UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)

WALCIANE DA SILVA

Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na

lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)

Versão corrigida da Tese conforme Resolução CoPGr 5890

São Paulo

Data do Depósito na SPG: 03/10/2012

WALCIANE DA SILVA

Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na

lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)

Tese apresentada ao Instituto de Química da

Universidade de São Paulo para obtenção do

Título de Doutor em Ciências (Bioquímica).

Orientadora: Profa. Dra. Clélia Ferreira

São Paulo

2012

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO _________________________________ INSTITUTO DE QUÍMICA

“Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)”

Tese de Doutorado submetida ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutora em Ciências - Área: Bioquímica.

Aprovada por:

__________________________________________ Profa. Dra. Clélia Ferreira Terra

Orientadora e Presidente

__________________________________________

Profa. Dra. Carla Columbano de Oliveira IQ - USP

__________________________________________

Prof. Dr. Carlos Takeshi Hotta IQ - USP

__________________________________________ Prof. Dr. Carlos Eduardo Winter

ICB - USP

__________________________________________

Prof. Dr. Ednildo de Alcantara Machado UFRJ

SÃO PAULO 23 de novembro de 2012

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Fátima e Donizete, pelo apoio incondicional

Aos meus irmãos Franciscarlla e Danilo

À minha avó Maria Jorge (in memoriam)

À Deus

À minha orientadora Profa. Dra. Clélia Ferreira, pela orientação, paciência, empenho e intensa dedicação. Ao Professor Dr. Walter Ribeiro Terra pelas valiosas discussões e sugestões em todas as etapas do trabalho. Aos amigos de laboratório pela convivência agradável e pela troca de experiências de bancada, Dr. Marcelo Padilha, Dr. Fábio Tamaki, Dra. Thaís Bifano, Dr. Ivan Bragatto, Juliene Jéssica, Guilherme Pereira, Daniela de Jesus. Em especial à Nathália Ramalho, Ticiane Damasceno, Katia Rebola e André Pimentel. À Dra. Fabiane Cançado, pela ajuda em experimentos, pelas discussões construtivas, pelos momentos de descontração e pela amizade. À Dra. Daniela Beton e Dra. Maria Cícera da Silva pela ajuda principalmente nas técnicas de biologia molecular. À técnica Christiane Cardoso pela importante ajuda nas análises de bioinformática. Aos técnicos: Gilliard de Faria, Ivanilde Marcelino, Izaura Toma, Dra. Layla Martins, Claudia Siqueira, Luci Navarro, Alexandre Sanchez e em especial a técnica Luiza Nakabayashi. Ao Professor Alberto de Freitas Ribeiro e ao técnico Waldir Caldeira pela colaboração em experimentos de microscopia eletrônica. Aos membros da banca examinadora pelas importantes sugestões e correções. Aos professores do Departamento de Bioquímica do IQ-USP por disponibilizarem os equipamentos de seus laboratórios. Aos colegas: Dra. Adriana Lopes, Ana Laura Borges, Antônio Filho, Marcio Cabral, Daniela Cunha, Dra. Daniela Gonzales e Alexsandra Scalfo. Às amigas do alojamento 102 Luziene Grandi, Sandra Andrade, Elaine Martins, Renata, Milessa Afonso. Em especial a Ana Paula Batista pela ajuda em química, pela convivência e amizade. Ao José Augusto pela ajuda, apoio e dedicação. Aos meus familiares e amigos pelo apoio e carinho apesar da distância. Às agências de fomento Capes, CNPq e Fapesp, pelo suporte financeiro.

RESUMO

Silva, W. Proteínas envolvidas na secreção microapócrina na lagarta de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). 2012. 124p. Tese de Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

A região anterior do intestino médio de Lepidoptera apresenta uma secreção

microapócrina de enzimas digestivas com vesículas migrando pelo interior das

microvilosidades. Essas vesículas brotam das microvilosidades intestinais como

vesículas de membrana dupla e são descarregadas dentro do lúmen. O objetivo

desse trabalho foi identificar as proteínas secretadas e aquelas envolvidas na

maquinaria secretória microapócrina em Spodoptera frugiperda. Para isso, vesículas

microapócrinas foram preparadas e usadas para a produção de anticorpo policlonal.

Esse anticorpo foi utilizado para varrer uma biblioteca de expressão de cDNA do

intestino médio de S. frugiperda. Também obtivemos um transcriptoma por

pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos transcritos do

intestino médio do mesmo inseto. Os clones positivos da varredura foram

sequenciados, montados e submetidos a um BLASTN contra as sequências obtidas

pelo pirosequenciamento, o que resultou na extensão dessas sequências.

Usamos ainda as sequências geradas pelo pirosequenciamento para

reanalisar sequências de proteínas presentes nas membranas microvilares, que

tinham sido obtidas anteriormente em nosso laboratório (Ferreira et al., 2007). A

reanálise das sequências de proteínas microvilares gerou 66 proteínas preditas.

Dessas, 18 foram consideradas contaminantes de outros compartimentos celulares

e 48 associadas às membranas microvilares. A análise das sequências obtidas das

vesículas microapócrinas gerou 50 proteínas preditas que podem ser secretadas por

essa rota.

As sequências encontradas tanto em membrana microvilar quanto em

vesículas microapócrinas podem ser classificadas em 8 grupos, de acordo com sua

função: (1) enzimas digestivas; (2) proteínas da membrana peritrófica; (3)

envolvidas com proteção; (4) transportadores; (5) receptores; (6) proteínas da

maquinaria secretória; (7) proteínas de citoesqueleto; (8) com função desconhecida

nesse local. Em ambas as preparações existem uma predominância de sequências

de enzimas digestivas. Nas membranas microvilares a maioria das sequências são

aminopeptidases, enquanto nas vesículas microapócrinas a maioria são lipases.

Os cDNAs correspondentes as proteínas que poderiam estar envolvidas na

maquinaria secretória foram clonados e sequenciados. São elas: fimbrina, cofilina,

gelsolina-1 e miosina I. RT-PCRs semi-quantitativas dessas proteínas em diferentes

tecidos do inseto (intestino, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça)

mostraram que somente gelsolina-1 está presente exclusivamente no intestino.

Os domínios G1-G3 da gelsolina característica do intestino (gelsolina-1)

foram expressos e usados para produzir anticorpos em coelhos. Esses anticorpos

reconhecem a proteína recombinante e uma proteína presente no epitélio intestinal

com massa molecular compatível com a massa predita para gelsolina-1.

Foi possível diminuir a expressão de gelsolina-1 utilizando RNA interferente.

Palavras-chave: Lepidoptera, Spodoptera frugiperda, secreção microapócrina, proteínas microvilares, pirosequenciamento, gelsolina.

