rato

Universidade do Vale do ParabaInstituto de Pesquisa e Desenvolvimento

"Efeito do laser de baixa potncia (As-Ga-Al) em tecido sseo de ratosubmetido leso, analisado por histomorfometria ssea"

Renata Amadei Nicolau

Dissertao de Mestrado apresentada noPrograma de Ps-Graduao em EngenhariaBiomdica, como complementao doscrditos necessrios para obteno do ttulode Mestre em Engenharia Biomdica.

So Jos dos Campos, SP

2001

Universidade do Vale do ParabaInstituto de Pesquisa e Desenvolvimento

"Efeito do laser de baixa potncia (As-Ga-Al) em tecido sseo de ratosubmetido leso, analisado por histomorfometria ssea"

Renata Amadei Nicolau

Dissertao de Mestrado apresentada noPrograma de Ps-Graduao em EngenhariaBiomdica, como complementao doscrditos necessrios para obteno do ttulode Mestre em Engenharia Biomdica.

Orientador (Univap): Prof. Dr. RenatoAmaro Zngaro.Orientador (USP): Prof.a Dra. VandaJorgetti

So Jos dos Campos, SP2001

Autorizo, exclusivamente para fins acadmicos e cientficos, a reproduo total ouparcial desta dissertao, por processos fotocopiadores ou transmisso eletrnica.

Renata Amadei NicolauSo Jos dos Campos, 29 de julho de 2001.

539.12.04N548e Nicolau, Renata Amadei Efeito do laser de baixa potncia (As-Ga-Al) Em tecido sseo de rato submetido leso, Analisado por histomorfometria ssea. So Jos Dos Campos: UniVap, 2001. 98p.

Dissertao de Mestrado apresentada ao Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Universidade do Vale do Paraba, 2001.

1.Efeito do laser de baixa potncia 2.Tecido sseo 3. Engenharia Biomdica I. Zngaro, Renato Amaro, orient. II. Jorgetti, Vanda, orient. III.t.

Dedicatria

Ao meu saudoso pai, exemplo de

bondade; meu eterno dolo.

Ao meu marido

e principalmente minha

filha pelo apoio e compreenso

nas horas de ausncia.

Agradecimentos

Ao meu orientador Prof. Dr. Renato Amaro Zngaro, pelo incentivo e amizade.

Agradeo por me permitir usufruir de seu exemplo de profissionalismo e humildade, me

ajudando em todos os momentos necessrios.

A Prof. Dra. Vanda Jorgetti pela confiana e apoio, tornando possvel a

realizao de grande parte deste trabalho. Minha mestra em tecido sseo, a quem devo

grande parte dos meus conhecimentos.

A Prof. Dra. Josepa Rigau i Mas, pelo imenso carinho e ateno. Pessoa a qual

devo minha formao em laser de baixa potncia.

A biloga Luciene Machado dos Reis, pela inigualvel ajuda prestada na parte

laboratorial.

Ao Prof. Dr. Antonio Luiz Barbosa Pinheiro, com o qual tive a honra e

satisfao de trabalhar durante os ltimos anos.

Prof.a Dra. Mnica Fernandes Gomes, pessoa nica, a qual me ajudou a dar os

primeiros passos na experimentao animal; presto minha eterna gratido.

Ao Prof. Dr. Jos Benedicto de Mello, pelo incentivo ao ingresso na carreira

cientfica.

Ao Prof. Dr. Batista Gargione Filho e ao Prof. Dr. Marcos Tadeu T. Pacheco

pela confiana depositada em mim tornando possvel a realizao deste trabalho.

A Marlene Amadei Usier, minha me, pelo constante apoio e interesse na minha

formao acadmica.

A todos os professores, colegas e funcionrios do Instituto de Pesquisa e

Desenvolvimento da Univap, que em algum momento solicitei apoio e orientao.

E principalmente a Deus, que tornou possvel tudo acontecer.

Nota

Esta dissertao apresenta-se dentro das normas explicitadas pelo Instituto de

Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraba para obteno do ttulo

de Mestre em Cincias do Curso de Ps-Graduao em Engenharia Biomdica. Para

aproximar expresses tcnicas s normas lexicogrficas, o texto foi adequado segundo os

seguintes dicionrios:

-Dicionrio Latino Portugus. Geraldo de Ulhoa Cintra e Jos Cretela Jnior. So Paulo,

1944. Editora Anchieta Limitada.

-Mini Dicionrio Aurlio Sculo XXI. Aurlio Buarque de Holanda Ferreira, 4 edio.

Rio de Janeiro, 2000. Editora Nova Fronteira.

Para as referncias bibliogrficas, foram adaptadas e simplificadas as normas da

Associao Brasileira de Normas Tcnicas, ABNT-NRB 06023/2000.

Resumo

Trabalhos utilizando Terapia com Laser de Baixa Potncia (TLBP) tmdemonstrado efeito estimulatrio no tecido sseo em processo de reparao. A TLBPtem sido utilizada como coadjuvante na cicatrizao de tecido sseo lesionado,promovendo incremento da neovascularizao, nmero de osteoblastos e incorporaode clcio. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito da TLBP em tecido sseo.Realizou-se uma perfurao no fmur de 48 ratos (divididos em grupo controle eirradiado). O grupo irradiado recebeu 10J/cm2 do laser de As-Ga-Al (660nm). Osanimais foram sacrificados em 5, 15 e 25 dias ps-cirurgia. Foi realizado o estudohistomorfomtrico do tecido sseo, realizando microscopia ptica e de fluorescncia. Osresultados em 15 dias demonstraram que o grupo irradiado apresentou superfcieosteoblstica significativamente maior (p=0,0002) que o grupo controle. No grupocontrole em 25 dias houve uma diminuio acentuada do ndice de remodelao sseaquando comparada ao grupo irradiado. A taxa de aposio mineral apresentou ndicessignificativamente superiores (p

SUMRIO

Pgina

1. Introduo 1

2. Reviso da Literatura 4

2.1 Laser de Baixa Potncia 5

2.2 Tecido sseo 15

3. Objetivo 22

4. Mtodos 24

4.1 Animais 25

4.2 Cirurgia e Medicao 25

4.3 Terapia com Laser de Baixa Potncia 26

4.4 Sacrifcio 28

4.5 Tcnica Histolgica 28

4.6 Anlise Histomorfomtrica 32

4.6.1 Anlise Histomorfomtrica - Parmetros Estticos 33

4.6.2 Anlise Histomorfomtrica Parmetro Dinmico 33

4.7 Metodologia Estatstica 36

5. Resultados 37

5.1 ndice de volume trabecular e parmetros estruturais 38

5.2 ndices de formao ssea 42

5.3 ndices de reabsoro 46

6. Discusso 49

7. Concluso 56

8. Referncias Bibliogrficas 58

9. Apndices 68

Apndice 1 (Certificado do Comit de tica em Pesquisa - Univap)

Apndice 2 (Grficos / estatstica)

LISTA DE ABREVIATURAS

As-Ga-Al: Arsenieto de Glio-Alumnio

As-Ga: Arsenieto de Glio

ATP: Adenosina trifosfato

C: Grau centgrado

cm: Centmetro

cm2: Centmetro quadrado

dE: Densidade de energia

dpc: Dias aps a cirurgia

ER: Espectroscopia Raman

FaNT: Fator a de necrose tumoral

FC: Fator de crescimento

FCF: Fator de crescimento dos fibroblastos

FCSI: Fator de crescimento semelhante a insulina

FCT: Fator de crescimento transformador

FNT: Fator de necrose tumoral

He-Ne: Hlio-Nenio

Hz: Hertz

IgA: Imunoglobulina A

IL-1: Interleucina-1

J: Joule

Kg: Kilograma

LBP: Laser de baixa potncia

mg: Miligrama

ml: Mililitro

mm: Milmetro

mW: Miliwatts

mmm: Micrometro

nm: Nanometro

TLBP: Terapia com laser de baixa potncia

W: Watts

LISTA DE FIGURAS

Pgina

Figura 2.2.1 - Fotomicrografia de tecido sseo corada com azul de toluidina.

Osteoblastos (Ob) e Osteide (Ost) recobrindo a parte da superfcie

da trabcula ssea (Tr). Medula (M). 200x (NICOLAU, RA et al..

Fotobioestimulao de Tecido sseo com Laser de Baixa

Potncia. IV FNCTS. 1998)..............................................................19


Osteoclasto (Oc) sobre superfcie de reabsoro (lacuna de Howship)

(setas ). Trabcula ssea (Tr). Medula (M). 400x (NICOLAU, RA et

al.. Fotobioestimulao de Tecido sseo com Laser de Baixa

Potncia. IV FNCTS. 1998).Figura 2.2.3 - Fotomicrografia de

tecido sseo. Superfcie de reabsoro (setas). Osteoclastos (Oc)

em lacunas de reabsoro sobre a trave ssea. Trabcula ssea (Tr).

Medula (M) .......................................................................................20


Superfcie de reabsoro (lacuna de Howship) (setas). Trabcula

ssea (Tr). Medula (M). 200x (NICOLAU, RA et al..

Fotobioestimulao de Tecido sseo com Laser de Baixa

Potncia. IV FNCTS. 1998)..............................................................21

Figura 4.3.1 - Animal em decbito lateral, sobre plataforma recebendo TLBP. Feixe

laser direcionado perpendicularmente a regio femural...................27

Figura 4.5.1 - A) vista posterior da amostra, B) vista frontal da amostra, C)

extremidade distal da epfise, D) distal lateral da amostra................30

Figura 4.5.2 - Bloco preparado para microtomia.........................................................30

Figura 4.6.1.1 Representao esquemtica da diartrose entre fmur e tbia. Regio

de: perfurao, cartilagem de crescimento e anlise

histomorfomtrica. (Modificado: JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J.

Histologia Bsica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.

1999)..................................................................................................33

Figura 4.6.2.1 - Fotomicrografia de tecido sseo calcificado com 7mm de espessura.

Observao feita sob luz ultravioleta em microscpio de

fluorescncia. Osteoblastos (Ob). Trabcula ssea (Tr). Medula (M).

