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KiKiKiKit t t t Genomic Genomic Genomic Genomic de de de de QuantificaçãoQuantificaçãoQuantificaçãoQuantificação de DNA de DNA de DNA de DNA

Manual TécnicoManual TécnicoManual TécnicoManual Técnico

PPPPara ara ara ara qqqquantificação de DNAuantificação de DNAuantificação de DNAuantificação de DNA

humano humano humano humano em análises forensesem análises forensesem análises forensesem análises forenses

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2

Kit para Kit para Kit para Kit para Quantificação de DNA humano Quantificação de DNA humano Quantificação de DNA humano Quantificação de DNA humano

1111. . . . IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução

Na maioria dos casos forenses, as amostras recebidas apresentam-se com

alto grau de degradação, além de serem freqüentemente contaminadas com

microorganismos. A metodologia empregada na extração dessas amostras não

permite a distinção do DNA proveniente das células do material humano daquele

oriundo dos contaminantes. O mesmo ocorre com o procedimento utilizado na

quantificação do material extraído, que detecta ácido desoxirribonucléico,

independentemente de sua origem. Devido a esses fatores, a qualidade do DNA

humano e a quantidade do mesmo nas amostras forenses não podem ser aferidas

com alto grau de precisão.

O kit Genomic de Quantificação de DNA humano da baseia-se na utilização

de PCR em tempo real para amplificar de forma específica, e no mesmo tubo,

seqüências presentes nos cromossomos autossômico e Y humanos (Tabela 1). O kit

também conta com um controle interno, constituído por uma seqüência de DNA

sintético, com objetivo principal de analisar a presença de possíveis inibidores da

reação presentes nas amostras forenses extraídas. Os três pares de primers

sintetizados para os alvos descritos resultam em um sistema triplex.

Tabela 1Tabela 1Tabela 1Tabela 1:::: Alvos do kit de quantificação humana da Genomic.

AlvoAlvoAlvoAlvo Gene AlvoGene AlvoGene AlvoGene Alvo FluorófFluorófFluorófFluoróforooroorooro Tamanho Tamanho Tamanho Tamanho

do do do do

ampliconampliconampliconamplicon

PloidiaPloidiaPloidiaPloidia

Autossômico Retinoblastoma 1 FAM 110 pb Diplóide

Cromossomo Y DAZ Texas Red 110 pb Haplóide

IPC DNA sintético Cy5 110 pb -------

3

Kit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humano

O kit é indicado para confirmar se a quantidade de DNA humano existente

em uma dada amostra é viável para posterior utilização nos sistemas de

identificação humana, tais como análises de STRs, SNPs e DIPs, e além disso, para

indicar se a amostra possui inibidores para as análises citadas.

Princípios do Princípios do Princípios do Princípios do kitkitkitkit

A química utilizada no sistema baseia-se na utilização de “quenchers” BHQ

ligados covalentemente a um oligonucleotídeo genérico (antiprimer), capaz de

parear com os primers fluorescentes de cada um dos alvos (Tabela 1) e inibir a

fluorescência dos mesmos. A fluorescência aumenta à medida que os produtos são

amplificados, possibilitando a captação do sinal pelo equipamento (Figura 1).

Figura 1:Figura 1:Figura 1:Figura 1: A cada final de ciclo, a temperatura da reação é diminuída para permitir a ligação

do antiprimer aos oligonucleotídeos marcados livres. O antiprimer não é capaz de ligar aos

produtos de PCR dupla-fita, permitindo com que a amplificação dos produtos com primers

marcados com FAM ou Texas Red resulte em um aumento exponencial da fluorescência..

Figura retirada de Li, J. et al., 2006.

Ciclo 1: Síntese da primeira fita do “template”.

Ciclo 2: Síntese da fita complementar, incluindo a região

contendo a sequência genérica.

Diminuição da temperatura para ligação do antiprimer aos primers livres e captação da fluorescência das duplas-fitas

geradas.

