Proteínas: estrutura tridimensional e Proteínas: estrutura tridimensional e forças envolvidasforças envolvidas

BIO10-329 Biofísica de ProteínasRegente: Célia R. Carlini

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Os assuntos abordados nessa aula são:

- Modelos de estrutura proteica

- Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas

- Métodos de estudo da estrutura de proteínas

Iniciaremos essa aula relembrando os conceitos de níveis organizacionais da estrutura de uma proteína, como visto na aula anterior:

A Hemoglobina é um heterotetrâmero formada por 2 tipos de cadeias polipeptídicas

Subunidades alfa

Subunidades betaHeme

(grupo prostético)

Estrutura quaternária:• Associação de mais de uma

cadeia polipeptídica • No modelo, um tetrâmero

composto de 4 cadeias polipeptídicas

x 4

Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:

Estrutura terciária:• Enovelamento de uma cadeia

polipeptídica como um todo.• Ocorrem ligações entre os

átomos dos radicais R de todos os aminoácidos da molécula

.

Estrutura secundária:• Enovelamento de partes da

cadeia polipeptídica• Formada somente pelos

átomos da ligação peptídica, através de pontes de H.

• Ex: alfa-hélices e folhas beta.

Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica; mantida por ligações peptídicas

aminoácido

É o esqueleto covalente (fio do colar), formado pela seqüência dos átomos (-N-C-C-)n na proteína.

Para entender a estrutura 3D das proteínas, vamos “dissecá-la” em níveis organizacionais para facilitar o estudo:

O primeiro passo para se estudar a estrutura de uma proteína é obtê-la de forma purificada.

Geralmente a proteína que se deseja estudar é um componente minoritário (0,01 a 1%) em uma complexa mistura de outras proteínas

que estão presentes em qualquer tipo de tecido ou célula.

Purificar uma proteína significa separar a proteína de interesse das outras presentes na fonte de origem, de modo a ter somente ela no meio.

Muitas vezes purificar uma proteína é a etapa limitante no estudo de suas características estruturais e propriedades biológicas.

Em uma próxima aula estudaremos os métodos disponíveis para purificação de uma proteína

Estrutura primária: é a sequência dos aminoácidos na cadeia polipeptídica.aminoácido

Para determinar a estrutura primária de uma proteína, é necessário primeiro conhecer a composição (número e tipos) de seus aminoácidos.

A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido. A área do pico quantifica o aminoácido.

A proteína pura é tratada com HCl 6N fervente para quebrar

(hidrólise) as ligações peptídicas.

A mistura resultante é submetida a métodos cromatográficos (fase reversa, troca iônica) para separar os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min)

fluor

escê

ncia

Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos atualmente mais utilizados:

a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com

fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a

hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é

identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o

próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal.

b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos

correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.

Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e

proteômica.

Método de Edman - sequenciamento de proteínas com

PITCPITC (fenil-isotiocianato)

ciclo 1

ciclo 2

hidrólise com ácido trifluoroacético

hidrólise ácida

vai para novo ciclo

análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)

(1)

(2)

(3)

acoplamento

acoplamento

Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:

1. Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);

2. Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S);

3. Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína.

Sequenciadores automatizados fazem todas as etapas, com capacidade

para realizar 30 ciclos por dia, a partir de 100-200 picomoles de proteína.

Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman.

Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição de suas sequências.

ProteínaTotal 150 a.a

sequência obtida a partir da proteína intacta

30 aa

Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros.

proteína inteira

peptídeos método A

peptídeos método B

Estudos da estrutura tridimensional de proteínas tiveram grande impulso na década de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de proteína.

Na queratina (proteína da lã de carneiro), Pauling viu um padrão repetitivo de zonas claras (eletrondensas) e escuras na difração de raios X.

