relatÓrio - cromatografia de exclusão molecular

Bioquímica Experimental I

Departamento de Química e Bioquímica

Licenciatura em Bioquímica

Docente: Marta Silva

Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, nº 40267

Andreia Sousa, nº 40261

Telmo Paiva, nº 40243

PL 3

7 de Novembro

Ano Lectivo 2011/2012

Cromatografia

de Exclusão

Molecular

Cromatografia de Exclusão Molecular

Página | 2

Índice

Resumo ......................................................................................................................... 3

Material e Métodos ....................................................................................................... 4

Resultados e Discussão ................................................................................................. 5

Cromatogramas ou gráficos de eluição das separações realizadas .............................. 5

#1. Absorvência a 620 nm do azul de dextrano em função do volume de eluição ... 5

#2. Absorvência da mistura padrão + azul de dextrano a 620, a 410 e a 280 nm ..... 8

#3. Absorvência a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em função do volume

de eluição ............................................................................................................ 17

Discussão global dos resultados obtidos .................................................................. 20

Conclusão ................................................................................................................... 24

Bibliografia ................................................................................................................. 25


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Resumo

Este trabalho experimental teve como objectivo ilustrar os princípios de

separação de uma mistura de proteínas globulares durante a realização de uma

cromatografia de exclusão molecular (também designada como cromatografia de

filtração em gel).

Inicialmente, empacotou-se a coluna com gel Sephadex G-100 obtendo-se uma

coluna de separação com 39 cm de altura e 0,65 cm de raio (ao que corresponde um

volume total de 51,76 mL). Depois da montagem da coluna, aplicaram-se as misturas

que se pretendia separar por esta técnica.

À mistura padrão e à amostra desconhecida foram adicionados 200µL de azul de

dextrano (Mr=2000 Da). Como o gel utilizado apresenta a sua gama de fraccionamento

entre os 8 e 80 kDa, o azul de dextrano vai ser totalmente excluído pelas partículas do

gel, pelo que o seu volume de eluição vai corresponder ao volume morto da coluna.

Conhecendo o volume morto da coluna e o seu volume total foi possível calcular o

coeficiente de distribuição Kav para cada componente, retirando o seu volume de eluição

do respectivo cromatograma. O Kav obtido para o azul de dextrano foi , para o

BSA foi , para a mioglobina foi , para o cromato de potássio

e para a amostra desconhecida foi

Através dos Kav do BSA, da mioglobina e do cromato de potássio e das suas

massas moleculares relativas conhecidas, obteve-se uma recta de calibração com

equação:

Da equação anterior retirou-se o valor da massa molecular relativa da amostra

desconhecida, que foi 19670 Da, que não correspondeu a nenhuma das massas

moleculares relativas da amostra padrão devido a erros experimentais e à utilização de

uma recta de calibração. Como qualquer dos erros mencionados aumentam o tempo de

retenção da proteína, a massa molecular obtida é inferior à massa molecular real da

proteína. Por comparação com os componentes da mistura padrão, estimou-se que a

amostra desconhecida era BSA.


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Material e Métodos

Neste trabalho laboratorial foi seguido o protocolo experimental à excepção de

alguns casos a seguir identificados:

Só foi preparada uma mistura padrão e não duas, sendo esta composta por:

7,5 mg mL-1

Albumina sérica bovina (BSA)

5 mg mL-1

Mioglobina Amostra Padrão

2 mg mL-1

K2CrO4

4 mg mL-1

Azul de dextrano

Não se procedeu à aplicação isolada do azul de dextrano, visto que este foi

adicionado tanto à mistura padrão como à solução desconhecida.

A aplicação da mistura padrão foi de 600µL e não de 500µL como referido no

protocolo.

À amostra desconhecida (300 µL) foi adicionado 200 µL azul de dextrano 4

mg/mL.

Apenas se traçou o espectro de absorção do azul de dextrano.

A absorvência da mistura padrão foi medida a 280, a 410 e a 620 nm. A

absorvência da amostra padrão foi medida a 280 e a 620 nm.


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Resultados e Discussão

Cromatogramas ou gráficos de eluição das separações realizadas

#1. Absorvência a 620 nm do azul de dextrano em função do volume de

eluição

Na aplicação das misturas na coluna, não se aplicou a amostra de azul de

dextrano isoladamente, pelo que, para realizar o cromatograma do azul de dextrano se

considerou as duas outras aplicações: azul de dextrano + amostra desconhecida e azul

de dextrano + mistura padrão.

O traçado do cromatograma do azul de dextrano permite calcular o volume

morto, ou de exclusão, da coluna. Este volume corresponde ao volume total do espaço

que rodeia as partículas do gel. Como o azul de dextrano apresenta uma massa

molecular na ordem dos 2000 kDa e como o gel utilizado apresenta a sua gama de

fraccionamento entre os 8 e 80 kDa, este vai ser totalmente excluído pelas partículas do

gel. Esta exclusão é observada visivelmente devido à cor azul do composto utilizado.