Repetição por 40 ciclos. A captação da fluorescência aumenta à medida que os produtos são gerados.

4


O sistema mostra acurácia para soluções contendo concentrações de DNA

acima de 32 pg/µL, onde a curva padrão mostra linearidade.

5

Kit para QuaKit para QuaKit para QuaKit para Quantificação de DNA humano ntificação de DNA humano ntificação de DNA humano ntificação de DNA humano

2222.... ComposiçãoComposiçãoComposiçãoComposição ddddo kito kito kito kit

Componentes fornecidosComponentes fornecidosComponentes fornecidosComponentes fornecidos

Todos os reagentes necessários para a amplificação dos 3 alvos são

fornecidos com o kit em uma série de 3 tubos (Tabela 2).

TabelaTabelaTabelaTabela 2:2:2:2: Componentes do kit e suas respectivas quantidades para 200 reações.

ComponenteComponenteComponenteComponente DescriçãoDescriçãoDescriçãoDescrição VolumeVolumeVolumeVolume

PCR Mix

Quatro tubos contendo

uma mistura de MgCl2,

desoxirribonucleotídeos

trifosfatos e Taq DNA

polimerase em solução

tampão apropriada.

1,25 mL/tubo

Primer Mix

Dois tubos contendo

primers fluorescentes

Foward e Reverse para

amplificação dos 3 alvos,

Antiprimer contendo o

quencher BHQ-2 e a

referência passiva Cy3.

0,55 mL/tubo

DNA genômico controle

Um tubo contendo DNA

genômico masculino a

50 ng/µL.

50 µL/tubo

6

Kit para QuantiKit para QuantiKit para QuantiKit para Quantificação de DNA humano ficação de DNA humano ficação de DNA humano ficação de DNA humano

Armazenamento dos ComponentesArmazenamento dos ComponentesArmazenamento dos ComponentesArmazenamento dos Componentes

Os fluoróforos ligados aos primers são sensíveis à luz. Portanto, devem ser

protegidos quando não estiverem em uso. Todos os componentes são entregues

congelados. Após o primeiro descongelamento, armazená-los a temperatura de

2ºC a 8ºC.

7

Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano

3333. . . . Reação de PCRReação de PCRReação de PCRReação de PCR

Preparo Preparo Preparo Preparo das diluições seriadasdas diluições seriadasdas diluições seriadasdas diluições seriadas para para para para a curva a curva a curva a curva padrãopadrãopadrãopadrão

Vortexar o DNA controle por 15 segundos antes de iniciar as diluições

(Tabela 3).

TaTaTaTabela 3bela 3bela 3bela 3:::: Diluições seriadas do DNA controle para composição da curva padrão.

TuboTuboTuboTubo

VolumeVolumeVolumeVolume

do DNAdo DNAdo DNAdo DNA

BufferBufferBufferBuffer TE TE TE TE Concentração FinalConcentração FinalConcentração FinalConcentração Final

1 Não diluído ------ 50 ng/µL

2 8uL tubo 1 32 µL 10 ng/µL

3 8uL tubo 2 32 µL 2 ng/µL

4 8uL tubo 3 32 µL 0,4 ng/µL

5 8uL tubo 4 32 µL 0,08 ng/µL

As diluições se mantém estáveis por até 2 semanas, desde que armazenadas

a temperatura entre 2 a 8ºC.

Preparo Preparo Preparo Preparo da Reaçãoda Reaçãoda Reaçãoda Reação

1. Preparar todas as reações em duplicata e um volume de master mix 10% maior

que o total requerido. Lembre-se de considerar os controles positivos e negativos

(Tabela 4). Vortexar os tubos por 5 segundos antes de efetuar a mistura.

8


Tabela 4Tabela 4Tabela 4Tabela 4:::: Volumes necessários para o preparo do master mix para uma reação.

