quilza raabe da silva gomes - cruzeiro do sul educacional...

Quilza Raabe da Silva Gomes

EXPRESSÃO DE RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO FRENTE A DIFERENTES PERÍODOS DE TREINAMENTO DE EXERCÍCIO

ACROBÁTICO

Universidade Cidade de São Paulo

SÃO PAULO

2014



ACROBÁTICO

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado e Doutorado em Fisioterapia da Universidade Cidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre, sob a orientação da Profa. Drª. Raquel Simoni Pires


SÃO PAULO

2014

Ficha elaborada pela Biblioteca Prof. Lúcio de Souza. UNICID G633e

Gomes, Quilza Raabe da Silva. Expressão de receptores metabotrópicos de glutamato frente a diferentes períodos de treinamento de exercício acrobático. / Quilza Raabe da Silva Gomes --- São Paulo, 2014. 115 p.; Anexos Bibliografia Dissertação (Mestrado) - Universidade Cidade de São Paulo. Orientadora Profa. Dra. Raquel Simoni Pires. 1. Exercício. 2. Habilidade motora. I. Pires, Raquel Simoni, orienta. II. Título.

CDD 615.82



ACROBÁTICO

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado e Doutorado em Fisioterapia da Universidade Cidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre, sob a orientação da Profa. Drª. Raquel Simoni Pires

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Mestrado, em

sessão pública realizada a ......../........../............., considerou

( ) Aprovada ( ) Reprovada

Examinadora:.........................................................................................................

Drª Caroline Cristiano Real

Universidade de São Paulo

Examinadora:.........................................................................................................

Profª.Drª Sandra Regina Alouche


Presidente:.............................................................................................................

Profª.Drª Raquel Simoni Pires


Dedico esse trabalho a Deus

Quanto mais me aprofundo na ciência

Mais me aproximo dEle

Agradecimentos

Agradeço em primeiro lugar a Deus, por sempre ter direcionado minha vida profissional, por ter me feito alcançar sonhos impossíveis, por ser minha fonte de inspiração, o ar que eu respiro, a força que me sustenta.

Agradeço ao meu marido, que foi meu maior incentivador e parceiro nesse desafio. Agradeço por ter ido a todos os lugares comigo (mesmo que fosse longe), por ter me ouvido e me acolhido nos momentos de choro, por ter ficado acordado muitas vezes, até altas horas enquanto estudava. Você é o melhor marido que Deus podia ter me dado. Te amo!!!

Agradeço a minha família; aos meus pais que sempre me incentivam, que são o meu porto seguro, meu alicerce, e que sempre recorro às suas orações nos momentos de crises. Às minhas irmãs Ilka, Quézia, Quédma que são parceiras eternas, nas risadas, na tristeza, nas perdas e nas conquistas. Aos meus cunhados que também entraram nessa jornada comigo. E a minha pequena sobrinha Larissa Mariah meu pacote de alegria, leveza e pureza.

Agradeço a minha professora e orientadora Raquel. Agradeço a parceria, os conselhos, os ensinamentos e conhecimentos passados, à compreensão em muitos momentos, ao acolhimento emocional e acima de tudo por sempre acreditar em mim e na minha capacidade.

Agradeço a professora amiga e companheira Sandra Alouche, por ser a verdadeira culpada do meu envolvimento no mestrado e por me guiar em muitos momentos. Agradeço a Monica Perracini e Sandra Freitas por contribuírem para a formação do meu conhecimento e crescimento profissional.

Agradeço a Priscila, Carol, Samira e Juliana pelos ensinamentos, pela disposição em me ajudar, e pela contribuição nesse trabalho. Ao Adilson, por sempre estar disposto a me ajudar e também pela sua alegria contagiante.

Agradeço as minhas amigas da turma do Mestrado Juliana Santi e Tatiane, nos conhecemos no primeiro dia e nos tornamos verdadeiras amigas, obrigadas pelo companheirismo, por me ouvirem, por trilharem comigo esse desafio. As meninas do “hemisfério esquerdo”: Renata, Flávia e Rafaela, pela parceria, pelas risadas, pelos conhecimentos trocados, pelo apoio, pelo suporte

emocional. Vocês tornaram esses dois anos mais leves e mais agradáveis. Essa é a melhor parte do mestrado: os amigos que encontramos e os laços que criamos.

As minhas amigas de faculdade e consultório Priscila e Vanessa, por estarem comigo na realização desse sonho.

Agradeço aos professores do programa de mestrado da Univercidade Unicid por nos ensinarem a sermos pesquisadores completos.

Agradeço a prof. Sandra Ortiz, chefe do Laboratório da UNICID, por me receber de maneira tão calorosa e ceder seu espaço para a realização dessa pesquisa.

Agradeço ao prof. Britto, chefe do Laboratório da USP, por conceder o espaço para a realização dessa pesquisa.

Agradeço a Fapesp e CNPq pelo apoio financeiro.

3

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES ........................................................................................................ 5

LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................................... 6

RESUMO ..................................................................................................................................... 8

ABSTRACT ................................................................................................................................. 9

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 10

1.1. Plasticidade neural ...................................................................................................... 10

1.2. Neurotransmissão Glutamatérgica ............................................................................. 12

1.3. Exercício X Plasticidade ............................................................................................... 16

1.4. Períodos de treinamento ............................................................................................ 20

1.5. Neuroanatomia funcional ........................................................................................... 21

1.5.1 Córtex Motor ....................................................................................................... 21

1.5.2 Estriado................................................................................................................ 24

1.5.3 Cerebelo .............................................................................................................. 25

2. JUSTIFICATIVA ..................................................................................................................... 29

3. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 30

3.1. Objetivo Geral ............................................................................................................. 30

3.2. Objetivos Específicos ................................................................................................... 30

4. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................................... 31

4.1. Animais ........................................................................................................................ 31

4.2. Desenho experimental ................................................................................................ 31

4.3. Protocolo de Exercício Acrobático .............................................................................. 32

4.4. Protocolo de Imuno-histoquímica ............................................................................... 33

4.5. Protocolo de “Immunoblotting” ................................................................................. 36

4.6. Análise Estatística ........................................................................................................ 37

5. RESULTADOS ....................................................................................................................... 38

5.1. Desempenho motor .................................................................................................... 38

4

5.2. Expressão dos receptores metabotrópicos de glutamato .......................................... 39

5.2.1 Córtex Motor ....................................................................................................... 39

5.2.2 Estriado................................................................................................................ 44

5.2.3 Cerebelo .............................................................................................................. 48

6. DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 51

6.1. Desempenho Motor .................................................................................................... 51

6.2. Efeitos dos Diferentes Períodos de Treinamento em Regiões Encefálicas ................. 51

6.2.1 Córtex Motor ....................................................................................................... 52

6.2.2 Estriado................................................................................................................ 54

6.2.3 Cerebelo .............................................................................................................. 57

6.2.4 Períodos De Treinamento X Respostas Plásticas................................................. 59

7. CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 61

8. REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 62

5

LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Esquema ilustrando as etapas do protocolo

experimental......................................................................................................31

Figura 2 - Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito de

treinamento de exercícios acrobáticos..............................................................32

Figura 3 - Esquema ilustrando as estruturas encefálicas e respectivas áreas

analisadas..........................................................................................................34

Figura 4 - Desempenho motor dos ratos para a realização das tarefas

presentes no circuito no treinamento acrobático avaliado pela média do tempo

gasto..................................................................................................................37

Tabela 1 - Níveis de expressão das subunidades do mGluRs nos diferentes

tempos de treinamento.....................................................................................40

Figura 5 - Efeitos dos diferentes períodos de exercício acrobático sobre a

expressão da subunidade do receptor mGluR1................................................41


expressão da subunidade do receptor mGluR2/3.............................................42









Tabela 2 - Resumo dos resultados...............................................................59

6

LISTA DE ABREVIATURAS

- AC: Acrobático

- AE: ambiente enriquecido

- AMPA: alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico

- AVE: acidente vascular encefálico

- BDNF: fator neurotrófico derivado do cérebro

- DAG: diacilglicerol

- DLS: dorsolateral

- DMS: dorsomedial

- EE: Exercício em esteira

- EV: exercício voluntário

- GPe: globo pálido externo

- GPi: globo pálido interno

- IP3: inositol trifosfato

- LTD: depressão de longo prazo

- MAP: proteína associado ao microtúbulo

- NF68: neurofilamento

- NMDA: N-metil- D-aspartato

- PKC: proteína quinase C

- SMA: área motora suplementar

- SNC: sistema nervoso central

7

- SYP: sinaptofisina

- SYS: sinapsina

8

RESUMO

Diferentes períodos de treinamento podem induzir mudanças plásticas em

áreas envolvidas com o controle e aprendizado motor. Os receptores

metabotrópicos de glutamato (mGluRs) estão envolvidos com funções

cognitivas, mas informações sobre a participação destes nas funções motoras

são escassas. Portanto, o objetivo desse estudo foi avaliar o desempenho

motor e a expressão das subunidades mGluR1 e mGluR2/3 no córtex motor,

estriado e cerebelo de ratos adultos jovens submetidos a diferentes períodos

de exercício acrobático. Foi utilizado 55 animais, Wistar, divididos

aleatoriamente em dois grupos: exercício acrobático (AC=44) e controle

sedentário (SED=11). O grupo AC foi subdivido em 4 grupos com diferentes

períodos de treinamento: 1 semana (AC1), 2 semanas (AC2), 4 semanas (AC4)

e 8 semanas (AC8). O protocolo de exercício constituiu de 5 passagens pelo

circuito acrobático, 3 vezes por semana. O desempenho motor foi avaliado pelo

tempo gasto para realizar cada passagem pelo circuito. Para a análise da

expressão das subunidades de mGluRs foi elegida duas técnicas: imuno-

histoquímica e “immunoblotting”. As comparações entre os grupos foram

realizadas pelo teste de ANOVA one-way e seguido do pós-teste de Tukey

quando houve diferença estatisticamente significante (p≤0,05). Na análise de

desempenho motor foi observado melhora no tempo de execução do exercício

a partir da terceira semana nos grupos AC4 e AC8. Os dados obtidos

demonstraram aumento na expressão de mGluR1 com quatro e oito semanas

de treinamento no córtex motor e região dorsomedial do estriado; na região

dorsolateral do estriado o aumento aconteceu nos grupos AC1 e AC8; no

cerebelo esse aumento ocorreu com duas semanas de treinamento. A

expressão de mGluR2/3 apresentou diminuição com duas e quatro semanas no

córtex motor; aumento com uma semana e oito semanas na região

dorsomedial e dorsolateral, e nenhuma mudança estatisticamente significativa

no cerebelo. Esses dados sugerem que diferentes períodos de exercício

acrobático induziram mudanças plásticas distintas nas diferentes áreas

encefálicas sugerindo plasticidade tempo e áreas motoras-dependente.

Palavras-chave: exercício, habilidade motora, neuroplasticidade, receptores

metabotrópicos de glutamato, sistema motor

9

ABSTRACT Different periods of acrobatic training can induce plastic changes in areas

involved in motor control and learning. The metabotropic glutamate receptors

(mGluRs) are involved in cognitive functions, but information on their

participation in motor functions are scarce. Therefore, the aim of this study was

evaluate the motor performance and the mGluR1 and mGluR2/3 subunits

expression in the motor córtex, striatum and cerebellum of young adults rats

submitted to different periods of acrobatic exercise. Young adult male Wistar

rats were randomly divided into 2 groups: acrobatic exercise (AC=44) and

sedentary control (SED=11). The AC group was subdivided into 4 groups with

different training times: 1 week (AC1), 2 weeks (AC2), 4 weeks (AC4) and 8

weeks (AC8). The exercise protocol constitutes of 5 passes through the

acrobatic circuit, 3 times a week. The motor performance was assessed by the

time taken to complete each trial. To analyze the expression of the mGluR

subunits was used immunohistochemistry and “immunoblotting” techniques.

Comparisons between groups were performed with ANOVA one-way and Tukey

post test when the analyses showed a statistically significant difference

(p≤0,05). After three weeks, the AC4 and AC8 animals presented a significant

reduction of the time necessary to complete the AC task. The data showed

increased mGluR1 expression after four and eight weeks of training in the motor

cortex and the dorsomedial region of the striatum, the dorsolateral stratum of

the increase occurred in the groups AC1 and AC8; this increase occurred in the

cerebellum with two weeks of training. The reduction of mGluR2/3 expression

was observed after two and four weeks acrobatic training in the motor cortex,

an increased expression after one and eight weeks in the dorsomedial and

dorsolateral regions, and no statistically significant changes in the cerebellum.