Quadro 1. Valores de absorvência obtida e considerada para amostra padrão e

desconhecida de azul de dextrano.

Resultados Obtidos Resultados Considerados

Veluição (mL)

Abs620

Mistura

Padrão

Abs620

Amostra

Desconhecida

Abs620

Mistura

Padrão

Abs620

Amostra

Desconhecida

1 0,000 -0,005 0,000 0,000

2 0,028 0,128 0,028 0,128

3 -0,010 0,018 0,000 0,018

4 0,060 0,016 0,060 0,016

5 0,002 -0,003 0,002 0,000

6 0,001 0,082 0,001 0,082

7 0,003 0,031 0,003 0,031

8 0,078 0,213 0,078 0,213

9 0,098 0,386 0,098 0,386

10 0,014 0,288 0,014 0,288

11 0,016 0,077 0,016 0,077


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Figura 1. Cromatograma de absorvência a 620 nm do azul de dextrano na mistura

padrão e na amostra desconhecida

Como se pode observar pela figura anterior (Figura 1), registou-se um máximo de

absorvência para o azul de dextrano aos 9 mL de eluição, a uma absorvência de 620 nm

(Abs620 = 0,098). O azul de dextrano tem uma massa molecular bastante elevada, como

já foi dito e, por isso, não conseguiu penetrar nos poros do gel, sendo o primeiro

composto a ser eluído.

Em todos os ensaios realizados, verificou-se um máximo de absorção para este

composto também aos 280 nm, por isso, para se comprovar que o azul de dextrano

absorve, de facto, aos 620 nm e aos 280 nm, traçou-se um espectro de absorção desta

solução, entre os 200 nm e os 700 nm.

0,0000,0200,0400,0600,0800,1000,1200,1400,1600,1800,2000,2200,2400,2600,2800,3000,3200,3400,3600,3800,4000,420

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Abso

rvên

cia

a 620 n

m

Volume de Eluição /mL

Absorvência a 620 nm do Azul de Dextrano na Mistura Padrão e

na Amostra Desconhecida

Azul Dextrano (Mistura

Padrão)

Azul Dextrano (Amostra

desconhecida)


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Figura 2. Espectro de absorção do azul de dextrano.

No espectro obtido, traçado entre 200 e 700 nm observam-se então dois

máximos de absorção. Esses máximos são, aproximadamente, aos 280 e aos 620 nm, tal

como esperado. No entanto, seria esperado que o máximo aos 620 nm fosse superior ao

máximo a 280 nm. O que influência as absorvências medidas para as fracções, como

exemplo, para a fracção 9, volume de eluição 9 mL, registou-se um máximo de

absorção aos 620 nm, o valor da absorvência obtido foi de 0,098 enquanto para o

mesmo volume de eluição, a 280 nm o valor obtido foi de 0,499.

Como já foi dito anteriormente, o objectivo da eluição do azul de dextrano é o

de determinar o volume morto da coluna cromatográfica. Este composto vai ser o

primeiro a ser eluído uma vez que não consegue penetrar nos poros do gel devido à sua

grande massa molecular, sendo assim o valor de Kav deste composto é igual a 0.

O volume morto da coluna, Vm, corresponde, então ao volume de eluição do

azul dextrano que é 9 mL.


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#2. Absorvência da mistura padrão + azul de dextrano a 620, a 410 e a 280

nm

Tal como explicado no procedimento, aplicou-se uma mistura de azul de

dextrano com a mistura padrão. Procedeu-se à leitura de absorvência de cada uma das

fracções recolhidas e traçou-se o respectivo cromatograma.

Quadro 2. Valores de absorvência obtidos durante a eluição da mistura com o azul de

dextrano e considerados na construção do cromatograma

Veluição

(mL)

