FACULDADE ASSIS GURGACZ

BRUNA BRASIL RODRIGUES FURTADOJOSICLEIA GARBIN LOCATELLILUCIMARA BOLSONI BOEIRA

LUÍS FERNANDO NAVA FERROPATRÍCIA CRISTINA RAUBER

SHEILA DANUZA OENNING

RELATÓRIO DE FITOQUÍMICA: PESQUISA DE FLAVANÓIDES EM Malva sylvestris

CASCAVEL2008

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BRUNA BRASIL RODRIGUES FURTADOJOSICLEIA GARBIN LOCATELLILUCIMARA BOLSONI BOEIRA

LUÍS FERNANDO NAVA FERROPATRÍCIA CRISTINA RAUBER

SHEILA DANUZA OENNING

RELATÓRIO DE FITOQUÍMICA: PESQUISA DE FLAVANÓIDES EM Malva sylvestris

Relatório apresentado como requisito de avaliação parcial da disciplina de Análise Instrumental e Orgânica do curso de Farmácia da Faculdade Assis Gurgacz.

Professora Orientadora: Jane de Jesus da Silveira Moreira

CASCAVEL2008

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1. INTRODUÇÃO

Como derivados das vias biossintéticas do acetato e chiquimato, os flavanóides

compreendem uma série de compostos secundários que ocorrem exclusivamente em

plantas superiores, sendo responsáveis, na planta, pela coloração das flores.

O termo flavanóide deriva do latim flavus, que significa amarelo, em virtude da

cor que conferem as flores. As antocianinas (uma das classes de compostos

flavanóides), por exemplo, são correntes vegetais com ampla distribuição nas plantas.

Os flavonóides concentram-se mais na parte aérea das plantas, ocorrendo em menor

proporção nas raízes e nos rizomas. A grande vantagem dos flavanóides ou

bioflavanóides é sua baixíssima toxicidade. São essenciais para a completa absorção

de vitamina C, ocorrendo normalmente onde haja esta vitamina. Na figura 01 observa-

se o esqueleto básico dos flavanóides:

Figura 01: Esqueleto básico de compostos flavanóides (Retirado de: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-40422003000400014&lng=en&nrm=iso)

Nos últimos anos, um grade interesse tem sido voltado para o papel das ERRO

(Espécies Radicalares Reativas de Oxigênio) na etiologia de várias doenças. As

propriedades antioxidantes que os flavanóides têm, assim atraído a atenção para a

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nutrição preventiva, pois eles protegem os constituintes alimentares contra o dano

oxidativo, podendo também contribuir para a prevenção de importantes patologias,

como doenças cardiovasculares, envelhecimento, cânceres, e outras. Existem vários

relatos de que os flavonóides exibem uma grande variedade de efeitos biológicos,

incluindo ação antibacteriana, antiviral, antiinflamatória, antialérgica e vasodilatadora.

Alem disto, eles inibem in vitro a peroxidação lipídica, a agregação plaquetária, a

permeabilidade e a fragilidade capilar, e a atividade de enzimas, como a ciclo-

oxigenase e a lipoxigenase. Os flavonóides exercem esses efeitos como antioxidantes

seqüestradores de ERRO, quelantes de cátions divalentes, proteção ao DNA e também

como scavengers de peroxinitrilo (ONOO). Estudos clínicos e epidemiológicos tem

demonstrado uma significativa correlação inversa entre o consumo de flavanóides e a

mortalidade por doenças cardiovasculares

Os flavanóides, biossintetizados a partir da via dos fenilpropanóides, constituem

uma importante classe de polifenóis, presentes em relativa abundância entre os

metabólitos secundários de vegetais e também é mais conveniente empregar-se uma

definição que leva em conta também a origem biogenética. Os flavanóides representam

um dos grupos fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem

natural. Essa classe de compostos é amplamente distribuída no reino vegetal. Quase

ausente em algas, alguns representantes foram identificados em briófitas, existindo

somente um relato de ocorrência em fungos. Em pteridófitas também foram

encontrados, mas sua variabilidade estrutural é pequena. Todavia, estão presentes em

abundância nas angiospermas, apresentando nesse grupo enorme diversidade

estrutural.

