_relatório
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Universidade Presbiteriana Mackenzie
23/03/2012
Extração de DNA genômico bacteriano e analise eletroforética
do resultado
Felipe Tadeu Rocha – 31004741
Julia Zaccarelli – 41019318
Lorenzo De Mingo – 41018435
Marianna Manes – 41052129
Thaislaine Guerner – 31118682
4ª Etapa
Turma B12
Resumo
Este trabalho tem como objetivo a visualização de moléculas de DNA da
bactéria E.coli através do método de eletroforese. Para isso foi feita a extração
do DNA, o preparo do gel e a corrida eletroforética. O resultado foi que as
moléculas de DNA bacteriano migraram muito pouco em direção ao pólo
positivo do gel. Isso aconteceu porque essas moléculas são muito grandes e,
consequentemente, não conseguem se deslocar muito.
1. Introdução
O DNA é formado por genes, que são a parte funcional do DNA
genômico. Os genes contêm as informações do organismo e as que serão
passadas de uma geração para a outra. O Genoma é o conjunto completo de
fatores hereditários contidos nos cromossomos. (COMCIENCIA, 2000).
A molécula de DNA é formada pela ligação de duas fitas, que são
constituídas por nucleotídeos. Estes, por sua vez, são a junção de uma
pentose com função de Desoxirribose, fazendo uma ligação glicosídica com
bases nitrogenadas (A,T,C,G) e uma ligação fosfodiester ao grupo fosfato
(podem ser até três grupos fosfato em um nucleotídeo) .
Um nucleotídeo se liga ao outro na sequência 5’3’. Isso significa que o
grupo OH do carbono 3 da pentose do nucleotídeo inicial da fita se liga ao
grupo fosfato do carbono 5 de outro nucleotídeo. Desse modo, ao analisar uma
fita de DNA, o nucleotídeo inicial da fita terá o seu carbono 5 ligado a um grupo
fosfato e o último nucleotídeo da fita sempre terá o seu grupo OH livre. Assim,
sempre que um nucleotídeo deseja se ligar a fita, ele será acoplado ao carbono
3 - por isso se diz que as fitas de DNA seguem a sequência 5’3’. Essa junção
de nucleotídeos dá origem ao RNA (quando é apenas um fita) ou ao DNA
(quando duas fitas se ligam através de pontes de hidrogênio entre as bases
nitrogenadas) (COMCIENCIA, 2000).
O DNA do cromossomo bacteriano é um filamento circular, constituído
por duas cadeias dispostas em hélice (JUNQUEIRA, 2005) e que fica solto no
citoplasma da bactéria numa região chamada de nucleoide, que fica próxima a
membrana plasmática. Além dos cromossomos do nucleoide, as bactérias
podem apresentar outros pequenos fragmentos de cromossomos circulares,
denominados plasmídeos (JUNQUEIRA, 2005). Os plasmídeos ficam
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localizados no citosol fora do nucleoide. Por não ter uma separação espacial, o
genoma fica exposto aos ribossomos e, por consequência, a tradução e a
transcrição nas bactérias ocorrem simultaneamente.
Neste experimento foi utilizado DNA da bactéria Escherichia coli. Essa
bactéria é um bacilo gram negativo de tamanho moderado, pertencente à
família Enterobacteriaceae. Ela faz parte da flora intestinal do homem. Em
condições especiais esta bactéria pode causar infecções oportunistas, como a
gastroenterite - causando diarréia, disenteria, febre, cólicas abdominais e fezes
sanguinárias (MURRAY, 2010).
Para a visualização dos resultados foi utilizada a técnica da eletroforese
em gel de agarose. A eletroforese é um método de separação de moléculas
criado na década de 1930 pelo químico sueco Arnie Tiseleus. Ele é baseado na
diferença de velocidades em que as moléculas se locomovem quando
submetidas a um campo elétrico de corrente contínua. Essa técnica pode ser
usada em vários tipos de moléculas, como vitaminas, carboidratos, proteínas,
ácidos nucléicos e nucleotídeos (HOLLER, 2002).
O método se inicia colocando a amostra a ser estudada em um suporte
poroso e plano, como, por exemplo, gel. Em seguida, é colocada uma solução
tampão, capaz de estabelecer o pH da solução, facilitando a separação das
moléculas (FERNANDEZ, 2001). Por último, é aplicada uma corrente elétrica
por um par de eletrodos, sendo um em cada lado do suporte (HOLLER, 2002).
Como resultado, há formação de zonas ou bandas, que são
agrupamentos de moléculas de acordo com os seus tamanhos, formas e
cargas (FERNANDEZ, 2001). A velocidade de migração depende da carga e
do tamanho das moléculas. Moléculas menores têm uma velocidade maior e
moléculas com uma carga maior também tem uma velocidade maior (HOLLER,
2002). O período de tempo de migração depende do tipo de molécula que esta
sendo analisada (FERNANDEZ, 2001).
2. Objetivos
Este trabalho tem como objetivo extrair o DNA genômico da bactéria
E.coli utilizando o reagente DNAzol e analisar o resultado utilizando a técnica
da eletroforese em gel de agarose.