Resultados obtidos Resultados considerados

Cor Composto Absorvência Absorvência

620

nm

410

nm

280

nm

620

nm

410

nm 280 nm

1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 -

Azul

Dextrano

2 0,028 0,019 0,016 0,028 0,019 0,016 -

3 -0,010 0,010 0,010 0,000 0,010 0,010 -

4 0,060 0,088 0,085 0,06 0,088 0,085 -

5 0,002 0,007 0,004 0,002 0,007 0,004 -

6 0,001 0,002 0,003 0,001 0,002 0,003 -

7 0,003 0,003 0,008 0,003 0,003 0,008 -

8 0,078 0,035 0,308 0,078 0,035 0,308 Azul

9 0,098 0,049 0,499 0,098 0,049 0,499 Azul

10 0,014 0,026 0,233 0,014 0,026 0,233 Azul claro

11 0,016 0,077 0,189 0,016 0,077 0,189 -

12 0,120 0,243 0,227 0,120 0,243 0,227 Amarelo claro

BSA e

Mioglobina

13 0,014 0,300 0,134 0,014 0,3 0,134 Amarelo claro

14 0,017 0,513 0,156 0,017 0,513 0,156 Amarelo

15 0,022 0,813 0,204 0,022 0,813 0,204 Amarelo

16 0,066 0,936 0,275 0,066 0,936 0,275 Amarelo

17 0,034 1,067 0,267 0,034 1,067 0,267 Amarelo

18 0,023 0,935 0,208 0,023 0,935 0,208 Amarelo

19 0,018 0,732 0,164 0,018 0,732 0,164 Amarelo

20 0,015 0,610 0,147 0,015 0,610 0,147 Amarelo claro

21 0,010 0,414 0,139 0,01 0,414 0,139 Amarelo claro

22 0,008 0,334 0,223 0,008 0,334 0,223 Amarelo claro

23 0,007 0,356 0,514 0,007 0,356 0,514 Amarelo claro

K2CrO4

24 0,004 0,396 0,934 0,004 0,396 0,934 Amarelo

25 0,003 0,486 1,399 0,003 0,486 1,399 Amarelo

26 0,002 0,451 1,385 0,002 0,451 1,385 Amarelo


Página | 9

27 0,003 0,367 1,125 0,003 0,367 1,125 Amarelo

K2CrO4

28 0,002 0,214 0,625 0,002 0,214 0,625 Amarelo

29 0,002 0,132 0,354 0,002 0,132 0,354 Amarelo claro

30 0,001 0,093 0,241 0,001 0,093 0,241 Amarelo claro

31 0,010 0,103 0,210 0,001 0,103 0,210 Amarelo claro

32 0,001 0,062 0,163 0,001 0,062 0,163 Amarelo claro

33 0,001 0,049 0,129 0,001 0,049 0,129 Amarelo claro

34 0,002 0,045 0,119 0,002 0,045 0,119 -

35 0,002 0,038 0,101 0,002 0,038 0,101 -

36 0,002 0,035 0,087 0,002 0,035 0,087 -

Figura 3. Cromatograma da eluição da mistura de mistura de azul de dextrano com a

mistura padrão.

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

1,100

1,200

1,300

1,400

1,500

1,600

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

Abso

rvên

cia

Volume de Eluição /mL

Absorvência da Mistura Padrão com Azul de Dextrano a 620, 410 e

280 nm

Absorvência a 620 nm




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De forma a determinar quais os comprimentos de onda a que se deve monitorizar

as diferentes separações realizadas é necessário traçar o espectro de absorção de cada

um dos componentes que constituem a mistura, determinando a que comprimento de

onda corresponde o seu máximo de absorção. É, então, a este comprimento de onda que

se devem efectuar as leituras de absorvência das fracções que contêm o composto em

questão.

Assim, os comprimentos de onda usados para realizar as leituras de absorvência

das fracções eluídas correspondem ao comprimento de onda máximo para cada um dos

compostos que constituem a mistura.

Sabendo que o azul de dextrano foi o primeiro composto a ser eluído (por

apresentar maior massa molecular, poderá afirmar-se que o primeiro pico do

cromatograma corresponderá ao azul de dextrano e, assim, o máximo de absorção do

azul de dextrano ocorrerá aos 620 nm. Para além disto, nas fracções que, possivelmente,

conteriam azul de dextrano, observa-se também um pico de absorção ao comprimento

de onda de 280 nm. Estes factos são comprovados, tal como explicado anteriormente,

quando se observa o espectro de absorção do azul de dextrano e se distinguem dois

picos de absorção, um perto dos 280 nm e outro próximo dos 620 nm.

Relativamente aos outros compostos constituintes da mistura padrão (BSA,

mioglobina e K2CrO4), pode supor-se que estes terão o seu máximo de absorção ao

comprimento de onda de 410 nm. Esta conclusão deve-se ao facto de se observarem

picos de absorvência correspondentes a estes compostos quando se lê a absorvência (das

fracções que se supõe que as contenham) a este comprimento de onda.

Pelas razões atrás mencionadas, para a mistura do azul de dextrano com a

amostra padrão A efectuaram-se leituras de absorvência aos comprimentos de onda de

280, 410 e 620 nm.

Para interpretar o cromatograma obtido é necessário, em primeiro lugar, ter em

conta que o tamanho e a forma das moléculas são os factores dominantes em todo o

processo de separação. Portanto, moléculas com maior massa molecular relativa e com

maior raio de Stokes não penetram nos poros do gel e, como tal, são as primeiras a ser

eluídas.