Rgua Micromtrica (Rm) utilizada para medida entre duas

marcaes por tetraciclina no dia da cirurgia {Tetr (i)} e 24 horas

antes do sacrifcio {Tetr (f)}. (1260x) (Modificado: MALLUCHE,

HH; FAUGERE, MC. Atlas of Mineralized Bone Histology. New

York: Karger. 1986)..........................................................................35

Figura 5.1.1 - Regio de anlise histomorfomtrica da lmina n 914-3 de um animal

do grupo controle 5 dias ps-cirurgia. As medidas foram realizadas

em 30 campos, um campo (375,4mm2) acima da cartilagem de

crescimento........................................................................................41

Figura 5.1.2 - Figura 5.1.2 Regio de anlise histomorfomtrica da lmina n 929-

1 de um animal do grupo irradiado 5 dias ps-cirurgia. As medidas

foram realizadas em 30 campos, um campo (375,4mm2) acima da

cartilagem de crescimento.................................................................41

LISTA DE TABELAS

Pgina

Tabela 2.1 - Reviso do efeito da TLBP em tecido sseo (In Vitro e In Vivo)..........14

Tabela 4.1 - Diviso dos animais em grupos e cronograma do sacrifcio..................25

Tabela 4.3.1 - Protocolo de irradiao com laser de As-Ga-Al.......................................27

Tabela 5.1 - Anlise histomorfomtrica do volume trabecular e dos parmetros

estruturais dos grupos irradiados e controle...........................................39

Tabela 5.2.1 - Anlise histomorfomtrica dos ndices de formao ssea.....................43

Tabela 5.2.2 - Anlise histomorfomtrica da taxa de aposio mineral diria...............44

Tabela 5.4 - Anlise histomorfomtrica dos ndices de reabsoro ssea...................47

LISTA DE GRFICOS

Pgina

Grfico 5.1.1 Volume trabecular (BV/TV) em reas prximas injria ssea, dos

animais controles e irradiados nos diferentes dias ps-cirurgia. Cada

ponto representa a mdia e o desvio padro de um grupo experimental

(n=7-8).................................................................................................40

Grfico 5.1.2 Espessura trabecular (Tb.Th) em reas prximas injria ssea, dos



(n=7-8).................................................................................................40

Grfico 5.1.3 Distncia trabecular (Tb.Sp) em reas prximas injria ssea, dos



(n=7-8).................................................................................................40

Grfico 5.1.4 Numero de trabculas (Tb.N) em reas prximas injria ssea dos



(n=7-8).................................................................................................40

Grfico 5.2.1 Volume osteide (OV/BV) em reas prximas injria ssea, dos



(n=7-8)................................................................................................ 45

Grfico 5.2.2 Superfcie osteide (OS/BS) em reas prximas injria ssea, dos



(n=7-8).................................................................................................45

Grfico 5.2.3 Superfcie osteoblstica (Ob.S/BS) em reas prximas injria ssea,

dos animais controles e irradiados nos diferentes dias ps-cirurgia.

Cada ponto representa a mdia e o desvio padro de um grupo

experimental (n=7-8)...........................................................................45

Grfico 5.2.4 Espessura osteide (O.Th) em reas prximas injria ssea, dos



(n=7-8).................................................................................................45

Grfico 5.3.1 Superfcie de reabsoro (Oc.S/BS) em reas prximas injria ssea,



experimental (n=7-8)...........................................................................48

Grfico 5.3.2 Superfcie osteoclstica (ES/BS) em reas prximas injria ssea,



experimental (n=7-8)...........................................................................48

Apndice 2

Grfico 1- Volume trabecular (BV/TV%) em reas prximas injria ssea dos animais

controles (C) e irradiados (I) nos diferentes dias ps-cirurgia (dpc). Cada

coluna representa a mdia aritmtica de um grupo experimental (n=7-8).

Grfico 2 - Espessura Trabecular (Tb.Th (mm)) em reas prximas injria ssea dos

animais controles (C) e irradiados (I) nos diferentes dias ps-cirurgia (dpc).

Cada coluna representa a mdia aritmtica de um grupo experimental (n=7-

8).

Grfico 3 - Distncia trabecular (Tb.Sp (mm)) em reas prximas injria ssea dos



8).

Grfico 4 - Nmero de trabculas (ou nmero de traves) (Tb.N (/mm)) em reas

prximas injria ssea dos animais controles (C) e irradiados (I) nos

diferentes dias ps-cirurgia (dpc). Cada coluna representa a mdia aritmtica

de um grupo experimental (n=7-8).

Grfico 5 - Volume osteide (OV/BV%) em reas prximas injria ssea dos animais

controles (C) e irradiados (I) nos diferentes dias ps-cirurgia (dpc). Cada

coluna representa a mdia aritmtica de um grupo experimental (n=7-8).

Grfico 6 - Superfcie osteide (OS/BS%) em reas prximas injria ssea dos



8).

Grfico 7 - Superfcie osteoblstica (Ob.S/BS%) em reas prximas injria ssea dos



8).

Grfico 8 - Espessura osteide (O.Th (mm)) em reas prximas injria ssea dos



8).

Grfico 9 - Taxa de aposio mineral diria (MAR(mm/d)) em reas prximas injria

ssea dos animais controles (C) e irradiados (I) nos diferentes dias ps-

cirurgia (dpc). Cada coluna representa a mdia aritmtica de um grupo

experimental (n=7-8).

Grfico 10 - Superfcie osteoclstica (Oc.S/BS%) em reas prximas injria ssea dos



8).

Grfico 11 - Superfcie de reabsoro (ES/BS%) em reas prximas injria ssea dos



8).

11. Introduo

21. Introduo

O reparo tecidual um dos fenmenos mais interessantes observado nos

organismos vivos, podendo ser considerado como um dos mecanismos primrios de

sobrevivncia (LIZARELLI, LAMANO-CARVALHO e BRENTEGANI, 1999). Um

dos tecidos com maior capacidade de repararao o tecido sseo, exibindo um

potencial de regenerao surpreendente capaz de restaurar perfeitamente sua estrutura

original e suas propriedades mecnicas (SCHENK, 1996). A remodelao ssea e sua

estimulao so motivos de um grande nmero de estudos, impulsionados nas ltimas

dcadas pelo intenso uso de prteses de titnio na Odontologia e Ortopedia. O interesse

nesta rea se deve, principalmente, aos fatores capazes de acelerar a osteointegrao que

promove uma maior rapidez na reabilitao do paciente. O estmulo do incremento

sseo tm sido obtido atravs de vrios meios entre eles: enxerto de osso autgeno, uso

de protena morfogentica ssea (HECKMAN et al., 1991); IGF-I (SPENCER et al.,

1991); uso do ultra-som pulsado com baixa intensidade (PILLA et al., 1990); emprego

de campos eletromagnticos (CANE, BOTTI e SOANA, 1993); e mais recentemente

por terapia com laser de baixa potncia (TLBP) (NICOLAU, ZNGARO e PACHECO,

1998; KUCEROV et al., 2000).

O uso da TLBP na maioria dos pases (KARU, 1989 (a) e 1989 (b); ATSUMI,

1989 e ROSHAL, 1991) se faz principalmente nas reas de Fisioterapia e Dermatologia,

auxiliando na reparao de leses musculares e lceras de decbito. A Ortopedia pouco

usufrui desta tcnica devido a escasses de relatos experimentais e clnicos no tecido

sseo. Em princpio, esta terapia modula vrios sistemas biolgicos envolvidos no

processo de reparao, promovendo modificaes bioqumicas, eltricas, etc.

(GALLETTI et al., 1992).

A TLBP tem demonstrado resultados favorveis In Vitro e In Vivo quanto ao

estmulo da reparao ssea, neste sentido trabalhos In Vivo sugere que esta terapia

promove acelerao da reparao ssea, tais como: reparao alveolar (OLIVEIRA,

1992; GARCIA, CARVALHO e OLIVEIRA, 1995); neoformao ssea ps disjuno

palatina (SAITO e SHIMIZU, 1997); e reparao de fraturas (LUGER et al., 1998).

3Os lasers mais estudados em TLBP esto na regio do espectro eletromagntico

compreendido entre o visvel e o infravermelho prximo (Hlio-Nenio (He-Ne

632,8nm) e Arsenieto de Glio (As-Ga 904nm)).

At o momento, a maioria dos estudos realizados In Vivo utilizando TLBP em

tecido sseo so qualitativos e para que seja comprovada sua eficcia, quanto ao

aumento da remodelao ssea, estudos quantitativos devem ser realizados.

42. Reviso da Literatura

52.1 Laser de Baixa Potncia

A palavra LASER um acrnimo de Light Amplification by Stimulated Emission

of Radiation, ou seja, luz amplificada por emisso estimulada de radiao. As

caractersticas que diferem a luz laser de uma lmpada so: a monocromaticidade, a

brilhncia, a coerncia e a direcionalidade. A possibilidade de focalizao em pequenas

reas e a emisso de altas densidades de energia, fazem do laser um instrumento de

grande interesse e importncia para aplicaes nas reas da sade, tanto no diagnstico

como na terapia.

Os lasers so divididos em lasers de alta e baixa potncia. Os primeiros so

destinados a remoo, corte e coagulao de tecidos, enquanto que os lasers de baixa

potncia (LBP) so utilizados em processos de reparao tecidual. Os principais efeitos

gerados pelo LBP nos tecidos tm natureza estimulatria, causando aumento do

metabolismo celular, quimiotaxia e vascularizao, etc (LOPES e BRUGNERA, 1998).

A coerncia uma das propriedades da luz laser, porm ao penetrar no tecido,

esta propriedade se perde nos primeiros extratos da pele. Isto ocorre devido grande

variedade de estruturas celulares que compem a pele (WHARTON et al., 1964 e 1966;

PARRISH; 1980, JORI, 1980; ANDERSON et al., 1982, MICKILEY et al., 1988;

HACZEKI et al., 1988 e 1989). Segundo alguns autores, apesar da perda de coerncia

da radiao do LBP no interior dos tecidos, esta absorvida pelas clulas gerando

alteraes no seu metabolismo tanto em tecidos superficiais como profundos (GIESE,

1980; MESTER et al., 1985; LOBKO et al., 1985; SVAASAND, 1990). O efeito de

estimulao com LBP depende do comprimento de onda, da dose e da intensidade da

luz utilizada na irradiao (FEDOSEYEVA et al., 1988).

O LBP age principalmente sobre organelas celulares (mitocndria e membrana),

gerando aumento de ATP e modificando o transporte inico. Acredita-se que existem

fotorreceptores celulares, sensveis a determinados comprimentos de onda, que, ao

absorverem ftons, desencadeiam reaes qumicas. Desta forma o LBP acelera, a curto

prazo, a sntese de ATP (gliclise e oxidao fosforilativa) e a longo prazo a transcrio

e a replicao do DNA (KARU, 1987; KARU, 1989 (a, b e c)).

Foi demonstrado por MESTER e MESTER (1989) que, alm do efeito local a A

terapia com laser de baixa potncia (TLBP), promove efeitos sistmicos. Os autores

6realizaram experimentos nos quais compararam a evoluo de feridas por queimaduras

em animais. Os animais foram distribudos em dois grupos, um grupo controle que no

recebeu irradiao laser e um segundo grupo com duas feridas (uma ferida de cada lado

da espinha dorsal) e que s recebeu tratamento em uma delas. Tanto a ferida irradiada

como a no irradiada, foram reparadas ao mesmo tempo e muito antes do que nos

animais controles.

Os estudos In Vitro tm demonstrado efeitos moduladores da TLBP em vrios

tipos de tecido. Embora extrema cautela deva ser tomada ao extrapolar resultados In

Vitro para situaes clnicas, provvel que os efeitos da TLBP estejam envolvidos na

acelerao do processo de cicatrizao tecidual (RIGAU, 1996).

O maior nmero de estudos realizados com TLBP foi direcionado na avaliao

da reparao de feridas cutneas devido a relativa facilidade de realizao deste tipo de

experimento, assim como o curto perodo de tempo necessrio para a reparao tecidual.

Segundo autores a TLBP causa estimulao da degranulao de mastcitos e melhora na

microcirculao (SNYDER-MACKLER et al., 1989; AUN et al., 1989; SNYDER-

MACKLER et al., 1989; SILVEIRA e LOPES, 1993; YANG et al., 1997). Devido aos

resultados positivos obtidos pela utilizao da TLBP quanto a estimuao no reparo de

leses cutneas e musculares estudos foram dirigidos ao do laser sobre tecido sseo

(BARUSHKA, YAAKOBI e ORON, 1995).