ABSTRACT Silva, W. Proteins involved in microapocrine secretion in Spodoptera frugiperda caterpillar (Lepidoptera). 2012. 124p. PhD Thesis - Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

Lepidoptera anterior midgut presents a microapocrine secretion of digestive

enzymes with secretory vesicles migrating inside the microvilli. These vesicles bud

from the midgut microvilli as double membrane vesicles and are discharged into the

lumen. The aim of this work was to identify the proteins secreted and those involved

in the microapocrine secretory machinery in Spodoptera frugiperda larvae. For this,

microapocrine vesicles were prepared and used for polyclonal antibody production.

This antibody was used to screen a cDNA expression library of S. frugiperda midgut.

We also obtained a transcriptome by pyrosequencing a cDNA library derived from

transcripts of the midgut. Positive clones from the screening were sequenced,

assembled and N-blasted against S. frugiperda sequences obtained by

pyrosequencing. This procedure led to the extension of the sequences previously

obtained.

We also used the sequences generated by pyrosequencing to reanalyze the

sequences of microvillar membrane proteins obtained previously by Ferreira et al.

(2007). This reanalysis generated 66 predicted proteins that are present in the

microvillar membranes. Eighteen were considered to be contaminants from other

compartments and 48 associated with the microvillar membranes. Analysing the

sequences from microapocrine vesicles we found 50 predicted proteins that should

be secreted by microapocrine vesicles.

The sequences found in both microvillar membrane and microapocrine

vesicles may be classified into 8 groups, according to their function: (1) digestive

enzymes; (2) peritrophic membrane proteins; (3) protection; (4) transporters; (5)

receptors; (6) secretory machinery; (7) cytoskeleton; (8) with unknown function. In

both preparations there is a predominance of sequences of digestive enzymes. In

microvillar membranes, there is a remarkable amount of aminopeptidases, while in

microapocrine vesicles this is true for lipases.

cDNAs coding for proteins that could be involved in the microapocrine

secretory machinery were cloned and sequenced. They are: fimbrin, cofilin, gelsolin-

1 and myosin I. Using RT-PCR, we showed that mRNAs coding for gelsolin-1 and

myosin I are present only in the intestinal tissue. The mRNAs coding for other

proteins were found in all tissues.

The domains G1-G3 from gelsolin specific from intestinal midgut (gelsolin 1)

were expressed and used to raise antibodies in rabbit. These antibodies were able to

recognize the recombinant protein and a protein from the midgut epithelium that has

a molecular weight similar to the one predicted from gelsolin-1 sequence.

We succeed in decreasing the expression of gelsolin-1 by using interfering

RNA.

Keywords: Lepidoptera, Spodoptera frugiperda, microapocrine secretion, microvillar proteins, pyrosequencing, gelsolin.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Lagarta (a) e adulto (b) de Spodoptera frugiperda. ...................................... 17

Figura 2: Esquema representativo do sistema digestório dos insetos. ........................ 19

Figura 3: Modelos de processos secretórios de enzimas digestivas de insetos. ......... 22

Figura 4: Representação esquemática da formação de F-actina e reciclagem de G-

actina. ......................................................................................................................... 29

Figura 5: Representação esquemática da organização dos domínios de proteínas da

superfamília gelsolina. ................................................................................................ 32

Figura 6: Esquema representativo da obtenção das amostras P1 e P3 de S.

frugiperda. ................................................................................................................... 38

Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão da preparação de VM e ápice de uma

célula intestinal da região anterior do ventrículo de S. frugiperda. ............................... 60

Figura 8: Especificidade de anticorpos produzidos contra proteínas presentes em VM,

P1 e P3. ...................................................................................................................... 61

Figura 9: Distribuição do número de reads segundo seu tamanho em pb, obtida no

pirosequenciamento da biblioteca de cDNA do IM de S. frugiperda. ........................... 64

Figura 10: Porcentagem de sequências diferentes encontradas em membranas

microvilares (MM), ou vesículas microapócrinas (VM). ............................................... 77

Figura 11: Cladograma (neighbor joining) de sequências de aminopeptidases de S.

frugiperda e outros lepidópteros .................................................................................. 80

Figura 12: Cladograma (neighbor joining) de sequências de amilase de S. frugiperda e

outros lepidópteros, um transportador de aminoácido e um transportador de ácido

orgânico ...................................................................................................................... 81

Figura 13: Cladograma (neighbor joining) de sequências de lipases de S. frugiperda e

sequências similares ................................................................................................... 81

Figura 14: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-1 de S.

frugiperda. ................................................................................................................... 85

Figura 15: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-2 de S.

frugiperda. ................................................................................................................... 86

Figura 16: Alinhamento de sequências de aminoácidos de duas PDIs de S. frugiperda.

.................................................................................................................................... 88

Figura 17: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da fimbrina de S.

frugiperda. ................................................................................................................... 90

Figura 18: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da miosina I de S.

frugiperda. ................................................................................................................... 93

Figura 19: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da cofilina de S.

frugiperda. ................................................................................................................... 95

Figura 20: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da gelsolina-1 de S.

frugiperda. ................................................................................................................... 97

Figura 21: Padrão de expressão dos mRNAs codificantes de proteínas possivelmente

envolvidas com a maquinaria da secreção em diferentes tecidos de lagartas de S.

frugiperda mostrados por RT-PCR semi-quantitativa. ................................................. 99

Figura 22: Análise da construção pAE-gelsolina. ..................................................... 100

Figura 23: Análise do perfil de indução de células de E. coli BL21(DE3) transformadas

com o vetor pAE/gelsolina com IPTG 1 mM a 37ºC, 25ºC e 20ºC por 20 h. .............. 102

Figura 24: Solubilidade da gelsolina recombinante de S. frugiperda a 37ºC, 25ºC e

20ºC. ......................................................................................................................... 103

Figura 25: Análise por SDS-PAGE 12% das frações obtidas após a segunda

cromatografia de afinidade para purificação da gelsolina expressa em E. coli

BL21(DE3). ............................................................................................................... 104

Figura 26: Western blot após SDS-PAGE (12%) da proteína recombinante do epitélio

do ventrículo com o anticorpo anti-gelsolina.............................................................. 105

Figura 27: RT-PCR semi-quantitativa para confirmação da diminuição do número de

transcritos do gene da gelsolina de S. frugiperda. ..................................................... 107

Figura 28: Peso médio das lagartas de S. frugiperda após injeções com água livre de

nucleases e dsRNA-gelsolina. .................................................................................. 107

Figura 29: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3

dias após a injeção de água livre de nucleases ou dsRNA-gelsolina . ...................... 109

Figura 30: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3

dias após a injeção de água livre de nucleases ou dsRNA-gelsolina . ...................... 110

Figura 31: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas de S.

frugiperda 3 dias após a injeção de RNA interferente. .............................................. 111

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados para a obtenção do cDNA completo

codificante das proteínas de interesse. ....................................................................... 41

Tabela 2: Sequência dos iniciadores utilizados na realização da RT-PCR semi-

quantitativa.................................................................................................................. 45