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Conhecendo a massa molecular de cada um dos compostos que constituíam a

mistura aplicada na coluna cromatográfica, facilmente se pode prever a ordem de

eluição de cada um delas:

1º composto a ser eluído: Azul de Dextrano

2º composto a ser eluído: BSA

3º composto a ser eluído: Mioglobina

4º composto a ser eluído: K2CrO4

Procede-se, então, à análise do cromatograma de forma a comprovar os

pressupostos explicitados anteriormente.

Pela análise da absorvência medida a 620 nm, observa-se um pico (mais

saliente) correspondente a, aproximadamente, 9 mL. Este pico corresponde à eluição do

maior volume de azul de dextrano que, tal como se esperava, foi o primeiro composto a

ser eluído. No entanto, tal como referido anteriormente, o azul de dextrano também

absorve radiação a 280 nm, pelo que o pico que se observa a este comprimento de onda

para o mesmo volume (9 mL) corresponde também à eluição deste composto. Assim,

conclui-se que o raio de Stokes do Azul de Dextrano é superior ao diâmetro dos poros

do gel, pelo que este não tem capacidade de penetrar neste último, tal como referido

anteriormente.

Relativamente à curva que corresponde à absorvência medida a 410 nm, esta vai

dar-nos informação acerca da segunda e da terceira proteínas eluídas, a BSA e a

mioglobina. Na fracção correspondente a 17 mL eluídos detecta-se a presença de um

pico relativamente elevado de absorvência. Este pico corresponde à eluição da BSA, tal

como esperado. No entanto, observa-se que se trata de um pico com uma largura

bastante elevada, permitindo inferir que, a este volume, a BSA não foi a única proteína

eluída, tendo sido eluída juntamente com a mioglobina. Sabe-se que a mioglobina

possui menor massa molecular, quando comparada com a BSA logo, seria de esperar

que esta tivesse ficado retida por mais tempo nos poros do gel, sendo-se recolhido

apenas BSA a este volume de eluição. No entanto isto não aconteceu, dado que a


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mioglobina poderá ter sido arrastada durante a eluição da BSA, tendo-se recolhido BSA

(em maior quantidade) e um pequeno volume de mioglobina.

Continuando a seguir o cromatograma ao nível da absorvência a 410 nm,

detecta-se um novo e último pico de absorvência (menor que o anterior) a um volume

de eluição de, aproximadamente, 25 mL. Conclui-se, então, que este pico corresponde à

eluição do restante (e maior) volume de mioglobina que terá ficado retido na coluna

após a eluição do volume inicial acoplado à eluição da BSA, o que comprova a

diminuição da altura deste pico relativamente ao anterior. Este dado encontra-se de

acordo com o esperado, uma vez que a mioglobina possui menor massa molecular que a

BSA e, desta forma menor raio de Stokes.

No que diz respeito à curva da absorvência medida a 280 nm, é de salientar,

essencialmente, a observação de dois picos a 9 e a 25 mL, respectivamente. O primeiro

corresponde à eluição do Azul de Dextrano, tal como referido, enquanto que o segundo

pico corresponde à eluição do K2CrO4. De facto, este composto é aquele que apresenta

menor massa molecular, pelo que faz todo o sentido que seja aquele que permanece

retido nos poros do gel durante mais tempo e, como tal, é o último a ser eluído. Apesar

disso, analisando o cromatograma, conclui-se que é eluído, praticamente, em simultâneo

com a mioglobina nas fracções próximas dos 25 mL, ainda que em maior volume e em

mais fracções que esta última.

No geral conclui-se que a ordem de eluição verificada experimentalmente

correspondeu àquela que era suposto, sendo que o azul de dextrano foi aquele que

permaneceu menor tempo na coluna (não foi retido pelos poros do gel), enquanto o

K2CrO4 foi o composto que permaneceu mais tempo retido nos poros do gel. Assim,

relativamente ao raio de Stokes, este assume um menor valor quando se trata deste

último composto.

O volume morto da coluna corresponde ao volume presente no exterior das

partículas do gel, ou seja, o volume de eluição de um composto de massa molecular

elevada, o qual não consegue penetrar no interior dos poros do gel. Neste caso, dado que

o Azul de Dextrano corresponde a um composto com as características acima descritas,

o seu volume de eluição corresponde ao volume morto da coluna:


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O volume total diz respeito ao volume total do leito do gel na coluna e obtêm-se

conhecendo a altura ocupada pelo gel na coluna (39 cm) e o seu raio (0,65 cm):

Dado que o volume ocupado pelo gel é um parâmetro de difícil determinação,

para caracterizar o comportamento de um composto, desprezando a contribuição do

volume sólido das partículas de gel para o volume total da coluna. Este parâmetro

corresponde ao Kav e é dado por:

Em que Vt e V0 correspondem aos parâmetros acima explicitados e Ve ao volume

necessário para a remoção de um determinado componente da coluna, ou seja, volume

de eluição.