Um dos primeiros trabalhos foi realizado por BENEDICENTI e MARTINO, em

1983, no qual verificaram aumento de 22% na sntese de ATP mitocondrial, aps TLBP

em alvolo dentrio em reparao. Segundo esses autores a elevao da taxa de ATP

aumentaria o metabolismo celular contribuindo para a reparao alveolar.

BOGATOV et al. (1983) estudaram a regenerao ssea em mandbula de ratos

e observaram que a TLBP reduzia o tempo de reparao em ferimentos.

LOMNITSKII e BINIASHEVSKII (1983) estudaram o efeito de vrias doses de

radiao emitidas por laser de He-Ne (632,8nm) em 105 coelhos e os resultados obtidos

sugeriram estmulo na osteognese. Eles verificaram que a TLBP causava efeitos nas

clulas osteoblsticas e na regenerao ssea periodontal. Os autores inferiram que esta

terapia ativa as clulas osteoblsticas e acelera seu desenvolvimento e a calcificao.

TRELLES e MAYAYO (1987), observaram que o laser de He-Ne (632,8nm)

com irradiao de 2,4J/cm2 alternando dias, num perodo de trs semanas, auxiliava na

7reparao de fraturas sseas. Esses autores detectaram aumento da largura trabecular.

Alm de maior nmero de fibroblsticos nos calos sseos irradiados quando

comparados aos no irradiados.

TAKEDA (1988) utilizou o laser de As-Ga (904nm) com densidade de energia

de 20J/cm2 e densidade de potncia de 0,025W/cm2, durante cinco minutos, em uma

nica aplicao, em animais com periodontite. O autor observou maior proliferao de

fibroblastos nos animais irradiados. Am de maior formao do tecido osteide (osso

neoformado) e deposio de chumbo neste grupo quando comparado ao controle.

DE TEJADA et al. (1990), estudaram o efeito da irradiao com laser de He-Ne

(632,8nm) com potncia de 6mW, em fratura de fmur de rato, atravs de anlise ultra-

estrutural e hormonal. Os resultados levaram os autores a concluir que a TLBP aumenta

vascularizao e o rpido aparecimento de clulas osteognicas.

YAMADA (1991) verificou que a TLBP promove um efeito positivo na

proliferao, e diferenciao das clulas osteoblsticas In Vitro.

NAGASAWA et al. (1991) observaram que a TLBP (He-Ne; 632,8nm), sobre

osso alveolar aps exodontia, durante aproximadamente quatro minutos, favorece

reparao ssea mais rpida que em pacientes no irradiados (NAGASAWA et

al.,1991).

KUSAKARI et al. (1992) realizaram trabalhos In Vivo e In Vitro atravs dos

quais demonstraram a ao moduladora da TLBP sobre a reparao ssea e cultura de

osteoblastos. No experimento In Vivo utilizaram ces adultos submetidos perfuraes

na regio da mandbula e tratadas com TLBP (780nm), com uma potncia de 30mW.

Utilizando os mesmos parmetros de irradiao, os autores estudaram a ao deste laser

em cultura de osteoblastos (linhagem UMR 106) marcadas com timidina tritiada. Um

terceiro experimento foi realizado tambm com ces, aps exodontias com implantao

de cilindros de titnio nos alvolos. O protocolo de irradiao aplicado nesta fase do

trabalho foi utilizando um laser em 810nm e potncia de 60mW. Os resultados In Vitro

demonstraram que o laser em 780nm promoveu estimulao na sntese de DNA, sntese

protica e ativao de fosfatase alcalina. In Vivo, os lasers promoveram, sem muita

diferena entre os comprimentos de onda, aumento da reparao observado pela

elevao da quantidade de vasos presente no local de leso.

8OLIVEIRA (1992) realizou um estudo histolgico em osso alveolar infectado

(alveolite) tratado com TLBP. Utilizou o laser de As-Ga (904nm), com uma potncia de

entre 0,5 e 3,5mW e freqncia de 500 a 3700Hz. Analisando o processo de reparao

aps seis, 15 e 28 dias, o autor concluiu que a radiao laser acelerou a cronologia do

reparo das feridas, principalmente no sexto dia.

CAFALLI et al. (1993), realizaram estudo em coelhos submetidos TLBP aps

leses em osso subcondral dos joelhos. Os animais foram sacrificados aps 15, 30, 45 e

60 dias. Verificou-se que o tecido sseo, reparou-se mais rpido nos animais irradiados.

Na fase final do processo de reparao os resultados so semelhantes nos animais

tratados e no tratados com TLBP.

Na periodontia o surgimento da TLBP e sua aplicao clnica abriu novas

perspectivas teraputicas (LUGER, 1994; NEIBURGER, 1995).

BARUSHKA, YAAKOBI e ORON (1995) utilizou a TLBP (He-Ne 632,8nm),

com uma dose de 31J/cm2, durante 2,3 minutos, com potncia de 6mW; aplicada sobre

pequenas perfuraes em tbia de rato no quinto e sexto dia ps-cirurgia. Verificaram

que a TLBP promoveu o aumento no nmero de osteoblastos e o estgio de reparao

foi aproximadamente duas vezes mais acelerado, avaliados pela elevao da fosfatase

alcalina e histomorfometria repectivamente.

GLINKOWSKY E ROWINSKY (1995) utilizaram TLBP em fratura de tbia de

ratos e demonstraram atravs de anlise radiogrfica que a densidade ptica nos grupos

irradiados era maior que no grupo controle.

GARCIA, CARVALHO E OLIVEIRA (1995) analisaram histologicamente a

ao da TLBP (As-Ga 904nm) em alveolites provocadas experimentalmente. Para tanto

utilizaram 36 ratos Wistar divididos em trs grupos: grupo I (controle), grupo II e III

(irradiados por 2 e 4 minutos respectivamente, 2mW, 2.100Hz). A irradiao dos grupos

II e III foi realizada trs dias aps a cirurgia. Os animais foram sacrificados aps seis,

15, utilizando laser de He-Ne (632,8nm), e 28 dias do ato cirrgico. Os autores

observaram que o processo de reparao ssea foi mais intenso nos grupos II e III, como

proliferao fibroblstica e capilar, e aparecimento de trabculas sseas, aos 15 dias.

Concluram que a TLBP acelerou o reparo de alvolos infectados, sendo mais evidente

nos perodos iniciais (seis e 15 dias) e no grupo onde a irradiao foi de quatro minutos.

9DAVID et al. (1996), estudaram o efeito da TLBP utilizando o laser de He-Ne

(632,8nm), na reparao ssea de fraturas com fixao interna em tbia de ratos.

Sessenta e dois animais tiveram ambas as tbias submetidas cirurgia, tendo sido

utilizada a tbia contralateral como controle. A irradiao foi feita com doses de 0, 2 e

4J/cm2, com uma potncia de 10mW, sobre uma rea de 7mm2, de forma transcutnea.

Os animais foram submetidos irradiao diria, sendo sacrificados aps duas e seis

semanas ps-cirurgia. Avaliaram a reparao ssea das tbias atravs de radiografias e

estudo histolgico. Os resultados demonstraram no haver diferenas significativas

entre a regio de reparao nas tbias irradiadas quando comparados aos controles.

YAAKOBI et al. (1996) obtiveram bons resultados em ratos com leses tibiais

tratados com TLBP (He-Ne 632,8nm). A dosimetria aplicada neste estudo foi de

31J/cm2, com potncia de 5,3mW, durante 2,3 minutos diretamente sobre a regio de

perfurao no quinto e sexto dia ps-cirurgia. Os autores avaliaram a quantidade de

fosfatase alcalina e clcio na regio de reparao. Nos animais submetidos ao laser

houve mais deposio de clcio, assim como aumento da fosfatase alcalina, sugerindo

maior atividade e/ou nmero de osteoblastos no local de reparao.

ANDREU e ZALDVAR (1997), realizaram um trabalho clnico com intuito de

avaliar o efeito do laser de He-Ne (632,8nm) sobre reparao ssea periapical. Para

tanto selecionaram 40 pacientes de ambos os sexos, com idades entre 10 e 60

(agrupados entre 10 e 34 anos e 35 e 60 anos) que apresentavam leso periapical

crnica. Os pacientes receberam tratamento pulporradicular convencional e TLBP com

15J/cm2 e 7J/cm2, 2mW aplicados de forma pontual. Foram analisados variaes quanto

a idade e tempo de reparao do defeito sseo atravs de radiografia periapical da regio

logo aps o incio da terapia, aos trs,seis e 12 meses. O estudo demonstrou que houve

reparao do defeito sseo em 90% dos pacientes, sendo que em 67,5% destes este fato

ocorreu em um perodo inferior a seis meses ps tratamento. Os autores concluram que

houve acelerao no processo de reparao ssea e que a idade dos pacientes no

influenciou nos resultados obtidos.

HERNNDEZ et al. (1997) realizaram um ensaio clnico com 60 pacientes

portadores de doena periodontal verificando a ao do laser de He-Ne (632,8nm) na

reparao ssea. Os pacientes foram divididos em dois grupos: irradiado e no

irradiado, ambo submetidos cirurgia periodontal. O grupo irradiado foi tratado com

10

uma dose de 3J/cm2 (2mW) aps a cirurgia periodontal. Um controle radiogrfico

peridico foi realizado trs, seis e 12 meses aps a concluso do tratamento. Cem

porcento dos pacientes com periodontite simples incipiente tiveram ganho sseo parcial.

Daqueles que apresentavam periodontite simples moderada, 83,3% obtiveram ganho

sseo. Concluram que os pacientes tratados com laser tiveram valores de ganho sseo

cerca de 20% superiores comparados aos pacientes no tratados.

SAITO e SHIMIZU (1997), obtiveram bons resultados na regenerao ssea de

sutura palatina com utilizao de laser de As-Ga-Al (830nm), aps a disjuno palatina

em ratos. Foram realizadas irradiaes com dose de 35,3J/cm2 e potncia de 100mW

sobre a regio proposta, onde a expanso levou cerca de sete dias (trs a 10 minutos por

dia), trs dias (sete minutos por dia, durante os dias 0-2 ou 4-6), e um dia (21 minutos).

A regenerao de osso na sutura de palatina, avaliada por histomorfometria, revelou

maior regenerao no grupo tratado por sete dias mostrou, demonstrando a relao entre

dose e intensidade de reparao. A irradiao durante o perodo inicial de expanso (0 a

dois dias) foi mais efetiva, visto que posteriormente (dias quatro a seis) a irradiao no

teve qualquer efeito sobre a regenerao ssea. Estes achados, sugerem que o LBP pode

acelerar a regenerao ssea na sutura palatina durante expanso palatal rpida e que

este efeito no dependente s da dose de irradiao de laser total, como tambm do

tempo e freqncia de irradiao. Os autores sugerem que a TLBP possa ser de

benefcio teraputico, encurtando o perodo de reteno (aparelho ortodntico) devido a

acelerao da regenerao ssea em tratamentos ortodnticos.