These data suggest that different periods of acrobatic exercise induced plastic

changes in different brain areas suggesting different plasticity and time-

dependent motor areas.

Keywords: exercise, motor skill, neuroplasticity, metabotropic glutamate

receptors, motor system.

10

1. INTRODUÇÃO

1.1. Plasticidade neural

A neuroplasticidade é a capacidade do sistema nervoso em alterar a sua

organização estrutural e funcional como resposta à ação do ambiente interno e

externo, ou ainda como resultado de lesões que afetam o ambiente neural1, 2.

As mudanças plásticas têm sido descritas como neurogênese, aumento na

eficiência das sinapses, reorganização dos circuitos neuronais e mudanças na

expressão de células não neurais frente ao desenvolvimento, envelhecimento,

lesões e exercícios físicos, entre outros. Essas mudanças são observadas do

ponto de vista molecular, celular e até alteração nas redes e sistemas neurais.

Vários estudos tem demonstrado que perturbações advindas do ambiente

interno e externo geram alterações nas representações de mapas corticais,

assim como no crescimento de espinhos e dendritos, no aumento da área de

contato e mudança na trajetória dos axônios, na modulação de

neurotransmissor, na potenciação e depressão das sinapses, aumento na

expressão de proteínas estruturais, sinápticas, neuroprotetoras, aumento nos

receptores de neurotransmissores e nos fatores neurotróficos resultando assim

em novas possibilidades de diferenciação de neurônios e sobrevivência dos

mesmos2, 3 4-8.

Essas mudanças foram observadas frente a ação do ambiente interno como

o desenvolvimento; em crianças recém-nascidas observou-se alta atividade

sináptica no córtex cerebral, seguida de uma diminuição no decorrer do

desenvolvimento cronológico até o final da adolescência, reforçando a teoria de

que essa maior atividade acontece no período de desenvolvimento e contribui

para a fase de aprendizagem9. Os fatores externos como lesões e exercícios

também induzem neuroplasticidade; em animais submetidos a lesão estriatal

(semelhante a Doença de Huntington) e enxertados com células embrionárias

estriatais e foram expostos a um ambiente enriquecido notou-se um aumento

de potenciação de longo prazo (LTP) além da melhora no desempenho motor

pós transplantes10. Em macacos foi observada uma alteração na representação

11

da mão no córtex motor primário, após lesão isquêmica11. Em humanos

portadores de acidente vascular cerebral (AVC) foi observado recuperação

sensório-motora espontânea entre três e seis meses pós-lesão, sendo portanto

um bom momento para reabilitação12. Entretanto, mesmo em pacientes

crônicos, pós 8 anos de lesão, foram observadas mudanças nas áreas de

representação cortical com a continuidade do treinamento12.

Vários estudos que abordaram mecanismos plásticos, como potenciação

de longo prazo (LTP), depressão de longo prazo (LTD), a expressão do fator

neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), a expressão de proteínas estruturais,

sinápticas e receptores também demonstraram mudanças plásticas8, 13-15. O

BDNF tem como principal função a sobrevivência e proteção de células

nervosas no sistema nervoso central e periférico. Porém ele também está

envolvido em diversos processos como: indução da LTP no hipocampo;

aumento da frequência de ativação de sinapses; modulação da formação,

maturação e plasticidade de sinapses glutamatérgicas e gabaérgicas;

promoção da neurogênese e do crescimento axonal. Além disso a expressão

de BDNF aumentou no hipocampo após o exercício físico, sugerindo ser

essencial para os mecanismos moleculares de plasticidade sináptica13, 16, 17.

A potenciação de longo prazo (LTP) e/ou a depressão de longo prazo

(LTD), são caracterizadas por alterações na frequência ou na intensidade da

ativação de células tanto nas sinapses excitatórias glutamatérgicas como nas

sinapses inibitórias GABAérgicas. A LTP é uma forma de plasticidade

dependente da atividade, que resulta em um aumento persistente da

transmissão sináptica. A LTD é provocada por curtos períodos de atividade

sináptica, gerando um acúmulo transitório de cálcio nos terminais nervosos pré-

sinápticos que resultará alterações na liberação de neurotransmissores

modificando assim, os processos bioquímicos nas vesículas sinápticas. Esses

dois fenômenos constituem mecanismos responsáveis por mudanças plásticas,

e podem ocorrer devido às mudanças na liberação do neurotransmissor do

terminal pré-sináptico assim como o número de receptores no terminal pós-

sináptico, dentre outros fatores 3, 9, 12.

12

Os receptores glutamatérgicos (ionotrópicos e metabotrópicos) também

estão envolvidos em mecanismos plásticos. Os receptores ionotrópicos do tipo

N-metil- D-aspartato (NMDA) e do tipo alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-

isoxazolpropiónico (AMPA) e os metabotrópicos mGluR1 e mGluR2/3

participam dos mecanismos de LTP e LTD, os quais estão envolvidos em

processos de aprendizado e memória no hipocampo e também nas conexões

no córtex cerebral, no estriado e cerebelo participando ativamente dos

processos de plasticidade nessas áreas. Uma maneira de se observar a LTP é

pela inserção de receptores adicionais, do tipo AMPA, na membrana pós-

sináptica permitindo que o glutamato liberado abra um maior número de canais,

produzindo um aumento no potencial excitatório pós sináptico (PEPs); e

também o aumento na liberação do glutamato na membrana pré-sináptica. Já

os receptores metabotrópicos ativam os canais iônicos através de segundos

mensageiros (proteína G) e geram potencial mais lento porém de maior

duração 18-20.

1.2. Neurotransmissão Glutamatérgica

O glutamato, principal neurotransmissor excitatório, e seus receptores

(GluRs) estão envolvidos em vias que promovem as respostas a curto e longo

prazo pela célula neural, vias estas que apresentam suas atividades

intensificadas frente a atividade física21, 22. A neurotransmissão glutamatérgica

também está envolvida em várias funções encefálicas, tais como: cognição,

memória, aprendizado, plasticidade sináptica e na formação da rede neuronal

durante o desenvolvimento do sistema nervoso , entre outras23.

O glutamato é produzido na mitocôndria, transportado para o citoplasma e

empacotado nas vesículas sinápticas, onde ele será liberado na fenda

sináptica. A ação do glutamato é concluída por sistemas de captação nos

neurônios e células da glia, onde em situações normais é bombeado de volta

às vesículas para serem liberados futuramente24.

Os receptores são formados por proteínas transmembrânicas e suas

propriedades funcionais são determinadas pelos subtipos de GluRs e pela

13

composição das subunidades, entre outros aspectos25. Estudos farmacológicos

e eletrofisiológicos demonstraram que os receptores glutamatérgicos são

divididos em dois grupos, ionotrópicos e metabotrópicos26. Os receptores

ionotrópicos formam canais iônicos responsáveis pela transmissão sináptica

rápida. Já os receptores metabotrópicos (mGluRs) agem através de segundos

mensageiros intracelulares que modulam a transmissão sináptica, lentificando-

a27.

Os receptores ionotrópicos glutamatérgicos despolarizam a célula

provocando um potencial de ação, pois eles são formados por canais

permeáveis aos cátions (Na+, K+, Ca2+), e dependendo da afinidade aos

agonistas são divididos em NMDA e não-NMDA (AMPA e cainato). Os

receptores do tipo não-NMDA (AMPA) são mais permeáveis aos Na+ e K+, e

as vezes ao Ca2+. Já os receptores do tipo NMDA apresentam alta

permeabilidade ao Ca2+ provocando um aumento significativo nos níveis de

Ca2+ e permitindo a detecção deste pelos neurônios. Os níveis elevados de

Ca2+ ativam processos enzimáticos que interferem nas respostas de curto e

longo prazo nas células neuronais24, 28.

Em meados da década de 1980 observou-se a capacidade do

neurotransmissor glutamato ativar receptores acoplados a proteína G, dando

início assim, aos denominados mGluRs22, 27. As subunidades dos mGluRs

possui uma porção N-terminal de domínio extra celular, três alças extracelular e

intracelular e uma porção C-terminal citoplasmática, separadas por sete

regiões hidrofóbicas29. A porção N-terminal do receptor é o local onde se

localiza o sítio de ligação com o glutamato30, já os domínios intracelulares

interagem com a proteína G para iniciar os eventos de transdução de sinal

resultante de ações diversas como aumento da hidrólise do fosfoinositol,

ativação da fosfolipase D, diminuição da formação de cAMP e mudança na

função de canais iônicos31.

As funções dos receptores metabotrópicos demonstradas por vários

estudos são: mediar as sinapses excitatórias lentas e as sinapses inibitórias;

regular os canais de cálcio, os canais de potássio, e os canais não seletivos de

14

cátion; inibir e facilitar a liberação do transmissor, induzir a LTP e LTD de longo

prazo envolvido no processo de memória32-41. Além disso, esses receptores

podem estar envolvidos em processos degenerativos como a doença de

Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica e também a esquizofrenia42-44

Os mGluRs possuem subtipos ou subunidades denominadas mGluR1-8, e

foram classificados em três grupos de acordo com o grau de homologia da

sequência dos nucleotídeos, de propriedades farmacológicas, seletividade

agonista e do mecanismo de transdução45, 46. O grupo I é constituído pelos

receptores mGluR1 e mGluR5 que são seletivamente ativados por 3,5-di-

hidroxifenilglicina (3,5-DHPG) e acoplados à proteína Gq. Ativação desses

receptores estimula a hidrólise de fosfotidilinositol-bifosfato, gerando como

segundos mensageiros o diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3). O IP3

induz a liberação de cálcio intracelular nas células de Purkinje e nos neurônios,

enquanto o DAG facilita a ativação de proteína quinase C (PKC). O bloqueio da

expressão de mGluR1 nas células de Purkinje, por administração de doxicilina,

no cerebelo de camundongos adultos induziu uma descoordenação e ataxia,

ressaltando o papel desse subtipo no controle da função cerebelar47.

O grupo II inclui mGluR2 e mGluR3 que são acoplados a proteína Gi. A

ativação desses receptores produz inibição da adenilato ciclase, inibição de

canais de Ca2+ voltagem-dependentes e a ativação de canais de K+, inibindo a

produção de AMPc e tem como agonista seletivo LY379268. Por fim, o grupo III

composto por mGluR4, mGluR6, mGluR7 e mGluR8 que são acoplados a

proteína Gi/Go e são ativados por I-2-amino-4-fosfonobuanoate (L-AP4) e

produz inibição da adenilato cilcase, inibição de canais de Ca2+ voltagem-

dependentes e a ativação de canais de K+, inibindo a produção de AMPc.

Tanto o grupo II quanto o grupo III resultam em um potencial inibitório pós

sináptico. Enfim, os mGluRs estão envolvidos em mecanismos de transdução

que pode variar dependendo do subtipo do receptor, e das células em que são

expressos22, 27, 46, 48.

Os receptores mGluR1, mGluR3, mGluR5 e mGluR7 são distribuídos em

todo encéfalo, já mGluR2 e mGluR8 estão mais restritos em algumas regiões

15

específicas. Os receptores do grupo I (mGluR1 e mGluR5) foram encontrados

no corpo estriado, córtex cerebral, hipocampo, tálamo, hipotálamo, córtex

cerebelar e núcleo acumbens26, 49. O mGluR2 e mGluR3 que constituem o

grupo II foram encontrados no córtex cerebral, no giro denteado lateral e

basolateral, nos núcleos amigdalóides, hipocampo, núcleo reticular talâmico,

estriado e discretamente no córtex cerebelar20, 50. Por fim as subunidades do

grupo III se localizam no núcleo talâmico, septo lateral e pontina, substância

negra reticulada, córtex, hipocampo e cerebelo20, 51-53.

Devido à sua ampla distribuição no SNC, os receptores metabotrópicos

possuem um papel importante nas funções neuronais como a plasticidade

sináptica, a memória, o aprendizado, a cognição. Os receptores

metabotrópicos de glutamato encontrados no hipocampo tem demonstrado um

papel importante na aprendizagem e no armazenamento da memória a longo

prazo. A co-ativação deles é necessária para a indução de LTP, através da

modulação da neurotransmissão 54. Receptores do grupo I estão diretamente

envolvidos nos mecanismos de LTP e LTD e em processos de memória do

hipocampo42, e também são essenciais para induzir a LTD no circuito cortico-

estriatal55; já receptores de glutamato do grupo II e III tem papel importante na

regulação de LTD e na memória a longo prazo48. Os recepetores mGluRs

desencadeiam o ínicio da cascata de sinalização que provoca a estabilização

da plasticidade sináptica, além de influenciar as alterações de proteína

otimizando a comunicação sináptica 19, 48, 56, 57.