ComponenteComponenteComponenteComponente VolumeVolumeVolumeVolume

PCR Mix 23,0 µL

Primer Mix 5,0 µL

2. Homogeinize a mistura gentilmente e dispense 28 µL em cada tubo.

3. Adicione 2 µL de Buffer TE aos tubos do controle negativo (NTC).

4. Adicione 2 µL das diluições seriadas (Tabela 5) ou 2 µL da amostra

desconhecida individualmente em cada tubo.

5. Feche os tubos, centrifugue por 20 segundos a 3500 r.p.m. e coloque as reações

em um equipamento de Real-time PCR.

Protocolo para utilizaçãoProtocolo para utilizaçãoProtocolo para utilizaçãoProtocolo para utilização do sistemado sistemado sistemado sistema Applied Real Applied Real Applied Real Applied Real----time time time time

PCR 7500PCR 7500PCR 7500PCR 7500

1. Na tela inicial, clique em “Advanced Setup”.

9


2. Nomeie o experimento e mantenha as demais condições.

3. Clique em “Plate Setup” e “Add new target” para inserir os três alvos. Em

seguida clique “Add new samples” para definir o número de amostras a serem

quantificadas.

10


4. Na mesma tela, clique na aba “Assign Targets and Samples”.

5. Selecione os poços para o controle negativo e marque-os como NTC para os

alvos autossômico e Y e desconhecido (U) para o IPC.

11


6. Clique em “Define Set Up Standards” e preencha os campos conforme abaixo.

7. Clique “apply” e “close”.

8. Selecione os poços referentes aos pontos da curva e marque-os como

“Standards” para os alvos autossômico e Y e desconhecido para o IPC. Verifique

se a concentração de cada ponto está corretamente indicada para os 2 alvos.

12

KiKiKiKit para Quantificação de DNA humano t para Quantificação de DNA humano t para Quantificação de DNA humano t para Quantificação de DNA humano

9. Selecione o número de poços referente às amostras e marque-as como

desconhecido para os 3 alvos. Lembre-se se adicionar duplicatas para cada

amostra. Selecione também Cy3 em “Passive Reference”.

13


11. Clique em “Run Method” e configure o ciclo conforme descrito abaixo.

14


12. Após salvar o método, clique em “Run” e depois “Start Run”.

15


4444. . . . Análise das reaçõesAnálise das reaçõesAnálise das reaçõesAnálise das reações

1. Em “Analisys”, clique em “Amplification Plot” e selecione os poços referentes

aos pontos da curva.

2. Em “options”,selecione um dos alvos e marque o campo referente ao

“Threshould automático”. O “threshould” também poderá ser modificado

manualmente quando for conveniente.

3. Clique em “Analyze”. Os gráficos esperados para cada alvo são mostrados na

figura 2.

Figura 2: Figura 2: Figura 2: Figura 2: Gráficos esperados para as reações triplex feitas com os pontos da curva padrão.

As linhas nos gráficos autossômico e Y representam, respectivamente, os pontos de 50

ng/µL, 10 ng/µL, 2 ng/µL, , , , 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL e NTC.

Autossômico Y

IPC

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4. Para ver a curva padrão, clique em “Standard curve”. Checar o coeficiente de

regressão linear e a eficiência da reação. Os valores considerados satisfatórios

são mostrados na tabela 5.

Tabela 5Tabela 5Tabela 5Tabela 5:::: Valores do coeficiente de regressão linear e eficiência da reação

esperados para a curva padrão.

ParâmetroParâmetroParâmetroParâmetro Valores de referênciaValores de referênciaValores de referênciaValores de referência

Coeficiente de regressão linear (R2) Acima de 0,990

Eficiência da reação Entre 80% e 110 %

As curvas padrão esperadas para cada alvo são mostradas na figura 3.

FiguraFiguraFiguraFigura 3 3 3 3: : : : Curvas padrão esperadas as reações triplex. Os pontos em vermelho referem-se,

respectivamente, às concentrações de 50 ng/µL, 10 ng/µL, 2 ng/µL, , , , 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL.