-hélice

Filmefotográfico

Raio XPara explicar esse padrão, foi proposto o modelo da -hélice, com as seguintes caracterísiticas:

• esqueleto covalente C-C-N-C-C-N da proteína assume a forma de espiral ou mola, enrolada para a direita, com um espaçamento de 3,6 resíduos de aminoácido por volta;

• o enovelamento é estabilizado por pontes de hidrogênio entre átomos das ligações peptídicas de qualquer aminoácido, exceto prolina;

• as cadeias laterais dos aminoácidos voltam-se para fora da hélice.

Linus Pauling também propôs o modelo da folha pregueada ou estrutura para explicar o padrão de difração de raios X pela -queratina, proteína presente na unha, chifres e cascos de animais.

Na folha pregueada as cadeias polipeptídicas dispõem-se lateralmente (em paralelo) e fazem

pontes de H entre os átomos da ligação peptídica.

As cadeias laterais R dos aminoácidos voltam-se para cima ou para baixo do plano da folha

Vista lateral

Folha anti-paralela

-N C

-C NFolha paralela

-C N

-C N

Pontes de H

Folhas paralelas e antiparalelas podem se formar em uma proteína através de pequenas torções da cadeia polipeptídica.

antiparalela

Paralela, torção à direita

Paralela, torção à esquerda

Dobra

A -hélice e a folha são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica.

Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do C

Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra ou “alças” (domínios) de ligação a íons, como Ca2+ ou Zn2+.

tipo 1 tipo 2

hélice-dobra-hélice“Zinc-finger”

Beta-alfa-beta Só beta Só alfa

Barril betaBarril alfa-beta

Alguns modelos de organização estrutural, como os barris e , aparecem em vários tipos de proteínas, às vezes não relacionadas.

A estrutura terciária descreve a forma tridimensional final de uma cadeia polipeptídica, resultando da associação de partes organizadas da molécula,

chamadas de “domínios” ou “motivos” proteicos.

Proteínas com estrutura quartenária são composta de mais de uma cadeia polipeptídica, que podem estar associadas covalentemente

(pontes dissulfeto) ou não.

Subunidade (uma cadeia polipeptídica)

Proteína (biológicamente ativa; dímero não covalente )

Algumas definições importantes:

- Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural.

- Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica, que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína acima de sua sequência de aminoácidos.

- Os termos conformação e configuração não são sinônimos. Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula

determinada por ligações covalentes, como por exemplo, as formas L- e D- de um aminoácido.

Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes.

Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais.

Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína, podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua atividade biológica.

FORÇAS NÃO COVALENTES

Pontes de H-Aminoácidos polares

Ligações iônicas- Aminoácidos carregados

Interações hidrofóbicas-Aminoácidos apolares

Forças de Van der Waals-Qualquer aminoácido

ProteínaProteína

NH

— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —

2

ProteínaProteína

O—CH

Ponte de Hidrogênio

Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals

2

CH —CH3

CH3 CH3

CH3 — CH — CH2 —

— CH — CH3 H3C — CH —

CH3 CH3

++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de

uma proteína ?

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de

uma proteína ?

ProteínaProteína

NH

— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —

2

ProteínaProteína

O—CH

Ponte de Hidrogênio

Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals

2

CH —CH3

CH3 CH3

CH3 — CH — CH2 —

— CH — CH3 H3C — CH —

CH3 CH3

++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de

uma proteína ?

Pontes de H ocorrem:

- entre os átomos da ligação peptídica (por exemplo, a -hélice e a folha );

- entre cadeias laterais de aminoácidos polares, carregados ou não;

- para os grupos –NH3+ e

–COO- dos aminoácidos N- e C-terminal, respectivamente.

Ponte de Hidrogênio

Ligações iônicas:

- ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos com cargas contrárias;

- dependem do estado de ionização dos aminoácidos e do pH do meio;

- são menos frequentes do que as pontes de H.

ProteínaProteína

NH

— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —

2

ProteínaProteína

O—CH

Ponte de Hidrogênio

Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals

2

CH —CH3

CH3 CH3

CH3 — CH — CH2 —

— CH — CH3 H3C — CH —

CH3 CH3

++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de

uma proteína ?