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Podem-se encontrar flavanóides em diversas formas estruturais. Entretanto, a

maioria dos representantes dessa classe possui 15 átomos de carbono em seu núcleo

fundamental, constituídos de duas fenilas ligadas por uma cadeia de 03 átomos entre

elas. Nos compostos tricíclicos, as unidades são chamadas núcleos A, B e C e os

átomos de carbono recebe a numeração com números ordinários para os núcleos A e C

e os mesmos números seguidos de uma linha (‘) para o núcleo B.

São conhecidos até o presente mais de 4.200 flavanóides diferentes, sendo que

o número de novas estruturas identificadas praticamente dobrou nos últimos 20 anos.

Levando-se em consideração sua distribuição nas angiospermas, o presente

trabalho destina-se a apresentar os resultados obtidos da pesquisa de flavanóides na

planta herbácea da família das angiospermas conhecida popularmente como malva

(Malva sylvestris), da família das Malvaceaes, que possui ampla distribuição e

adaptação no globo terrestre. Os empregos terapêuticos da malva, contudo, estão

relacionados a outras substâncias de seu metabolismo, como as mucilagens (agentes

poliurônicos), que apresentam leve efeito laxativo e protetor de mucosas inflamadas.

Daí seu tão aclamado uso no tratamento de afecções bucais, como aftas, sob as mais

diversas preparações. Contudo, desejou-se verificar realmente a presença de

compostos flavanóides nesta planta através de metodologias de fitoquímica clássica

para a extração, identificação e caracterização da atividade biológica (como

antioxidante) desses compostos retirados de Malva sylvestris (figura 02).

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Figura 02: Espécie vegetal de Malva sylvestris (Retirado de: http://www.marysplantfarm.com/_photos/perennials/malva%20sylvestris%20zebrinus.jpg).

2. METODOLOGIA

Para a extração de flavanóides a partir de Malva sylvestris foi realizada infusão a

frio (maceração) durante 07 dias com solução hidroalcoólica na proporção de 80% de

etanol para 20% de água.

Para identificar a presença de flavanóides foi realizada a reação de Shinoda que

consiste na reação entre a amostra na qual se pesquisa, 50 mg de limalha de magnésio

e 0,5 mL de HCl fumegante, obtendo assim uma reação exotérmica.

Para a determinação da atividade antioxidante de extrato de Malva sylvestris foi

realizado método espectrofotométrico com o radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picril-

hidrazil).

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3. PROCEDIMENTO

Inicialmente adquiriram-se folhas secas de Malva sylvestris em loja especializada

em produtos naturais do comércio local do município de Cascavel (PR). Estas folhas já

estavam previamente secas e limpas para o consumo, devidamente embaladas.

Levou-se o pacote de folhas de Malva sylvestris para o laboratório de Química da

Faculdade Assis Gurgacz, realizando o procedimento necessário para a obtenção de

flavanóides que, iniciou-se com a moagem total da droga vegetal seca em liquidificador

até obter-se 30 gramas da mesma. Em seguida, transferiram-se essas 30 gramas de

droga vegetal moída para um balão de fundo chato de 500 mL, previamente aferido

(peso do balão vazio: 295,28 gramas) e, pesado novamente após a adição da planta

moída (peso do balão com a planta: 327,25 gramas). Feita a adição da planta ao balão,

preparou-se 400 mL de solução extratora para a realização da infusão a frio

(maceração) da planta. Essa solução extratora foi feita com 80% de etanol (equivalente

a 320 mL) e 20% de H2O (80 mL); a composição extratora é feita com dois solventes

com grande polaridade em função de que flavanóides são compostos fenólicos de alta

polaridade.

Após a preparação da solução extratora, transferiu-se a mesma para o balão que

continha à planta moída e envolveu-se esse balão em papel alumínio, para proteger o

conteúdo do mesmo da luz durante 07 dias, que foi o tempo necessário para a

realização da infusão a frio. Entretanto, após 30 minutos de maceração, retirou-se 02

mL do extrato para realizar identificação prévia de flavanóides, guardando novamente

sob proteção da luz o balão com a planta em infusão a frio. A identificação de

flavanóides consistiu em diluir esses 02 mL de extrato com 04 mL de água e, a partir

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dessa solução diluída, foi retirado 0,5 mL e colocado em tubo de ensaio, adicionando

em seguida 0,5 mg de magnésio (Mg) em raspas a esse tubo e após, adicionou-se a

esse tubo 0,5 mL de HCl fumegante gota a gota pela parede do tubo, observando a

variação de cor. Notou-se uma suave mudança da coloração da solução para um tom

rose bem suave, indicando presença de flavanóides.