Assim, procedeu-se ao cálculo do Kav para cada um dos compostos eluídos e,

consoante esse resultado, interpreta-se da seguinte forma:

Kav < 0: existem canais no leito do gel por onde as moléculas podem passar

facilmente (é necessário proceder a novo empacotamento da coluna para que se

possa proceder a uma cromatografia em condições correctas);

Kav = 0: as moléculas do soluto não podem penetrar nas partículas do gel;

Kav < 1: as moléculas do soluto encontram-se em maior percentagem no exterior

do que no interior das partículas do gel;

Kav = 1:as moléculas de soluto encontram-se igualmente distribuídas no interior

e no exterior das partículas do gel;

Kav> 1: as moléculas do soluto encontram-se em maior percentagem no interior

das partículas do que no seu exterior (ocorreu alguma adsorção das partículas do

soluto ao gel).


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Para o cálculo do Kav dos compostos considera-se o seu volume de eluição (Ve) –

observado no cromatograma – e usam-se os valores de Vt e V0 descritos anteriormente,

os quais são iguais para cada um dos compostos.

Azul de Dextrano (Mr=2 000 000 Da)

Albumina sérica bovina (Mr=66 400 Da)

Mioglobina (Mr=16 900 Da)

K2CrO4 (Mr = 194 Da)

Os resultados obtidos nos cálculos do Kav e a sua interpretação encontram-se

sintetizados no quadro seguinte:


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Quadro 3. Valores de Kav calculados para cada composto e respectiva interpretação.

Composto Kav Interpretação

Azul de

Dextrano 0 Não penetrou nos poros do gel.

BSA 0,07 Encontra-se em maior percentagem no exterior do gel do que

no interior.

Mioglobina 0,16 Encontra-se em maior percentagem (menor que no caso da

BSA) no exterior do gel do que no interior.

K2CrO4 0,37 Encontra-se em maior percentagem (menor que no caso da

mioglobina) no exterior do gel do que no interior.

O azul de dextrano, como já explicado no cromatograma 1, não entra nos poros

do gel, Kav=0. Sendo um composto não retido pelo coluna, o seu volume de eluição

corresponde ao volume morto.

Relativamente à BSA, obtém-se um Kav maior do que 0 e muito menor do que 1,

ainda que, quando aproximado, corresponde a 0. Para a mioglobina, o Kav foi menor que

o da proteína anterior e, consequentemente, mais próximo de 1, ainda que bastante

afastado desse valor. No que diz respeito ao cromato de potássio, o seu Kav é maior que

todos os anteriores e, consequentemente, mais próximo de 1.

No geral, todos os valores de Kav calculados permitem confirmar as conclusões

retiradas da análise dos cromatogramas, ou seja, a ordem de eluição de acordo com a

diminuição da sua massa molecular. Segundo isto, conclui-se que a BSA se encontrava

em maior quantidade no exterior do que nos interior dos poros do gel, passando-se o

mesmo para a mioglobina e para o cromato de potássio. Comparativamente uns com os

outros, pode dizer-se que o composto que se encontrava em maior quantidade no

exterior dos poros do gel era o Azul de Dextrano, seguido da BSA, da mioglobina e,

finalmente, do cromato de potássio.

Em suma, a percentagem relativa de cada composto no exterior dos poros do gel

é consequência da massa molecular de cada um deles e, portanto, do seu raio de Stokes.

Desta forma, quanto maior a quantidade de composto no exterior dos poros do gel, mais

rápida foi a eluição e, consequentemente, menor o seu tempo de retenção.


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Usando os valores de Kav calculados e conhecendo a massa molecular de cada

um dos compostos constituintes da mistura padrão traça-se a curva de calibração da

coluna. Os dados usados encontram-se especificados no quadro a seguir:

Quadro 4. Valores usados na construção da curva de calibração da coluna.

Figura 4. Curva de calibração da coluna.

Através da equação onde A e B são duas constantes e

Mr é o valor da massa molecular relativa de cada proteína, traçou-se uma regressão

linear, a qual corresponde à recta de calibração [y corresponde ao Kav e x ao ].