Ligação Iônica

ProteínaProteína

NH

— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —

2

ProteínaProteína

O—CH

Ponte de Hidrogênio

Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals

2

CH —CH3

CH3 CH3

CH3 — CH — CH2 —

— CH — CH3 H3C — CH —

CH3 CH3

++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de

uma proteína ?

-Interações hidrofóbicas:

- ocorrem entre as cadeias laterais de aminoácidos apolares;

- radicais apolares são repelidos pela água, aproximando-se uns dos outros;

- não é uma força de atração real, resultando da repulsão pela água;

- como consequência, em meio aquoso o interior de proteínas globulares é hidrofóbico.

Interações hidrofóbicas

ProteínaProteína

NH

— CH2 — OH ... O — C — CH2 — CH2 —

2

ProteínaProteína

O—CH

Ponte de Hidrogênio

Interações hidrofóbicas e Forças de van der Waals

2

CH —CH3

CH3 CH3

CH3 — CH — CH2 —

— CH — CH3 H3C — CH —

CH3 CH3

++—CH2—CH2—NH3 OC —CH2—CH2—Ligação Iônica

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de

uma proteína ?

Forças de Van der Waals

- é uma força eletrostática que ocorre entre dipolos temporários;

- dipolos temporários (duração de nanosegundos) são criados devido à órbita errática dos elétrons;

- pode envolver qualquer tipo de aminoácido;

- geralmente coincidem com as regiões da proteína onde ocorrem as interações hidrofóbicas, pois a aproximação dos radicais apolares facilita a interação entre os dipolos.

e Forças de van der Waals

O hormônio insulina é composto por duas subunidades, A e B, unidas por duas pontes dissulfeto intercadeia. Além disso, a cadeia B possui uma ponte dissulfeto intracadeia

A

B

Quais são os tipos de forças que mantém a estrutura tridimensional de

uma proteína ?

Além dos laços não covelentes, uma proteína pode ter pontes dissulfeto formada a partir de dois resíduos do aminoácido Cys (cisteína).

Pontes dissulfeto são covalentes e só podem ser rompidas por agentes redutores, como 2-mercapto-etanol.

* O valor indicado para cada ligação refere- se à quantidade

de energia necessária para rompê-la.

Tipo deligação

Energia *(Kcal/mol )

Tipo deligação

Energia *(Kcal/mol )

LIGAÇÃO SIMPLES LIGAÇÃO DUPLA

O — H 110 C O 170H — O 104 C N 147P — O 100 C C 146

C — H 99 P O 120N — H 93 LIGAÇÃO TRIPLA

C — O 84

C — C 83S — H 81 PONTE DE HIDROGÊNIOC — N 70 NH ...OC — S 62 OH ... NN — O 53 NH ... N S — S 51 OH ... O

4 - 5

C C 195

A ligação peptídica é muito forte e só se rompe em condições químicas drásticas, como 6N HCl a 100ºC.

A tabela mostra que a força das ligações entre os átomos do esqueleto covalente de uma proteína C-C-N-C-C-N é da ordem de 70 a 80 kcal/mol. (Não esquecer que a ligação C-N tem

carácter parcial de dupla ligação C=N, por causa da ressonância da ligação peptídica.)

A conformação proteica depende basicamente de forças fracas, como a ponte de H e interações hidrofóbicas.

A ponte dissulfeto (-S-S-) é relativa- mente rara entre as proteínas. Por ser um laço covalente, não se rompe quando uma proteína desnatura em meio ácido ou por calor.

Proteínas são moléculas frágeis e podem ser desnaturadas, com perda de suas propriedades biológicas, por pequenas variações do pH ou da temperatura do meio. A ponte de H é uma das principais forças envolvidas na estabilidade da conformação nativa.

As interações que as proteínas estabelecem com o meio são importantes na determinação de sua conformação.