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3. Material e métodos
3.1 Material biológico
1 tubo de 3mL da bactéria E.coli em meio LB, cultivada “overnight“ com
agitação
3.2 Reagentes
DNAzol, etanol absoluto gelado, solução tampão TAE ou TBA e TE
(TRIS-EDTA)
3.3 Corantes
Solução bluegreen, solução corante contendo 5% de glicerol, 0,1% de
azul de bromofenol e 0,1% de xylene cyanol.
3.4 Extração do DNA genômico
Centrifugamos a cultura de E.coli a 5000rpm durante 3 minutos. Em
seguida, descartamos o sebrenadante e adicionamos 250 µL de DNAzol.
Misturamos a solução para que ficasse bem homogênea. Na sequência,
transferimos para um microtubo para ser incubada a temperatura ambiente por
3 minutos.
Ao término da incubação, centrifugamos a solução a 10000 rpm por 5
minutos. Depois retiramos o sobrenadante e transferimos a solução para um
microtubo limpo. Adicionamos 125 µL de etanol absoluto gelado ao conteúdo
do microtubo e misturamos por inversão. Em seguida a solução foi incubada no
gelo por 3 minutos e depois centrifugada a 10000rpm.
Após a centrifugação, descartamos o sobrenadante. O DNA extraído da
bactéria ficou precipitado no fundo do tubo. Ressuspendemos o precipitado em
40 µL de tampão TE. Ao término do experimento, estocamos a solução final á -
20ºC.
3.5 Preparação do gel
Pesamos 0,3 gramas de agarose, adicionamos 30mL de solução tampão
TAE ou TBA e fundimos essa mistura em forno de microondas. Deixamos
resfriar até aproximadamente 50ªC. Colocamos depois o líquido no molde
previamente vedado com fita crepe. Posicionamos o pente de acrílico sobre o
molde e esperamos gelificar.
3.6 Preparação das amostras
Misturamos em um microtubo 8 µL de DNA genômico de E.coli, 1 µL de
solução bluegreen e 1 µL de solução corante.
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3.7 Aplicação das amostras
Transferimos o molde com o gel de agarose para a cuba eletroforética e,
em seguida, retiramos o pente e a fita crepe. Adicionamos solução tampão TAE
ou TBA na cuba, até ultrapassar o gel.
Em dois buraquinhos do gel, o primeiro e o último, colocamos a solução
padrão (formada pela mistura de 8 µL de DNA padrão (lambda Hindll), 1 µL de
solução corante e 1 µL de solução bluegreen). Nos outros buraquinhos
colocamos 10 µL de amostra.
3.8 Corrida eletroforética
Para que a corrida eletroforética acontecesse, ligamos os eletrodos à
fonte, aplicando uma voltagem inferior a 5V/cm2. As moléculas migraram do
pólo negativo para o positivo
3.9 Visualização
Ao término do experimento, desligamos a fonte de eletricidade e
retiramos os fios dos eletrodos. Em seguida retiramos a lâmina de acrílico com
o gel. Ajustamos essa lâmina num suporte de papel toalha. Depois colocamos
o gel em um transiluminador de luz U.V.
4. Resultados
As moléculas de DNA genômico da bactéria E.coli migraram pouco para
o polo positivo do gel de agarose.
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λ 1 2 3 4 5 6 λ
Figura 1: Eletroforese em gel de agarose. Colunas λ amostra padrão. Colunas 1, 3 e 5 amostras de DNA genômico. Colunas 2, 4 e 6 amostras de DNA plasmidial.
5. Discussão e conclusão
O resultado desse experimento foi o esperado, pois o gel de agarose é
muito poroso, o que faz com que moléculas de grandes dimensões, tais como
lipoproteínas e ácidos nucleicos, tenham facilidade em fazer a migração de um lado
para o outro. Desse modo, as moléculas de DNA genômico ficam aglomeradas
perto da cavidade em que foram colocadas para fazer a corrida eletroforética.
Apesar dos resultados serem os esperados, o método empregado para
fazer a extração do DNA, utilizando DNAzol, não foi o mais adequado. Existem
técnicas mais precisas, como o tratamento com formol e clorofórmio, que permite
uma melhor precipitação do DNA. Outros métodos utilizados são os kits de
extração, como, por exemplo, o Kit Qiagen TM e o Kit Invitrogen easyDNA, que
são próprios para que a análise seja feita por espectrofotometria, eletroforese
em gel de agarose ou PCR.
Há também outro fator a ser considerado. As pessoas que realizaram a
extração do DNA não possuíam nenhuma experiência na realização desse
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procedimento. Esse fato pode ter acarretado numa má qualidade de visualização
do resultado.
Foi possível concluir que a corrida eletroforética é extremamente útil na
análise de DNA genômico. Também foi possível perceber que as moléculas
presentes no material são muito grandes e, por isso, migram uma distância
muito pequena em uma velocidade muito reduzida.
6. Referências bibliográficas
COMCIENCIA. Projeto genoma: a ciência de ponta no Brasil. 06/07/2000.
Disponível em: <http://www.comciencia.br/reportagens/genoma/genoma10>.
Acesso em: 17 mar 2012
Entrevista com José Fernando Perez, diretor científico da FAPESP
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