Pela equação da recta de calibração retira-se o valor das constantes A e B: A =

0,116 e B = 0,6384. Assim:

y = -0,116x + 0,6384

R² = 0,9951

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0 1 2 3 4 5 6

Kav

log10 (Mr)

Relação linear entre Kav e o log10(Mr)

Componente Kav Mr (Da)

BSA 0,07 66400 4,822

Mioglobina 0,16 16900 4,228

K2CrO4 0,37 195 2,29


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#3. Absorvência a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em função do

volume de eluição

A amostra aplicada na coluna consiste em 300 µL de amostra desconhecida e

200 µL de azul de dextrano. Da cromatografia de exclusão molecular, obtiveram-se os

seguintes resultados:

Quadro 5. Registos dos resultados obtidos para a amostra desconhecida

Veluição

(mL)

Resultados Obtidos Resultados considerados

Cor Composto Absorvência Absorvência

620 nm 280 nm 620 nm 280 nm

1 -0,005 -0,001 0,000 0,000 -

Azul de

Dextrano

2 0,128 0,105 0,128 0,105 -

3 0,018 0,056 0,018 0,056 -

4 0,016 0,053 0,016 0,053 -

5 -0,003 0,017 0,000 0,017 -

6 0,082 0,098 0,082 0,098 -

7 0,031 0,077 0,031 0,077 -

8 0,213 0,397 0,213 0,397 Azul

9 0,386 0,645 0,386 0,645 Azul

10 0,288 0,573 0,288 0,573 Azul

11 0,054 0,323 0,054 0,323 Azul

12 0,064 0,249 0,064 0,249 -

Amostra

desconhecida

13 0,089 0,202 0,089 0,202 -

14 0,098 0,167 0,098 0,167 -

15 0,172 0,151 0,172 0,151 -

16 0,159 0,141 0,159 0,141 -

17 0,019 0,081 0,019 0,081 -

18 0,002 0,042 0,002 0,042 -

19 -0,003 0,011 0,000 0,011 -

20 -0,003 0,010 0,000 0,010 -

21 -0,004 0,006 0,000 0,006 -

22 -0,004 0,006 0,000 0,006 -

23 0,053 0,092 0,053 0,092 -

24 -0,004 0,003 0,000 0,003 -

Note-se que se mediu a absorvência a 280 e a 620 nm porque à amostra

desconhecida juntou-se azul de dextrano, e como mostrado anteriormente, são os

comprimentos de onda onde os valores de absorvência são máximos. Como se


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obtiveram valores de absorvência negativos, esses valores foram considerados zero, e

obteve-se o seguinte cromatograma:

Figura 5. Absorvência a 280 e a 620 nm da amostra desconhecida em função do

volume de eluição.

Numa cromatografia de exclusão molecular a separação das moléculas é efectuada

com base na sua massa molecular relativa ( ), ou seja, moléculas com maior são

menos retidas pelo gel da coluna sendo eluídas primeiro, enquanto moléculas com

menor são mais retidas pelo gel da coluna – por entrarem nos seus poros – sendo as

ultimas a serem eluídas. Assim, a ordem de eluição dá-se das moléculas com maior

para moléculas com menor .

Sabendo que a massa molecular relativa do azul de dextrano é cerca de 2 000 000

Da, pode-se afirmar que este será o primeiro composto a ser eluído, constituindo o

composto que não é retido pela coluna, ou seja, o seu volume de eluição corresponde ao

volume morto da coluna ( ). Assim, através do cromatograma da mistura padrão

(Figura 3), da observação do quadro e da representação gráfica anterior (Quadro 5 e

Figura 5, respectivamente) é possível identificar que o volume de eluição do azul de

dextrano é 9 mL, seguindo-se, depois, a eluição da amostra desconhecida

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0,500

0,550

0,600

0,650

0,700

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Ab

sorvên

cia

a 2

80 n

m

Volume de Eluição (mL)

Absorvência da Amostra Desconhecida a 280 e a 620 nm




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No segundo cromatograma (cromatograma da mistura padrão) através do cálculo

do coeficiente de distribuição, Kav, para cada componente da mistura e da sua relação

linear com o logaritmo de base 10 do valor da massa molecular relativa, ,

obteve-se uma recta de calibração com equação:

Através da equação anterior, calculando o Kav da amostra desconhecida é possível

determinar a massa molecular relativa do composto desconhecido e compará-la à dos

compostos da mistura padrão. Então, para a amostra desconhecida, que corresponde ao

pico do cromatograma que segue o azul de dextrano, o volume de eluição é 15 mL logo

o seu Kav é:

Substituindo na equação da recta de calibração obtém-se:

Ao comparar a massa molecular relativa obtida com a dos componentes da

mistura padrão é possível verificar que existe uma grande discrepância entre massa

molecular dos componentes da mistura padrão e da amostra desconhecida, podendo

então concluir-se erroneamente que a amostra desconhecida não se encontrava na

mistura padrão.

No entanto, é possível prever que a massa molecular relativa obtida encontra-se

abaixo do valor real devido a erros experimentais e às aproximações realizadas na

utilização de uma curva de calibração.