A bacteriorhodopsina é formada por 7 segmentos de -hélices apolares, que delimitam um canal interno de natureza polar.

O índice hidropático dos aminoácidos reflete a tendência que as suas cadeias laterais têm para interagir com o meio aquoso.

Quanto mais negativo esse índice, mais polar é o aminoácido.

O perfil hidropático de uma proteína é calculado como a soma dos índices hidropáticos a cada 9 resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica.

Permite prever regiões da proteína que interagem com a membrana plasmática ou com os meios interno/externo.

O perfil hidropático da bacteriorhodopsina prevê 7 regiões hidrofóbicas e 3 regiões hidrofílicas.

A bacteriorhodopsina (bR) da arqueobactéria

Halobacterium salinarum, é o sistema

fotossintético mais simples conhecido,

permitindo a sobrevivência do organismo

em situações de baixo O2, ao converter luz

solar em energia química. Quando a

molécula de bR absorve um fóton, ela se

torna uma bomba de prótons, bombeando H+

do meio intracelular para o exterior da

célula. A energia do gradiente eletroquímico

formado é então utilizada para síntese de

ATP por uma ATP sintase. citoplasma

meio externo

canal de H+

Bacteriorhodopsina inserida em uma porção da membrana

Para ter esse tipo de estrutura, a proteína apresenta as cadeias laterais de seus aminoácidos apolares voltadas para “fora”, em contacto com os lipídeos da membrana da célula. Aminoácidos polares estão voltados para “dentro”, delimitando o canal de prótons da molécula.

O pesquisador sueco Cristian Anfisen foi um pioneiro no estudo da estrutura 3D de proteínas, e recebeu o Prêmio Nobel (1972) por suas descobertas.Anfisen estudou a Ribunuclease (14.000d), proteína com 8 cisteínas formando 4 pontes dissulfeto.

Ele demonstrou que era possível fazer uma desnaturação reversível da proteína, adicionando uréia e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes dissulfeto. Ao retirar lentamente (por diálise), esses reagentes, a proteína volta a ter atividade biológica, mostrando que voltou à sua conformação nativa.

Esse fato é surpreendente pois as 8 cisteínas, combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades, de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas o arranjo original de pontes se forma.

A conclusão de Anfisen foi a de que a sequência dos aminoácidos (não alterada na desnaturação) é o que determina a estrutura 3D das proteínas.

Por que diferentes moléculas de uma proteína apresentam sempre a mesma estrutura 3D ? De onde vem a informação para a estrutura tridimensional de uma proteína ?

A conformação nativa de uma proteína representa o estado de menor energia do sistema.

A energia que estabiliza a estrutura 3D de uma proteína vem do aumento da entropia da água, representando “desorganização” da água à medida que interagem com a proteína.

In vivo conformações intermediárias das proteínas são estabilizadas por chaperonas durante o processo de síntese proteica.

Como é possível termodinamicamente que as proteínas tenham estruturas tão altamente organizadas ?

De onde vem a energia que estabiliza a estrutura 3D das proteínas ?

entropia

ener

gia

Estrutura nativa

Utilize o programa RasMol para explorar a estrutura tridimensional de proteínas:

1. Clique aqui para fazer o download do arquivo rw32b2a.exe. Salve-o numa pasta em seu computador.

2. Faça o download dos arquivos .pdb da quimotripsina e da pepsina.

3. Execute o RasMol (clique 2X no arquivo rw32b2a.exe) e abra os arquivos .pdb

4. Explore as várias formas de visualização das proteínas.

Encerramos aqui a segunda aula da disciplina Biofísica de Proteínas.

No ED 2 aplicaremos vários dos conceitos aprendidos hoje.

• Níveis de organização estrutural das proteínas

• Modelos de estrutura proteica

• Métodos de estudo da estrutura primária de proteínas

• Forças estabilizadoras da estrutura de proteínas