Autossômico Y

R2= 0,999

Ef = 95%

R2= 0,999

Ef = 94%

17


Acessando as concentrações das amostras Acessando as concentrações das amostras Acessando as concentrações das amostras Acessando as concentrações das amostras quantificadasquantificadasquantificadasquantificadas

Em “Amplification Plot”, selecione a aba “View Well Table”. A planilha

informará a quantidade de DNA detectada para cada alvo dentro de uma mesma

amostra. As unidades serão as mesmas utilizadas para as amostras da curva

padrão, ou seja, ng/µL.

Interpretação do resultado de amplificação do controle Interpretação do resultado de amplificação do controle Interpretação do resultado de amplificação do controle Interpretação do resultado de amplificação do controle

interno.interno.interno.interno.

O uso do controle interno IPC é útil na determinação de falhas no

equipamento ou de falhas humanas, bem como na indicação da presença de

possíveis inibidores da reação de PCR.

A kit Genomic de quantificação de DNA foi desenvolvido para que a

amplificação do controle interno gere em condições padrão um Ct de

aproximadamente 27. No entanto, uma variação no valor do 1,5 Ct acima ou abaixo

dos pontos da curva poderão ser observados e deverão ser considerados normais.

Além disso, amostras com concentrações maiores que 50 ng/µL podem gerar Ct

mais alto do que os citados acima. As situações possíveis para o sistema são

descritas na tabela 6.

Tabela 6Tabela 6Tabela 6Tabela 6:::: Interpretações com base na amplificação do controle interno da reação.

Alvos Alvos Alvos Alvos YYYY ou ou ou ou Autossômico Autossômico Autossômico Autossômico IPCIPCIPCIPC InterpretaçãoInterpretaçãoInterpretaçãoInterpretação

Sem amplificação Amplificação Resultado negativo- DNA

humano não encontrado

Sem amplificação Sem amplificação Resultado inválido

Amplificação com baixo Ct

e alto ∆Rn

Sem amplificação ou Ct alto (>29) Resultado do IPC

inconclusivo

Amplificação com alto Ct Sem amplificação ou Ct alto (>29) Presença de inibidores na

reação

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5555. . . . Validação do kitValidação do kitValidação do kitValidação do kit

Para validação do kit, um total de 7 amostras extraídas pela GENOMIC

foram quantificadas por espectrofotômetro e nanodrop. Outras 3 amostras foram

adquiridas através do “National Institute of Standards & Technology” (NIST). As

amostras e suas respectivas concentrações estão descritas na tabela 7.

Tabela 7Tabela 7Tabela 7Tabela 7:::: Amostras usadas como template nas reações de validação do kit.

NomeNomeNomeNome DescriçãoDescriçãoDescriçãoDescrição ConcentraçãoConcentraçãoConcentraçãoConcentração

Amostra 1 DNA masculino 0,1 ng/µL

Amostra 2 DNA masculino 0,29 ng/µL

Amostra 3 DNA de múltiplos homens

e mulheres.

2 ng/µL

Amostra 4 DNA masculino 2 ng/µL

Amostra 5 DNA feminino 13,5 ng/µL

Amostra 6 DNA masculino 16 ng/µL

Amostra 7 DNA feminino 22 ng/µL

Amostra NIST A DNA masculino de um

único indivíduo.

5 ng/µL

Amostra NIST B DNA de múltiplas

mulheres.

5 ng/µL

Amostra NIST C DNA de múltiplos homens

e mulheres.

5 ng/µL

As amostras foram usadas como template em reações de PCR em tempo real

dos kits de Quantificação da Genomic, Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit

(Applied Biosystems) e Investigator® Quantiplex (Qiagen). Os resultados das

quantificações apresentaram mesmo grau de magnitude em todos os casos testados

(Tabela 8).