Animais submetidos a administração do antagonista do grupo II do mGluR

e treino em labirintos apresentaram déficit da memória espacial resultante da

perda de LTD , prejudicando a memória a longo prazo, porém não houve

mudanças em relação à LTP58. Essas informações são reforçadas pelo estudo

onde os animais foram submetidos à implantação de dois eletrodos na região

CA1 do hipocampo, um eletrodo de registro e outro eletrodo de estímulo, e

após a aplicação de antagonistas do grupo mGluR I e II, foi observado que é

necessário a ativação dos mesmos para que ocorra o fenômeno LTD,

demonstrando que o grupo I de mGluR parece induzir e modular a LTP e

modular o grau de LTD e , enquanto o grupo II é responsável pela manutenção

16

de LTD56.

Mais recentemente tem sido demonstrado um nova função dos mGluRs

além destas citadas acima. Jia e colaboradores (2010)59 demonstraram o

envolvimento do mGluR1 na neuroproteção frente a lesão isquêmica cerebral

em ratos. Este estudo demonstrou que o treinamento físico em esteira

previamente a lesão foi capaz de promover uma menor liberação de glutamato

pós isquemia cerebral e que esse efeito foi mediado pela diminuição da

expressão de mGluR1.

1.3. Exercício X Plasticidade

O exercício físico tem sido muito utilizado como um fator externo para

estimular o sistema nervoso, provocando alterações plásticas. Inúmeros

estudos em animais submetidos a exercícios físicos têm demonstrado que

essas alterações estão presentes em várias áreas do sistema nervoso central

(SNC), tais como: córtex motor, cerebelo, estriado, hipocampo e medula

espinal 7, 8, 60, 61. Atualmente, existem estudos empregando diferentes modelos

de exercício que levam em conta a intensidade (alta ou baixa), frequência

(intermitente ou contínuo) e duração (curto ou longo período)62.

A literatura nos mostra alguns tipos de exercícios utilizados com animais

que se propõem a simular exercícios realizados pelos humanos, tanto como

atividade física, como para reabilitação. Os exercícios utilizados são: exercício

voluntário (EV), ambiente enriquecido (AE), exercício em esteira (EE) e o

exercício acrobático (AC)62.

No EV os animais ficam sozinhos dentro da gaiola, se exercitam

espontaneamente dentro de uma roda, de forma intermitente, que pode ser por

curtos períodos de alta intensidade, sem a necessidade de uma manipulação

externa. As mudanças promovidas pelo EV ocorrem em áreas responsáveis

pela aprendizagem e memória, promovendo aumento no número de células no

giro denteado63, aumento da parvalbumina, que é uma proteína ligante de

cálcio e está associada ao fator neuroprotetor, a regulação do ciclo celular

17

entre outras funções no hipocampo64; do BDNF, sinapsina I e AMPc65, além de

sinaptogênese nas regiões do hipocampo, córtex e neocórtex do encéfalo de

ratos adultos 66, 67.

No AE, vários animais são mantidos em uma gaiola maior e expostos a

diferentes tipos de estímulos, tais como rampas, brinquedos, túneis e rodas

que são mudados de local constantemente. Além da atividade os animais

desfrutam de uma interação social dentro desse ambiente complexo.

Geralmente eles são comparados com grupo controle isolados (não há

interação social), ou grupo controle social (que há interação social sem

exposição a estímulos). Nessa condição o animal é que toma a iniciativa de

começar e parar a atividade61, 68, 69. Além disso, é importante considerar nos

estudos que utilizam o AE como estímulo, a variação que acontece no tipo de

estímulos que é oferecido ao animal, o tempo que ele fica exposto (se é uma

exposição contínua ou intermitente) e por último se o animal faz um exercício

físico promovido pela presença da roda dentro da gaiola, pois estes são fatores

que podem gerar respostas distintas68. As mudanças neuronais

desencadeadas por essa vivência num ambiente enriquecido envolvem

aumento da arborização dendrítica, diminuição da gliose, promove

neurogênese, aumento na transmissão sináptica no hipocampo, melhora na

aprendizagem e na memória assim como aumento nos níveis de BDNF61, 68, 70,

71.

No EE, o examinador determina a velocidade, inclinação e o tempo do

treinamento, sendo considerado assim, um exercício forçado7, 8, 72. Estudos

com este tipo de exercício a curto (3 e 7 dias) e longo prazo (15 e 30 dias)

demonstraram mudanças na expressão de receptores de glutamato do tipo

AMPA no córtex sensório-motor, estriado e cerebelo60. Os exercícios em

esteira a curto prazo e de intensidade moderada demonstrou um aumento na

plasticidade do hipocampo, assim como neurogênese com apenas 3 dias de

treinamento7. Outro sinal de plasticidade observado foi o aumento do BDNF

que quando frente a lesões, promove a regeneração axonal no SNC, após 7

dias de exercício73. Animais que realizaram exercicio em esteira por 30

minutos, 5 dias na semana, sendo, um grupo durante 1 semana, segundo

18

grupo durante 3 semanas e terceiro grupo por 4 semanas e logo após a 4ª

semana sofreram uma lesão isquêmica focal, causado pela oclusão da artéria

cerebral média, apresentaram redução no volume do infarto e do edema,

sugerindo um efeito neuroprotetor do exercício 74.

Por fim, o AC, que será utilizado no nosso estudo, onde o animal é colocado

em um circuito com obstáculos (rampas, barras paralelas, cilindros de madeira,

cordas, escadas) que estimulam a resolução de problemas, equilíbrio e

coordenação, necessitando do animal o planejamento do movimento que será

executado. Em animais submetidos a exercícios acrobáticos (10 obstáculos

diferentes: um cilindro rotativo, varas de diâmetros variados, uma corrente

suspensa, blocos de madeira, entre outros obstáculos) que consistia em passar

3 vezes por este circuito no decorrer de 1, 2, 5, 10 e 20 dias, comparado com

grupos controles ativos e inativo, foi observado no córtex motor um aumento no

número de sinapses por neurônios na fase intermediária e um aumento

transitório, na percentagem de neurônios que expressam a proteína Fos,

durante período de aquisição. Sugerindo que os níveis de proteínas Fos não

tem relação com o aumento dos números de sinapse e que a aquisição de

novas habilidades motora resulta em aprendizagem motora e pode envolver

mudanças estruturais e funcionais no córtex motor75.

Estudos com diferentes tipos de treinamento motor revelaram um aumento

no número de sinapses nas células de Purkinje, juntamente com o aumento da

densidade dos espinhos dendriticos no grupo acrobático comparado ao grupo

de exercícios na pista sem obstáculos, sugerindo sinaptogênese entre as fibras

paralelas e as células de Purkinje76, 77. Já outro estudo demonstrou que a

aprendizagem de uma nova habilidade motora por período prolongado (10 e 38

dias de treinamento), e não a mera atividade motora, está associada ao

aumento no número de sinapses e do volume dos astrócitos na camada das

células de Purkinje do lóbulo paramediano do cerebelo. Entretanto, essas

respostas se mostraram distintas frente a interrupção prolongada desse

treinamento, pois somente a sinaptogênese persistiu após a interrupção por 28

dias, com uma redução significativa do volume dos astrócitos. Estes dados

parecem sugerir que a hipertrofia astrocitária faz se necessário, no momento

19

da formação de novas sinapses frente ao aprendizado de novas habilidades

motoras e não na manutenção da sinaptogênese induzida pelo aprendizado78.

Um outro aspecto que vem sendo analisado após diferentes períodos de

treinamento acrobático é a expressão das proteínas neuronais, estruturais e

sinápticas, nas áreas motoras encefálicas8, 79. Um estudo realizado pelo nosso

grupo observou o aumento da proteína MAP2 e sinaptofisina foi no córtex

motor e estriado de animais submetidos a exercício AC, com passagem de 5

vezes no circuito, 3 vezes por semana por um período de 4 semanas8. Já

quando analisado a expressão de proteínas estruturais no decorrer do

treinamento de 1 semana, 2 semanas e 4 semanas foi notado, no córtex motor,

uma diminuição de MAP2 e aumento de neurofilamentos (NF68) a curto prazo,

e a longo prazo um aumento de MAP2. No estriado, o treinamento a curto

prazo induziu aumento de PAN, sinapsina (SYS) e sinaptofisina (SYP) na

região dorsomedial e aumento de MAP2, SYP e SYS na região dorsolateral

coincidindo com a melhora no desempenho motor, sugerindo que essa melhora

aconteceu devido ao aumento da eficiência sináptica no estriado, já que essa

região está envolvida com a fase de aquisição79.

Animais que sofreram lesão na área de representação dos membros

anteriores do córtex sensório-motor foram submetidos a treinamento acrobático

durante 28 dias consecutivos, sendo treino leve até o 4º dia, constituído por

exposição à sala de teste (1º dia), passagem por um obstáculo (2º dia), uma

passagem no circuito com auxílio (3º dia) e duas passagens no circuito com

auxílio (4º dia); a partir do 5º dia até 13º realizaram 4 sessões no circuito ao

dia e do 14º até 28º dia realizaram 2 sessões de treinamento ao dia; esses

animais apresentaram aumento da sinaptogênese na camada V do córtex

motor contralateral a lesão quando comparado ao grupo controle (animais que

realizaram exercícios repetitivos), sugerindo que a aquisição de novas

habilidades no momento pós-cirúrgico, pode aumentar a eficiência da

adaptação ou reorganização à lesão 80.

Todas essas evidências demonstram que o exercício tem um importante

papel na neuroproteção, no aumento da sinaptogênese, na eficiência sináptica,

20

na neurogênese, na recuperação pós lesão traumática do SNC 81, 82, gerando

melhorias da capacidade de aprendizagem motora, da memória e função

sensório motor de ratos submetidos a diversos protocolos de exercícios 62, 68, 69,

73, 76.

1.4. Períodos de treinamento

A literatura tem demonstrado o efeito do exercício no SNC, como uma ação

do meio externo que tem gerado neuroplasticidade. Esses estudos descrevem

protocolos de exercício que consideram diferentes períodos de treinamento:

curto, médio e longo prazo. Entender como esses diferentes períodos

influenciam na neuroplasticidade tem sido um desafio a ser estudado.

Exercícios em esteira, realizados precocemente, após a lesão isquêmica,

tem demonstrado melhora na recuperação funcional. Animais apresentaram

melhora da função motora, após a realização do exercício por 30 minutos ao

dia, durante 11 dias consecutivos. Essa melhora se deu devido ao aumento do

comprimento dendrítico e da arborização no estriado contralateral83. Esse

modelo de exercício também apresentou mudanças bifásicas de GluA1,

diminuindo na fase inicial (3 e 7 dias) e aumentou na fase final (15 e 30 dias)

no córtex motor. Já GluA2/3 apresentou diminuição com 3 dias de treinamento

no cerebelo, e aumento de AMPA com 15 e 30 dias de treinamento no

estriado60. No hipocampo houve neurogênese com 3 dias de treinamento e

aumento de BDNF após 7 dias de treinamento de EE7, 73.

Animais submetidos a exercício AC apresentaram um aumento no número

de sinapses por neurônio no córtex motor com 5, 10 e 20 dias de treinamento

(fase de consolidação) quando comparado com 1 e 2 dias de treinamento (fase

de aquisição)75. Um aumento de sinaptofisina também foi observado com 1, 3 e

5 dias de treinamento AC no córtex motor14. Já animais que realizaram

treinamento AC por 30 dias consecutivos apresentaram um aumento do volume

dos dendritos das células de Purkinje e no número de sinapses por neurônio

quando comparados com EV e animais SED84.

21

Alterações plásticas e motoras também foram observados em animais que

sofreram lesão isquêmica e foram submetidos a exercício AC por 25 dias

consecutivos, analisados em momentos diferentes do treinamento. Eles

apresentaram melhora no déficit motor a partir do 11º dia de treinamento,

melhora no teste de caminhada sobre uma faixa estreita a partir do 7º dia e

melhora no teste de escada horizontal a partir do 21º dia de treinamento.

Quanto ao número de neurônios FosB-positivas, que são marcadores de

atividade neuronal, houve um aumento no grupo AC no córtex no 14º, quando

comparado ao grupo lesado, porém não se manteve esse aumento até o 29º

dia, já no estriado não houve diferença entre os grupos. O nível da proteína

PSD95, foi utilizado como um marcador de sinaptogênese e apresentou

aumento apenas no 29º dia no córtex motor, já no estriado esse aumento

ocorreu no 14º dia. Esses resultados sugerem que o treino AC induziu melhora

na função motora na fase inicial (até 14º dia) e melhora no equilíbrio e

coordenação na fase final (14º ao 29º) concordando com o aumento de PSD95

no estriado na fase inicial e no córtex motor na fase tardia85.