Durante a aplicação da mistura da amostra desconhecida com o azul de dextrano,

o topo da coluna secou o que conduziu à abertura de fendas no gel. Assim, a entrada da

mistura no gel exigiu um maior volume de eluição, o que aumenta o Kav obtido (maior

volume de eluição da amostra), e como tal a massa molecular relativa obtida é menor

que a real.

Na utilização de uma curva de calibração admite-se que a separação dos

compostos de uma mistura é apenas condicionada por efeitos estéreos e de partição no

caso de se estabelecerem interacções entre os componentes, o volume de eluição será

maior do que o suposto o que resulta no cálculo de uma massa molecular relativa

inferior à real, como é o caso.


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Como a massa molecular relativa da amostra calculada é inferior à real, quando

comparada com a mistura padrão, poderá estimar-se que a amostra desconhecida era

albumina sérica bovina (BSA) com massa molecular relativa de 66 400 Da.

Discussão global dos resultados obtidos

Através dos cromatogramas traçados foi possível determinar o volume morto da

coluna, calcular o Kav dos diferentes componentes da mistura padrão e preparar a curva

de calibração da coluna.

O gráfico de eluição do azul de dextrano permitiu calcular o volume morto da

coluna, uma vez que a massa molecular relativa deste composto é da ordem dos 2000

kDa e, como o gel utilizado apresenta a sua gama de fraccionamento entre os 8 e 80

kDa, este vai ser totalmente excluído pelas partículas do gel. Esta exclusão é observada

visivelmente devido à cor azul do composto utilizado e podemos concluir que volume

de eluição do azul de dextrano se deu até aos 9 mL (que corresponde também ao

máximo de absorvência a 620 nm), pelo que este volume corresponde ao volume morto.

No entanto, em todos os ensaios realizados, verificou-se um máximo de absorção

para este composto também aos 280 nm, por isso, para se comprovar que o azul de

dextrano absorve a estes dois comprimentos de onda – 620 nm e 280 nm –, traçou-se

um espectro de absorção desta solução, entre os 200 nm e os 700 nm.

Como este composto vai ser o primeiro a ser eluído devido à sua grande massa

molecular e consequente não penetração nos poros do gel, o valor de Kav do azul de

dextrano é igual a 0.

Traçou-se também o cromatograma da mistura de azul de dextrano com a mistura

padrão e procedeu-se à leitura de absorvência de cada uma das fracções recolhidas. Os

comprimentos de onda usados para realizar estas leituras correspondem ao comprimento

de onda máximo para cada um dos compostos que constituem a mistura.

Relativamente aos compostos constituintes da mistura padrão (BSA, mioglobina e

K2CrO4), supôs-se que estes teriam o seu máximo de absorção ao comprimento de onda


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de 410 nm, uma vez que se observaram picos de absorvência correspondentes a estes

compostos quando se lê a absorvência, das fracções que se supõe que os contenham, a

este comprimento de onda. Portanto, para o traçar do cromatograma, foram lidas as

absorvências para os comprimentos de onda de 280 nm, 410 nm e 620 nm.

Uma vez conhecendo a massa molecular relativa de cada um dos compostos que

constituíam a mistura aplicada na coluna cromatográfica e tendo em conta que o

tamanho e a forma das moléculas são os factores dominantes em todo o processo de

separação, facilmente se pode prever a ordem de eluição de cada um delas, visto que

moléculas com maior massa molecular relativa e com maior raio de Stokes não

penetram nos poros do gel e, como tal, são as primeiras a ser eluídas, seguindo-se as de

menor massa. Assim, a ordem prevista para a eluição seria: azul de dextrano, BSA,

Mioglobina, K2CrO4, respectivamente por ordem decrescente de massa molecular

relativa.

Pela análise do cromatograma 2 (Figura 3), observa-se um pico (mais saliente) da

absorvência medida a 620 nm, correspondente a, aproximadamente, 9 mL. Este pico

corresponde à eluição do maior volume de azul de dextrano que, tal como se esperava,

foi o primeiro composto a ser eluído. O pico que se observa ao comprimento de onda de

280 nm para o mesmo volume de azul de dextrano corresponde também à eluição deste

composto, uma vez que este também absorve radiação a 280 nm, como já foi dito.

A curva que corresponde à absorvência medida a 410 nm dá-nos informação

acerca da segunda e da terceira proteínas eluídas, a BSA e a mioglobina. Na fracção

correspondente a 17 mL eluídos detecta-se a presença de um pico relativamente elevado

de absorvência. Este pico corresponde à eluição da BSA, tal como esperado. No

entanto, como se tratou de um pico com uma largura bastante elevada, permitiu assumir

que, a este volume, a BSA não foi a única proteína eluída, tendo sido eluída juntamente

com a mioglobina. Aos 25 mL de eluição detectou-se um novo e último pico de

absorvência, concluindo-se, então, que este pico corresponde à eluição do restante

volume de mioglobina. A diminuição da altura deste pico relativamente ao anterior

deve-se ao facto de ter sido eluído volume de mioglobina inicial acoplado à eluição da

BSA. Este dado também se encontra de acordo com o esperado, uma vez que a


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mioglobina possui menor massa molecular que a BSA e, desta forma menor raio de

Stokes.