Tabela 3: Atividades específicas (mU/mg proteína) de enzimas digestivas em

diferentes amostras preparadas do intestino de S. frugiperda. .................................... 63

Tabela 4: Resumo dos dados obtidos no pirosequenciamento da biblioteca de cDNA

obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda ..................................................... 64

Tabela 5: Contigs codificando proteínas encontradas em membranas microvilares

classificadas como contaminantes ou com função desconhecida. .............................. 66

Tabela 6: Contigs codificando proteínas encontradas nas membranas microvilares

intestinais de S. frugiperda. ............................................................................................ 67

Tabela 7: Contigs codificando proteínas encontradas nas vesículas microapócrinas

que contêm peptídeo sinal. ............................................................................................ 71

Tabela 8: Contigs codificando proteínas encontradas em vesículas microapócrinas

sem peptídeo sinal ou que não possuem a porção N-terminal. .................................... 73

Tabela 9: Contigs codificando proteínas presentes nas vesículas microapócrinas

classificados como contaminantes ou outras com sequência incompleta e proteínas

sem peptídeo sinal. ......................................................................................................... 74

Tabela 10: Proteínas preditas que podem estar envolvidas na maquinaria de secreção

microapócrina de secreção microapócrina selecionadas como candidatas a partir de

pesquisa na literatura e encontradas no Spodobase..................................................... 83

Tabela 11: Identidades e similaridades das sequências de PDI-1 e PDI-2 de S.

frugiperda com PDIs presentes em outros insetos. ....................................................... 87

Tabela 12: Identidades e similaridades das PDIs de S. frugiperda e humanos. .......... 88

Tabela 13: Identidades e similaridades da sequência de fimbrina de S. frugiperda com

as de outros insetos. ....................................................................................................... 91

Tabela 14: Identidades e similaridades da sequência de miosina I de S. frugiperda

com as de outros insetos. ............................................................................................... 94

Tabela 15: Identidades e similaridades da sequência de cofilina de S. frugiperda com

as de outros insetos. ....................................................................................................... 95

Tabela 16: Identidades e similaridades da sequência de gelsolina de S. frugiperda com

as de outros insetos. ....................................................................................................... 98

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Abs Absorbância ABD Domínio ligante de actina ABP Proteína ligante de actina ADP Adenosina bifosfato ATP Adenosina trifosfato Blast Basic local aligment search BSA Albumina do soro bovino cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar DEPC Dietilpirocarbonato dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfatados dsRNA RNA de fita dupla EDTA Etilenodiaminotetracetato de sódio EST Expressed sequence tags F-actina Filamento de actina G1-G3 Domínios G1, G2 e G3 da gelsolina 1 de S. frugiperda G-actina Actina globular GFP Gene codificador da green fluorescent protein GPI Âncora de glicosilfosfatidilinositol IM Intestino médio IPTG Isopropiltiol beta-D-galactopiranosídeo KDa Quilodaltons LB Meio de cultura de Luria-Bertani mRNA RNA mensageiro MP Membrana peritrófica mU Miliunidades NCBI National Center for Biotechnology Information NTPs nucleotídeos trifosfatados NZ-amina caseína hidrolisada enzimaticamente NZY meio de cultura com NZ-amina P1 e P3 Preparações de um fracionamento celular de membranas

microvilares pb Pares de bases PCR Reação em cadeia da polimerase PDI Proteína dissulfeto isomerase PMSF Fenilmetilsulfonil fluoreto RNAi RNA interferente rpm Rotações por minuto RT-PCR Transcriptase reversa SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS SM Meio de suspensão TAE Tampão Tris acetato EDTA TBS Tampão Tris salina Tris Tri (hidroximetil) amino metano VM Vesículas microapócrinas X-gal 5-bromo-4-cloro-3-indoil-β-D-galactopiranosídeo

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 15

1.1. Considerações iniciais ....................................................................................... 15 1.2. Sistema digestório dos insetos .......................................................................... 18 1.3. Processos de secreção de proteínas ................................................................ 19 1.4. Proteínas microvilares intestinais de insetos ..................................................... 25 1.5. Proteínas potencialmente envolvidas na secreção microapócrina .................... 27

2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 36 3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ................................................................ 37

3.1. Animais .............................................................................................................. 37 3.2. Preparação das amostras de S. frugiperda ....................................................... 37 3.3. Microscopia eletrônica ....................................................................................... 38 3.4. Ensaios de atividades enzimáticas .................................................................... 39 3.5. Procedimentos para manipulação e análises de ácidos nucléicos .................... 40

3.5.1. Iniciadores para amplificação do cDNA codificante de PDIs (1 e 2), fimbrina, miosina I, cofilina e gelsolina-1. ............................................................................ 40 3.5.2. PCR ............................................................................................................ 42 3.5.3. Eletroforese em gel de agarose .................................................................. 42 3.5.4. Purificação do produto de PCR a partir do gel de agarose ......................... 42 3.5.5. Ligação de produtos de PCR em plasmídeo ............................................... 43 3.5.6. Transformações de células competentes .................................................... 43 3.5.7. Purificação de plasmídeos .......................................................................... 44 3.5.8. Sequenciamento de DNA ............................................................................ 44 3.5.9. RT-PCR semi-quantitativa .......................................................................... 44

3.6. Procedimentos para varreduras de biblioteca de cDNA .................................... 46

3.6.1. Preparação de anticorpos anti-P1, anti-P3 e anti-VM ................................. 46 3.6.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) ........... 47 3.6.3. Western blotting .......................................................................................... 47 3.6.4. Plaqueamento e indução das bibliotecas de cDNA..................................... 48 3.6.5. Imunoensaios nas membranas de nitrocelulose ......................................... 49 3.6.6. Coleta dos clones positivos ......................................................................... 50 3.6.7. Excisão do plasmídeo Bluescript ................................................................ 50

3.7. Procedimentos para o pirosequenciamento ...................................................... 52

3.7.1. Purificação do mRNA das amostras do IM ................................................. 52 3.7.2. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda .......................................................................................... 52

3.8. Análises de bioinformática ................................................................................. 53 3.9. Procedimentos para obtenção e análise de gelsolina recombinante ................. 54

3.9.1. Expressão da gelsolina em Escherichia coli ............................................... 54 3.9.2. Teste de solubilidade da gelsolina recombinante ....................................... 55 3.9.3. Purificação parcial da gelsolina recombinante ............................................ 56 3.9.4. Produção de anticorpos policlonais anti-gelsolina ...................................... 56 3.9.5. Detecção imunológica de proteínas ............................................................ 57

