Departamento Acadêmico de Química Curso Técnico Integrado

Disciplina: Microbiologia Industrial Relatório de Aulas Práticas

Alunos: Maria Luiza Andrade Aquino Mariana Gabriela de Oliveira Ruslam Romaine Eleutério

Subturma: T3Professora: Fernanda Badotti

COLORAÇÃO DE GRAM

1. Introdução

A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 por Hans Christian Joachim Gram, médico

bacteriologista dinamarquês. É um procedimento de coloração diferencial, pois não cora todos os

tipos de células igualmente; e muito útil, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos:

gram-positivas e gram-negativas, de acordo com diferenças na parede celular das bactérias.

Consiste no tratamento sucessivo do esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes

cristal violeta, iodo, etanol - acetona e fucsina básica.

Os diferentes tipos de bactérias reagem de modo diferente à coloração de Gram, porque

diferenças estruturais em suas paredes celulares afetam a retenção ou liberação de uma

combinação de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I). Entre outras

diferenças, as bactérias gram-positivas têm uma parede celular mias espessa de peptideoglicana

(dissacarídeos e aminoácidos) que as bactérias gram-negativas. Além disso, as bactérias gram-

negativas contêm uma camada de lipopolissacarídeos (lipídeos e polissacarídeos) como parte de

sua parede celular. Quando aplicada a células gram-positivas e gram-negativas, a violeta de

genciana e o iodo penetram facilmente nas células. Dentro as mesmas, a violeta de genciana e o

iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo é maior que a molécula CV que entrou na

célula e, devido ao seu tamanho, não pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano

das células gram-positivas pelo álcool. Nas células gram-negativas o álcool rompe a camada

lipopolissacarídica e o complexo é removido através da camada fina de peptideoglicano, que não

consegue reter o complexo. Como resultado, as células gram-positivas retêm o corante e

permanecem de cor púrpura. As células gram-negativas não retêm o corante e ficam incolores até

serem contracoradas com um corante vermelho, após o que adquirem cor rosa. O método de

Gram é uma das mais importantes técnicas de coloração em microbiologia médica. Porém, os

resultados da coloração de Gram não são universalmente aplicáveis, pois algumas células

bacterianas coram-se fracamente ou não adquirem cor. A reação de Gram é mais consistente

quando usada em bactérias jovens, em crescimento.

A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o tratamento de uma

doença já que bactérias gram-positivas tendem a ser mortas facilmente por penicilinas e

cefalosporinas e as bactérias gram-negativas geralmente são mias resistentes, pois os antibióticos

não podem penetrar na camada de lipopolissacarídeos.

O método de coloração de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura

bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido

de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias gram-positivas quanto gram-negativas

absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta

devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se

um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a camada lipídica

das membranas externas das bactérias gram-negativas, deixando também pequenos buracos na

fina camada de peptideoglicana pelos quais o complexo CV-I se espalha , decorando as células.

Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas e

provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o

corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica,

pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos

de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é,

portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais

como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra é tratada com um

corante secundário, a fucsina básica. Como as bactérias gram-negativas ficam incolores após a

lavagem com álcool, a adição do contracorante colore as células. Ao microscópio, as células

gram-positivas aparecerão coradas em violeta e as gram-negativas em rosa. Em células de

bactérias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou

químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou

todas as células coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova é importante.

Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-

acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados,

pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. A

fucsina cora muitas bactérias gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez

não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanol-acetona pode ser

substituído por álcool 95%.

2. Objetivos

Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para o método

de coloração de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactérias de acordo com a coloração

obtida e relacionando-as à composição química da parede celular das mesmas. Desenvolver a

habilidade, também, para utilizar o microscópio óptico, observando as bactérias após a coloração

de Gram.

3. Materiais necessários

3.1 Reagentes:

Água

Álcool

Cristal violeta

Lugol

Safranina

3.2 Materiais

Alça de Platina

Lâminas de vidro

Pipetas de Pasteur

Suporte para coloração das lâminas

Placa com crescimento bacteriano: E.coli e S.aureus

Tubo de ensaio

3.3 Equipamentos

Microscópio óptico

Bico de Bunsen

4. 1ª etapa: Preparação da atividade prática

4.1 Preenchimento da Ficha Formativa de Reagentes (Tabela 01)

NomesMeios de cultura/

reagentes

Composição Química

Descrição Físico-

química

Riscos à saúde/

impacto ambiental

Manuseio Estocagem Referência bibliográ-

fica

Cristal Violeta

- C25H30ClN3

Solubilidade em água:

20 g/L (20 °C)

Ponto de fusão:

189 - 194 °C

Massa molar: 407.99 g/mol

Densidade: 1.19 g/cm3

(20 °C)

pH: 2.5 - 3.5 (10 g/l, H2O,

20 °C)

Suspeito de

provocar cancro.

Nocivo por ingestão. Provoca lesões

oculares graves. Muito

tóxico para os organis-

mos aquáticos

com efeitos duradou-

ros.

- Pipetas de pasteur

- uso de jaleco

Ver referência

s bibliográ-

ficas(Item 5.1.4)

Lugol

- Iodeto de potássio

- Cristais de iodo

- Água destilada

- Solúvel em água à 20 ºC

- Densidade1,01 g/cm³ a

20 ºC

- pH: 3,5 (H2O, 20 ºC)

- Ponto de ebulição: 100

ºC

- Não é perigoso para a água

- Pipetas de pasteur

- uso de jaleco

Armazenar de 15°C a

25°C

Ver referência

s bibliográ-

ficas(Item 5.1.4)

Safrani-

na- C20H19ClN4

Solubilidade em água:

50 g/L (20 °C)

Massa molar: 350.85 g/mol

- Forte contami-nante de

água

- Pipetas de pasteur

- uso de jaleco

- pH: 10 (10 g/l, H2O, 20 °C)

5. 2ª etapa – Execução da atividade principal

5.1 Procedimentos/metodologia

I) Coloração e esfregaço

Utilizando-se da área estéril em volta do bico de Bunsen ou a capela de fluxo laminar,

retirar, com o auxílio da alça de platina, uma pequena porção da bactéria desejada (já

inoculada em placa petri).