Após 07 dias de infusão, realizou-se a filtração gravimétrica do extrato. Desse

filtrado, seria necessário retirar 04 mL para serem colocados em tubo de centrífuga,

contudo, como esse extrato estava bastante concentrado de clorofila retirou-se apenas

01 mL e diluiu-se em 09 mL de água destilada, para que dessa solução diluída, fosse

retirado 04 mL para daí realizar a centrifugação durante 20 minutos. Do sobrenadante

da solução centrifugada, retirou-se 0,5 mL para proceder novamente a identificação de

flavonóides, conforme descrito no parágrafo anterior. A cor observada foi semelhante

ao teste feito anteriormente, ou seja, houve uma mudança para uma cor rose suave

bem clara, sendo positiva para a presença de flavanóides.

Com o restante do sobrenadante da fração centrifugada fez-se cromatografia de

camada delgada (CCD) com 03 mL de fase móvel contendo as seguintes frações: 15%

de hexano (0,45 mL), 25% de metanol (0,75 mL), 30% de acetato de etila e 30% de

clorofórmio (0,9 mL). Obteve-se a placa representada na figura 01:

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Figura 01: Placa de CCD com o extrato bruto (sem adição de solventes orgânicos) diluído centrifugado

Como se pode observar na figura 01, a fase móvel utilizada não foi adequada

para a separação de possíveis flavanóides presentes no extrato bruto (sem adição de

outros solventes após a filtração gravimétrica) diluído centrifugado, pois os solventes

utilizados possuíam um caráter bastante apolar e o extrato permaneceu no ponto onde

foi aplicado, não havendo, portanto, corrida de quaisquer compostos polares presentes.

Com o restante do filtrado do infuso de 07 dias, transferiu-se para um balão de

fundo redondo que foi em seguida levado a rota-evaporador até total evaporação do

solvente. O resíduo que ficou no balão foi diluído com 100 mL de água destilada. Dessa

solução aquosa foram retirados 30 mL e extraiu-se 03 vezes com os seguintes

solventes: éter etílico, acetato de etila e hexano, usando sempre de 10 a 15 ml de

solvente por vez. Essa extração foi realizada da seguinte forma:

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Transferiram-se para um funil de separação os 30 mL da solução aquosa

e adicionou-se 10 mL de éter etílico e agitou-se suavemente o funil até a

retirada total dos gases formado; essa primeira fase orgânica foi

descartada, porque o éter etílico ficou com uma coloração verde bastante

acentuada (excesso de clorofila), o que não seria necessário para a

extração de flavanóides. Em seguida fez-se a extração com éter etílico por

mais 03 vezes, novamente com 10 mL de solvente, sempre se agitando

suavemente até a retirada dos gases formados. A fase aquosa de cada

uma das três extrações não foi descartada como costumeiramente, mas

guardada para a extração com acetato de etila. A fase orgânica com éter

etílico foi guardada em um béquer devidamente identificado e guardada

com a proteção de uma folha de papel alumínio;

Com a fase aquosa que restante da extração com éter etílico, se fez 03

extrações com acetato de etila, sempre no volume de 10 mL por extração,

agitando-se suavemente até a retirada total dos gases formados. A fase

orgânica dessa extração foi guardada em béquer devidamente identificado

e com folha de papel alumínio e a fase aquosa foi guardada para a

próxima extração.

Com a fase aquosa da extração com acetato de etila, procedeu-se a

extração com hexano durante 03 vezes, sempre com 10 mL de solvente,

agitando suavemente. A fase orgânica foi guardada em béquer

identificado e com papel alumínio para minimizar a evaporação do

solvente e a fase aquosa foi descartada.

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Com esses três extratos prontos (cada um com aproximadamente 30 mL de

volume total), retirou-se de cada um deles 0,5 mL e transferiu para tubos de ensaios

individuais para cada extrato e os mesmos foram levados a banho-maria até completa

evaporação do solvente. Paralelamente, a secagem dos solventes realizou-se a CCD

dos três extratos, com a mesma fase móvel utilizada para a realização da CCD do

extrato bruto.

Após a evaporação total do solvente, reconstituiu-se o resíduo do tubo com 0,5

mL de água e procedeu-se com o teste para a detecção de flavanóides. O teste

apresentou resultado positivo somente para a solução reconstituída do extrato de

acetato de etila. A CCD apresentou um resultado, no mínimo curioso, levando-se em

consideração o resultado do teste qualitativo para flavanóides, como pode ser

visualizado na figura 02.