3.10. RNA interferente de gelsolina .......................................................................... 57

4. RESULTADOS ..................................................................................................... 59

4.1. Preparação das amostras de vesículas microapócrinas, frações subcelulares (P1 e P3) e obtenção de anticorpos ......................................................................... 59 4.2. Enzimologia de vesículas microapócrinas ......................................................... 62 4.3. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos mRNAs do IM de S. frugiperda ........................................................................................................ 63 4.4. Identificação de proteínas microvilares intestinais de S. frugiperda .................. 64 4.5. Identificação de proteínas presentes nas vesículas microapócrinas de S. frugiperda ................................................................................................................. 69 4.6. Comparação das sequências presentes nas microvilosidades e vesículas micrapócrinas ........................................................................................................... 76 4.7. Comparação de algumas sequências selecionadas de enzimas digestivas ..... 78 4.8. Sequências de proteínas que poderiam estar relacionadas ao mecanismo da secreção microapócrina ........................................................................................... 82

4.8.1. Proteína dissulfeto isomerase (PDI)............................................................ 84 4.8.2. Fimbrina ...................................................................................................... 89 4.8.3. Miosina I ...................................................................................................... 91 4.8.4. Cofilina ........................................................................................................ 94 4.8.5. Gelsolina-1 .................................................................................................. 95

4.9. RT-PCR semi-quantitativa das proteínas que poderiam estar envolvidas na secreção microapócrina ........................................................................................... 98 4.10. Gelsolina-1: Expressão heteróloga, produção de anticorpos e supressão da expressão com RNA interferente .............................................................................. 99

4.10.1. Produção de gelsolina recombinante ...................................................... 100 4.10.2. Produção do anticorpo anti-gelsolina e imunocitolocalização no epitélio intestinal de S. frugiperda ................................................................................... 105 4.10.3. Diminuição da expressão de gelsolina utilizando RNA interferente ........ 106

5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 113

5.1. Proteínas presentes em diferentes compartimentos celulares ........................ 113 5.2. Proteínas presentes nas microvilosidades de S. frugiperda ............................ 114 5.3. Secreção microapócrina em S. frugiperda....................................................... 117

6. CONCLUSÕES .................................................................................................. 121 7. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 123 SÚMULA CURRICULAR ........................................................................................ 139

15

1. INTRODUÇÃO

1.1. Considerações iniciais

Com uma projeção populacional humana de 10 bilhões para 2050, uma

prioridade imediata para a agricultura é o aumento da produtividade das culturas de

uma maneira sustentável e rentável (Gatehouse et al., 2011). Atualmente a

produção mundial de alimentos torna-se ameaçada diante ao ataque de pragas, que

acarretam perdas de aproximadamente um terço da produção de alimentos durante

o processo de crescimento, colheita e estocagem (Ware, 1994; Sarmento et al.,

2002). Dentre as diversas pragas que atacam as culturas, destacam-se os insetos.

Os insetos são organismos bem sucedidos e apresentam o maior sucesso

evolutivo na história da vida na Terra. Provavelmente um pouco mais de 1 milhão de

espécies já foram descritas, ou registradas em alguma publicação taxonômica

(Gullan e Cranston, 2010). Uma melhor ideia da representatividade desses

organismos na Terra é percebida quando notamos que esse 1 milhão de espécies já

descritas corresponde a mais de 50% de todos os seres vivos, considerando

animais, plantas, fungos, bactérias e vírus. As espécies de insetos descritas estão

distribuídas desigualmente entre os grupos taxonômicos chamados ordens. Cinco

principais ordens destacam-se por sua alta riqueza de espécies: Coleoptera

(besouros), Diptera (moscas), Hymenoptera (vespas, formigas e abelhas),

Hemiptera (percevejos) e Lepidoptera (borboletas e mariposas) (Gullan e Cranston,

2010).

Estima-se que cerca de 10-20% das perdas na produção das principais

plantações globais sejam devido aos insetos-praga (Ferry et al., 2006). Os insetos-

praga não apenas provocam perdas na produtividade diretamente, devido ao ataque

herbívoro, mas também indiretamente por atuarem como vetores de vários

patógenos de plantas (Hilder e Bouter, 1999).

Os danos causados por insetos na agricultura ainda persistem apesar de

muitos anos de pesquisa para desenvolver métodos eficazes de controle. Os

insetos-praga têm sido controlados principalmente com a utilização de inseticidas

químicos. Desde sua introdução em 1947, os inseticidas são a principal contribuição

para a produção de alimentos, entretanto, sabe-se que esses produtos representam

16

preocupações ambientais e de saúde (Gatehouse et al., 2011). O uso indiscriminado

destes compostos sintéticos tem originado problemas graves e bem conhecidos,

incluindo resistência genética de espécies pragas, resíduos tóxicos em produtos

armazenados, aumento nos custos de aplicação, riscos de manipulação, poluição

ambiental, entre outros (Rembold, 1994; Adeyemi, 2010). Embora alguns processos

alternativos de controle já tenham sido implantados, estamos longe de podermos

dispensar os agrotóxicos.

Existem poucos exemplos de substâncias químicas que foram desenvolvidas

a partir da identificação de um processo específico ou proteína alvo envolvida na

invasão de hospedeiro ou doença (Belay et al., 2012). Em decorrência disso, insetos

benéficos como as abelhas e mariposas selvagens além dos parasitóides e

predadores das pragas agrícolas também são afetados. Dessa forma, além de

eliminar os inimigos naturais, selecionamos artificialmente, de forma global, pragas

cada vez mais resistentes a agentes químicos.

Nos últimos anos, as plantações expressando δ-endotoxinas de Bacillus

thuringiensis (Bt) também conhecidas como proteínas Cry tiveram um impacto

benéfico e significativo na agricultura global em termos de redução de pragas e

melhorias na qualidade de plantações (Gatehouse et al., 2011). Na ingestão, as

toxinas Bt são solubilizadas no intestino onde são proteoliticamente clivadas na

região N-terminal na sua forma ativa, responsável por ligar-se a receptores

presentes nas células epiteliais intestinais, formando poros que resulta na morte

celular por lise osmótica, seguida pela morte do inseto (Gatehouse et al. 2011).

Culturas transgênicas foram primeiro comercializadas em meados da década de

1990 com a introdução de plantas de milho, batatas e algodão expressando toxinas

Bt. Em 2010, 148 milhões de hectares de plantações biotecnológicas foram

cultivadas em 29 países, representando 10% de todos 1,5 bilhões de hectares de

terras cultivadas do mundo (Gatehouse et al., 2011). Entretanto, por causa do

potencial dos insetos-praga em desenvolver resistência, e também devido ao risco

de plantas transgênicas atingirem organismos não alvos, vários tipos de estratégias

alternativas continuam sendo desenvolvidas. Atualmente os estudos envolvem

conhecimentos básicos sobre a bioquímica de digestão dos insetos, genes de

vegetais codificando proteínas com atividade inseticida, a utilização da genômica

funcional para identificar genes de resistência endógena e uso de RNA interferente

(Gatehouse et al., 2011).