NICOLAU, ZNGARO e PACHECO (1998) analisaram o grau de reparao

ssea mediante utilizao de TLBP. Utilizaram 12 ratos Wistar, divididos em grupo

controle e grupo irradiado. Os animais tiveram o fmur direito perfurado, recebendo

irradiao com laser de He-Ne (632,8nm), a cada 24 horas, com densidade de energia de

2J/cm2 e potncia de 2,68mW. As irradiao foram feitas de forma transcutnea a cada

24 horas durante 30 dias. Os grupos (controle e irradiado) foram radiografados aps

cinco, 15 e 30 dias da cirurgia. Para a anlise das radiografias foi utilizado o programa

de imagem ImageLab 2.3. As reas de reparao ssea no grupo irradiado

apresentaram maior ndice de radiopacidade comparado ao grupo controle,

demonstrando qualitativamente maior calcificao. Estes dados levaram os autores a

concluir que a TLBP causou o estmulo da maturao ssea no local de leso,

11

evidenciado 15 dias aps cirurgia. Em 30 dias no houve diferena entre animais

controles e irradiados.

OZAWA et al. (1998), verificaram a ao da irradiao de 500mW com laser de

As-Ga-Al (830nm) em osteoblastos de rato em cultura. Os resultados demonstraram que

a irradiao promoveu maior proliferao celular e aumento da fosfatase alcalina. Foi

percebida maior formao de ndulos sseos nas culturas irradiadas, aps 21 dias. Os

autores ressaltam dois pontos importantes neste estudo: um que houve a estimulao da

proliferao celular de osteoblastos, outro que a irradiao ocasionou estmulo na

diferenciao celular, percebida pela maior diferenciao de clulas osteoblsticas e

incremento na formao ssea.

PICON et al. (1998), realizaram um estudo histolgico em ratos, investigando a

reparao alveolar modulada por laser de He-Ne (550nm). Os autores utilizaram 48

animais os quais foram submetidos a exodontia. Vinte e quatro animais tiveram o

alvolo irradiado previamente sutura com 0,95mW, durante seis minutos. A radiao

foi conduzida ao interior do alvolo via fibra ptica (125mm). Os animais foram

sacrificados trs, sete, 14 e 21 dias aps a cirurgia. No grupo irradiado foi verificado

pequeno aumento no significativo na proliferao osteoblstica e na formao de

tecido sseo, quando comparado ao grupo controle. Segundo os autores estes resultados

sugerem que esse tipo de tratamento no trouxe benefcios significantes para o processo

de reparao, atribuindo este fato principalmente ao comprimento de onda utilizado

(regio do verde com 550nm).

LUGER et al. (1998) investigaram o efeito da TLBP na reparao de fraturas

sseas em ratos. Neste trabalho 50 ratos Wistar, divididos dois grupos de 25 animais,

foram submetidos a fratura da tbia, fixada internamente. Um dos grupos foi tratado

com laser de He-Ne (632,8nm, 35mW), diariamente durante 14 dias, 30 minutos por

dia. O segundo grupo serviu como um controle. Depois de quatro semanas, a tbia foi

analisada por teste de tenso (Lloyd LR). A dureza estrutural da tbia (dureza de calo) e

a carga mxima de extenso e fratura foram medidas. A carga mxima e dureza

estrutural da tbia foram significativamente maiores no grupo irradiado quando

comparados aos controles. Em quatro animais controle observou-se a no consolidao

da fratura, o que no foi percebido em nenhum animal do grupo irradiado.

12

SATHAIAH, NICOLAU e ZNGARO (1999) investigaram o efeito da TLBP

na reparao ssea de ratos Wistar atravs da tcnica de Espectroscopia Raman (ER) no

infravermelho prximo. Neste estudo foram utilizados 30 ratos Wistar (20 irradiados e

10 controles), os quais tiveram a tbia direita perfurada. Os animais foram irradiados a

cada 24 horas em quatro sesses com 4J/cm2; 2,68mW; durante 100 segundos, atravs

de um laser de He-Ne (632,8nm). Os animais foram sacrificados cinco, 10, 15, 20, e 25

dias aps a cirurgia e as amostras ssea submetidas a ER em cinco pontos cada. A

anlise de resultados foi realizada observando o deslocamento Raman do pico de

hidroxiapatita de clcio (960cm 1) atravs de espectros Raman. Observou-se que o pico

da hidroxiapatita de clcio apresentou-se significativamente mais intenso nos animais

irradiados, sendo esta diferena mais evidente no grupo com 15 dias ps-cirurgia. Os

autores concluram a existncia de maior incorporao de hidroxiapatita de clcio em

estruturas sseas sobre a ao do laser de He-Ne.

LIZARELLI, LAMANO-CARVALHO e BRENTEGANI (1999) observaram a

ao do laser de As-Ga-Al (790nm) sobre reparao ssea alveolar em ratos. Para tal

estudo utilizaram 1,5J/cm2, 30mW, durante 20 segundos, sobre uma rea de 0,4cm2,

aplicados em uma dose nica em forma de varredura imediatamente aps a cirurgia. O

estudo foi realizado atravs de anlise histolgica sete, 14 e 21 dias ps-cirurgia. Aps

sete e 14 dias o grupo irradiado apresentou uma quantidade de tecido sseo formado

cerca de 10% maior que o grupo controle.

KUCEROV et al. (2000), realizou um estudo para avaliar o efeito de diferentes

freqncias de radiao de 1,5J/cm2 por cinco dias, com LBP sobre o processo de

reparao ssea. Para tanto 124 pacientes foram submetidos a exodontias de molares

inferiores (36, 37, 38, 46, 47, 48). Foram tratados com TLBP com laser As-Ga-Al

(670nm), com potncia de 20mW e freqncias de cinco, 292 e 9.000Hz. O nvel de

IgA e albumina na saliva, e mudanas na densidade ssea do alvolo foram

monitorados. Observaram diferenas significantes nos nveis de IgA e albumina no

grupo irradiado quando comparados aos no irradiados. Foram observados nveis

significativamente maiores de IgA e albumina no grupo irradiado comparados ao

controle, principalmente no grupo tratado com 9.000Hz. A densidade ssea analisada

por radiografia digital, seis meses aps o tratamento cirrgico no mostrou diferenas

entre os grupos irradiado e controle.

13

DRTBUDAK, HASS e MAILATH-POKORNY (2000), investigaram a ao

da TLBP com laser As-Ga-Al (690nm) em culturas de clulas sseas. Neste estudo 30

culturas foram irradiadas com uma densidade de energia de 1,6J/cm2, durante 60

segundos, com potncia de 21mW, analisadas em trs, cinco e sete dias. Utilizaram

tetraciclina incorporada ao meio de cultura para identificao dos nveis de

mineralizao. A intensidade de fluorescncia das culturas foi mensurada aps oito, 12 e

16 dias. A anlise aos 12 dias demonstrou que o grupo irradiado apresentava

crescimento superior ao controle. A produo de matriz ssea e intensidade de

fluorescncia foi significativamente maior no grupo irradiado aps oito, 12 e 16 dias,

quando comparados aos controles.

FREITAS, BARANAUSKAS e CRUZ-HFLING (2000) estudaram a

influncia do laser de He-Ne sobre a osteognese ps fratura, em tbia de ratos Wistar.

O tratamento foi realizado 24 horas aps a leso com doses de 3,15; 31,5 e 94,7J/cm2.

Os animais foram sacrificados oito e 15 dias aps a fratura, e a leso analisada por

microscopia eletrnica de varredura. Com dose de 3,15J/cm2 os animais irradiados no

apresentaram diferenas significantes, em relao aos controles. Entretanto com a dose

de 94,7J/cm2 houve maior consolidao no grupo irradiado. Alm disso, os autores

observaram aumento do volume trabecular e dos osteoblastos aps a TLBP. Na tabela

2.1 est reunida a reviso do efeito da TLBP em tecido sseo In Vitro e In Vivo.

14

Tabela 2.1 Reviso do efeito da TLBP em tecido sseo (In Vitro e In Vivo):

Elemento de anlise Efeito Modelo Laser Autor

Reparao: alveolar + Rato As-Ga (904nm) Bedicenti e Martino, !983

+ Humano He-Ne (632,8nm) Nagasawa et al., !991

+ Rato As-Ga (904nm) Oliveira, !992

+ Rato As-Ga (904nm) Garcia et al., !995

o Rato He-Ne (550nm) Picon et al., !998

+ Rato As-Ga-Al (790nm) Lizarelli et al., 1999

+ Rato As-Ga-Al (790nm) Kucerov et al., 2000perfurao mandbula + Co As-Ga-Al (780nm) Kusakari et al., 1992

+ Rato As-Ga-Al (780nm) Kusakari et al., 1992perfurao osso longo + Rato He-Ne (632,8nm) Baruska et al., 1995

+ Rato He-Ne (632,8nm) Yaakobi et al., 1996

+ Rato He-Ne (632,8nm) Nicolau et al., 1998

+ Rato He-Ne (632,8nm) Freitas et al., 2000osso periodontal + Coelho He-Ne (632,8nm) Lomnitskii e Biniashevskii, 1983osso periapical + Humano He-Ne (632,8nm) Andreu e Zaldvar, !997

+ Humano He-Ne (632,8nm) Hernndez et al., !997disjuno palatina + Rato As-Ga-Al (830nm) Saito e Shimizu, 1997fratura + Rato He-Ne (632,8nm) Trelles e Mayayo, 1987

+ Rato As-Ga (904nm) Glinkowsky e Rowinsky, !995

o Rato He-Ne (632,8nm) David et al., 1996

+ Rato He-Ne (632,8nm) Luger et al., 1998osteointegrao + Co As-Ga-Al (810nm) Kusakari et al., 1992

Osteoblastos:n de clulas + Coelho He-Ne (632,8nm) Lomnitskii e Biniashevskii, 1983

+ Cultura As-Ga-Al (830nm) Ozawa et al., 1998

+ Cultura As-Ga-Al (890nm) Drtbudak et al., 2000

+ Rato He-Ne (632,8nm) Trelles e Mayayo, 1987

+ Rato He-Ne (632,8nm) Baruska et al., 1995

Rato He-Ne (550nm) Picon et al., !998

+ Rato He-Ne (632,8nm) Freitas et al, 2000Sntese de DNA + Cultura As-Ga-Al (780nm) Kusakari et al., 1992Sntese protica + Cultura As-Ga-Al (780nm) Kusakari et al., 1992Fosfatase alcalina + Cultura As-Ga-Al (780nm) Kusakari et al., 1992

+ Cultura As-Ga-Al (830nm) Ozawa et al., 1998

+ Rato He-Ne (632,8nm) Baruska et al., 1995


+ Rato He-Ne (632,8nm) Freitas et al, 2000

Largura Trabecular: + Rato He-Ne (632,8nm) Trelles e Mayayo, 1987

Superfcie Osteide: + Rato As-Ga (904nm) Takeda, 1988

N de Vasos Sangneos: + Co As-Ga-Al (780nm) Kusakari et al., 1992

+ Co As-Ga-Al (810nm) Kusakari et al., 1992

Matriz Osteide: + Cultura As-Ga-Al (890nm) Drtbudak et al., 2000

Deposio Mineral: + Rato As-Ga (904nm) Takeda, 1988


+ Rato He-Ne (632,8nm) Sathaiah et al., 1999

15

2.2 Tecido sseo

O tecido sseo possui alto grau de rigidez e resistncia presso. Os ossos so

grandes armazenadores de substncias, sobretudo de ons de clcio e fosfato. A extrema

rigidez do tecido sseo resultado da interao entre os componentes orgnicos e

mineral da matriz. A matriz ssea composta por uma parte orgnica e uma parte

inorgnica cuja composio dada basicamente por ons fosfato e clcio formando

cristais de hidroxiapatita (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999).