Os dados relatados acima demonstram que períodos diferentes de

treinamento geram repostas plásticas distintas em áreas encefálicas também

distintas como o córtex motor, o estriado, o hipocampo, o cerebelo dentre

outras; sendo importante maior elucidação sobre esses resultados para

definição de períodos de treinamento adequados para respostas plásticas

específicas, como por exemplo, após lesões neurológicas.

1.5. Neuroanatomia funcional

As áreas descritas a seguir estão envolvidas no processamento de

informação sensorial, planejamento e execução dos comandos motores, no

processo de aprendizagem e no controle motor.

1.5.1 Córtex Motor

O córtex motor está subdividido em área motora primária e áreas pré-

22

motoras (áreas motoras secundárias ou de associação). A área motora

primária é responsável pela execução do movimento e está localizada no giro

pré-central e na região posterior do lobo frontal. Já as áreas pré-motoras são

responsáveis pela orientação interna e planejamento do movimento, resultando

em movimentos mais complexos86. Ambas as áreas (primária e secundária)

apresentam uma representação somatotópica proposta por Brodmann87.

Lorente de Nó em 194288, demonstrou que o córtex cerebral apresenta uma

organização em 6 camadas que numerou de I a VI, compostas por tipos

celulares diferentes: células granulares ou estreladas (interneurônios); células

fusiformes e células piramidais. Na camada I, II e III encontra-se as fibras de

associação (dendritos apicais de neurônios com corpos celulares nas camadas

V e VI), na IV camada estão as fibras aferentes, na V camada encontra-se as

células piramidais eferentes, também chamadas de células de Betz na área

motora, e suas fibras partem em direção ao tronco encefálico, medula espinal e

núcleos da base, e na camada VI saem as fibras que vão em direção ao

tálamo. As informações da periferia são conduzidas até o córtex cerebral por

meio de impulsos nervosos através da neurotransmissão glutamatérgica86, 89.

As vias descendentes do córtex exercem influência sobre os músculos.

Além da inervação cortical direta sobre os neurônios motores alfa através do

trato córtico-espinal, outras vias eferentes influenciam as fibras descendentes

restante, tais como: o trato córtico-rubral modula o trato rubro-espinhal; o trato

córtico-tectal modula o trato tecto-espinal e o trato córtico-reticular modula os

tratos reticulo-espinal. Essa influência pode ocorrer também pelas alças

laterais, por exemplo: o trato córtico-estriatal inerva o núcleo caudado e

putâmen; o trato córtico-pontino e córtico-olivar inervam o cerebelo. E por fim, o

córtex pode influenciar outras áreas corticais diretamente pelas vias córtico-

cortical e indiretamente pelas vias córtico-talâmica86, 90 .

Os neurônios do córtex motor codificam os parâmetros que definem os

movimentos individuais ou sequências de movimentos simples. Esses

neurônios corticais estão envolvidos na retransmissão dos comandos motores

para motoneurônios alfa que fazem a contração apropriada da musculatura;

23

codificam a quantidade da força do movimento; são selecionados para

direcionar o movimento; para orientar a extensão do movimento de acordo com

a distância do alvo e também a velocidade do movimento86, 90.

O córtex pré-motor emite axônios diretamente para o córtex motor primário

e medula espinal, e encontra-se envolvido no planejamento de tarefas mais

complexas de movimentos voluntários. Os neurônios do córtex pré-motor

sinalizam a preparação para o movimento; estão associados a aspectos

sensoriais de determinados atos motores; responde ao contexto

comportamental do movimento e estão envolvidos no processo da ação correta

e incorreta do movimento86, 90.

A área motora suplementar (SMA) está envolvida na programação

sequencial de movimentos complexos, realizando essa seleção por meio de

movimentos já armazenados na memória, responde às sequências de

movimentos e ensaio mental dessa sequência de movimentos bilaterais. As

áreas de associação localizadas no córtex pré-frontal e córtex parietal posterior

não se relacionam com atos motores individuais, mas são necessárias para

permitir que os movimentos executados estejam apropriados dentro do

contexto comportamental86, 90.

A capacidade do córtex motor em alterar a sua estrutura celular, frente aos

estímulos externos, gerando plasticidade tem sido amplamente estudada em

humanos e animais1, 91, 92. Quatro semanas de treinamento de sequência

motora em 10 indivíduos demonstrou mudanças no sistema motor após

reveladas pelos exames de ressonância magnética1. Animais submetidos a

diferentes períodos de treinamento (3, 7 e 10 dias) de tarefas de alcance

demonstraram sinaptogênese cortical e reorganização do mapa cortical na fase

tardia do aprendizado, após 7 e 10 dias de treinamento, sugerindo que essas

mudanças não contribuem para a fase inicial da aquisição de habilidade motora

e sim para a consolidação dessa habilidade que foi encontrada na fase tardia91.

Animais que sofreram lesão no córtex motor primário, apresentaram

reestruturação da conectividade sináptica devido ao uso dos membros

anteriores92.

24

1.5.2 Estriado

Os núcleos da base compreendem um conjunto de estruturas distribuídas

no telencéfalo, diencéfalo e mesencéfalo, e é composto pelo estriado (núcleo

caudado, putâmen, núcleo accumbens), o globo pálido interno (GPi) e externo

(GPe), núcleo subtalâmico (NST) e a substância negra. O núcleo caudado é

uma estrutura em forma de C, que está intimamente associada com a parede

lateral do ventrículo lateral e termina nos núcleos amigdalóides . O putâmen

está separado do núcleo caudado pelo braço anterior da cápsula interna;

devido a aparência estriada dessas pontes celulares o núcleo caudado e

putâmen são referidos coletivamente como neostriado ou apenas estriado , e o

núcleo accumbens é chamado de estriado ventral93.

Cerca de 90% das células que compõe o estriado são os neurônios com

espinhos dendriticos e projeções GABA-érgicas94. O estriado é o destinatário

da eferência do córtex cerebral e dos núcleos talâmicos. As projeções do

córtex motor primário e do somatossensorial, chegam ao putâmen, enquanto

que o córtex pré-motor, áreas motoras suplementares e pré-frontais se

projetam para o caudado. Já o globo pálido interno e a substância reticulada

são as estruturas de saída do estriado 86.

Os sinais nos núcleos da base são processados por duas vias, conhecidas

como via direta e via indireta. Elas têm como alvo o tálamo, e podem produzir

efeitos opostos. A ativação da via direta ocorre por projeções do estriado para

o GPi e desse para o tálamo, provocando a desinibição do tálamo e resultando

em excitação tálamo-cortical. Enquanto a ativação da via indireta ocorre por

meio de projeções para o GPe, núcleo subtalâmico, GPi e por fim o tálamo,

resultando em inibição dos neurônios talâmicos. As projeções dopaminérgicas

provenientes da substância negra afetam de maneira diferente as vias. A via

direta é composta por receptores dopaminérgicos D1, facilitando a transmissão,

já a via indireta é composta por receptores dopaminérgicos D2, que reduz a

transmissão. A ativação das duas vias ocorre concomitantemente permitindo

um equilíbrio na resposta motora. Essas vias formam o circuito núcleos da

25

base-tálamo-cortical (NB-tálamo-cortical). A via direta facilita os programas

motores no córtex cerebral para a tarefa atual, enquanto a via indireta inibe

programas motores concorrentes à execução da mesma tarefa39, 89.

O estriado está envolvido no processo de aprendizagem, nas fases iniciais

e finais94. O estriado dorsomedial ou associativo (DMS – homólogo ao caudado

em primatas) que recebe aferências da área motora suplementar e córtex pré-

frontal está envolvido nas fases iniciais. Já o dorsolateral ou sensóriomotor

(DLS – homólogo ao putâmen em primatas), recebe aferências do córtex

sensório-motor e é principalmente ativado nas aquisições de comportamento

habituais e automáticas95.

Vários estudos tem demonstrado que os receptores mGluRs possuem uma

variedade de ações fisiológicas nos núcleos da base e são distribuídos de

maneira heterogênea46, 108, 96, 97. O grupo I de receptores são expressos na

sub-populações dos neurônios do estriado e tem apresentado funções como

indução de LTP e LTD, despolarização da membrana, e indução do potencial

pós-sináptico, entre outros49, 98. O grupo II também é expresso no núcleo

caudado e putâmen96, e estão envolvidos no processo de LTD97. A potenciação

de longo prazo (LTP) no estriado é predominantemente observada nas

sinapses corticoestriatal na região dorsomedial e rostral, e parece facilitar a

aprendizagem de habilidade e ação dirigidas ao alvo. Já a depressão de longo

prazo (LTD) tem maior prevalência na região dorsolateral e ventral e estão

envolvidas no aprendizado de ações habituais94, 99, 100.

1.5.3 Cerebelo

O cerebelo localiza-se na região posterior do cérebro e é responsável pelo

controle motor e manutenção da postura, através das vias descendentes

tornando o movimento mais preciso e adaptável quando necessário. Através

dos receptores vestibulares e proprioceptores o cerebelo realiza ajustes

posturais, modulando os comandos para os neurônios motores permitindo a

compensação de mudanças na posição do corpo ou na força muscular a fim de

manter o equilíbrio86, 101. O cerebelo também está envolvido na coordenação

26

dos movimentos voluntários, pois coordena o instante e a força necessária para

que grupos musculares diferentes consigam produzir movimentos fluidos dos

membros. Além disso, o cerebelo participa do processo de aprendizagem

motora, já que apresenta um papel na adaptação dos programas motores para

o ajuste fino, permitindo assim movimentos precisos86, 90.

O cerebelo é composto por duas estruturas principais: o córtex cerebelar e

os núcleos profundos. Duas fissuras dividem o córtex cerebelar em três

subdivisões: lobo floculonodular, lobo posterior e lobo anterior numa vista

sagital. Numa vista posterior ele é dividido em três zonas: o vermis, a zona

intermediária e os hemisférios laterais. As eferências cerebelares partem dos

três núcleos cerebelares profundos. O núcleo fastigial recebe informações

aferentes vestibulares, somatossensorial, auditiva e visual, e também do

vermis; e projeta essas informações para os núcleos vestibulares e formação

reticular. Os núcleos intepostos recebem informações da zona intermediária e

aferência espinhal, somatossensorial proximal, auditiva e visual; projetam para

o núcleo rubro contralateral. O núcleo denteado recebe informação do

hemisfério cerebelar lateral e aferências do córtex cerebral, projetando para o

núcleo rubro contralateral e ventrolateral, e núcleo talâmico. Os núcleos

vestibulares recebe informação do lobo floculonodular e do labirinto vestibular,

e projetam para vários núcleos motores e medula espinhal.

Do ponto de vista funcional o cerebelo se divide em: vestibulocerebelo que

é envolvido com os reflexos vestibulares e na manutenção da postura;

espinocerebelo, o qual participa da integração das entradas sensoriais com os

comandos motores para gerar coordenação motora; e o cerebrocerebelo que é

envolvido no planejamento e tempo dos movimentos, além das funções

cognitivas do cerebelo. O córtex cerebelar é dividido em três camadas: a

camada granular composta pelas células granulares, a camada medial formada

pelas células de Purkinje e a camada molecular composta por células em cesto

e estreladas, por axônios das células granulares e os dendritos das células de

Purkinje101, 102.

As células granulares representam a maioria dos neurônios cerebelares e

27

realizam sinapses excitatórias nas células de Purkinje por meio dos seus

axônios que ascendem para a camada molecular formando as fibras paralelas.

Essa camada também é composta por células inibitórios de Golgi tipo II e

apresentam ramos dendriticos na camada do córtex cerebelar. A camada das

células de Purkinje formam ramificações com seus dendritos e são orientadas

em paralelo, constituindo a efêrencia do córtex cerebelar. A camada molecular

é compotas pelas fibras paralelas das células granulares, pelos dendritos das

células de Purkinje, os dendritos das células de Golgi, pelas células em cesto e

estreladas, promovendo assim uma área sináptica extensa101. Essa disposição

permite um padrão de conectividade simples e esteriotipado, através das

aferências excitatórias compostas pelas fibras musgosas e trepadeiras.

As fibras musgosas originam nos núcleos pontinos, na medula espinhal, na

formação reticular do tronco encefálico e nos núcleos vestibulares de onde

saem projeções excitatórias para os núcleos do cerebelo e para as células

granulares, essas enviam axônios para a superfície cortical que se bifurcam na

camada molecular e passam a ser chamadas de fibras paralelas fazendo

sinapses excitatórias com várias células de Purkinje devido à disposição das

mesmas. As fibras trepadeiras originam-se no núcleo olivar inferior e na

formação reticular medial, fazendo projeções sômato-sensoriais, visuais e do

córtex cerebral para os núcleos cerebelares e para as células de Purkinje,

tendo a característica de ser uma sinapse extremamente potente nas células

de Purkinje86, 101.