17

Pelo exposto acima, fica claro o quanto o desenvolvimento de novas formas

de controle de insetos é necessário. O sistema digestório dos insetos constitui a

maior interface desprotegida de contato entre o inseto e o meio ambiente, tornando-

se um alvo relativamente mais frágil para ser atacado por substâncias que visem

desorganizar alguma de suas propriedades. Desta forma, certificamos que é

necessário um aprofundamento nos estudos relacionados com a fisiologia e

bioquímica do sistema digestório dos insetos a fim de obter maior conhecimento dos

processos que nele ocorrem, o que poderia levar a um aprimoramento eficiente nas

técnicas de controle dos insetos-praga.

O inseto-praga utilizado nesse estudo é o Lepidoptera Spodoptera frugiperda

(Lepidoptera: Noctuidae) (Figura 1). Sua lagarta é conhecida como a lagarta do

cartucho do milho ou lagarta militar. No Brasil, S. frugiperda é a principal praga do

milho e também causa prejuízo significativo na cultura de algodão. S. frugiperda

pode ainda atacar alfafa, amendoim, arroz, aveia, batata, batata doce, cana-de-

açúcar, hortaliças, soja e trigo (Pashley, 1988). As lagartas recém emergidas

alimentam-se das folhas mais novas do milho (cartucho do milho) e em seguida,

atacam todas as folhas centrais, destruindo-as completamente (Gallo et al., 1988).

Assim, S. frugiperda afeta a capacidade fotossintética da planta e,

consequentemente, a produção (Sarmento et al., 2002). Em ocorrências tardias,

pode atacar a espiga e propiciar a entrada de patógenos e umidade (Ávila et al.,

1997) aumentando os prejuízos.

Figura 1: Lagarta (a) e adulto (b) de Spodoptera frugiperda (Fotos: Embrapa arroz e feijão e

Ivan Cruz).

18

1.2. Sistema digestório dos insetos

O sistema digestório dos insetos embora apresente considerável variação

entre as ordens, pode ser esquematizado na figura 2 (Terra e Ferreira, 1994). Ele é

formado por uma região anterior, uma média e uma posterior.

O intestino anterior começa na boca e inclui a faringe, o esôfago, o papo e o

proventrículo, que é um órgão triturador em alguns insetos e em outros apenas uma

válvula que regula a entrada de alimento no intestino médio (IM), principal sítio de

digestão e absorção de nutrientes. O papo é um órgão de armazenamento em

alguns insetos.

O intestino posterior inclui os túbulos de Malpighi (órgãos excretores), o íleo,

o cólon e o reto (envolvidos na absorção de água e íons) e o ânus.

O intestino médio é a única região que não é revestida por quitina e é

responsável pela secreção de enzimas e pela absorção de nutrientes. Ele pode ser

apenas um cilindro, denominado ventrículo, ou apresentar cecos gástricos em

número, tamanho e localização variável conforme a espécie. O bolo alimentar é

contido em uma membrana semipermeável denominada membrana peritrófica (MP)

composta por quitina e proteínas. A MP delimita o espaço endoperitrófico (onde se

encontra o bolo alimentar) e o espaço ectoperitrófico (espaço luminal entre a MP e o

epitélio).

Os Lepidoptera não possuem cecos gástricos, seu IM é bem maior que as

demais regiões e tem o formato de um cilindro de igual diâmetro, que é também

denominado ventrículo. No ventrículo dos Lepidoptera encontramos, além de células

colunares (responsáveis pela absorção de nutrientes e secreção de enzimas e

outras proteínas), umas poucas células endócrinas, e células caliciformes

(responsáveis pela secreção de potássio).

O ventrículo dos Lepidoptera, embora não apresente diferenças

macroscópicas, possui alguma diferenciação antero-posterior. A região anterior do

ventrículo absorve fluidos e a região posterior do ventrículo secreta. Além disso, as

células caliciformes dessas duas regiões apresentam morfologia diferente, sendo

que na região anterior a maior parte da cavidade formada pela invaginação da

membrana apical encontra-se na região basal da célula, enquanto na região

posterior essa cavidade é mais apical. Outra diferenciação refere-se às

microvilosidades das células caliciformes que apresentam nas duas regiões

19

quantidades diferentes de portassomos e mitocôndrias (Santos et al., 1984).

Entretanto, a diferença mais interessante encontrada entre essas regiões é o modo

pelo qual as proteínas são secretadas.

Figura 2: Esquema representativo do sistema digestório dos insetos (adaptado de Terra e

Ferreira, 1994).

1.3. Processos de secreção de proteínas

Um importante avanço no estudo de mecanismos secretórios resultou da

combinação de procedimentos bioquímicos e citológicos (Cristofoletti et al., 2001).

Enzimas digestivas, como todas as proteínas animais, são sintetizadas no retículo

endoplasmático rugoso, processadas no Complexo de Golgi e empacotadas dentro

de vesículas de secreção. Existem diversos mecanismos pelos quais os conteúdos

das vesículas secretórias são liberados no lúmen intestinal dos insetos e os

mecanismos secretórios dependem grandemente da região do IM. Os mecanismos

principais de secreção de proteínas são: secreção holócrina, exocitose e a secreção

apócrina. Um mecanismo peculiar, a secreção microapócrina está presente em

lepidópteros.

Na secreção holócrina, vesículas secretórias são armazenadas no citoplasma

até sua liberação, sendo que toda a célula secretória é perdida para o espaço

extracelular. Jarial (2005) examinou por microscopia eletrônica a região anterior do

IM de adultos de Cenocorixa bifida (Hemiptera: Corixidae) e verificou a presença de

células degenerando contendo grânulos secretórios na superfície luminal e a

ocorrência de vesículas vazias e fragmentos celulares no lúmen consistentes com a

20

secreção holócrina de enzimas digestivas (Jarial, 2005). Em insetos Stomoxys

calcitrans adultos, dados imunocitoquímicos mostraram que vesículas contendo

tripsina juntamente com organelas são descarregadas por células da zona opaca,

sugerindo secreção holócrina (Jordão et al., 1996).

Durante a secreção exocítica (Figura 3A), as vesículas de secreção fundem-

se com a membrana apical da célula intestinal esvaziando seu conteúdo sem perda

do citoplasma. Em todas as células eucarióticas, há uma corrente fixa de vesículas

exocíticas que brotam da rede trans de Golgi e se fusionam com a membrana

plasmática que trabalha continuamente e supre a membrana plasmática de

proteínas e lipídeos recém formados, além de liberar proteínas no espaço

extracelular (Alberts et al., 2011). Desde sua descoberta em 1950 (Palade, 1959), a

exocitose foi e ainda é grandemente investigada como sendo um processo para

descarregar produtos secretórios hidrofílicos (por exemplo, neurotransmissores,

hormônios e enzimas) para o espaço extracelular (Chieregatti e Meldolesi, 2005).