No que diz respeito à curva da absorvência medida a 280 nm, é de salientar,

essencialmente, a observação de dois picos: 9 e 25 mL, respectivamente. O primeiro

corresponde à eluição do azul de dextrano, como já foi referido, enquanto o segundo

pico corresponde à eluição do K2CrO4. De facto, este composto é aquele que apresenta

menor massa molecular, pelo que permaneceu retido nos poros do gel durante mais

tempo e, como tal, foi o último a ser eluído. Apesar disso, através da análise do

cromatograma, concluiu-se que é eluído praticamente em simultâneo com a mioglobina.

Os resultados obtidos para os valores de Kav foram, respectivamente, para o azul

de dextrano, BSA, mioglobina e K2CrO4:0, 0,07, 0,16 e 0,37. Os valores de Kav

calculados permitiram confirmar as conclusões retiradas da análise do cromatograma,

ou seja, a ordem de eluição de acordo com a diminuição da sua massa molecular assim

como traçar a curva de calibração da coluna (Figura 4).

Foi traçado também o cromatograma da mistura de azul de dextrano com a

mistura desconhecida e procedeu-se à leitura de absorvência de cada uma das fracções

recolhidas.

Pela observação do cromatograma 3 (Figura 5) foi possível identificar que o

volume de eluição do azul de dextrano foi de 9 mL, seguindo-se, depois, a eluição da

amostra desconhecida. Através da equação obtida no cromatograma 2 é possível

determinar a massa molecular relativa do composto desconhecido e compará-la à dos

compostos da mistura padrão, calculando o Kav para os picos obtidos na eluição da

mistura desconhecida. Então, para a amostra desconhecida, que corresponde ao pico do

cromatograma que segue o azul de dextrano, o volume de eluição é 15 mL pelo que o

seu valor de Kav é de 0,14. A massa molecular relativa obtida foi de 19 670 Da. A

comparação deste valor com o dos componentes da mistura padrão permite verificar que

existe uma grande discrepância entre a massa molecular dos componentes da mistura

padrão e da amostra desconhecida, concluindo-se erroneamente que a amostra

desconhecida não se encontrava na mistura padrão. Erroneamente porque durante a

aplicação da mistura da amostra desconhecida com o azul de dextrano, o topo da coluna

secou o que conduziu à abertura de fendas no gel. Assim, a entrada da mistura no gel


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exigiu um maior volume de eluição, o que aumenta o Kav obtido e como tal a massa

molecular relativa obtida é menor que a real. Sendo a massa molecular relativa da

amostra calculada inferior à real, quando comparada com a mistura padrão, poderá

estimar-se que a amostra desconhecida era albumina sérica bovina (BSA) com massa

molecular relativa de 66 400 Da.


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Conclusão

Através do método cromatográfico de exclusão molecular, baseado na velocidade

de migração das partículas em função do seu raio de Stokes e da sua massa molecular

relativa, Mr, procurou-se determinar a massa molecular de uma proteína desconhecida,

tendo por base o comportamento de uma amostra padrão.

Através do cromatograma obtido para a mistura padrão com azul de dextrano, e

tal como era esperado, a ordem de eluição dos componentes foi a seguinte: azul de

dextrano, BSA, mioglobina e K2CrO4 (cromato de potássio), que corresponde a uma

ordem decrescente de valores de massas moleculares relativas.

Através do cálculo do volume morto, correspondente ao volume de eluição do

azul de dextrano (V0=9mL) foi possível estabelecer uma relação de Kav entre os

diferentes componentes e as suas respectivas Mr.

Para o azul de dextrano, o valor de Kav obtido foi igual zero, o que coincide com o

valor previsto, uma vez que este composto apresenta uma massa molecular relativa

bastante elevada e superior ao limite de exclusão do gel, para o BSA, mioglobina e

cromato de potássio, os Kav são superiores a 0 e inferiores a 1, assumindo valores

distintos entre si devido às suas diferentes massas moleculares relativas. Através destes

valores de Kav, foi possível traçar uma recta de calibração de onde se obteve o valor da

massa molecular relativa da amostra desconhecida.

Apesar do valor obtido para a massa molecular da proteína desconhecida não ter

correspondido a nenhuma das massas moleculares relativas da amostra padrão, estimou-

se, por comparação com os componentes da mistura padrão, que a amostra

desconhecida era BSA.


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Bibliografia

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relatÓrio - cromatografia de exclusão molecular

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