Colocar uma gota de água destilada em um lâmina, esfregar a ponta da alça de platina

com a bactéria na gota, fazendo um círculo.

Secar a água com o auxílio do bico de bunsen.

Corar com Cristal violeta por 60 segundos.

Lavar com esguicho de água destilada

Corar com Lugol por 60 segundos.

Lavar com esguicho de água destilada.

Passar álcool acetona até que não haja mais desprendimento de corante.

Lavar com esguicho de água destilada.

Corar com fucsina por 30 segundos.

Lavar com esguicho de água destilada e esperar secar.

II) Microscópio

Ligar o microscópio na tensão adequada.

Acoplar a lâmina à mesa (platina) do microscópio.

Focalizar utilizando o parafuso macrométrico, ajustar o foco com o parafuso micrométrico.

No caso da lente de maior aumento, colocar óleo de imersão, imergir a lente no óleo, focar

utilizando o parafuso macrométrico e ajustar com ajuda do micrométrico.

Após o término da visualização, retirar a lâmina e limpar a objetiva que imergiu no óleo

com um papel absorvente.

5.1.1 Leitura e interpretação dos resultados

Os microorganismos roxos, com forma de cocos, vistos no microscópio eram gram-positivos

(Staphylococcus aureus), enquanto os de coloração rosa com forma de bastonetes eram gram-

negativos (Escherichia coli). Essa diferença de cor ocorre, pois as bactérias gram-positivas

possuem uma densa camada de peptideoglicano em sua parede celular, enquanto as gram-

negativas possuem uma fina camada desse composto e uma membrana externa, constituída por

lipopolisacarídeos. Ao corar as bactérias com cristal violeta e lugol, o complexo de cristal violeta-

iodo é absorvido por ambas, porém, ao serem tratadas com álcool, as espessas paredes celulares

das bactérias gram-positivas são desidratadas, provocando a contração dos poros do

peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; enquanto a porção lipídica das

membranas externas das bactérias gram-negativas se dissolve, deixando o complexo ser

removido. Ao corar ambas com a safranina, as gram-negativas absorvem esse contracorante por

estarem incolores, diferentemente das gram-positivas, que não absorvem por já estarem coradas.

Foi possível a observação de bactérias descoradas em ambos esfragaços (Staphylococcus

aureus e Escherichia coli); e também algumas bactérias do tipo Staphylococcus aureus com

uma cor mais roseada e outras do tipo Escherichia coli em um tom mais roxeado em

comparação com as outras do mesmo esfregaço. Isso pode ter ocorrido por causa de uma má

coloração ou até mesmo devido ao tipo de cultura das bactérias. A etapa de descoloração na

Coloração de Gram é uma das mais importantes. Isso, porque se for muito prolongado o tempo de

exposição ao solvente (álcool), o complexo cristal violeta-iodo pode ser removido de ambos tipos

de bactérias (gram-positivas e gram-negativas) e ambas serem coradas pelo contracorante

(safranina) na próxima etapa do procedimento, o que explica a cor roseada de algumas gram-

positivas, e se o tempo for curto, pode não haver remoção do complexo cristal violeta-iodo das

bactérias gram-negativas, o que explica a coloração roxeada de algumas delas no esfregaço. A

descoração das bactérias pode ser explicada pela retenção ou não do corante, já que depende

das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas, tais como densidade,

espessura, porosidade e integridade. Outras explicações para esses resultados adversos podem

estar ligadas a células velhas, células mortas ou células com envelopes danificados por agentes

químicos ou físicos, tais como o aquecimento no bico de bunsen, utilizado para a secagem do

esfregaço.

Outro problema nas etapas de coloração pode ser o quanto espesso é um esfregaço, já que é

mais difícil descora-las e até mesmo permitir a observação no microscópio.

Por esses motivos, a Coloração de Gram nunca deve ser utilizada como um diagnóstico definitivo

para a classificação de bactérias e sim como um ponto de partida. Visto isto, a Coloração de Gram

somente será um recurso rápido e útil quando corretamente realizada e interpretada e com o uso

de culturas em que se saiba, pelo menos, o tempo de incubação.

5.1.2 Apresentação de propostas de minimização, reutilização, tratamento e descarte dos

resíduos gerados

Os meios utilizados podem ser reaproveitados transformando estes em alimentos para animais e

adubos. Para a produção dos alimentos e adubos seria necessário o tratamento dos produtos

gerados pela degradação do meio e pelo metabolismo das bactérias. Porém, não foram

encontradas pesquisas nessa área. O tratamento existente consiste na combustão dos meios, o

que gera muita poluição por gás carbônico e resíduos sólidos não identificados. (concertar)

5.1.3 Conclusão

5.1.4 Bibliografia

- MICHAEL J. PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R. KRIEG.   Microbiologia: Conceitos e

Aplicações - vol. 1. 2ª Ed.

- TORTORA, Gerard J., FUNKE, Berdell R. e CASE, Christine L. Roberta Marchiori Martins. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005.

- MERCK CHEMICALS Brazil. Disponível em:

http://www.merck-chemicals.com.br/is-bin/INTERSHOP.enfinity/WFS/Merck-BR-Site/pt_BR/.

Acessado em: 15 de maio de 2010.