Relatório

Análise da ação do magnésio por controle da permeabilidade membranar

Docente:

Profº Dr. Joaquim A. F. Vicente

Discentes:

Delcides A. Moraes 2010156971

Isabella K. R. Dias 2010157022

Licenciatura em Biologia

Coimbra

Dezembro de 2010

Sumário

Sumário

Introdução .....................................................................................2

Materiais e Métodos ......................................................................3

Resultados e Registros ..................................................................4

Discussão .......................................................................................6

Conclusão ......................................................................................9

Referências Bibliográficas ..........................................................10

Introdução

Sabemos que a estrutura celular é um tanto complexa em sua fisiologia. Inúmeras organelas desempenham diversas funções que favorecem o desenvolvimento e manutenção dos organismos.

Entre essas organelas merecem destaque as mitocôndrias, que são responsáveis, entre outras coisas, pela oxidação de substâncias, e contribuindo assim para a obtenção de energia. Energia essa utilizada em inúmeros processos vitais.

É nessa organela que ocorre o processo conhecido como Cadeia Respiratória.A cadeia respiratória é uma das etapas da respiração celular. Seus componentes estão localizados na crista mitocondrial e apresentam um complexo enzimático com três citocromos. Esse complexo é responsável pela oxidação da substância, e está relacionado à produção de energia. É justamente nesta etapa da respiração que vamos realizar nossos estudos, a fim de perceber a importância de determinados cátions na fisiologia celular.

Para ser mais específico, através da permeabilidade membranar induzida, poderemos avaliar a importância do Mg+2 para a fosforilação oxidativa.

De modo geral, temos como objetivo para este ensaio a avaliação da importância fisiológica de um cátion, através de indução da permeabilidade membranar por ação de um ionóforo. Mais especificamente, a importância do magnésio na atividade de diferentes substratos da respiração mitocondrial e respectiva fosforilação oxidativa, ou seja, sua importância como agente que auxilia o desenvolvimento do potencial.

Materiais e Métodos

Para a realização dos ensaios, é necessário a utilização de mitocôndrias vegetais, no presente caso, de tubérculo de batata ( Solanum tuberosum), uma vez que se fossem utilizadas mitocôndrias de fígado de ratos, devido ao transporte de cálcio, teríamos algumas complicações com a diminuição do potencial.

Também se faz necessário a utilização de um sistema de medição de potencial elétrico (ΔΨ) mitocondrial com eletrodo de TPP+.

E por final, o meio de reação. Nesse caso utiliza-se 250 mM sacarose, 20 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 0,05% BSA, 10 mM HEPES. Tudo isso em um pH neutro (em torno de 7).

Também foram utilizadas as seguintes soluções:

- 1 mM de TPP+;- 100 mM de ADP;- 100 mM de ATP;- 1 mM de A23187;- 1 M de succinato de K;- 1 M de Citrato de K;

- 1 M de α-cetoglutarato;- 200 mM de NAD+;- 200 mM de TPP;- 100 mM e 250 mM de MgCl2;- 100 mM e 250 mM de MnCl2;-100 mM e250 mM CaCl2.

Para cada ensaio é necessário a adição de 1,5 mM de meio de reação com 250 mM de sacarose, 20 mM de KCl, 2 mM de KH2PO4, 0,05% BSA, 10 mM HEPES, (pH 7.2), com TPPCl (3μM) e a concentração de MgCl2 indicada para cada ensaio.

Adicione 0,2 mM ATP (MV) Adicionar 0,3 a 0,5 mg de suspensão mitocondrial

Inicia-se então o movimento do papel do registrador (1 a 2 cm/m), e selecione uma sensibilidade de escala total correspondente a 20 ou 50 mV.

Adiciona-se 10 mM de succinato (ou 4 mM de citrato +0,5 mM de NAD+ + 0,5 mM de Tiamina pirofosfato, ou 4 mM de α-cetoglutarato + 50 μM de ADP + 0,5 mM de NAD+ + 0,5 de tiamina pirofosfato).

Deve-se verificar a acumulação eletroforética de TPP+ na mitocondria por energização mitocondrial.

Adiciona-se então 100 μM de ADP. (Verifique a sáda de TPP+ da mitocôndria devido a despolarização induzida pela fosforilação do ADP).

Adiciona-se agora 1 μM de Ionóforo A23187.(Observe o movimento de TPP+).

