; Microbiologia prática: roteiro e

manual; Atheneu; 1993; ,

        Pelczar Jr, M. J.; Chan, E. C. S.; Krieg, N. R.; Microbiology: concepts and applications;  McGrawHill; 1993;

Disponível em: http://www.biomedicinabrasil.com/2011/06/coloracao-de-gram.html

Disponível em: http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAp_AAA/processo-coloracao-gram.

Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/115_03gram.pdf