Pytelkova e colaboradores (2009) verificaram através de imunomarcação que α-

amilases são secretadas por secreção exocítica nas células intestinais da mariposa

da farinha Ephestia kuehniella. Tripsina é secretada na região posterior do IM de

mosquitos adultos (Graf et al., 1986), larvas de moscas (Jordão et al., 1996) e

lagartas (Jordão et al., 1999) também por exocitose. Jarial (2005) verificou a

presença de grânulos secretórios próximos à membrana plasmática apical de C.

bifida, sugerindo a liberação de secreção por exocitose.

Na secreção apócrina (Figura 3B) o processo secretório é acompanhado de

perda de parte do citoplasma apical (Gesase e Satoh, 2003). Cristofoletti e

colaboradores (2001) utilizaram anticorpos anti-amilase e anti-tripsina para

imunocitolocalizar amilase e tripsina respectivamente em células intestinais de

Tenebrio molitor (Coleoptera). Eles verificaram que amilases são encontradas no

interior de vesículas em uma protuberância apical na região anterior do IM enquanto

que tripsinas são encontradas na região posterior do IM sendo liberadas por

exocitose. Alguns autores interpretam a liberação dessas protuberâncias celulares

como secreção holócrina, ao invés de apócrina, enquanto outros sugerem que elas

são parte de um processo de renovação celular (Terra e Ferreira, 1994; Cristofoletti

et al., 2001). Assim o processo de secreção apócrina em inseto envolve vesículas

secretórias originadas de áreas do Golgi que aparentemente fundem-se antes de

serem liberadas com a protuberância apical, contrastando com mecanismos

21

apócrinos conhecidos para vertebrados. No mecanismo secretório apócrino humano

a protuberância apical é de estrutura homogênea e nenhuma organela é encontrada

nessas protuberâncias (Schaumburg-Lever e Lever, 1975; Stoeckelhuber et al.,

2003). As moléculas secretadas pelo mecanismo apócrino são sintetizadas dentro

do citoplasma e concentradas na região formadora da protuberância apical da

membrana plasmática (Wilhelm et al., 1998). Desta forma essas moléculas podem

ser secretadas apesar de elas não terem um peptídeo sinal que as direcionem para

a membrana plasmática por exocitose. Em humanos, glândulas apócrinas estão

distribuídas em várias áreas do corpo, como axilas, órgãos genitais femininos

externos, regiões inguinal, periumbilical, perianal, periareolar e também próstata que

usam mecanismos apócrinos para liberar seus produtos (Requena et al., 1998;

Saga, 2002; Wilhelm et al., 2003; Stoeckelhuber et al., 2011).

O mecanismo de secreção apócrina em glândulas da axila humana foi

investigada por Schaumburg-Lever e Lever (1975) através de microscopia

eletrônica. Inicialmente ocorre a formação de uma protuberância apical e então a

formação de uma membrana divisória horizontal na base da protuberância e

finalmente ocorre o aparecimento de túbulos sobre e paralelos à membrana divisória

causando a decapitação da protuberância seguida do provimento da membrana

plasmática para ambos, protuberância apical e membrana plasmática da célula.

Esses processos são similares aos que ocorrem durante a citocinese na divisão

celular, os quais são promovidos e regulados por muitos componentes

(Stoeckelhuber et al., 2011). As proteínas envolvidas na citocinese são

principalmente proteínas de citoesqueleto. Para investigar quais proteínas estão

envolvidas no mecanismo secretório apócrino em glândulas apócrinas axilares

humana, Stolckelhuber e colaboradores (2011) procuraram por proteínas

associadas à citocinese por tratar-se de um processo comparável com células

glandulares apócrinas. Através de imunohistoquímica, eles detectaram actina,

miosina II, citoqueratina 7 e 19, α e β-tubulina, anilina, cofilina, sintaxina 2, vamp

8/endobrevina e septina 2. Nas células glandulares altamente ativas estas proteínas

estão localizadas na base da protuberância apical, quando a protuberância está em

processo de liberação ou estão concentradas no topo da protuberância apical.

A ordem Lepidoptera apresenta um mecanismo de secreção peculiar, nunca

antes descrito, em que pequenas vesículas de secreção percorrem o interior de

microvilosidades na região anterior do ventrículo. Este tipo de secreção é

22

denominado secreção microapócrina e consiste na liberação de vesículas de dupla

membrana (Figura 3C), ou uma fusão de vesículas entre si e com o topo da

microvilosidade formando “bolhas” que se desprendem para o lúmen (Figura 3D).

Em ambos os casos, os conteúdos são liberados por solubilização causada pelo alto

pH existente no fluido ectoperitrófico ou por detergentes luminais (Terra e Ferreira,

2012).

M

VS

CG

N

RER

EC

VS

VS

Figura 3: Modelos de processos secretórios de enzimas digestivas de insetos. (A) Secreção

exocítica; (B) secreção apócrina; (C) secreção microapócrina com brotamento de vesículas;

(D) secreção microapócrina com vesículas formando “bolhas” que se destacam das

extremidades das microvilosidades. CG, complexo de Golgi; EC, extrusão celular; M,

microvilosidade; N, núcleo; RER, retículo endoplasmático rugoso; VS, vesícula de secreção

(adaptado de Terra e Ferreira, 2012). As vesículas liberadas na secreção microapócrina

podem ser recuperadas centrifugando-se o material presente no fluido ectoperitrófico.

Os modelos de secreção microapócrina de enzimas digestivas (Figuras 3C e

3D) foram propostos a partir de diversos estudos realizados por nosso grupo de

pesquisa. Santos et al., (1986), trabalhando com Erinniys ello e Ferreira et al.

(1994), trabalhando com Spodoptera frugiperda, reuniram dados experimentais para

um modelo de secreção de amilase e tripsina. Os autores realizaram

fracionamentos subcelulares do epitélio do ventrículo anterior e cada sedimento

obtido era diluído, congelado e descongelado, novamente homogeneizado e

centrifugado para poder distinguir-se entre uma enzima integrante de membrana de

23

uma envolta por membrana (por exemplo, uma proteína solúvel dentro de uma

vesícula de secreção). O fluido ectoperitrófico foi centrifugado e o mesmo

procedimento foi realizado com o material sedimentado. Atividades específicas de

marcadores celulares além de amilase e tripsina foram determinadas em todas as

frações. Cada material particulado obtido após o fracionamento subcelular foi

observado ao microscópio eletrônico. Segundo o modelo proposto, tripsina é

sintetizada ligada a membrana de pequenas vesículas que tem tamanho bem menor

que as vesículas exocíticas clássicas e migram por dentro das microvilosidades

celulares, brotando lateralmente ou fundindo-se com a membrana plasmática apical

dessas estruturas (secreção microapócrina).