Adicione 100 μM de ADP.(Verifique novamente a saída de TPP+ da mitocondria devido a despolarização induzida pela fosforilação do ADP).

Resultados e Registros

Registro com Magnésio (Mg+2)

Fig. 1 – Registro obtido por utilização de eletrodo de TPP+ e representativo da atividade da ATP-sintetase em um meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de 0.5 mM de MgCl2.

Foram adicionados TPP+ (4 mM de Mg), ATP, succinato, e iniciamos o registro, adicionando mitocôndrias de batata. Ao adicionar as mitocôndrias, a agulha do registrador se desloca rapidamente para a direita, evidenciando a existência de um potencial, que se mantêm constante até então. Logo em seguida, adiciona-se solução de 50 mM de ADP. E com isso faz com a que a agulha rapidamente se desloque para a esquerda, voltando logo em seguida à mesma linha de onde partiu. Adiciona-se agora o ionóforo A23187 (1 μl). Isso não provoca qualquer alteração no registro da agulha. Novamente adiciona-se solução de 50 mM de ADP, e novamente a agulha desloca-se para a esquerda e depois de poucos segundos retorna à mesma linha.

Registro sem Magnésio (Mg+2)

Fig. 2 - Registro obtido por utilização de um eletrodo de TPP+ e representativo da actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na ausência de MgCl2.

Agora foram adicionados um meio sem Mg+2, TPP+, ATP e succinato, e inicia-se o registro. Adicionam-se mitocôndrias, e a agulha novamente se desloca para a direita, sem apresentar duas fases. Adiciona-se ADP, e mais uma vez a agulha desloca-se para a esquerda, entretanto de forma menos acentuada, e demorando um pouco mais para voltar à posição original. Com a adição do ionóforo A23187, a agulha se desloca um pouco mais para a direita. Adiciona-se ADP novamente, porém, nada ocorre, a agulha permanece no mesmo sentido.

Entretanto, mesmo sendo um ensaio sem Mg+2, adicionamos ao final uma quantia Mg e verificou-se que a agulha, que se deslocava no mesmo sentido, deslocou-se drasticamente para a esquerda.

Discussão

Registro com Magnésio (Mg+2)

Como já mencionado anteriormente, ao adicionarmos as mitocôndrias, a agulha se desloca rapidamente para a direita, evidenciando a existência de um potencial. Entretanto, o potencial obtido através do eletrodo de TPP+ não é um potencial elétrico. O eletrodo em questão mede a saída de TPP+ das mitocôndrias.

Com a adição do ADP, parte desse potencial é dissipado. A curva desloca-se rapidamente para a esquerda, indicando uma despolarização. Há a queda do potencial por alguns instantes, mas o deslocamento da agulha para a direita deixa claro que o potencial perdido está sendo recuperado, e em poucos segundo, volta a ser o mesmo que antes da despolarização.

Com a análise dos resultados obtidos podemos supor que ao ser adicionado o ADP ocorre uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial de forma rápida. Em seguida, ao adicionar 1µM de A23187 cuja função é retirar o magnésio que existe no interior da mitocôndria para o meio, não notamos qualquer alteração evidente. Para comprovar que a atividade foi realizada com sucesso adicionou-se novamente o ADP. Nesse momento é possível verificar uma nova fosforilação oxidativa, que assim como a primeira, ocorre de forma rápida.

A partir disso, podemos supor que a atividade do ionóforo A23187, embora tenha sido exercida, não apresentou resultados evidentes. Possivelmente isso ocorre porque as quantias de Magnésio existente tanto internamente quanto externamente apresentavam certa equivalencia. Por isso não causava movimentação de íons.

Registro sem Magnésio (Mg+2)

No caso do registro em meio contendo EDTA, e nehum vestigio inicial de Magnésio, após a adição das mitocôndrias, a agulha indica o desenvolvimento de um potencial, porém, ao contrário do que aconteceu no meio com Magnésio, aqui o desenvolvimento do potencial ocorre em uma única fase, uma vez que na ausência de Mg+2 o potencial não é afetado, sendo portanto um pouco melhor.

Ao adicionar ADP, verifica-se, assim como no caso anterior, que a agulha se desloca para a esquerda, porém menos que no caso anterior. Isso traduz-se em uma fosforilação mais lenta.