Dentre os tipos celulares que compem o tecido sseo se encontram:

Osteoblastos: Clulas que sintetizam a parte orgnica da matriz ssea. Durante a alta

atividade sinttica, os osteoblastos destacam-se por apresentar elevada basofilia, que se

atenua a medida que a sntese protica reduzida. Essas clulas apresentam-se com

formato polidrico, possuindo ncleo ovide e sistemas de comunicao intercelular. Os

osteoblastos no momento em que esto envolvidos completamente por matriz ssea do

origem aos ostecitos (ROSS e ROMRELL, 1993; SILVA, 2000) (Figura 2.2.1).

Ostecitos: So clulas localizadas em cavidades ou lacunas dentro de trabculas

sseas. Estas clulas esto associadas nutrio das trabculas, possuindo estas,

prolongamentos citoplasmticos que conectam umas as outras (ROSS e ROMRELL,

1993; SILVA, 2000).

Osteoclastos: Clulas que participam dos processos de reabsoro do tecido sseo. So

clulas gigantes e multinucleadas, extensamente ramificadas, derivadas da fuso de

moncitos que atravessam os capilares sangneos. Medem 30 a 50 micrometros,

possuem trs a seis ncleos ovides (Figura 2.2.2). Nos osteoclastos jovens, o

citoplasma apresenta uma leve basofilia que vai progressivamente diminuindo com o

amadurecimento da clula, at que o citoplasma torna-se acidfilo. Os osteoclastos

atravs da ao enzimtica, escavam a matriz ssea, formando depresses conhecidas

como superfcies de reabsoro ou lacunas de Howship (ROSS e ROMRELL, 1993;

SILVA, 2000) (Figura 2.2.3).

O tecido sseo frente a injria tem uma inigualvel capacidade de reparao. O

mecanismo de reparao ssea em condies normais, ocorre inicialmente por um

aumento da atividade osteoblstica, formando rapidamente tecido sseo imaturo, matriz

orgnica, seguida pelo depsito de sais de clcio. Os osteoblastos secretam colgeno e

16

substncia fundamental amorfa que constituem tecido sseo no mineralizado, ou

osteide. Esta matriz colgena passvel de mineralizao posterior.

A resposta do osso fratura, perfurao, infeco, interrupo da fonte sangnea

e s leses de expanso relativamente limitada. O osso inerte deve ser reabsorvido, e o

osso novo deve ser formado, ocorrendo crescimento de vasos sangneos na rea

envolvida (GUYTON, 1993; ROSS e ROMRELL, 1993).

Qualquer leso ssea (fratura, defeito, fixao de implantes, interrupo do

suprimento sangneo) ativa a regenerao ssea local pela liberao de fatores de

crescimento (FC) e indutores. O osso uma das fontes mais ricas em fatores de

crescimento. Entre os fatores de crescimento detectados no osso, alguns so produzidos

pelas clulas sseas, tais como: fator de crescimento semelhante a insulina (FCSI), fator

de crescimento de transformao (FCT), fator de crescimento de fibroblasto (FCF),

fator de crescimento derivado de plaquetas (FCDP) enquanto outros so sintetizados por

tecidos sseos relacionados (interleucina-1 {IL-1}, fator a de necrose tumoral {FaNT}).

O reparo em defeitos sseos um bom modelo para o estudo da regenerao ssea. Ao

contrrio das fraturas, os defeitos so menos propensos a fatores mecnicos e obstrues

do suprimento sangneo. A cicatrizao do defeito, portanto, foi utilizada em muitas

experincias clssicas tratando-se da influncia de medidas cirrgicas e farmacolgicas

para melhorar a regenerao ssea. Com relao aos pequenos defeitos corticais,

estudos foram dirigidos cicatrizao de orifcios criados com dimetros entre 0,1 e

1,0mm na tbia de coelhos. A formao ssea no interior destes orifcios inicia-se dois

dias aps a leso, sem precedncia de reabsoro osteoclstica, e revelou a dependncia

de tamanho definido. Aps quatro semanas os defeitos esto preenchidos por osso

compacto. Uma simples leso produzida pela perfurao de um orifcio parece ativar

uma seqncia programada de eventos, iniciados pelo preenchimento do defeito por

formao ssea aposicional e depois conduzida a uma integrao estrutural da rea do

defeito por remodelao harversiana. Pequenos defeitos sseos esponjosos revelam um

padro de cicatrizao similar ao da cortical. A cicatrizao tambm ocorre em duas

fases, comeando com formao de osso embrionrio atravessando o defeito e no

interior dos espaos intertrabeculares adjacentes. Numa segunda fase, a remodelao

restaura a arquitetura trabecular (SCHENK; 1996).

17

O estudo do tecido sseo, tanto do ponto de vista fisiolgico como patolgico,

desenvolveu-se, principalmente, a partir da dcada de 60 (SEDLIN et al., 1963) atravs

da histomorfometria ssea. Alguns dos avanos tecnolgicos que contriburam para esse

desenvolvimento foram:

I) A incluso de amostras sseas em plsticos e o uso de micrtomos de impacto que

permitiram a obteno de cortes finos e uma diferenciao perfeita entre o tecido

mineralizado, no mineralizado (osteide) e clulas sseas (FROST, 1958);

II) A quantificao das vrias estruturas morfolgicas, o que permite estabelecer as

caractersticas do tecido (FROST, 1973).

A histomorfometria ssea utiliza princpios da estereologia, que estuda

estruturas tridimensionais de amostras bidimensionais (DELESSE, 1847; BADDLEY et

al., 1986). Segundo COMPSON et al. (1989), a histomorfometria ssea descreve, de

forma quantitativa, informaes quanto ao crescimento, remodelao e estrutura ssea.

Alm disso, a histomorfometria analisa os componentes da morfologia ssea tais quais:

medidas de volume, rea, permetro, etc. Uma das tcnicas empregadas na leitura

histomorfomtrica o mtodo semi-automtico, que utiliza um microscpio conectado a

um computador e a uma cmera clara ou cmera de vdeo (MALLUCHE et al.,1982).

As imagens histolgicas so desenhadas com auxlio de um cursor sobre placa

digitalizadora (GARRAHAN et al., 1986). A anlise quantitativa das estruturas

observadas, depende do tipo de software empregado, o qual pode permitir tambm o

estudo da microarquitetura do tecido sseo (GARRAHAN et al., 1986; COMPSTON et

al., 1989; MELLISH et al., 1991; PARISIEN et al., 1995). Tal tcnica precisa,

reprodutvel, alm de possibilitar ao operador eliminao de artefatos histolgicos

(GARRAHAN et al., 1986).

Outro avano tecnolgico que contribuiu para o estudo do tecido sseo tanto

em nveis fisiolgicos quanto patolgicos, foi a possibilidade de estudar a formao

ssea atravs do uso de marcadores como por exemplo a Tetraciclina (FROST et al.,

1961). A Tetraciclina tambm um quelante de clcio e incorpora-se no tecido sseo

recm formado especialmente nas regies onde o mineral foi recentemente depositado.

Assim, pode ser facilmente identificado, quando o corte histolgico exposto a luz

ultravioleta. A mineralizao avana em direo borda ssea, em velocidade

proporcional ao ritmo de deposio e maturao de novas camadas de matriz osteide

18

depositada pelos osteoblastos localizados na borda (MEUNIER, 1973). Dessa forma, ao

administrarmos dois perodos de Tetraciclina com intervalo de dias conhecidos,

podemos observar duas linhas de fluorescncia e calcular sem dvidas, a taxa de

deposio mineral diria (PARFITT et al., 1983).

19

Figura 2.2.1. - Fotomicrografia de tecido sseo corada com azul de toluidina. Osteoblastos

(Ob) e Osteide (Ost) recobrindo a parte da superfcie da trabcula ssea (Tr).

Medula (M). 200x (NICOLAU, RA et al.. Fotobioestimulao de Tecido

sseo com Laser de Baixa Potncia. IV FNCTS. 1998).

Tr

Tr

Obr

M

Ostc r

20

Figura 2.2.2 - Fotomicrografia de tecido sseo corada com azul de toluidina. Osteoclasto

(Oc) sobre superfcie de reabsoro (lacuna de Howship) (setas ). Trabcula

ssea (Tr). Medula (M). 400x (NICOLAU, RA et al.. Fotobioestimulao

de Tecido sseo com Laser de Baixa Potncia. IV FNCTS. 1998).

M

Oc

Tr

21

Figura 2.2.3 - Fotomicrografia de tecido sseo corada com azul de toluidina. Superfcie de

reabsoro (lacuna de Howship) (setas ). Trabcula ssea (Tr). Medula (M).

200x (NICOLAU, RA et al.. Fotobioestimulao de Tecido sseo

com Laser de Baixa Potncia. IV FNCTS. 1998).

M

Tr

22

3. Objetivo

23

3. Objetivo

Avaliao do efeito do Laser de Baixa Potncia (As-Ga-Al) em tecido sseo de

rato submetido uma injria, analisado por histomorfometria ssea atravs de

microscopia ptica e de fluorescncia.

24

4. Mtodos

25

4. Mtodos

Neste estudo foram aplicados os princpios ticos da experimentao animal em

conformidade COBEA (Colgio Brasileiro de Experimentao Animal), tendo sido

aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Univap (Apndice I).

4.1. Animais

Foram utilizados 48 ratos, da raa Wistar, Rattus norvegicus, variao albinus,

com peso mdio de 250 gramas. Os animais tiveram origem no Centro de Zootecnia da

Universidade de So Paulo, os quais passaram por um perodo de sete dias de

ambientao no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Univap em ambiente

climatizado (23 C), alimentados com rao LABINA e gua a vontade. A tabela 4.1

descreve a diviso dos grupos, nmero de animais de cada grupo e cronograma do

estudo

Tabela 4.1 - Diviso do animais em grupos e cronograma do sacrifcio.

GRUPO SUBGRUPOS N. DE ANIMAIS SACRIFCIO APS A CIRURGIA

CONTROLE 5, 15, 25 24 (8 para cada subgrupo) 5, 15, 25 diasIRRADIADO 5,15, 25 24 (8 para cada subgrupo) 5, 15, 25 dias

Os animais foram pesados e a seguir anestesiados com anestsico geral Zoletil

50 (Virbac) na dose de 50,0mg/Kg IM, com seringas de insulina descartveis (Becton

Dickson Indstrias Cirrgicas Ltda). Aps a anestesia, os animais foram submetidos

depilao na regio femural da perna direita. A seguir realizou-se a delimitao da rea

a ser incisionada com lpis dermatogrfico. O traado se fez sobre a pele na regio

lateral de fmur, joelho, tbia e fbula. Com povidine promoveu-se assepsia da regio. A

rea a ser operada foi isolada com TNT (tecido no tecido) fenestrado estril.