Figura 02: Placas de CCD da esquerda para a direita, extratos de: éter, acetato de etila e hexano.

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O extrato etéreo apresentou quatro manchas distintas com boa resolução,

enquanto que o extrato acetilado apresentou duas manchas bem suaves (uma quase

imperceptível na fotografia) e o extrato de hexano também apresentou uma mancha

bem marcante. Provavelmente a fração etérea conseguiu isolar outros compostos

polares que não fossem flavanóides, explicando o porquê da apresentação das 04

manchas. Fez se o fator de resolução de cada uma das manchas:

Éter Acetato de etila Hexano

Rf1- 0,98 Rf1-0,96 Rf1-0,71

Rf2-0,85 Rf2-0,84

Rf3-0,80

Rf4-0,75

Com o extrato que apresentou resultado positivo para o teste qualitativo (extrato

de acetato de etila), retirou-se 01 mL e fez-se a secagem total do solvente,

reconstituindo-se após isso, com 04 mL de água. Com essa solução fez-se a leitura

espectrofotométrica de 200 nm até 400 nm. Obtiveram-se as absorbâncias descritas No

gráfico 01.

00,20,40,60,8

11,21,4

COMPRIMENTO DE ONDA (λ)

ABS

Gráfico 01: Curva de calibração do extrato de Malva sylvestris com acetato de etila

12

Através da observação do gráfico pode presumir-se que há uma quantidade e

variedade de flavanóides muito grande no extrato de Malva sylvestris com acetato de

etila, em diversos comprimentos de onda (λ).

Feito a curva de calibração do extrato de malva com acetato de etila, era

necessário avaliar a atividade antioxidante do mesmo. Para tanto se utilizou o reativo

de DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil), que é uma espécie radical livre que deve ser

reduzida (através da doação de um hidrogênio) pela substância antioxidante, ou seja, a

espécie flavanóide da Malva sylvestris (BONANI, et al 2006). Inicialmente fez-se a

curva de calibração de soluções de DPPH sob o comprimento de onda (λ) de 515 nm,

como mostra o gráfico 02.

Gráfico 02: Curva de calibração com soluções de DPPH a 515 nm.

Em seguida, preparou-se 02 mL de extrato nas concentrações de 250 µg/mL,

150 µg/mL e 25 µg/mL para a realização da determinação da atividade antioxidante do

extrato de malva nessas concentrações.

Para tanto, inicialmente pesou-se um tubo de ensaio vazio (23,1843 g) e

colocou-se o extrato de malva com acetato de etila dentro desse tubo e levou-se a

00,20,40,60,8

11,2

15 20 25 30 35CONCENTRAÇÃO (mg/mL)

AB

S

13

banho-maria até completa evaporação do solvente, para posterior re-diluição. Quando

houve a evaporação e secagem total do tubo, pesou-se o mesmo para verificar a

quantidade de resíduo presente. O peso do tubo com resíduo foi de 23, 2007 g;

subtraindo-se o peso do tubo vazio (23,1843 g), obteve-se de resíduo 0,01640 g de

resíduo, ou 16,4 mg. Ressuspendeu-se esse resíduo com 05 mL de metanol. A partir

dessa solução, calculou-se a quantidade necessária da mesma para a preparação de

solução de 02 mL contendo 250 µg/mL de extrato a partir do seguinte cálculo

(lembrando que cada 01 mg equivale a 1000 µg, e 16,4 mg de resíduo equivale a

portanto 16.400 µg):

M1V1 = M2V2

16.4000.V1 = 250.2

V1 = 0,030 mL

Completou-se o volume com 1,97 mL de água destilada e assim obteve-se 02

mL de solução contendo o extrato obtido na concentração de 250 µg/mL.