O fato de destacarem-se porções específicas das microvilosidades para o

lúmen intestinal de S. frugiperda é confirmado pelo fato do material particulado

recuperado a partir do fluido ectoperitrófico apresentar atividade específica maior

para tripsina e amilase e menor para aminopeptidase (marcadora de membrana

microvilar) do que a verificada em preparações de microvilosidades (Bolognesi et

al., 2001). Esse modelo foi bastante corroborado quando imunocitolocalizações

utilizando anticorpos anti-tripsina e anti-amilase mostraram que as enzimas

realmente estavam presentes nas pequenas vesículas (Jordão et al., 1999 e

Bolognesi et al., 2001). A tripsina localiza-se preferencialmente nas bordas das

vesículas de secreção, indicando estar localizada na membrana da vesícula,

enquanto a amilase aparece mais em seu interior, indicando estar presente

preferencialmente na forma solúvel dentro das vesículas.

No enterócito de mamíferos, pequenas vesículas se destacam do topo das

microvilosidades (McConnell et al., 2009). Essas vesículas são compostas apenas

pela membrana microvilar e tem uma composição de enzimas digestivas diferente

daquela apresentada pela membrana microvilar total. A atividade de maltase-

glicoamilase, lactase-florizina hidrolase e sucrase isomaltase são menores nessas

vesículas do que na membrana microvilar. Por outro lado, a vesícula é enriquecida

de fosfatase alcalina (McConnell et al., 2009).

Essas vesículas são diferentes daquelas encontradas na secreção

microapócrina de Lepidoptera. Nos mamíferos elas correspondem a um brotamento

somente da membrana plasmática do topo da microvilosidade, não envolvendo uma

vesícula de secreção (McConnell e Tyska, 2007). Outra diferença é que para sua

secreção não há necessidade de grandes alterações no citoesqueleto da

24

microvilosidade inteira como em Lepidoptera, pois nesse último há uma vesícula

percorrendo o interior da microvilosidade.

A função dos dois tipos de vesículas também parece ser diferente. As

vesículas encontradas no lúmen de Lepidoptera contêm enzimas digestivas e outras

proteínas no seu interior, sendo responsáveis, pelo menos em parte, por sua

secreção (Jordão et al., 1999; Bolognesi et al., 2001). As vesículas encontradas em

mamíferos não parecem contribuir para a secreção digestiva, pois, conforme

comentado acima, elas ocorrem nesse compartimento em menor quantidade.

Pelo fato dessas vesículas intestinais dos mamíferos conterem grandes

quantidades de fosfatase alcalina, sua suposta função é de defesa contra infecções.

Fosfatase alcalina desfosforila e desintoxica lipopolissacarídeos bacterianos que

estão presentes em abundância na membrana externa de bactérias gram-negativas

(ver McConnell et al., 2009). A desfosforilação desse lipopolissacarídeo reduz sua

toxicidade em pelo menos 100 vezes (Schromm et al., 1998).

A presença desse mecanismo de secreção peculiar de lepidópteros, em que

pequenas vesículas de secreção enzimáticas percorrem o interior da

microvilosidade, deve ser possível, entre outras coisas, devido às propriedades

particulares do citoesqueleto dessas microvilosidades. Propriedades diferentes para

o citoesqueleto das microvilosidades das células da região anterior do ventrículo de

Lepidoptera foram encontradas. Quando se obtém uma fração rica em

microvilosidades, seja do intestino de mamíferos seja de insetos, elas continuam

bastante contaminadas com citoesqueleto (Jordão et al., 1995). Um tratamento

dessas microvilosidades com Tris hiperosmótico permite separar as membranas dos

elementos de citoesqueleto, tanto em mamíferos (Critchley et al., 1975) como em

insetos (Jordão et al., 1995; Capella et al., 1997). Quando esse tratamento é feito, a

atividade específica de enzimas marcadoras de membranas microvilares aumenta

nessa fração, pela remoção de proteínas do citoesqueleto. Isso acontece utilizando

intestino de mamíferos e diferentes regiões do tubo digestório de Tenebrio molitor

(Coleoptera), cecos de Rhynchosciara americana, partes do ventrículo de Musca

domestica (ambos Diptera) e a região posterior do ventrículo do Lepidoptera

Spodoptera frugiperda. Por outro lado, tratamento das microvilosidades obtidas da

região anterior desse último inseto não leva a nenhuma alteração na atividade

específica das enzimas marcadoras de membranas microvilares, indicando que os

elementos do citoesqueleto são mais facilmente removidos e são retirados já

25

quando se faz a preparação de microvilosidades. Esse resultado é confirmado

observando-se preparações de microvilosidades, onde se observa que as da região

anterior são bem mais livres de elementos eletrodensos (Capella et al., 1997).

A diferença de comportamento do citoesqueleto em Lepidoptera pode ser

devida a ausência de uma ou mais proteínas do citoesqueleto, a presença de

proteínas diferentes ou a presença das mesmas proteínas em quantidades muito

diferentes. Talvez não seja somente o citoesqueleto que sofre alterações, uma vez

que as vesículas de secreção microapócrina são bem menores que as exocíticas

clássicas, que aparecem na região posterior do mesmo ventrículo (Jordão et al.,

1999; Bolognesi et al., 2001).

Os mecanismos de secreção apócrina e microapócrina de enzimas digestivas

em células da região anterior do IM com a liberação de vesículas contendo enzimas

pode ser uma adaptação para aumentar a dispersão dos conteúdos das vesículas

dentro do lúmen intestinal de tecidos que absorvem água (Terra e Ferreira, 2012). O

movimento de fluidos em direção as células do ventrículo anterior poderia prevenir

uma difusão uniforme dos materiais secretados pela exocitose. Como as células do

intestino médio posterior secretam fluidos, não haveria problemas de dispersão do

material lançado por exocitose dessas células. Baseado em exemplos conhecidos,

mecanismos apócrinos parecem estar espalhados entre os insetos menos derivados

enquanto que os insetos mais derivados usam mecanismos microapócrinos em

tecidos que absorvem água (Terra e Ferreira, 2012).

1.4. Proteínas microvilares intestinais de insetos

As membranas desempenham papel crítico na estrutura celular por fornecer

uma barreira física entre a célula e seu meio e os vários compartimentos

subcelulares dentro das células eucarióticas. Apesar da estrutura básica das

membranas biológicas ser fornecida pela bicamada lipídica, as proteínas de

membrana desempenham a maioria das funções específicas das membranas

(Alberts et al., 2008). Assim sendo, as quantidades e os tipos de proteínas em uma

membrana são altamente variáveis. As diferentes proteínas de membrana estão

associadas às membranas de formas diferentes. As proteínas transmembrana se

estendem através da bicamada por uma α-hélice, ou múltiplas α-hélice ou folhas β-

dobradas (barril β). Outras proteínas estão localizadas no citosol, porém ficam

26

associadas à membrana por meio de uma α-hélice anfipática exposta na superfície

da membrana. Algumas proteínas podem se ligar a um dos lados da bicamada por

um ou mais grupos lipídicos covalentemente ligados. Há ainda proteínas ligadas

indiretamente a uma das faces da membrana por meio de ligações não covalentes

com outras proteínas de membrana (Alberts et al., 2011).