Em resumo, essas aferências que chegam ao córtex cerebelar saem pelos

axônios das células de Purkinje e são direcionadas para os núcleos

cerebelares profundos e por fim para o tálamo formando assim o circuito

cerebelo-tálamo-cortical (Cb-tálamo-cortical), que fornece ao córtex motor

informações sobre os movimentos em andamento, sobre a velocidade e a força

desse movimento86.

Vários estudos tem demonstrado a distribuição diferencial das subunidades

mGluR1 e mGluR2/3 no cerebelo27, 103. Os receptores metabotrópicos de

glutamato do grupo I estão localizados no cerebelo nas células de Purkinje27. A

28

imunorreatividade da subunidade mGluR2/3 no cerebelo foi localizada,

preferencialmente, nas células de Golgi, terminais do axônio da célula de Golgi,

nos glomérulos cerebelar e nos terminais axonais das fibras musgosas. Na

camada molecular a localização nos dendritos se deu na célula pós-sináptica,

sugerindo que o glutamato liberado das fibras paralelas e musgosas, podem

agir sobre as células de Golgi e da glia103.

29

2. JUSTIFICATIVA O envolvimento dos receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) em

funções cognitivas e memória tem sido amplamente estudado nas mais

diversas situações, envolvendo até sua participação na neuroproteção após

lesão cerebral. Entretanto, é pouco conhecido a participação dos receptores

metabotrópicos de glutamato em áreas encefálicas relacionadas com

aprendizado, coordenação e execução motora frente a diferentes períodos de

exercícios físicos.

30

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Avaliar o desempenho motor e a expressão de receptores metabotrópicos

de glutamato no encéfalo de ratos, frente a diferentes períodos de treinamento

de exercício acrobático.

3.2. Objetivos Específicos

Avaliar a expressão das subunidades mGluR1 e mGluR2/3 dos receptores

metabotrópicos de glutamato no córtex motor, estriado e cerebelo de ratos

adultos jovens submetidos a diferentes períodos de treinamento (uma, duas,

quatro e oito semanas) de exercícios acrobáticos.

Analisar o desempenho necessário para a execução das tarefas no decorrer

do treinamento de exercício acrobático, em função dos períodos de

treinamento.

31

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Animais

Este estudo utilizou 55 ratos machos, adultos jovens da linhagem Wistar

provenientes do Biotério Central do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, e

mantidos em uma sala do Biotério da Universidade Cidade de São Paulo com

ciclo invertido claro/escuro artificialmente controlado de 12/12 h, com livre

acesso a alimentação e água e temperatura constante de 23ºC. Previamente

ao início do treinamento, os animais foram adaptados ao ciclo invertido por um

período de 15 dias25. Este estudo foi conduzido de acordo com os Princípios

Éticos de Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pela Comissão Ética em

Experimentação Animal (CEEA) do ICB/USP em 21/05/2010, protocolo

registrado sob nº 152 nas folhas 95 do livro 2 para uso de animais de

experimentação.

4.2. Desenho experimental

Neste estudo, os animais foram separados aleatoriamente em dois grupos:

exercício acrobático (AC, n=44) e sedentário (SED, n=11). Os animais do grupo

acrobático foram submetidos a um período de reconhecimento da tarefa motora

passando 2 vezes pelo circuito em 2 dias da semana e, em seguida subdividido

em 4 subgrupos caracterizados por diferentes períodos de treinamento: uma

semana (AC1), duas semanas (AC2), quatro semanas (AC4) e oito semanas

(AC8). Os animais sedentários foram mantidos no mesmo ambiente que os

treinados, e as caixas de ratos continham animais dos diferentes grupos.

Cada um dos grupos foi composto por 11 animais, sendo 4 animais

utilizados para a técnica de imuno-histoquímica e 7 animais utilizados para a

técnica de “immunoblotting”. O treinamento acrobático dos animais dos quatro

grupos experimentais (AC1, AC2, AC4 e AC8) iniciou no mesmo dia e finalizou

após os respectivos períodos de treinamento (Figura 1).

32

Figura 1. Esquema ilustrando as etapas do protocolo experimental. A linha

grossa identifica o período de treinamento acrobático.

4.3. Protocolo de Exercício Acrobático

Os animais foram treinados no seu período ativo67 e antes do treinamento

propriamente dito, os ratos foram submetidos a um período de adaptação as

tarefas motoras por dois dias consecutivos, passando duas vezes pelo circuito.

O treinamento acrobático consistiu em atravessar 5 vezes um circuito

composto por gangorra, barreira, ponte com duas cordas paralelas finas, trave

de madeira roliça, cabo de madeira e ponte de uma única corda (Figura 2)

numa frequência de 3 vezes por semana, em dias alternados, até totalizar o

período de cada um dos grupos acrobáticos8, 104. Quando necessário foram

dados estímulos manuais no trem posterior dos animais para incentivar a

finalização da tarefa. Ao final de cada passagem foram registrados o tempo

gasto para realização da tarefa, o qual permitiu a avaliação do desempenho

motor ao longo dos períodos de treinamento75, 105. Os dados de desempenho

motor refletem a média das 5 passagens nos 3 dias de treinamento semanal.

Ao término da 5ª passagem de cada animal pelo circuito, todo o circuito foi

limpo com etanol 5%.

33

Figura 2. Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito de

treinamento de exercícios acrobáticos Fonte: Garcia e colaboradores (2012)

Foram utilizados dois protocolos para análise das subunidades mGluR1 e

mGluR2/3: protocolo de imuno-histoquímica e o protocolo de “immunoblotting”.

A técnica de imuno-histoquímica destina-se a uma análise mais específica dos

tipos celulares e de regiões encefálicas, podendo descriminar as camadas

celulares do córtex motor e cerebelo, como as porções mediais e laterais do

estriado. Já na técnica de “immunoblotting” é feito a quantificação das

proteínas de uma região como um todo. Essas duas técnicas são usadas de

maneira complementar.

4.4. Protocolo de Imuno-histoquímica

Foram processados 7 animais nessa técnica, foram anestesiados com

quetamina (10mg/kg) e xilazina (1mg/kg) por via intramuscular e submetidos à

perfusão transcardíaca, com solução salina 0,9%, seguida de solução fixadora

constituída de paraformaldeído 2% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH

7,4). Após a perfusão, os encéfalos foram coletados e armazenados em

paraformaldeído 2%, durante 4-5 horas. Após este período, o material foi

transferido para uma solução crioprotetora de sacarose a 30% em PB. Após

24-36 horas, foi realizado a microtomia nos encéfalos em um micrótomo

deslizante de congelamento (Leica SM 2000 R) obtendo cortes 30 µm de

34

espessura.

Os cortes histológicos foram armazenados em solução crioprotetora numa

placa de cultivo, e mantidos em freezer a -20ºC até o momento do

procedimento de imuno-histoquímica. Os cortes contendo as seguintes áreas:

córtex motor, estriado, e cerebelo foram processados pela técnica de imuno-

histoquímica com anticorpos específicos para detecção de mGluR1 e

mGluR2/3 (anticorpos policlonais feito em coelho - Chemicon , Temecula, CA,

EUA).

O processamento da técnica de imuno-histoquímica constou das seguintes

etapas: os cortes selecionados foram lavados em tampão fosfato (PB 0,1M) por

três vezes de 10 minutos, e posteriormente incubados com anticorpos

primários específicos para mGluR1 (1:500) e mGluR2/3 (1:500) diluídos em PB

com 0,3% de Triton X-100 por um período de 14 a 18 horas à temperatura

ambiente (24ºC).

Os cortes foram então novamente lavados em PB0,1M à temperatura

ambiente e incubados por uma hora e meia com anticorpo secundário

biotinilado (diluído a 1:200) contra as imunoglobulinas do animal no qual foi

feito o anticorpo primário (anti-coelho feito em cabra – Vector, Burlingame, CA,

USA). Após nova série de lavagens à temperatura ambiente, os cortes foram

incubados por uma hora numa solução de Triton-X-100 0,3 % em tampão

fosfato 0,1M com 0,4 M de NaCl, contendo o complexo avidina-biotina-

peroxidase (ABC ELITE kit, Vector Labs.). Após nova série de lavagens, os

cortes foram imersos num meio contendo 3-3’diaminobenzidina (DAB- Sigma-

Aldrich) 0,05% em tampão fosfato 0,1M por cerca de 5 minutos, sendo

acrescentados a seguir 3 ml de solução de H2O2 a 0,3% em água destilada,

mantendo-se os cortes neste banho até que a reação fosse evidenciada.

Atingida a imunorreatividade desejada com o desenvolvimento de coloração

marrom clara, os cortes foram removidos da solução com DAB e imersas em

tampão PB 0,1M. Depois de nova série de lavagens em tampão fosfato 0,1M

com o objetivo de remoção do excesso de reagente, os cortes foram colocados

sobre lâminas de vidro gelatinizadas e colocadas em placa quente para secar,

35

e em seguida foram hidratadas em água destilada por 1 minuto, banhadas em

solução de tetróxido de ósmio 0,1% por 15 – 30 segundos, desidratadas por

uma série de álcoois em concentrações crescentes, clareadas com Hemo-De

(Fisher) e cobertas com lamínulas, tendo como meio de montagem o Permount

(Sigma). A imunorreatividade foi analisada ao microscópio de luz (Nikon E800)

acoplado a um sistema computadorizado de análise de imagem e as

quantificações foram realizadas com o programa Image (NIH).

A imunomarcação para mGluR1 e mGluR2/3 foi realizada em 4 animais de

cada grupo, sendo analisado 5 cortes dos quais foram capturados 8 campos

tanto do córtex motor como do cerebelo, e 12 campos do estriado (Figura 3). A

metade desses campos foram obtidos do hemisfério direito e a outra metade do

hemisfério esquerdo, mas a análise foi feita em conjunto. As regiões de

interesse foram identificadas baseado no atlas Stereotaxic Coordinates106.

Para o córtex motor foi analisado entre 2.52-1.56 da área de bregma (Figura 3).

Para o estriado foi analisado entre 1.80-0.36 da área de bregma, e para o

cerebelo analisamos o córtex cerebelar (lóbulo paramediano) entre 14.08-12.30

da área de bregma (Figura 3).

Figura 3. Esquema ilustrando as estruturas encefálicas e respectivas áreas

analisadas. Fonte: Adaptado de Paxinos e Watson (2005)

As áreas escolhidas participam do processamento da função motora. No

córtex foram selecionadas as áreas motoras primária (M1) e secundária (M2),

36

que estão envolvidas com a execução e o planejamento motor,

respectivamente. Nesta estrutura foram analisadas a camada V imediações,

pois contém as células eferentes do córtex. No estriado foram analisados a

região dorsomedial, que recebe aferência da MAS e córtex pré-frontal, e

dorsolateral, recebe aferência do córtex sensório-motor, em toda extensão

rostro-caudal. Já no cerebelo foi selecionada a região paramediana, e

analisado as camadas molecular e de células de Purkinje do córtex cerebelar.

A densidade óptica relativa foi obtida utilizando a rotina “integrated density”

do programa Image J (NIH/USA) da área marcada, e o resultado expresso em

forma de média. Já densidade média das células imunorreativas de cada

imagem foi obtida da rotina “Threshold”, a qual permite o tingimento das células

imunorreativas e posteriormente contadas pelo programa Image J.

4.5. Protocolo de “Immunoblotting”

Ao término de cada período de treinamento os animais utilizados para essa

técnica foram guilhotinados e rapidamente removido o córtex motor, o estriado

e o cerebelo, e em seguida homogenizado a 4ºC em tampão de extração (Tris

pH 7,4 100 mM; EDTA 10 mM; PMSF 2 mM; aprotinina 0,01 mg/ml) utilizando o

homogenizador do tipo Turratec modelo MA-102/mini (Marconi; São Paulo,

Brasil). Os homogenatos foram centrifugados a 12.000 rpm por 20 minutos a

4ºC em uma centrífuga modelo CT14000 DR (Cientec, São Paulo, Brasil). O

conteúdo protéico do material isolado dos diferentes grupos foi dosado pelo

método de Bradford (Amresco, U.S.A) (Bradford, 1976). As amostras foram

diluídas em um mesmo volume de tampão Tris/HCl 125 mM, pH 6,8, contendo

2,5% (p/v) de SDS, 2,5% de 2-mercaptoetanol (2-ME), 4mM de EDTA e 0,05%

de azul de bromofenol, e as amostras foram posteriormente fervidas em banho-

maria por 5 min. Amostras contendo 75µg de proteína do córtex motor, 75µg de

proteína do estriado e 100µg de proteína do cerebelo foram aplicadas em um

gel de poliacrilamida e submetido a eletroforese com corrente constante de 25

mA. A quantidade diferente de amostras foi adotada após a realização da curva

de mGluR1 e mGluR2/3 realizadas nas estruturas estudadas, onde observou

37

melhor marcação com 75 µg para estriado e córtex e 100 µg para cerebelo.

