Purificación de Proteínas por FPLC

Universidad de Barcelona Facultad de Biología

Departamento de Genética, Microbiología y Estadística

Belén Infanzón Departamento de

Producción, IICS-UNA

6 set – 26 oct 2016

� Los solventes pasan por tubos desde un reservorio externo.

� El flujo de los solventes es programado con una computadora y controlado por las bombas.

� La muestra es introducida en el inyector y conducida a la columna con el flujo del solvente

FPLC

� Cromatografía de Afinidad

Un ligando es unido covalentemente a un soporte sólido, el cual es empaquetado a la columna cromatográfica.

Una mezcla de componentes se aplica a la columna. Los contaminantes, que no tienen ninguna afinidad para el ligando, se lavan a través de la columna, quedando unido el componente deseado (proteínas, péptidos, fragmento de ADN, etc.).

FPLC: Aplicaciones

� Cromatografía de Afinidad

La elución se logra cambiando el pH o la concentración de sal, o aplicando solventes orgánicos o una molécula que compite por el enlace del ligando.

FPLC: Aplicaciones

1. UV Detector With Conductivity Monitor

2. SV5-4 select valve 4. AVR9-8 switching valves 7. F40 workstation

8. BioFrac fraction collector

9. AVR 7-3 sample inject valve

Proteína E2 del virus del chikungunya

Objetivos Obtener las proteína multiepitope antigénica mE2 del virus del chikungunya marcada con HIS-tag en el N-terminal y purificada para ser aplicada a la elaboración de prueba diagnóstica. 1) Clonar la secuencia codificante de la proteína mE2 libre de GST y con His-Tag en el N-terminal en el vector pET28. 2) Expresar la proteína mE2 a partir de de E. coli BL21 pET28-E2. 3)   Realizar la purificación de la proteína producida

por FPLC.

Se utilizó el plásmido pGEX-E2, diseñado y construido en el laboratorio de Producción del IICS, dentro del Proyecto de Rectorado con código IICS/01/16 , en donde la secuencia de la proteína multiepitope E2 del virus del chikungunya fue clonada en un vector pGEX de manera a ser expresada con un tag o etiqueta de GST En el marco del proyecto, el plásmidos ya fueron verificados por secuenciación y ya se realizaron pruebas de expresión. También se logró purificar exitosamente la proteína E2 a partir de la fracción soluble con columnas de afindad de GST-tag, por lo que en la estancia de vinculación se decidió probar una estrategia diferente de expresión y purificación, para intentar expresar una proteína sin el tag de GST (de 26 kDa), expresando la E2 con cola de histidinas como tag que es muy pequeña en cuanto a tamaño.

E2 multiepitope

Antecedentes

E2 multiepitope

120 μg de proteína de un cultivo de 50 mL

Antecedentes

Transformación a E. c o l i B L 2 1 d e l plásmido pET28-E2

Expresión de E. coli BL21 pET28-E2

Obtención de células. Disrupción celular con french press

Clonación de E2 en el vector pET28, con His tag N-t

Clonación de E2 en pET28 y Expresión en Escherichia coli BL21

Extracto

Pellet

Clonación de E2 en pET28 y Expresión en Escherichia coli BL21

A                    B  

6000  pb  pb  

3000  pb  pb  

1000  pb  pb  

       A                        B                                      C  

6000  pb  pb  

3000  pb  pb  

1000  pb  pb  

Digestiones de pET28 / BamHI XhoI (A,B). Gel de agarosa al 1% teñido con sybr safe

Digestiones de pGEX-E2 / BamHI XhoI (A-C). Gel de agarosa al 1% teñido con sybr safe

Clonación de E2 en pET28 y Expresión en Escherichia coli BL21

A                  B                                  C                                          D                                          E                                  F                                G           3000  pb  pb  

1000  pb  pb  

Screening por amplificación con primers específicos de clones transformantes de E. coli BL21 pET28-E2. Control negativo (A), control positivo plásmido pGEX-E2 (B), clones 1 a 5 de E. coli BL21 pGEX-E2 (C-G). Gel de agarosa al 1% teñido con sybr safe

Clonación de E2 en pET28 y Expresión en Escherichia coli BL21

E. coli BL21 pET28-E2

Clonación de E2 en pET28 y Expresión en Escherichia coli BL21

Clonación de E2 en pET28 y Expresión en Escherichia coli BL21

Niquel exchange045:10_UV Niquel exchange045:10_Cond Niquel exchange045:10_Cond% Niquel exchange045:10_Conc Niquel exchange045:10_Flow Niquel exchange045:10_Temp Niquel exchange045:10_Fractions Niquel exchange045:10_Inject Niquel exchange045:10_Logbook

0

500

1000

1500

2000

mAU

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 ml1 2 3 4 5 6 Waste 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

SDS-PAGE 15% poliacrilamida coloreado con azul de Coomassie como análisis de la expresión mediante purificación de la proteína E2: Marcador de peso molecular (M), fracción soluble del cultivo de E. coli BL21 pET28-E2 (1), percolado de la purificación (2), eluato de la purificación.