4.2. Cirurgia e Medicao

Utilizando-se de bisturi cirrgico descartvel (lmina n 15), realizou-se uma

inciso contnua, sobre o traado com lpis dermatogrfico sobre a pele na regio lateral

26

de fmur, joelho, tbia e fbula. Os tecidos subcutneo e muscular foram divulsionados,

com o auxlio de uma tesoura romba (tipo Metzembaum), permitindo acesso ao

peristeo sem rompimento de fibras de tecido muscular. O peristeo foi incisionado e

descolado permitindo assim acesso ao fmur. A visibilidade do tecido sseo foi possvel

por meio de afastadores cirrgicos (retrator gengival - Duflex) que mantiveram tecido

muscular, pele e peristeo afastados do osso durante a perfurao. Realizada a

exposio do tecido sseo foi feita a perfurao, lateralmente epfise distal do fmur;

1,5mm a cima da insero superior da cpsula articular do joelho. A perfurao foi

efetuada com broca cirrgica para osso (1mm), acoplada a um micromotor (405n

Dentec), atingindo peristeo e cortical ssea, removendo cerca de 2mm de profundidade

de substncia esponjosa. A profundidade da broca foi obtida atravs stopers

endodnticos estreis. Aps a perfurao, houve o reposicionamento do tecido muscular

que foi suturado com fio de sutura absorvvel Vycril (Johnson e Johnson 6-0). A pele do

animal foi suturada com fio de seda montado com agulha (Johnson e Johnson 4-0). Cada

procedimento cirrgico acarretou em um tempo mdio de 45 minutos. Foi administrada

Tetraciclina {Terramicina (Pfizer)} na dose de 20mg/Kg IM no dia da cirurgia e 24

horas antes do sacrifcio, com seringas de insulina descartveis (Becton Dickson

Indstrias Cirrgicas Ltda). A tetraciclina foi utilizada como marcador para anlise

histomorfomtrica dinmica (taxa de aposio mineral diria) (PARFITT, 1983).

4.3 Terapia com Laser de Baixa Potncia (TLBP)

Para a realizao da TBLP os animais receberam sedao com 15,0mg/Kg de peso

Zoletil 50 (Virbac), mnima dose capaz de torn-los cooperativos terapia. Estes eram

posicionados em decbito lateral sobre uma plataforma. A TLBP foi realizada no 2, 4, 6

e 8 dia aps a cirurgia seguindo parmetros conforme tabela 4.3.1. Os animais foram

irradiados com laser de As-Ga-Al (660nm) (Dermolaser-HD 2040-Solaris) na pele sobre

a regio lesionada de forma pontual em apenas um ponto (Figura 4.3.1). Os animais

controle receberam o mesmo tipo de manipulao que os animais irradiados, porm com

o laser desligado.

27

Tabela 4.3.1 - Protocolo de irradiao com laser de As-Ga-Al.

Parmetros de irradiao valores

Densidade de Energia (dE) 10J/cm2

Potncia 5,0 x 10-3W

Comprimento de Onda 660nm

rea do Feixe 0,08cm2

Distncia da Pele 1cm

Tempo 160 segundos

Figura 4.3.1 - Animal em decbito lateral, sobre plataforma recebendo TLBP. Feixe laser

direcionado perpendicularmente regio femural.

28

4.4. Sacrifcio

O sacrifcio dos animais foi realizado cinco, 15 e 25 dias aps a cirurgia (dpc)

com inalao de ter Etlico seguido de deslocamento cervical.

4.5. Tcnica Histolgica

Aps o sacrifcio, o fmur direito de cada animal foi dissecado, conservando-se a

cartilagem de crescimento.

Os fragmentos sseos foram cortados na regio mediana da difise e desgastada

frontalmente na epfise distal, sendo estes submetidos as seguintes etapas de

processamento:

a) Etanol a 70%: permanncia por sete dias;

b) Etanol 100%: permanncia por sete dias;

c) Tolueno: permanncia por um dia;

d) Soluo A (75% de metilmetacrilato e 25% de dibutilftalato): permanncia por sete

dias;

e) Soluo A + 1% de perxido de benzola: permanncia por sete dias;

f) Incluso: A incluso do fragmento foi realizada em uma pr base, ou seja, em um

frasco de vidro de 20ml com tampa, com cerca de 5ml de Soluo A + 2,5% de

Perxido de Benzola, j polimerizada (em estufa 37C). O fragmento foi

adicionado sobre esta pr base com subsequente preenchimento do frasco com

10ml de Soluo A + 2,5% de Perxido de Benzola, ficando desta maneira imerso o

fragmento. O frasco foi levado estufa a 37C por 48 horas para polimerizao da

Soluo A + 2,5% de Perxido de Benzola.

29

g) Preparo do Bloco: O frasco de vidro de 20ml no qual foi realizada a incluso, serviu

somente como molde, desta maneira o mesmo foi quebrado (Figura 4.5.1).

Aps a remoo do vidro foi confeccionado um bloco retangular com auxlio

de uma serra. Seguindo de lixamento do mesmo com lixa d'gua e identificao. Neste

momento o bloco estava pronto para a microtomia (Figura 4.5.2).

30

A

DC

B

Figura 4.5.1 - A) vista posterior da amostra, B) vista frontal da amostra, C) extremidade distal da

epfise, D) distal lateral da amostra.

Figura 4.5.2 - Bloco preparado para microtomia.

31

h) Microtomia: O bloco foi fixado em um micrtomo de impacto (Junk K) com navalha

de Tungstnio. De cada bloco foram obtidos seis cortes histolgicos de 5mm e

quatro cortes histolgicos de 10mm. Os cortes foram colocados em lmina

gelatinadas (#soluo a 2%), esticados com lcool 50% e 100% com pincel.

Aps a microtomia as lminas foram deixadas em estufa 37C por cerca de 12

horas. As lminas com cortes de 5mm de espessura foram coradas com Azul de

Toluidina a 0,1%, e as lminas com 10mm foram montadas em lmina e

lamnula sem colorao.

# Gelatina a 2%:

Gelatina branca (em torno de duas gramas) picada, dissolvida em 100ml de gua

destilada (placa aquecedora).

i) Desplastificao: As lminas foram imersas em metilmetacrilato 100% para

desplastificao dos cortes, durante aproximadamente 20 minutos. Aps a

desplastificao foram desidratadas em Etanol 100% e reidratadas em Etanol

50% e por fim gua destilada;

j) Colorao com Azul de Toluidina (0,1%): As lminas desplastificadas foram coradas

com Azul de Toluidina a 0,1% por cerca de 10 minutos. Aps a colorao as

lminas foram secadas cuidadosamente em leno de papel e passadas em lcool

butlico e clareadas em Tolueno.

Todas as lminas coradas foram avaliadas superficialmente em microscpio

para verificar a necessidade ou no de novos cortes, mediante colorao inadequada ou

presena de artefatos em excesso.

32

4.6. Anlise Histomorfomtrica (AH)

Os parmetros histomorfomtricos estudados foram os parmetros estticos e

parmetro dinmico, e seguiram a nomenclatura padronizada pela American Society of

Bone and Mineral Research (PARFITT et al., 1987) traduzida para o portugus, com

exceo das abreviaes.

Parmetros histomorfomtricos estticos:

- Volume trabecular (BV/TV%): volume ocupado pelo osso trabecular, mineralizado

ou no, expresso como porcentagem do volume ocupado pela medula e trabculas.

- Volume osteide (OV/BV%): volume ocupado pelo osso no mineralizado

(osteide), expresso como porcentagem do volume ocupado pelo osso trabecular

(mineralizado e no mineralizado).

- Superfcie osteide (OS/BS%): porcentagem da superfcie trabecular recoberta por

matriz osteide em relao a superfcie trabecular total.

- Superfcie osteoblstica (Ob.S/BS%): porcentagem trabecular, que apresenta

osteoblastos em relao a superfcie trabecular total.

- Superfcie osteoclstica (Oc.S/BS%): percentual da superfcie trabecular, que

apresenta osteoclastos em relao a superfcie trabecular total.

- Superfcie de reabsoro (ES/BS%): percentual da superfcie trabecular que

apresenta lacunas de reabsoro ssea com a presena ou no de osteoclastos.

- Espessura trabecular (ou espessura das traves) {Tb.Th (mmm)}: espessura das

trabculas sseas expressa em micrometro.

- Espessura osteide {O.Th (mmm)}: espessura do rebordo da matriz osteide depositada

nas trabculas sseas, expressa em micrometros.

- Distncia trabecular {Tb.Sp (mmm)}: distncia entre as trabculas sseas, expressa em

micrometros.

- Nmero de trabculas (ou nmero de traves) {Tb.N (/mm)}: nmero de trabculas

sseas, por milmetro de tecido, sendo tambm um ndice que expressa a densidade

trabecular.

33

Parmetro histomorfomtrico dinmico:

- Taxa de aposio mineral diria {MAR(mmm/d)}: distncia entre duas marcaes por

tetraciclina dividida pelo intervalo de tempo entre as duas marcaes, expresso em

micrometros por dia.

4.6.1. Anlise Histomorfomtrica (AH) -Parmetros Estticos

As lminas com cortes de 5mm coradas com azul de toluidina tiveram anlise

histomorfomtrica com parmetros estticos (volume osteide, superfcie osteide,

superfcie osteoblstica, espessura osteide, superfcie de reabsoro, superfcie

osteoclstica, volume trabecular, espessura das trabculas sseas, distncia entre as

trabculas sseas, nmero de trabculas sseas). As medidas foram realizadas em 30

campos por lmina, imediatamente um campo (375,4mm2) acima da cartilagem de

crescimento. Este estudo foi realizado com auxlio de microscpio (Nikon, Labophot-

2A) cursor, placa digitalizadora e o programa Osteomeasure (Osteometrics, Inc.)

(GARRAHAN et al., 1986) (Figura 4.6.1.1).

4.6.2. Anlise Histomorfomtrica (AH) -Parmetro Dinmico

As lminas com cortes de 10mm tiveram anlise histomorfomtrica com

parmetro dinmico (taxa de aposio mineral diria), analisadas pela dupla marcao

com tetraciclina presentes no tecido sseo na regio. Foram analisadas cerca de 10

regies com dupla marcao pela tetraciclina, situadas acima da cartilagem de

crescimento (Figura 4.6.1.1). Este estudo foi realizado com microscpio provido de: luz

ultravioleta (Labophot 2A Nikon), placa digitalizadora, programa Osteomeasure

(Osteometrics, Inc.) (GARRAHAN et al., 1986) (Figura 4.6.2.1).

34

Figura 4.6.1.1 Representao esquemtica da diartrose entre fmur e tbia. Regio de:perfurao, cartilagem de crescimento e anlise histomorfomtrica.(Modificado: JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica.Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 1999).

Regio deperfurao

Regio de anlisehistomorfomtrica

Peristeo

Membrana sinovial

Cpsula

Cartilagem articular

Cavidade articular

Osso esponjoso

Osso compacto

Cavidade medular

TBIA

FMUR

Cartilagem de crescimento

35

Figura 4.6.2.1- Fotomicrografia de tecido sseo calcificado com 7mm de espessura. Observao

feita sob luz ultravioleta em microscpio de fluorescncia. Osteoblastos (Ob).