Após a separação eletroforética, as proteínas foram transferidas para uma

membrana de nitrocelulose (Millipore, 0,2um de diâmetro) de acordo com a

técnica descrita por Towbin et al. 107 em 1979. Os antígenos presentes na

membrana de nitrocelulose foram submetidos à caracterização

imunoenzimática. Após bloqueio com leite desnatado (Molico, Nestlé) 5% em

tampão Tris-Salina (Tris 10mM e NaCl 0,15M, pH 7,5), por 2 horas, as

membranas foram incubadas com os mesmos anticorpos utilizados na imuno-

histoquímica, porém em concentrações mais baixas (1:1000). Em seguida, as

membranas foram lavadas com solução basal e incubadas por 2 horas com um

anticorpo secundário marcado com peroxidase (Amersham Biosciences),

diluído a 1:5000 em solução bloqueadora, respectivamente. O excesso de

conjugado foi removido com mais um ciclo de lavagens e os antígenos foram

revelados, com solução de Kit ECL (Amersham Biosciences) de

quimioluminescência, no aparelho C-Digit e analisadas quanto à densidade das

bandas marcadas, utilizando o programa Image J, sendo realizada a razão

entre a densidade óptica das subunidades e da α-tubulina, e estes dados foram

então submetidos às análises estatísticas com o programa Graph Pad Prisma

5.

4.6. Análise Estatística

Os dados do estudo apresentaram uma distribuição normal segundo o teste

de Kolmogorov-Smirnov. As análises dos dados foram conduzidas a partir do

teste one-way. Quando a análise de variância apresentou diferença

estatisticamente significante os dados foram submetidos ao pós-teste de

Tukey. Para todos os testes, o nível de significância assumido foi de p≤0,05

(Statistica 12, StatSoft). Os resultados estão representados nos gráficos e

descritos no texto na forma de média±erro padrão da média (M+EPM) (Graph

Pad Prism 5).

38

5. RESULTADOS

5.1. Desempenho motor

Os animais dos quatro grupos experimentais (AC1, AC2, AC4 e AC8)

apresentaram tempos semelhantes para a realização da tarefa ao final da

primeira semana de treinamento (104,38+6,78, 115,54+9,66, 108,67+5,81,

104,51+5,78 respectivamente). Os grupos AC4 e AC8 revelaram, a partir da

terceira semana de treinamento fuma redução significativa do tempo

necessário para executar todo o circuito comparado ao da primeira semana

(83,81+5,14 e 71,88+4,51, respectivamente, p<0,01), persistindo até as últimas

semanas de treinamento (AC4, 85,50+4,27 e AC8, 66,53+7,99) (Figura 2). Vale

ressaltar a inexistência de diferenças entre os tempos da terceira, quarta,

quinta, sexta, sétima e oitava semana de treinamento.

Figura 4: Desempenho motor dos ratos para a realização das tarefas presentes no circuito no treinamento acrobático avaliado pela média do tempo gasto. *p<0,05 ;** p<0,01.

50

60

70

80

90

100

110

120

130

Tem

po (s

egun

dos)

AC1

AC2

AC4

AC8 *

* *

** ** ** ** **

39

5.2. Expressão dos receptores metabotrópicos de glutamato

Nossos resultados demonstraram que todas as estruturas estudadas,

córtex motor, estriado e cerebelo, apresentaram células imunorreativas a

subunidade mGluR1 e as subunidades mGluR2/3, já que o último anticorpo

reconhece regiões homólogas das subunidades mGluR2 e mGluR3. Além

disso, em alguns momentos encontramos dados discordantes entre as técnicas

utilizadas, visto que analisam de maneira diferenciada a expressão dessas

proteínas.

Os dados estão apresentados na Tabela 1.

5.2.1 Córtex Motor

Os receptores mGluR1 e mGluR2/3 foram expressos no corpo celular e

prolongamentos dendríticos nas camadas II, III e V do córtex motor. Os dados

imuno-histoquímicos deste trabalho referem-se a camada V onde se encontram

as células eferentes do córtex cerebral (Figuras 5 e 6).

O treinamento acrobático induziu mudanças na expressão da

subunidade mGluR1 no córtex motor ao longo dos períodos de treinamento

comparado ao sedentário tanto na análise da imuno-histoquímica, quanto na

análise de “Immunoblotting” (Figura 5). A densidade média de células mGluR1-

positivas aumentou significativamente nos grupos AC4 (ca. 255%; p<0,001) e

AC8 (ca. 103%; p<0,006) quando comparados ao SED [F (4,15) =35,245;

p<0,001].

Na densidade óptica relativa foi observado uma resposta bifásica do

mGluR1 ao longo do treinamento acrobático, pois houve uma diminuição no

grupo AC1 (ca. 55%; p<0,003) e um aumento nos grupos AC4 (ca. 62%;

p<0,001) e AC8 (ca. 96%; p<0,001) quando comparado ao SED [F (4,15)

=57,647; p<0,001]. Nos dados de “Immunoblotting” houve um aumento

estatisticamente significante de mGluR1 apenas no grupo AC8 (ca. 67%;

p<0,001) quando comparado com o grupo SED [F (4,28) =13,385; p<0,001]

(Figura 5).

40

Mudanças na expressão das subunidades mGluR2/3 no córtex motor, na

camada V, também foram induzidas pelo treinamento acrobático (Figura 6). O

número de células mGluR2/3-positivas reduziu nos grupos AC2 (ca. 53%;

p<0,001) e AC4 (ca. 53%; p<0,001) quando comparados ao SED [F (4,15)

=28,160; p<0,001] retornando ao nível do sedentário após 8 semanas de

treinamento (Figura 6).

Os dados de densidade óptica relativa revelaram uma resposta bifásica

da expressão de mGluR2/3 no córtex motor frente aos diferentes tempos de

treinamento acrobático, pois ocorreu uma diminuição nos grupos AC2 (ca.

56%; p<0,001) e AC4 (ca. 37%; p<0,001), com aumento na expressão no

grupo AC8 (ca. 54%; p<0,001) quando comparados ao SED [F (4,15) =88,276;

p<0,001]. Nos dados de “Immunoblotting” a expressão das subunidades

mGluR2/3 não apresentaram diferenças estatisticamente significante entre os

grupos quando comparados ao SED (Figura 6).

41

SED AC1 AC2 AC4 AC8 SED AC1 AC2 AC4 AC8Córtex Motor mGluR1 1 (±0,08) 1,04 (±0,06) 0,93 (±0,04) 1,01 (±0,08) 1,67 (±0,13)* mGluR1 1 (±0,07) 0,45 (±0,05)* 0,69 (±0,05) 1,62 (±0,03)* 1,96 (±0,15)*

mGluR2/3 1 (±0,12) 1,18 (±0,08) 1,17 (±0,08) 1,07 (±0,07) 1,08 (±0,08) mGluR2/3 1 (±0,04) 0,97 (±0,11) 0,44 (±0,11)* 0,63 (±0,12)* 1,54 (±0,03)* Med Lat Med Lat Med Lat Med Lat Med Lat

Estriado mGluR1 1 (±0,24) 1,71 (±0,34) 2,64 (±0,21)* 1,92 (±0,31) 1,41 (±0,26) mGluR1 1 (±0,16) 1 (±0,17) 0,75 (±0,04) 1,55 (±0,11) 1,61 (±0,21) 1,84 (±0,31)* 2,30 (±0,28)* 1,45 (±0,14) 3,18 (±0,06)* 2,13 (±0,07)*mGluR2/3 1 (±0,17) 1,08 (±0,17) 1,10 (±0,10) 1,08 (±0,09) 0,82 (±0,06) mGluR2/3 1 (±0,05) 1 (±0,02) 1,86 (±0,15)* 1,85 (±0,05)* 0,79 (±0,03) 0,72 (±0,05) 0,36 (±0,14) 0,66 (±0,11)* 2,20 (±0,29)* 1,52 (±0,07)*

Cerebelo mGluR1 1 (±0,08) 1,51 (±0,08)* 1,37 (±0,19) 0,43 (±0,10)* 1,07 (±0,21) mGluR1 1 (±0,04) 1,30 (±0,02) 1,04 (±0,13) 1,53 (±0,25) 1,17 (±0,06)mGluR2/3 1 (±0,09) 1,21 (±0,02) 1,17 (±0,02) 1,02 (±0,13) 0,88 (±0,13) mGluR2/3 1 (±0,02) 1,25 (±0,10) 1,07 (±0,15) 0,98 (±0,11) 1,30 (±0,12)

SED: sedentário; AC1: grupo acrobático de 1 semana; AC2: grupo acrobático de 2 semanas; AC4: grupo acrobático de 4 semanas; AC8: grupo acrobático de 8 semanas; mGluR1: receptor metabotrópico de glutamao R1; mGluR2/3: receptor metabotrópico de glutamao 2/3 (*p<0,05 vs grupo sedentário); Média (±SEM)

Tabela 1. Níveis de expressão das subunidades do mGluRs nos diferentes tempos de treinamento Região

EncefálicaProteína "Immunoblotting" Proteína Imuno-histoquímica

42

Figura 5. Córtex Motor. Efeitos dos diferentes períodos de exercício acrobático sobre a expressão da subunidade do receptor mGluR1. A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato ilustrando a expressão de mGluR1. B: Análise semi-quantitativa da densidade média de mGluR1 pela técnica de imuno-histoquímica, análise semi-quantitativa da densidade óptica de mGluR1 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de mGluR1 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC1: grupo acrobático treinado por uma semana; AC2: grupo acrobático treinado por duas semanas; AC4: grupo acrobático treinado por quatro semanas; AC8: grupo acrobático treinado por oito semanas. *p<0,05.

43

Figura 6. Córtex Motor. Efeitos dos diferentes períodos de exercício acrobático sobre a expressão da subunidade do receptor mGluR2/3. A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato ilustrando a expressão de mGluR2/3. B: Análise semi-quantitativa da densidade média de mGluR2/3 pela técnica de imuno-histoquímica, Análise semi-quantitativa da densidade óptica de mGluR2/3 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de mGluR2/3 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC1: grupo acrobático treinado por uma semana; AC2: grupo acrobático treinado por duas semanas; AC4: grupo acrobático treinado por quatro semanas; AC8: grupo acrobático treinado por oito semanas. *p<0,05.

44

5.2.2 Estriado

Corpos celulares e prolongamentos neuronais em toda extensão do estriado

apresentaram imunorreatividade contra os anticorpos das subunidades

mGluR1 e mGluR2/3 (Figuras 7 e 8).

Na região dorsomedial do estriado, as mudanças da subunidade mGluR1

induzidas pelo treinamento acrobático aconteceram nos grupos AC4 e AC8,

sendo observado um aumento na expressão tanto na densidade das células

mGluR1-positivas (AC4 - ca. 131%; p=0,011386, AC8 - ca. 109%; p<0,038) [F

(4,15) =7,3235; p<0,002] quanto na densidade óptica (AC4 - ca. 130%;

p<0,001, AC8 - ca. 318%; p<0,001) quando comparado com o grupo SED [F

(4,15) =32,561; p=0,001) ].

Na região dorsolateral, o aumento de células mGluR1-positivas foi

observado nos grupos AC1 (ca. 147%; p<0,001) e AC8 (ca. 122%; p<0,004) [F

(4,15) =16,522; p<0,001]; e nos grupos AC2 (ca. 84%; p<0,031) e AC8 (ca.

113%; p<0,004) na densidade óptica quando comparado ao SED [F (4,15)

=5,6675; p<0,006]. O aumento da expressão de mGluR1 revelado pelo

“Immunoblotting” aconteceu com duas semanas de treinamento (AC2 - ca.

164%; p<0,002) quando comparado ao SED [F (4,29) =4,9871; p<0,004]

(Figura 7). Os outros tempos de treinamento não induziram mudanças

significativas em relação ao SED (Figura 7).