A partir dessa solução, foi realizado o primeiro teste de avaliação da atividade

antioxidante de flavanóides presentes na malva. Para tanto, montou-se um dois tubos,

cada um contendo 0,3 mL dessa solução, porém, um deles foi completado com 2,7 mL

de metanol (tubo branco dessa solução) e o outro tubo foi completado com 2,7 mL de

solução de DPPH a 40 µg/mL, que é uma substância radical livre e conforme seu perfil

de absorbância espectrofotométrico decrescesse, indicaria a complexação dessa

substância com substâncias antioxidantes (flavanóides) presentes no extrato. Após a

adição de DPPH ao tubo contou-se 1 minuto e fez se a leitura no espectrofotômetro UV-

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VIS em 515 nm, tanto do branco quanto da amostra. O conteúdo desses dois

preparados não foi descartado, sendo observada a absorbância novamente dos

mesmos após 10, 20, 30 e 60 minutos. Os resultados obtidos podem ser observados no

gráfico 03, sendo que a absorbância do branco está em rosa e a absorbância da

solução com DPPH está em amarelo.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1 10 20 30 60

TEMPO (MINUTOS)

ABS

Gráfico 03: Perfil espectrofotométrico de absorção da solução de Malva sylvestris 250 µg/mL, em 515 nm.

Pode se observar que não houve uma variação significativa entre as três leituras

intermediárias, mas houve uma redução final de 0,917 de absorbância inicial (1 minuto)

até 0,845 de absorbância final (60 minutos).

Com esse resultado fez se o mesmo procedimento para a concentração de 150

µg/mL, ou seja, fez se um cálculo para obter o valor de extrato ressuspendido a ser

utilizado na preparação dessa solução e também fez se um tubo branco e um tubo com

DPPH, utilizando 0,3 da solução feita com mais 2,7 mL de metanol para o tubo branco

e, 0,3 da solução com 150 µg/mL mais 2,7 mL de DPPH para avaliar a atividade

antioxidante. Obteve-se o gráfico a seguir (série rosa indica absorbância do tubo branco

e série amarela indica absorbância da amostra):

15

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1 10 20 60

TEMPO (MINUTOS)

ABS

Gráfico 03: Perfil espectrofotométrico de absorção da solução de Malva sylvestris 150 µg/mL, em 515 nm.

Observa-se que a variação foi ínfima, ou seja, não houve atividade antioxidante

significativa nessa concentração. Com isso não se fez a solução de Malva sylvestris na

concentração de 25 µg/mL.

4. CONCLUSÃO

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Ao finalizar o presente trabalho pode-se afirmar que a malva possui flavanóides,

porém, com baixa atividade biológica antioxidante (conforme verificado pela reação com

DPPH) e com pouca concentração (observado pela intensidade da reação de Shinoda).

No entanto, apresenta uma variedade de compostos polares como pôde ser visualizado

nas placas de cromatografia de camada delgada com éter, acetato de etila e hexano.

Quanto à realização da atividade, a mesma foi muito exaustiva e minuciosa,

exigindo muito tempo e vidrarias. Isso sem dúvida alguma acaba refletindo na pesquisa

científica do país, pois os pesquisadores muitas vezes não possuem recursos

financeiros para estudos de bioprospecção e muitas vezes, nem disponibilidade grande

para tal atividade possuem, devido a demais atividades que devem realizar em função

de seu próprio sustento. Há, portanto, uma necessidade na modernização das técnicas

de fitoquímica, ao mesmo tempo em que deve se buscar desenvolver métodos

alternativos econômicos para instituições de fomento e pesquisadores da mesma forma

em que esses métodos devem minimizar resíduos de grande impacto ambiental.

5. BIBLIOGRAFIA

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1. BONANI, V. F. L.; HESS, S. C.; PERES, M. T. L. P.; FARIAS, C. C.; FEDÉL, L. E.

S.; PERUZZO, G. M. PROSPECÇÃO DE AGENTES ANTIOXIDANTES DE

VEGETAIS DE MATO GROSSO DO SUL. In: Anais da 58ª Reunião Anual da

SBPC - Florianópolis, SC - Julho/2006. Retirado de

http://www.sbpcnet.org.br/livro/58ra/SENIOR/RESUMOS/resumo_3291.html.

2. SILVA, Tania Maria Sarmento da et al . Ocorrência de flavonas, flavonóis e

seus glicosídeos em espécies do gênero Solanum (Solanaceae). Química

Nova ,  São Paulo,  v. 26,  n. 4, 2003 .  Disponível em:

<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-

40422003000400014&lng=en&nrm=iso>.

3. SIMÕES, CLÁUDIA MARIA OLIVEIRA et al. Farmacognosia: da planta ao

medicamento. 5ª Ed. Editora UFSC/UFRGS, Porto Alegre/Florianópolis, 2003.

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