Clonación de E2 en pET28 y Expresión en Escherichia coli BL21

Conclusión Se obtuvo el plásmido pET28-E2 y la cepa de E. coli BL21 pET28-E2, para la expresión de la proteína E2 libre de GST y con His-tag en el N-terminal. No se logró la expresión de la proteína de 7 kDa en la fracción soluble del cultivo en las condiciones ensayadas (cultivo con inducción con IPTG 0,5 mM incubado ON a 18°C; purificación a partir de extracto en condiciones nativas).

Proteína NS1 del virus del dengue

Objetivos Obtener las proteína multiepitope antigénica mNS1 del virus del dengue purificada para ser aplicada a la elaboración de prueba diagnóstica. 1) Expresar la proteína mNS1 en la fracción soluble de cultivo de E. coli. 2) Optimizar las condiciones expresión. 3) Realizar la purificación de la proteína producida por FPLC. 4) Cuantificar la proteína pura obtenida.

Se utilizó el plásmido pGEX-NS1 clon 1 y el plásmido pGEX-NS1 clon 5, plásmido diseñado y construido en el laboratorio de Producción del IICS, como trabajo de maestría de LMS López. La secuencia de la proteína antigénica multiepitope NS1 del virus del dengue, tal como fue diseñada, fue clonada en un vector pGEX de manera a ser expresada con un tag o etiqueta de GST (glutatión S-transferasa) en el N-terminal y de histidinas (His-tag) en el C-terminal. En el marco del trabajo de maestría, los plásmidos ya fueron verificados por secuenciación y ya se realizaron pruebas de expresión con ambos clones. También se realizaron varios intentos de purificación del clon 5 a partir tanto de la fracción soluble como de la insoluble, con columnas de afindad de His-tag y de GST-tag, pero no se logró obtener la proteína purificada.

NS1 multiepitope

Tesis de Maestría Liz López

Antecedentes

NS1 multiepitope

Tesis de Maestría Liz López

Antecedentes

Transformación a E. coli BL21 y Origami del pGEX-NS1 clon 5

Expresión de E. coli BL21 pGEX-NS1 clon 5 y E. coli Origami pGEX-NS1 clon 5

O b t e n c i ó n d e células. Disrupción celular con French press

Expresión y Purificación de pGEX NS1

Extracto

Pellet

Expresión

SDS-PAGE 12% poliacrilamida coloreado con azul de Coomassie. Marker, Extracto BL21 NS1, Pellet BL21 NS1, Extracto Origami NS1, Pellet Origami NS1, Extracto Origami LipR (puse como control de cepa), Pellet Origami LipR.

Expresión y Purificación de pGEX NS1

Niquel exchange035:10_UV Niquel exchange035:10_Cond Niquel exchange035:10_Cond% Niquel exchange035:10_Conc Niquel exchange035:10_Flow Niquel exchange035:10_Temp Niquel exchange035:10_Fractions Niquel exchange035:10_Inject Niquel exchange035:10_Logbook Niquel exchange035:10_UV@01,BASEM

0

500

1000

1500

2000

mAU

0.0 5.0 10.0 15.0 min1 2 3 4 5 6Waste7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

-0.02

1.78

9.39

14.84

20.56

tubo 11 --- 19%

Expresión y Purificación de pGEX NS1

Marker, extracto, extracto, Eluato (con 90mM imidazol)

Niquel exchange 2 columnas005:10_UV Niquel exchange 2 columnas005:10_Cond Niquel exchange 2 columnas005:10_Cond% Niquel exchange 2 columnas005:10_Conc Niquel exchange 2 columnas005:10_Flow Niquel exchange 2 columnas005:10_Temp Niquel exchange 2 columnas005:10_Fractions Niquel exchange 2 columnas005:10_Inject Niquel exchange 2 columnas005:10_Logbook Niquel exchange 2 columnas005:10_UV@01,BASEM

0

500

1000

1500

2000

mAU

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 -0.01

1.35

11.70

26.45 28.02 29.88 32.92 34.51 36.91

tubo 14--- 10% buffer B

Expresión y Purificación de pGEX NS1

Transformación a E. coli BL21 del pGEX-NS1 clon 1

Expresión de E. coli BL21 pGEX-NS1 clon 1

Obtención de células. Disrupción celular con french press

Expresión y Purificación de pGEX NS1

Extracto

En condiciones nativas

Expresión y Purificación de pGEX NS1

En condiciones desnaturalizantes (con urea 6M)

Expresión y Purificación de pGEX NS1

Expresión y Purificación de pGEX NS1

ExPASy ProtParam tool

Expresión y Purificación de pGEX NS1

Conclusión Se obtuvo la proteína NS1 purificada a partir de la fracción soluble de un cultivo de E. coli BL21 pGEX-NS1. Para log rar es te resu l tado , las cond ic iones estandarizadas durante el cultivo fue una inducción con IPTG 0,5 mM incubando ON a 18 C. Se realizó la purificación a partir de la fracción soluble con incubación previa con urea 6M y manteniendo las condiciones desnaturalizantes durante el proceso. Las proteínas del extracto fueron eliminadas durante el proceso de purificación con buffer de lavado que contenía 50 mM de imidazol, y la proteína unida específicamente a la columna fue eluida con 300 mM de imidazol.

Muchas Gracias!!