As subunidades mGluR2/3 apresentaram aumento na expressão na região

dorsomedial nos grupos AC1 e AC8 tanto na densidade média de células

mGluR2/3-positivas (AC1 - ca. 282%; p<0,001, AC8 - ca. 191%; p<0,001) [F

(4,15) =36,434; p<0,001]; quanto na densidade óptica (AC1- ca. 86%; p<0,014;

AC8 - ca. 120%; p<0,001) comparado ao grupo SED [F (4,15) =23,004;

p<0,001].

A região dorsolateral apresentou uma resposta bifásica de expressão de

mGluR2/3 frente aos diferentes períodos de treinamento acrobático. O aumento

da expressão de mGluR2/3 se repetiu nos grupos AC1 e AC8 na densidade de

células mGluR2/3-positivas (AC1 - ca. 366%; p<0,001, AC8 - ca. 157%;

p<0,003) [F (4,15) =44,752; p<0,001], e na densidade óptica (AC1 - ca. 85%;

45

p<0,001, AC8 - ca. 520%; p<0,001), porém houve diminuição na densidade

óptica no grupo AC4 (ca. 34%; p<0,020) quando comparado ao grupo SED [F

(4,15) =59,294; p<0,001]. Os dados da “Immunoblotting” não revelaram

mudanças estatisticamente significante na expressão de mGluR2/3 ao longo

dos diferentes períodos de treinamento acrobático quando comparado os

grupos com o SED (Figura 8).

46

Figura 7. Estriado. Efeitos dos diferentes períodos de exercício acrobático sobre a expressão da subunidade do receptor mGluR1. A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato ilustrando a expressão de mGluR1. B: Análise semi-quantitativa da densidade média de mGluR1 pela técnica de imuno-histoquímica, análise semi-quantitativa da densidade óptica de mGluR1 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de mGluR1 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC1: grupo acrobático treinado por uma semana; AC2: grupo acrobático treinado por duas semanas; AC4: grupo acrobático treinado por quatro semanas; AC8: grupo acrobático treinado por oito semanas. *p<0,05.

47

Figura 8. Estriado. Efeitos dos diferentes períodos de exercício acrobático sobre a expressão da subunidade do receptor mGluR2/3. A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato ilustrando a expressão de mGluR2/3. B: Análise semi-quantitativa da densidade média de mGluR2/3 pela técnica de imuno-histoquímica, análise semi-quantitativa da densidade óptica de mGluR2/3 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de mGluR2/3 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC1: grupo acrobático treinado por uma semana; AC2: grupo acrobático treinado por duas semanas; AC4: grupo acrobático treinado por quatro semanas; AC8: grupo acrobático treinado por oito semanas. *p<0,05.

48

5.2.3 Cerebelo

As subunidades mGluR1 e mGluR2/3 foram expressas nos corpos celulares

das células de Purkinje e nos dendritos na camada molecular do cerebelo

(Figura 9, 10).

A densidade média de células mGluR1-positiva apresentou um aumento no

grupo AC2 (ca. 18%) comparado ao SED [F (4,15) =8,0617; P=0,001] (Figura

9). Quanto a densidade óptica relativa não observamos mudanças significativas

na expressão de mGluR1 frente aos diferentes períodos de treinamento

acrobático.

Os dados de “Immunoblotting” demonstraram uma resposta bifásica da

expressão de mGluR1, sendo encontrado um aumento estatisticamente

significante com uma semana de treinamento (AC1 - ca. 50%; p= 0,03) e uma

diminuição após 4 semanas de treinamento (AC4 - ca. 51%; p= 0,04)

comparada ao SED [F (4,28) =11,565; p=0,001].

A expressão das subunidades mGluR2/3 tanto no córtex cerebelar como no

cerebelo como todo não apresentou diferenças estaticamente significante ao

longo dos períodos de treinamento acrobático, tanto nos dados da imuno-

histoquímica quanto no “Immunoblotting” (Figura 10).

49

Figura 9. Cerebelo. Efeitos dos diferentes períodos de exercício acrobático sobre a expressão da subunidade do receptor mGluR1. A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato ilustrando a expressão de mGluR1. B: Análise semi-quantitativa da densidade média de mGluR1 pela técnica de imuno-histoquímica, análise semi-quantitativa da densidade óptica de mGluR1 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de mGluR1 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC1: grupo acrobático treinado por uma semana; AC2: grupo acrobático treinado por duas semanas; AC4: grupo acrobático treinado por quatro semanas; AC8: grupo acrobático treinado por oito semanas. *p<0,05.

50

Figura 10. Cerebelo. Efeitos dos diferentes períodos de exercício acrobático sobre a expressão da subunidade do receptor mGluR2/3. A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato ilustrando a expressão de mGluR2/3. B: Análise semi-quantitativa da densidade média de mGluR2/3 pela técnica de imuno-histoquímica, análise semi-quantitativa da densidade óptica de mGluR2/3 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de mGluR2/3 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC1: grupo acrobático treinado por uma semana; AC2: grupo acrobático treinado por duas semanas; AC4: grupo acrobático treinado por quatro semanas; AC8: grupo acrobático treinado por oito semanas. *p<0,05.

51

6. DISCUSSÃO 6.1. Desempenho Motor

O exercício acrobático requer a aprendizagem de novas habilidades

motoras, pois o animal precisa realizar movimentos coordenados para superar

os obstáculos. Uma das maneiras de observar a aprendizagem motora é

através da melhora no desempenho do comportamento aprendido. O

aprendizado motor consiste de duas fases: a fase de aquisição (inicial) onde

ocorre uma melhora rápida do desempenho após poucos treinos; e a fase de

consolidação, caracterizada por uma estabilização ou lentificação no ganho do

desempenho motor108, 109.

Nossos resultados demonstram que houve redução no tempo necessário

para a passagem pelo circuito a partir da terceira semana de treinamento

(grupos AC4 e AC8) e persistiu até a oitava semana (AC8) quando comparados

à primeira semana. A redução de tempo para a realização dessas tarefas foi

maior na terceira semana, seguida de uma queda constante mas de menor

monta até a oitava semana de treinamento. Outros estudos também

demonstraram essa melhora rápida do desempenho motor nas fases iniciais:

com três dias, quatro dias, cinco dias, duas semanas de treinamento1, 75, 79, 110,

111, sendo possível em alguns estudos observar a permanência dessa

melhora8, 79. A diminuição do tempo gasto para percorrer o circuito observado

no nosso estudo e nos citados acima pode ser resultado de mudanças

comportamentais, tais como diminuição de hesitações e dos estímulos

manuais, sendo atribuído a aprendizagem. E além disso, existe uma hipótese

que a aprendizagem rápida envolve processos de planejamento, enquanto a

aprendizagem lenta requer mais tempo, e por isso necessita de alterações

estruturais por meio do fortalecimento tempo-dependente das ligações entre os

neurônios112.

6.2. Efeitos dos Diferentes Períodos de Treinamento em Regiões Encefálicas

Os dados obtidos demonstraram que diferentes períodos de treinamento

52

acrobático induzem mudanças distintas tanto na expressão das subunidades

dos mGluRs quanto nas áreas estudadas. A expressão da subunidade mGluR1

mostrou maior alteração frente aos longos períodos (AC4 e AC8) no córtex

motor e estriado dorsomedial, e no estriado dorsolateral e cerebelo frente a

curtos períodos de treinamento (nas duas primeiras semanas). Já as

subunidades mGluR2/3 revelaram mudanças no córtex motor e estriado, mas

não cerebelar. No córtex motor observamos mudanças bifásicas na camada V

(diminuição na segunda e quarta semana e aumento na oitava semana) e no

estriado dorsomedial e dorsolateral as mudanças ocorreram na primeira e

oitava semanas de treinamento acrobático. Esses dados suportam a idéia de

que o sistema nervoso é um órgão dinâmico e capaz de se ajustar frente as

demandas do ambiente e diferentes períodos de treinamento.

6.2.1 Córtex Motor

Diferentes períodos de treinamento AC induziram mudanças distintas na

expressão dos receptores mGluR1 e mGluR2/3 no córtex motor de ratos

adultos jovens reveladas pelas técnicas de imuno-histoquímica e

“immunoblotting”. Entretanto, em alguns momentos observamos pequenas

discrepâncias na expressão desses receptores reveladas por essas diferentes

técnicas.

Períodos mais longo de treinamento (AC4 e AC8) induziram um aumento na

expressão de mGluR1 quando comparado ao grupo sedentário coincidindo

com a estabilização no desempenho motor e com a fase de consolidação do

aprendizado revelada pelos nossos dados de comportamento motor.

No córtex motor a subunidade mGluR1 está localizado na membrana pré e

pós-sináptica e sua ativação aumenta a excitação neuronal54. É sabido que ele

está envolvido em processos plásticos como: desenvolvimento113,

aprendizagem e memória no hipocampo56; além de induzir a LTP, pois sua

ativação aumenta o influxo de Ca+ no neurônio pós-sináptico, gerando assim,

um aumento no potencial excitatório pós-sináptico21, 54. Desta forma, podemos

sugerir que o aumento do receptor mGluR1 na fase tardia do treinamento, por

53

nós revelados, juntamente com o envolvimento dessa subunidade no

mecanismo de LTP sejam um dos substratos neurais para o processo de

consolidação do aprendizado.

Outros estudos têm demonstrado que o treinamento induz

neuroplasticidade no córtex motor na fase tardia. Aumento da arborização

dendrítica e sinaptogênese no córtex motor após treinamento de uma tarefa

complexa tem sido bastante observada em alguns estudos relacionados com a

aprendizagem motor 8, 79, 91,114. Animais submetidos ao exercício AC por

diferentes períodos de treinamento (1sem, 2sem e 4sem)8, 79 apresentaram

aumento de MAP2 no córtex motor apenas na 4º semana, ou seja, na fase

tardia. Kleim e col (2004)91 demonstraram que no córtex motor houve a

reorganização de mapas corticais e sinaptogênese na fase tardia (7-10 dias)

em animais submetidos a treinamento de tarefas de alcance. Movimentos

sequenciais produziram reorganização neural no córtex motor (M1), reveladas

por imagens de ressonância magnética funcional, ao longo do treinamento114.

Animais que sofreram lesão isquêmica apresentaram aumento no nível da

proteína PSD95 (indicadora de sinaptogênese) no córtex motor bilateral após

25 dias de treinamento AC, quando comparado ao 14º dia, simultaneamente

com a melhora nos testes de equilíbrio e coordenação85.

Portanto, os nossos dados corroboram com os citados acima, revelando

que o aumento na expressão de mGluR1 após quatro e oito semanas de

treinamento AC demonstram maior ativação celular juntamente com a indução

da LTP, resultando num aumento e eficiência da área cortical envolvida no

controle dessa atividade motora e consequente reorganização do mapa cortical

na fase de consolidação observada pela melhora comportamental do

desempenho motor.

Em relação a subunidade mGluR2/3 do receptor metabotrópico, nossos

dados de imuno-histoquímica apresentam uma diminuição na expressão destes

no córtex motor nos grupos AC2 e AC4, e aumento após oito semanas de

treinamento (AC8).

O mGluR2/3 é preferencialmente encontrado na membrana pré-sináptica e

54

tende a diminuir a excitação da célula, ou por inibição de canais de Ca+, ou por

inibição da adenilil-ciclase reduzindo a síntese de AMPc, sugerindo uma

diminuição na sinalização e portanto uma inibição da transmissão sináptica48,

61. Essa cascata metabólica mediada pelo receptor mGluR2/3 está envolvida na

manutenção da LTD que é a diminuição persistente da eficácia sináptica42.

Dados do nosso grupo de pesquisa revelaram aumento significativo de

sinaptofisina (SYP) tanto a curto como a longo prazo do treinamento

acrobático, quando analisadas pelo método de imuno-histoquímica79. Portanto,

a combinação dos dados de diminuição da expressão de mGluR2/3 juntamente

com o aumento de SYP sugerem que houve uma diminuição na inibição da

transmissão sináptica resultando no aumento da excitação o que pode

favorecer o fortalecimento das sinapses já existentes ou aumentar a

excitabilidade neuronal, justificando assim a melhora no desempenho motor

apresentada anteriormente.

Já o aumento da expressão de mGluR2/3 após oito semanas de

treinamento acrobático sugere uma diminuição da excitabilidade sináptica,

mecanismo responsável pela depressão de longo prazo (LTD).

Desta forma, vale ressaltar que a reorganização cortical demonstrada pelos

nossos dados ocorreu ao longo dos diferentes períodos de treinamento

acrobático, mas que os longos períodos de treinamento foram os que induziram

as principais mudanças, envolvendo mecanismos tanto de LTP como de LTD,

resultando na melhora do desempenho funcional motor. Além disso, a maioria

dos dados da literatura sobre a expressão dos receptores metabotrópicos

envolvem somente o hipocampo, sendo raros os trabalhos que envolvem o

córtex motor e também a participação do receptor no exercício.