A adição de A23187 provoca uma alteração no movimento da agulha que se desloca um pouco mais para a direita. Aqui, conseguimos ver a atuação do ionóforo representada no papel, pois como a solução não possuia Mg+2, foi retirado grande quantidade de tal cátion do interior da mitocôndria, e transferido ao meio. Com isso, acaba por inibir a atuação da ATP-sintetase, fazendo com que, mesmo após nova adição de ADP, não seja registrada uma nova fosforilação oxidativa.

Dessa forma, e com base nos cálculos posteriores, é possivel verificar que na ausencia de Mg2+ a taxa de fosforilação (TF) é menor que nos caso anterior.

Taxa de Fosforilação =

Concentração de ADP

Unidade de Tempo

50 mM50 μM50 nM

1 L1 ml1 μl

Então, com o intuito de mostrar que o magnésio, nesse caso a falta dele, era responsável pela ausência de fosforilação, adicionamos tal íon ao meio. Essa adição imediatamente foi traduzida como um rápido deslocamento da agulha, indicando uma fosforilação.

Calculando as Taxas de Fosforilação

Como já mencionado anteriormente, através de análises dos registros, podemos pressupor algumas informações, como por exemplo, de que na ausencia de magnésio, a fosforilação é menos favorecida. Agora vamos demosntrar os cálculos que nos confirmam tais suposições:

Algumas considerações para o cálculo da TF do ADP.

- Tomaremos por base de nossos cáculos a seguinte equação:

- Foram adicionados 3μl de ADP a 50mM. Entretanto, temos de transformar mM em nM, uma vez que a unidade padrão para μl é nM. Neste caso temoso seguinte quadro:

Logo, são 50 nM em 1μl. Em 3 μl serão tres vezes mais, resultando para o ADP, uma concentração de 150 nMoles. (50 X 3 = 150 nMoles).

- O papel correu com velocidade de 2cm/minuto. A partir dessa informaçõa podemos calcular o tempo de cada fosforilação, medindo no registro a distancia entre o seu começo e o seu fim, e aplicando regra de três:

TF 1 : 1,5 cm (15mm)

20mm — 1 minuto15mm — x x= 0,75 minutos

TF1 = 150 nMoles.mg-1 de proteína / 0,75 minutosTF1 = 200 nMoles. mg-1 de proteína / minuto

TF 2: 1,2 cm (12mm)

20mm — 1 minuto12mm — x x= 0,6 minutos

TF2 = 150 nMoles.mg-1 de proteína / 0,6 minutosTF2 = 250 nMoles.mg-1 de proteína / minuto

Nota: TF1 e TF2 estão contidas no registro apresentado na figura 1, refernte ao ensaio em meio com Magnésio.

TF 3: 2,8 cm (28mm)

20mm — 1 minuto28mm — x x= 1,4 minutos

TF3 = 150 nMoles.mg-1 de proteína / 1,4 minutosTF3 = 107 nMoles.mg-1 de proteína / minuto

TF 4: TF4 = 0, pois não houve fosforilação no segundo registro, na segunda adição de ADP.

Logo, com bases nos cálculos acima, podemos confirmar que na ausência de Mg+2, a fosforilação oxidativa é reduzida, uma vez que há uma menor taxa de fosforilação se comparada à um meio com o mesmo íon.

TF1 = 200 nMoles. mg-1 de proteína / minuto

TF2 = 250 nMoles. mg-1 de proteína / minuto

TF3 = 107 nMoles. mg-1 de proteína / minuto

Conclusão

A partir dos ensaios realizados, podemos concluir que de fato o magnésio tem um papel importante no processo de respiração celular, especificamente na taxa de fosforilação. Sua presença esyá associada à taxas mais altas, enquanto que sua ausência se relaciona a taxas menores.

Quando está em baixa quantidade dentro da célula, mais especificamente na mitocôndria, altera o funcionamento da ATP-sintetase, ocasionando por isso, uma queda no processo de fosforilação oxidativa das substâncias.

Referências Bibliográficas

Vicente, Joaquim A. F.; Protocolo Prático: Análise da acção do magnésio por controlo da permeabilidade membranar (eletrodo de TPP+).

Vercesi, Anibal Eugênio; Mitocôndrias: ATP, Calor e Morte Celular in Ciência Hoje, vol 34, nº 199, pág. 16-23; Novembro de 2003.

Nota: Foram utilizados ainda para elaboração do presente relatório, os apontamentos de aulas ministradas e de aulas em laboratórios.