Trabcula ssea (Tr). Medula (M). Rgua Micromtrica (Rm) utilizada para

medida entre duas marcaes por tetraciclina no dia da cirurgia {Tetr (i)} e 24

horas antes do sacrifcio {Tetr (f)}. (1260x) (Modificado: MALLUCHE, HH;

FAUGERE, MC. Atlas of Mineralized Bone Histology. New York: Karger.

1986).

Tr

M

Ob

Rm

Tetr (i) Tetr (f)

36

4.7. Metodologia Estatstica

Todas as variveis aferidas no estudo foram analisadas com o auxlio do

programa GraphPad Prism. A expresso dos valores est demonstrada em mdia

aritmtica e desvio-padro, submetido ao teste estatstico ANOVA e t-Student e

complementado pelo ps- teste Bonferroni. O nvel de significncia estabelecido foi de

5% (p

37

5. Resultados

38

5. Resultados

5.1 - ndice de volume trabecular e parmetros estruturais*:

Na comparao entre o grupo controle e irradiado, o volume trabecular nos

animais irradiados cinco dias ps- cirrgico (dpc) foi significativamente (p= 0,0346)

maior que o apresentado pelos animais controle (Tabela 5.1, Grfico 5.1.1 e Figura

5.1.1 e 5.1.2). A distncia entre as trabculas sseas dos animais do grupo controle

cinco e 15 dpc foi maior (p=0,0586) que a observada nos animais do grupo irradiado.

Os grupos controle e irradiados apresentam uma curva com mesma tendncia,

onde os valores para 25 dpc so semelhantes para todos os ndices estruturais e de

volume trabecular (Tabela 5.1 e Grfico 5.1.1, 5.1.2, 5.1.3 e 5.1.4). Para ambos os

grupos a espessura trabacular aumentou significativamente (p

1Tabela 5.1 -Anlise histomorfomtrica do volume trabecular e dos parmetros estruturais dos grupos irradiados e controle.

Grupo Controle Grupo Irradiado

dpc BV/TV(%) Tb.Th(mmm) Tb.Sp(mmm) Tb.N(/mm) dpc BV/TV(%) Tb.Th(mmm) Tb.Sp(mmm) Tb.N(/mm)

5 (n=7) 30,5 1,7 48,6 2,6 112,1 6,6 6,3 0,3 5 (n=8) 35,6 1,4# 54,5 1,7 99,4 4,9 6,6 0,215 (n=7) 33,0 5,1 48,9 1,0 101,9 8,0 6,8 0,4 a 15 (n=8) 38,6 1,9 51,6 2,3 83,2 4,8 7,5 0,3 a

25 (n=7) 38,9 1,6 b 65,3 2,9 e f 104,2 6,4 6,0 0,3 25 (n=8) 38,0 1,0 61,3 2,5 c 102,9 4,3 c 6,1 0,2 c

BV/TV(%)- Volume trabecular; Tb.Th(mm)- Espessura das trabculas sseas; Tb.Sp- Distncia entre as trabculas sseas; Tb.N(/mm)- Nmero de trabculas sseas.# p < 0,05 ou p < 0,01, nvel de significncia estatstica na comparao entre os grupos controle e irradiado. Nvel de significncia entre os tempos experimentais,p < 0,05: a (5 vs 15 dpc), b: (5 vs 25 dpc), c (15 vs 25 dpc), p < 0,01: d (5 vs 15 dpc), e: (5 vs 25 dpc), f (15 vs 25 dpc).

125

30

35

40

45

50

0 5 10 15 20 25 30dias ps-cirurgia

Vol

ume

trabe

cula

r (%

)

controle

irradiado

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25 30dias ps- cirurgia

Esp

essu

ra tr

abec

ular

(m

m)

controle

irradiado

70

80

90

100

110

120

130

0 5 10 15 20 25 30

dias ps- cirurgia

Dis

tnc

ia tr

abec

ular

(m) controle

irradiado

Grfico 5.1.2 Espessura trabecular (Tb.Th) em reasprximas injria ssea, dos animais controles e irradiadosnos diferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa amdia e o desvio padro de um grupo experimental (n=7-8)

Grfico 5.1.1 Volume trabecular (BV/TV) em reas prximas injria ssea, dos animais controles e irradiados nos diferentesdias ps-cirurgia. Cada ponto representa a mdia e o desviopadro de um grupo experimental (n=7-8)

Grfico 5.1.3 Distncia trabecular (Tb.Sp) em reasprximas injria ssea, dos animais controles e irradiadosnos diferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa amdia e o desvio padro de um grupo experimental (n=7-8).

Grfico 5.1.4 Numero de trabculas (Tb.N) em reasprximas injria ssea dos animais controles e irradiados nosdiferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa a mdia e odesvio padro de um grupo experimental (n=7-8).

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25 30

dias ps- cirurgia

Nm

ero

de tr

abc

ulas

(/m

m) controle

irradiado

2

Figura 5.1.1 Regio de anlise histomorfomtrica da lmina n 914-3 de um animal do grupocontrole 5 dias ps-cirurgia. As medidas foram realizadas em 30 campos, umcampo (375,4mm2) acima da cartilagem de crescimento.

Figura 5.1.2 Regio de anlise histomorfomtrica da lmina n 929-1 de um animal do grupoirradiado 5 dias ps-cirurgia. As medidas foram realizadas em 30 campos, umcampo (375,4mm2) acima da cartilagem de crescimento.

35.2 - ndices de formao ssea*:

Os grupos controle e irradiados apresentam uma curva com mesma tendncia,

decrescente e significativa (p

1Tabela 5.2.1 - Anlise histomorfomtrica dos ndices de formao ssea.


dpc OV/BV(%) OS/BS(%) Ob.S/BS(%) O.Th(mmm) dpc OV/BV(%) OS/BS(%) Ob.S/BS(%) O.Th(mmm)

5 (n=7) 0,3 0,1 16,7 2,1 10,1 1,1 1,0 0,1 5 (n=8) 0,5 0,1 25,1 3,8 14,0 2.0 1,2 0,115 (n=7) 0,4 0,05 15,2 1,8 8,7 0,5 1,2 0,1 15 (n=8) 0,7 0,2 19,4 1,4 12,7 0,6 1,6 0,425 (n=7) 0,01 0,01 e f 1,1 0,4 e f 0,5 0,2 e f 0,7 0,1 e 25 (n=8) 0,1 0,01# b f 2,8 0,8 e f 1,3 0,4 e f 1,1 0,2

OV/BV(%)- Volume osteide; OS/BS(%)- Superfcie osteide; Ob.S/BS(%) - Superfcie osteoblstica; O.Th(mm)- Espessura osteide# p < 0,05 ou p < 0,01, nvel de significncia estatstica na comparao entre os grupos controle e irradiado. Nvel de significncia entre os tempos experimentais,p < 0,05: a (5 vs 15 dpc), b: (5 vs 25 dpc), c (15 vs 25 dpc), p < 0,01: d (5 vs 15 dpc), e: (5 vs 25 dpc), f (15 vs 25 dpc).

2Tabela 5.2.2 - Anlise histomorfomtrica da taxa de aposio mineral diria.


dpc MAR(mmm/d) dpc MAR(mmm/d)

15 (n=7) 0,48 0,05 15 (n=8) 0,82 0,16

25 (n=7) 0,26 0,05 f 25 (n=8) 0,38 0,06 f

MAR(mm/d): taxa de aposio mineral# p < 0,05 ou p < 0,01, nvel de significncia estatstica na comparao entre os grupos controle e irradiado. Nvel de significncia entre os tempos experimentais,p < 0,05: c (15 vs 25 dpc), p < 0,01: f (15 vs 25 dpc).

10

3

6

9

12

15

18


Sup

erfc

ie o

steo

bls

tica

(%)

controle

irradiado

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

2.4


Esp

essu

ra o

ste

ide

(mm

) controle

irradiado

Grfico 5.2.1 Volume osteide (OV/BV) em reasprximas injria ssea, dos animais controles eirradiados nos diferentes dias ps-cirurgia. Cada pontorepresenta a mdia e o desvio padro de um grupoexperimental (n=7-8).

Grfico 5.2.2 Superfcie osteide (OS/BS) em reasprximas injria ssea, dos animais controles e irradiadosnos diferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa amdia e o desvio padro de um grupo experimental (n=7-8).

Grfico 5.2.3 Superfcie osteoblstica (Ob.S/BS) em reasprximas injria ssea, dos animais controles e irradiadosnos diferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa amdia e o desvio padro de um grupo experimental (n=7-8).

Grfico 5.2.4 Espessura osteide (O. Th) em reasprximas injria ssea, dos animais controles e irradiadosnos diferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa amdia e o desvio padro de um grupo experimental (n=7-8).

0.01

0.1

1


Volum

e os

teide

(%)

controle

irradiado

0

5

10

15

20

25

30

35


Sup

erfc

ie o

ste

ide

(%)

controle

irradiado

25.3 - ndices de reabsoro*:

Os ndices que avaliam a reabsoro ssea, ou seja, a superfcie de reabsoro e

a superfcie osteoclstica (Figura 5.3.1) foram mais elevados no grupo irradiado cinco

dpc, porm somente a superfcie osteoclstica foi significativamente (p=0,0492) maior

que o grupo controle (Tabelas 5.3 e Grfico 5.3.1 e 5.3.2).

Nos animais irradiados 15 dpc no foram observadas diferenas em relao ao

controle, no entanto com 25 dpc tanto a superfcie de reabsoro (p= 0,0032) quanto a

superfcie osteoclstica (p=0,0028) foram significativamente maiores que nos controles

(Tabelas 5.3 e Grfico 5.3.1 e 5.3.2).

No grupo irradiado a reabsoro reduz significativamente (p

1Tabela 5.3 - Anlise histomorfomtrica dos ndices de reabsoro ssea.


Dpc ES/BS(%) Oc.S/BS(%) dpc ES/BS(%) Oc.S/BS(%)

5 (n=7) 8,9 0,9 7,4 0,7 5 (n=8) 14,2 2,2 12,2 1,9 #

15 (n=7) 8,6 1,0 6,4 0,8 15 (n=8) 7,8 0,9 a 5,9 0,8 d

25 (n=7) 4,0 0,4 e f 3,3 0,4 e f 25 (n=8) 8,7 1,1 7,5 1,0

ES/BS(%)- Superfcie de reabsoro; Oc.S/BS(%)- Superfcie osteoclstica# p < 0,05 ou p < 0,01, nvel de significncia estatstica na comparao entre os grupos controle e irradiado. Nvel de significncia entre os tempos experimentais, p < 0,05: a (5 vs 15 dpc), b: (5 vs 25 dpc), c (15 vs 25 dpc), p < 0,01: d (5 vs 15 dpc), e: (5 vs 25 dpc), f (15 vs 25 dpc).

1Grfico 5.3.1 Superfcie de reabsoro (Oc.S/BS) em reasprximas injria ssea, dos animais controles e irradiados nosdiferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa a mdia e odesvio padro de um grupo experimental (n=7-8).