6.2.2 Estriado

Períodos diferentes de exercício induziram mudanças distintas, na região

dorsolateral e dorsomedial do estriado, das subunidades mGluR1 e mGluR2/3.

Além disso, nem sempre os dados da técnica de imuno-histoquímica

corroboraram com os de “immunoblotting”.

55

Na região dorsomedial houve aumento na expressão da subunidade

mGluR1 a partir da quarta semana de treinamento e se manteve até a oitava

semana, e na região dorsolateral houve 2 picos, um nas duas primeiras

semanas e outro na oitava semana. Já na técnica de “immunoblotting” o

aumento aconteceu apenas com duas semanas de treinamento.

O aumento na expressão das subunidades mGluR2/3 aconteceu na

primeira e na oitava semana de treinamento na região dorsomedial e

dorsolateral revelados pela técnica de imuno-histoquímica. Por outro lado, a

técnica de “immunoblotting” não revelou mudanças significativas entre os

grupos.

O estriado é o principal núcleo de entrada dos núcleos da base, recebendo

aferência do córtex cerebral e dos núcleos talâmicos e desempenha papel

importante na integração sensório-motora, estando envolvido nas fases iniciais

e de consolidação do aprendizado100. Estas informações corroboram com os

nossos dados de expressão de mGluRs em diferentes períodos de

treinamento, sugerindo que essas mudanças são decorrentes da participação

do estriado tanto na fase inicial ou de aquisição como no tardia ou de

consolidação.

O bloqueio seletivo de receptores mGluR1 nos neurônios da via

corticoestriatal impediu a indução de LTP115 e LTD116, sugerindo a importância

dos mesmos na regulação e manutenção desse mecanismo plástico. Outros

estudos têm demonstrado que a ação do mGluR1 na LTD pode ocorrer devido

ao seu papel regulador nos níveis de CA2+ no meio intracelular, já que para

que ocorra a LTD é preciso que haja um padrão especifico do aumento

intracelular de CA2+55, 117. Esses dados demonstram que as subunidades

mGluR1 e mGluR2/3 tem um papel importante na regulação e manutenção dos

processos de LTP e LTD no estriado, indicando neuroplasticidade nas células

estriatais.

Os nossos dados mostram que o aumento de mGluR1 na região

dorsomedial aconteceu na fase tardia do treinamento, sugerindo que seja

devido ao aumento de LTP, já que a região dorsomedial do estriado é onde

56

ocorre predominantemente o processo de LTP107. Essa melhora coincide com a

estabilização no desempenho motor. Já na região dorsolateral o aumento

ocorreu em períodos diferentes (nas duas primeiras e na oitava semanas).

Considerando, que a região dorsolateral apresenta um predomínio de

processamentos neurais que envolvem LTD, talvez isso possa explicar um

aumento de mGluR1 em momentos diferentes dos da região dorsomedial do

estriado e que este aumento esteja mais ligado aos mecanismos de regulação

da LTD e não ao mecanismo de LTP.

O aumento de mGluR2/3 aconteceu em momentos diferentes, com uma e

oito semanas de treinamento, tanto na região dorsomedial quanto na região

dorsal, porém é possível observar que esse aumento foi maior na região

dorsolateral, e que pode ser justificado pelo aumento da LTD, já que nessa

região há um predomínio desse processo. Esse dado sugere que houve um

aumento da inibição da transmissão sináptica em dois períodos diferentes.

Vários estudos têm demonstrado que o exercício físico pode induzir

mudanças plásticas no estriado. Animais que realizaram EE apresentaram um

aumento do receptor AMPA, nas células estriatais, na fase tardia do

exercício60. No estudo que utilizou exercício voluntário, por 6 semanas/7dias

por semana, observou mudanças nos níveis de sinaptofisina no estriado

quando comparado ao grupo controle69. Aumento de proteínas estruturais foi

observado no estriado de animais submetidos a EE e exercício AC por 4

semanas; o aumento de NF68 foi observado nos dois grupos, já a proteína

MAP2 apresentou mudanças apenas no grupo AC. Esse trabalho também

demonstrou diferenças quanto a região dorsomedial e dorsolateral; na região

dorsomedial houve aumento na expressão da SYP (no grupo AC) e SYS (nos

grupos AC e EE); na região dorsolateral o aumento de SYP aconteceu apenas

no grupo EE, sugerindo que o exercício provocou mudanças distintas nas

regiões dorsomedial e dorsolateral do estriado8.

Já em outro estudo que utilizou exercício AC por 1 sem, 2 sem e 4 sem

apresentou aumento de MAP2 e NF68 no estriado somente na fase inicial do

treinamento, porém o aumento de SYP e SYS na região dorsomedial,

57

aconteceu na fase final do treinamento79, corroborando com o estudo acima

citado. Por fim, um estudo utilizando exercício AC encontrou sinais de

sinaptogênese na fase intermediária do treinamento (14º) quando comparado a

fase final no estriado85.

Em resumo, nossos dados de aumento de mGluR1 e mGluR2/3 após uma e

oito semanas de treinamento acrobático na região dorsolateral do estriado

sugerem envolvimento desses receptores em mecanismos de LTD, enquanto o

aumento de mGluR1 após longos períodos de treinamento acrobático na região

dorsomedial do estriado seja um dos responsáveis pelos mecanismos de LTP

ai presentes. E mais, essas especificidades podem ser um dos substratos

neurais responsáveis pelo envolvimento do estriado tanto na fase inicial do

aprendizado de novas habilidades e sequências motoras, como na

consolidação dessas habilidades motoras numa fase mais tardia.

6.2.3 Cerebelo

Diferentes períodos de exercício acrobático induziram mudanças na

expressão somente da subunidade mGluR1 no cerebelo, tanto com a técnica

de imuno-histoquímica quanto a de “immunoblotting”, não sendo observado

alterações na expressão das subunidades mGluR2/3.

Os dados obtidos pela análise do cerebelo como um todo, pela técnica de

“immunoblotting” revelaram mudanças bifásicas na expressão de mGluR1, com

um aumento após uma semana (curto período) de treinamento acrobático, mas

na quarta semana (longo período) houve uma diminuição significativa na

expressão desse receptor. Os dados de imuno-histoquímica obtido da análise

da camada de células de Purkinje e camada molecular do córtex cerebelar da

região do lobo paramediano apresentaram aumento na expressão da

subunidade mGluR1 com duas semanas de treinamento (fase inicial).

O cerebelo possui função moduladora nos comandos motores, além de

integrar informações sensoriais diversas para proporcionar movimentos suaves

e movimentos voluntários complexos15. Além disso, esta estrutura participa na

58

coordenação para algumas formas de aprendizado motor, com maior atuação

na fase de consolidação do aprendizado118.

No cerebelo o processo de LTD acontece na sinapse entre as células de

Purkinje e as fibras musgosas pelo emparelhamento dos potenciais pós-

sináptico nas fibras paralelas119. O papel dos mGluRs na LTD no cerebelo foi

demonstrado pela aplicação de agonista dessas subunidades120, onde

obtiveram indução de LTD pelo aumento de Ca2+ intracelular nas fibras

paralelas121. E, confirmados pelo estudo com animais geneticamente alterados

no gene mGluR1, pois apresentaram diminuição na LTD e demonstraram

ataxia cerebelar grave, sugerindo que esse receptor está envolvido nesse

fenômeno plástico e no controle do movimento122.

Estudos em animais que utilizaram diversos tipos de exercício físico

apresentaram alterações plásticas no cerebelo. Animais que realizaram

exercício AC por 10 dias e 38 dias apresentaram aumento no número de

sinapses por célula de Purkinje na fase inicial sendo que esse aumento

persistiu até a fase final do treinamento76. Esses dados foram confirmado por

Kleim e col.66 em com animais que realizaram AC e EV por 30 dias

consecutivos sendo que o aumento foi superior no grupo AC. A presença de

angiogênese aconteceu no córtex cerebelar de animais que precisaram

aprender habilidades motoras mais complexas (AC), quando comparado com

EV e EE, devido ao aumento no volume das células de Purkinje, na camada

molecular, e aumento no número dos vasos sanguíneos84. Esses dados

sugerem que a adaptação comportamental ocorrida após a aprendizagem de

novas habilidades está associada com adaptação estrutural e funcional do

córtex cerebelar.

Dados do nosso grupo de pesquisa revelaram que aumento da proteína

estrutural, neurofilamento (NFs), e sináptica SYP após curto período de

treinamento acrobático sugere incrementos da eficiência sináptica juntamente

com aumento da velocidade de condução dos impulsos nervosos na camada

molecular79. Esses dados corroboram com os nossos dados de expressão de

mGluR1 que ocorreu com duas semanas de treinamento, sugerindo a

59

participação do cerebelo na fase inicial do aprendizado.

Nossos dados de expressão de mGluR2/3 não apresentaram mudanças

entre os grupos, o que talvez se explica pela localização do mGluR2/3 no

cerebelo, que são predominantemente encontrados nas células de Golgi, e no

nosso estudo observamos as células de Purkinje103.

6.2.4 Períodos De Treinamento X Respostas Plásticas

Diferentes períodos de treinamento acrobático induziram mudanças

distintas na expressão de receptores metabotrópicos de glutamato do tipo I

(mGluR1) e do tipo II (mGluR2/3) nas regiões encefálicas envolvidas com o

controle motor coincidindo, em alguns momentos, com as fases de aquisição e

consolidação de aprendizagem motora.

Tabela 2. Resumo dos resultados

O aumento da proteína mGluR1 deu, preferencialmente durante o longo

período de treinamento tanto no córtex motor quanto no estriado. No cerebelo

esse aumento aconteceu apenas na fase inicial. Já a proteína mGluR2/3

apresentou aumento tanto a curto período no estriado, quanto a longo período

mGluR1 mGluR2/3

CURTO PERÍODO LONGO PERÍODO CURTO PERÍODO LONGO PERÍODO

AC1 AC2 AC4 AC8 AC1 AC2 AC4 AC8

CÓRTEX

ESTRIADO DM

DL

CEREBELO

60

no córtex motor e estriado, vale ressaltar que esse aumento se deu no extremo

desses dois períodos com uma e oito semanas, entretanto, no cerebelo não

houve mudanças estatisticamente significativas.

Esses resultados demonstram que o exercício acrobático induziu mudanças

plásticas no circuito córtico-cerebelar após duas semanas de treinamento,

enquanto longos períodos de treinamento geraram mudanças

predominantemente no circuito córtico-estriatal. Essa ativação córtico-cerebelar

resulta do aumento da expressão de mGluR1 no cerebelo e diminuição de

mGluR2/3 no córtex motor, coincidindo com a melhora abrupta do desempenho

motor, na fase inicial ou de aquisição do aprendizado de uma habilidade

motora complexa. A ativação do circuito córtico-estriatal, resultante do aumento

das subunidades mGluR1 e mGluR2/3 na quarta e oitava semanas, coincide

com a fase de consolidação do aprendizado motor, sugerindo a participação

dessas subunidades na indução de LTP e LTD e modulação de LTP.

Embora períodos acima de duas semanas de treinamento acrobático,

induziram mudanças em circuitos diferenciados, apenas uma semana de

treinamento foi capaz de induzir o aumento na expressão da subunidade

mGluR2/3 no estriado e mGluR1 no cerebelo, sugerindo uma diminuição da

excitabilidade no estriado e um aumento da excitabilidade cerebelar,

corroborando com o aumento de SYP e EGR1 também encontrado com

apenas uma semana de treinamento79, que pode ser justificada pelas

correções iniciais que o animal precisou realizar para completar o circuito.

61

7. CONCLUSÕES

- A expressão de mGluR1 mostrou-se aumentada no córtex motor e região

dorsomedial do estriado após quatro e oito semanas de treinamento, enquanto

na região dorsolateral do estriado o aumento aconteceu nos grupos AC1 e

AC8; e no cerebelo esse aumento ocorreu após duas semanas de treinamento.

- A expressão de mGluR2/3 apresentou-se diminuída no córtex motor após

duas e quatro semanas de treinamento acrobático; aumentada nas regiões

dorsomedial e dorsolateral após uma semana e oito semanas, e ausência de

mudança significativa no cerebelo.

- Esses dados sugerem que diferentes períodos de exercício acrobático

induziram mudanças distintas nos receptores metabotrópicos de glutamato nas

diferentes áreas encefálicas sugerindo plasticidade tempo e áreas motoras-

dependente.

62

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