19


Tabela 8Tabela 8Tabela 8Tabela 8:::: Quantificação de 10 amostras de concentrações conhecidas utilizando o

kit de quantificação da Genomic e Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit (Applied

Biosystems) e Investigator® Quantiplex (Qiagen). Um volume de 2 µL de cada

amostra foi usado nas reações em duplicata em todos os kits.

20


6666. . . . Efeito dos inibidores noEfeito dos inibidores noEfeito dos inibidores noEfeito dos inibidores no sistema sistema sistema sistema

O efeito dos inibidores hematina e ácido húmico nas reações de

quantificação foram observados através de reações contendo quantidades

crescentes de cada inibidor. Os resultados mostraram que o Ct do controle interno

aumenta à medida que a concentração de inibidor aumenta na reação. Além disso, o

aumento do Ct para o controle interno é acompanhado pelo aumento do Ct dos

alvos autossômico e Y (Figuras 4 e 5).

IPC - Hematina

0

10

20

30

40

50

0 µM 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM 35µM

Ct

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 µM 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM 35µM

Hematina

Ct

Y

Autossômico

IPC

A.

B.

21


Figura 4Figura 4Figura 4Figura 4:::: Amostras de concentração 1 ng/µL de DNA genômico masculino humano

foram geradas com diferentes concentrações do inibidor hematina. A) Cts

observados para os alvos autossômico, Y e IPC. B) Variação do Ct para o alvo IPC.

C) Quantificação obtida das amostras em cada situação de inibição.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Hematina

DN

A (

ng

/µL

)

Y

Autossômico

Y 0,775 0,565 0,42 0,175 0,023 0

Autossômico 0,82 0,725 0,37 0 0 0

0µM 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM

C.

22


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 ng/µL 5 ng/µL 10 ng/µL 15 ng/µL 20 ng/µL 25 ng/µL 30 ng/µL

Ácido Húmico

Ct

Y

Autossômico

IPC

IPC - Ácido Húmico

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 ng/µL 5 ng/µL 10 ng/µL 15 ng/µL 20 ng/µL 25 ng/µL 30 ng/µL

Ct

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Ácido Húmico

DN

A (

ng

/µL

)

Y 0,988 0,643 0,378 0,233 0,019 0

Autossômico 1,038 0,419 0,258 0,008 0 0

0

ng/µL

5

ng/µL

10

ng/µL

15

ng/µL

20

ng/µL

25

ng/µL

Figura Figura Figura Figura 5555:::: Amostras de concentração 1ng/uL de DNA genômico masculino humano

foram geradas com diferentes concentrações do inibidor ácido húmico. A) Cts

observados para os alvos autossômico, Y e IPC. B) Variação do Ct para o alvo IPC.

C) Quantificação obtida das amostras em cada situação de inibição.

A.

B.

C.

23


7777. . . . MMMMistura de DNA masculino e istura de DNA masculino e istura de DNA masculino e istura de DNA masculino e

femininofemininofemininofeminino O comportamento do sistema foi avaliado em situações de misturas de DNA

masculino e feminino. Uma quantidade fixa de 0,2 ng/µL de DNA masculino foi

misturada a DNA feminino em diferentes proporções. Um volume de 2 µL de cada

mistura foi usado para avaliar o limite de detecção do sistema para o alvo do

cromossomo Y. As quantificações obtidas do DNA masculino ficaram dentro do

esperado, mesmo em “background” 1000 vezes maior de DNA feminino.

0,01

0,1

1

10

100

1:0

1:1

1:2

1:5

1:1

0 1

:20

1:5

0

1:1

00

1:5

00

1:1

000 0:1

Proporção (DNA masculino:DNA feminino)

DN

A (n

g/u

L)

Y

Autossômico

24


8888. . . . ContatoContatoContatoContato

GENOMIC Engenharia Molecular

Rua Itapeva, 500 Conjunto 5AB

São Paulo- SP

Responsável técnico: Dr. Martin Whittle

Contato: [email protected]

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