Grfico 5.3.1 Superfcie osteoclstica (ES/BS) em reasprximas injria ssea, dos animais controles e irradiados nosdiferentes dias ps-cirurgia. Cada ponto representa a mdia e odesvio padro de um grupo experimental (n=7-8).

2

5

8

11

14

17

20


Sup

erfc

ie d

e re

abso

ro

(%

)

controle

irradiado

2

5

8

11

14


Supe

rfci

e os

teoc

lst

ica

(%) controle

irradiado

26. Discusso

36. Discusso

O uso de ratos em estudos experimentais clssico pela sua facilidade de

manuseio e baixo custo. A utilizao de ratos para estudo da remodelao ssea tambm

freqente, uma vez que as respostas do tecido sseo destes mamferos s injrias se

assemelham as encontradas em humanos (GOUVEIA, 1996; SCHENK, 1996). Foram

utilizados ratos machos adultos jovens em fase de crescimento, para evitar a

interferncia de fatores como climatrio e idade. Optou-se por analisar na histologia

uma regio do fmur composta predominantemente por osso trabecular, pois trata-se de

osso metabolicamente mais ativo que o osso cortical, e, portanto, mais susceptvel

ao de estmulos (PARFITT et al., 1987).

Na literatura, observa-se uma grande variao de protocolos nos estudos In Vivo,

quanto ao tipo de laser utilizado, a dosimetria e metodologias de irradiao empregadas,

dificultando a comparao entre os mesmos (TAKEDA, 1988; OLIVEIRA, 1992;

BARUSHKA et al., 1995; LUGER et al., 1998).

Dos poucos estudos sobre a TLBP aplicada ao tecido sseo, a maioria no

utilizou mtodos quantitativos de anlise (GARCIA et al., 1996; HERNNDEZ et al.,

1997) ou ento avaliaram a rea contralateral irradiada como controle (DAVID, et al.,

1996). Este procedimento contra-indicado devido a relatos de efeito sistmico da

TLBP (SARTI et al., 1995; MESTER e MESTER, 1989).

DRTBUDK, HAAS e MAILATH-POKORNY (2000), relatam que o laser de

As-Ga-Al emitindo radiao em 660nm eficiente na estimulao de clulas sseas In

Vitro. Apesar dos cuidados que se deve ter para extrapolar resultados In Vitro para In

Vivo, este trabalho serviu de base para os estudos In Vivo realizados no presente estudo.

DAVID et al. (1996), contrariando achados de TRELLES e MAYAYO (1987),

verificaram que o laser de He-Ne com doses de energia de 2 e 4J/cm2, no causava

efeito estimulatrio no processo de reparao de fraturas sseas em ratos. Os autores

utilizaram ambas as tbias do mesmo animal, sendo uma controle e a outra irradiada.

Esta metodologia utilizando rea contralateral como controle, pode ter levado ao

resultado ineficaz da TLBP obtido pelos autores, justificado pelo provvel efeito

sistmico gerado por esta terapia (RIGAU, 1996).

4 Uma segunda proposta utilizando doses de energia mais elevadas foi relatada por

FREITAS, BARANAUSKAS e CRUZ-HFLING (2000) e LUGER et al. (1998),

utilizando 31,5J/cm2 e 63J/cm2, respectivamente, para modular processos de reparao

de fratura. Os autores verificaram o incremento do nmero de osteoblastos e fibras

colgenas em reas de reparao e acelerao da reparao ssea. A dosimetria

empregada no presente trabalho baseou-se nos estudos de NEIBURGER (1995) e RIGAU

(1996), cuja densidade de energia foi da ordem de 10J/cm2, considerada eficiente para

reparao de tecidos.

O estudo da velocidade de aposio mineral (parmetro dinmico da

histomorfometria) foi descrito por SAITO e SHIMIZU (1997), atravs do qual

observaram maior aposio mineral em animais irradiados com As-Ga-Al em

comparao aos controles, durante disjuno palatina. Neste trabalho, utilizando o

mesmo tipo de laser, nos valemos tambm da histomorfometria para anlise do tecido

sseo, pois esta tcnica permite uma anlise quantitativa dos parmetros de formao,

reabsoro e estruturais, favorecendo a compreenso do processo de remodelao ssea

normal e modulada pela TLBP. A padronizao da leso (profundidade, largura e local

de perfurao) e da leitura histomorfomtrica, permitiu avaliar o processo de

remodelao ssea entre a cartilagem de crescimento e a regio de injria.

BARUSHKA, YAAKOBI e ORON (1995) obtiveram um volume trabecular

superior em animais controles comparados a irradiados. No entanto, OLIVEIRA (1992)

observou aumento no volume trabecular em alvolos em processo de reparao aps

irradiao com laser de As-Ga evidente em seis dias ps- cirurgia. Resultados

semelhantes aos de OLIVEIRA foram encontrados neste trabalho, no qual o volume

trabecular do grupo irradiado foi superior ao do controle aps cinco dias ps-cirurgia.

Coerente com estes resultados observamos que a distncia entre as trabculas sseas do

grupo irradiado foi menor do que o grupo controle nesse mesmo perodo ps-cirurgia.

Os resultados de nosso estudo demonstraram uma formao ssea superior nos

animais irradiados (Tabelas 5.2.1 e 5.2.2 e Grfico 5.2.1, 5.2.2, 5.2.3 e 5.2.4). Este

resultado concordante com os obtidos por BARUSKA, YAAKOBI e ORON (1995),

que avaliaram a atividade osteoblstica atravs dos nveis de fosfatase alcalina,

verificando elevao da fosfatase alcalina nos animais irradiados e portanto maior

atividade osteoblstica.

5YAAKOBI, MALTZ e ORON (1996), avaliaram a atividade osteoblstica

atravs da anlise da concentrao local de fosfatase alcalina. Os autores observaram

que a atividade osteoblstica reduziu-se, com o passar do tempo ps- cirurgia, nos

animais controles e irradiados, sendo menos acentuada nestes ltimos. Os mesmos

autores utilizando como marcador o 45CaCl2 (clcio radioativo) observaram que a

aposio mineral nos animais irradiados foi cerca de 50% maior quando comparados

aos controles 15 dias ps-cirurgia. A concentrao mineral reduziu-se aos 28 dias para

nveis prximos dos controles, porm ainda superiores aos dos animais irradiados,

demonstrando com isso que alm do estmulo da atividade osteoblstica houve maior

aposio mineral. Outro estudo analisando a estrutura mineral foi realizado por

SATHAIAH, NICOLAU e ZNGARO (1999), que utilizando a tcnica de

Espectroscopia Raman observaram maior quantidade de hidroxiapatita de clcio nos

animais irradiados quando comparados aos controles aps 15 dias. Segundo os autores o

aumento da concentrao de hidroxiapatita de clcio pode ter ocorrido em decorrncia

do aumento da atividade osteoblstica (aumento da formao de matriz orgnica)

promovido pela TLBP. Os resultados obtidos pelos autores corroboram nossos achados,

visto que a superfcie osteoblstica nos animais irradiados era significativamente maior

que nos controles. Da mesma forma verificamos que a taxa de aposio mineral do

grupo irradiado foi maior que o do controle neste mesmo perodo. Este ndice sofreu um

decrscimo em funo do tempo para ambos os grupos, porm sempre foi superior nos

animais irradiados.

FREITAS, BARANAUSKAS e CRUZ-HFLING (2000), estudando fraturas

sseas submetidas irradiao, atravs de microscopia eletrnica de varredura,

verificaram que os animais irradiados 15 dias aps a fratura, apresentavam intensa

proliferao de osteoblastos e reparo mais rpido das fraturas quando comparados aos

controles. Em nosso estudo verificamos que o volume osteide foi mais elevado nos

animais irradiados em 25 dpc em relao ao controle. Provavelmente, a superioridade

deste ndice de formao (volume osteide) nos animais irradiados tenha ocorrido

devido a maior quantidade de osteoblastos (superfcie osteoblstica), verificada em 15

dias nestes animais. Esta elevao da atividade osteoblstica modulada pela TLBP foi

descrita por KUSAKARI et al. (1992) o qual reportou a estimulao de DNA, sntese de

protenas e fosfatase alcalina em cultura de clulas osteoblsticas (UMR 106) irradiadas.

6De forma semelhante OZAWA et al. (1998) observaram estimulao na proliferao de

osteoblastos aps irradiao, verificada pela anlise do nmero de mitoses e nveis de

fosfatase alcalina.

Segundo ZAIDI et al. (1993) o osteoblasto a principal clula envolvida na

ativao hormonal dos osteoclastos, sendo estes ativados por um mecanismo

dependente principalmente de substncias solveis liberadas pelos osteoblastos.

Conforme descrito, neste trabalho verificou-se que a superfcie osteoblstica nos

animais irradiados foi significativamente superior a dos controles em 15 dias, desta

forma pode-se justificar a maior superfcie osteoclstica e superfcie de reabsoro em

25 dias nos animais irradiados. No grupo irradiado a superfcie osteoclstica em cinco

dias tambm foi significativamente maior do que o controle, demonstrando a provvel

ao estimuladora da TLBP sobre osteoclastos em perodos iniciais de reparao. A

elevao deste ndice pode justificar a presena de uma maior superfcie de reabsoro,

a qual resultado da ao dos osteoclastos.

Nos animais irradiados, verificamos que os ndices de reabsoro reduzem em

funo do tempo de cinco para 15 dias, porm permanecem estveis em 25 dias. No

grupo controle esta reduo da reabsoro ocorre somente em 25 dias (Tabela 5.3 e

Grfico 5.3.1 e 5.3.2). Analisando-se a superioridade da atividade osteoblstica em 15

dias nos animais irradiados e consequente aumento do volume osteide (matriz ssea)

em 25 dias, provavelmente os osteoblastos tenham estimulados a elevao dos nveis de

reabsoro, de forma a manter a remodelao ssea em nveis de normalidade. Estes

resultados so embasados pela fisiologia ssea, pois segundo HENTUNEN et al.

(1994), da matriz ssea liberada uma protena que estimula formao de osteoclastos

de forma dose dependente.

No foram observadas diferenas significativas quanto a superfcie osteoclstica e

superfcie de reabsoro em 15 dias entre os grupos irradiado e controle (Tabela 5.3 e

Grfico 5.3.1 e 5.3.2). Estes dados no so corroborados pelos resultados obtidos por

BARUSHKA, YAAKOBI e ORON (1995), os quais verificaram que nos animais

irradiados havia maior nvel de fosfatase cida em 15 dias ps- cirurgia.

A relativa superioridade de reabsoro ssea ocorrida nos animais irradiados em

relao aos controles, verificada neste trabalho pode ter sido gerada devido a

estimulao da liberao de prostaglandina E2 (ZAIDI et al., 1993), promovida pela

7TLBP, estimulao esta verificada por TRELLES e MAYAYO (1987). Estes resultados

demonstraram uma remodelao ssea acentuada, sugerindo a existncia de estimulao

do processo de reparao ssea (NAGASAWA et al.,1991), uma vez que a estimulao

da remodelao ssea em reas vizinhas a reparao, proporciona um ambiente

favorvel a esta.

O aumento da remodelao ssea verificada neste trabalho, vai de encontro a

resultados obtidos em exp

rato

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