As membranas microvilares presentes nas células intestinais de inseto são

homólogas as que foram descritas para vertebrados e revisado por Bement e

Mooseker (1996). As microvilosidades intestinais de insetos foram isoladas pela

primeira vez por Ferreira e Terra (1980) usando uma técnica de precipitação

diferencial com cálcio (Schmitz et al., 1973) desenvolvida para mamíferos. Em

seguida Hanozet e colaboradores (1980) usaram a mesma técnica para isolar

microvilosidade de células colunares do intestino de lagarta de lepidóptero.

A técnica consiste em homogeneizar o tecido e em seguida adicionar um

cátion bivalente (usualmente Ca++). Os íons Ca++ causam aglutinação de

membranas, exceto das microvilares, por causa da carga eletrônica associada com

o glicocálix. O sobrenadante de uma centrifugação em baixa velocidade é

enriquecido em microvilosidades que podem ser recolhidas através de uma

subsequente centrifugação com média velocidade (ver Terra et al., 2006).

As preparações de microvilosidades podem ser usadas para mostrar que

enzimas digestivas integrais variam entre os diferentes taxa. Frequentemente elas

são: aminopeptidase, fosfatase alcalina, carboxipeptidase, dipeptidase e α-

glicosidase (Terra e Ferreira, 1994). As preparações de microvilosidades também

são usadas para encontrar transportadores de aminoácidos (Terra et al., 2006).

Transportadores de íons (Pullikuth et al., 2003) e aquaporinas (Le Caherec et al.,

1997) foram encontradas em membranas celulares apicais de insetos e acredita-se

serem proteínas microvilares. Além desses estudos, a pesquisa com receptores da

toxina Cry de B. thuringiensis tem levado a identificação de diversas proteínas

microvilares intestinais de lepidópteros como aminopeptidase (Knight et al., 1994) e

caderinas (Vadlamudi et al, 1995).

A densidade de membranas microvilares varia grandemente, com os insetos

que apareceram de modo tardio na evolução (insetos mais derivados) tendo

membranas mais densas (e, portanto maior conteúdo de proteínas) que insetos que

apareceram anteriormente na evolução (insetos menos derivados, Terra et al.,

2006). Embora um maior conteúdo de proteínas não necessariamente signifique

27

uma maior variedade de proteínas, há evidências que apóiam isso. Eletroforese em

gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) de proteínas microvilares

intestinais de coleópteros (densidade de membranas 1,08-1,10) resulta em menos

bandas visíveis que em lepidópteros e dípteros (densidade de membrana 1,14 -

1,16) (Jordão et al., 1995; Capella et al., 1997). Caso realmente seja verdade que

insetos mais derivados têm maior variedade de proteínas microvilares que insetos

menos derivados, a superfície celular intestinal parece desempenhar um papel mais

sofisticado em insetos mais derivados que nos menos derivados. A identificação das

proteínas presentes nas microvilosidades pode ajudar no entendimento da função

microvilar no mecanismo de secreção microapócrina.

Duas diferentes abordagens para o estudo do proteoma de preparações de

microvilosidades intestinais de vários lepidópteros têm sido realizadas. A primeira é

baseada na capacidade de separação por eletroforese em gel bidimensional (2D-

PAGE), com focalização isoelétrica na primeira dimensão seguida por SDS-PAGE

na segunda dimensão (Candas et al., 2003; Krishnamoorthy et al., 2007; McNall e

Adang, 2003). A segunda abordagem é baseada na varredura de uma biblioteca de

cDNA intestinal usando anticorpos produzidos contra preparações microvilares livre

de citoesqueleto (Ferreira et al., 2007). Pauchet e colaboradores (2009a) analisaram

o proteoma de microvilosidades intestinais de Manduca sexta através de duas

diferentes abordagens acopladas ao espectrômetro de massa para identificação das

proteínas. Na primeira, eles realizaram uma separação por cromatografia de troca

iônica de proteínas de microvilosidades solubilizadas por Triton X-100, seguida por

SDS-PAGE das frações contendo proteínas e na segunda abordagem foi feita uma

eletroforese nativa (blue Native-PAGE) seguida por SDS-PAGE numa segunda

dimensão. Eles identificaram proteínas classificadas como enzimas digestivas, alvos

ligantes da toxina Cry e proteínas envolvidas na transdução de sinais, ATP sintases

e uma proteína ligante da clorofila. Outras análises proteômicas de preparações de

membranas microvilares intestinais de lepidópteros encontraram as enzimas

digestivas descritas anteriormente além de outras proteínas como transportadores

ABC (ATP-binding cassette), ATPase, actina, caderina, afadina, etc (McNall e

Adang, 2003; Krishnamoorthy et al., 2007).

1.5. Proteínas potencialmente envolvidas na secreção microapócrina

28

Actina é um dos principais componentes do esqueleto celular que é essencial

para esculpir e manter a forma da célula, além de apoiar a dinâmica de inúmeros

processos como mobilidade celular, divisão celular e morfogênese para o tráfico

proteico intracelular (Cingolani e Goda, 2008). A actina foi descoberta pela primeira

vez em 1942 como sendo o principal componente proteico do músculo esquelético

de coelhos (Straub, 1942) e desde então diversos trabalhos científicos

demonstraram que esta proteína está presente em todas as células eucarióticas.

Os filamentos de actina são estruturas polarizadas consistindo de duas

extremidades com crescimento diferenciado, uma extremidade “mais”, onde o

crescimento é rápido e a outra “menos”, onde o crescimento é lento. A

reorganização dinâmica do citoesqueleto de actina é requerida para um grande

número de processos celulares, incluindo mobilidade celular, citocinese, e

morfogênese (Mohri, et al., 2006). Os filamentos de actina são regulados por um

mecanismo complexo envolvendo diversas proteínas ligantes de actina. A

maquinaria central de um rápido turnover de actina requer a nucleação de actina,

desmontagem dos filamentos e cobertura da extremidade “mais”, para limitar o

número de sítios de alongamento (Cooper e Schafer, 2000; Carlier et al., 2003;

Pollard e Borisy, 2003; Nicholson-Dykstra et al., 2005).

Actina existe em duas formas na célula, uma globular, a G-actina

monomérica e uma filamentosa e polimérica, a F-actina. G-actina é uma proteína de

cerca de 375 aminoácidos consistindo de 4 subdomínios que cercam uma fenda

geralmente ocupada por ATP (Kasai e Oosawa, 1969). F-actina é composta por

uma cadeia espiralada de moléculas idênticas de G-actina, todas “apontadas” para

a mesma direção em relação ao eixo da cadeia. Dentro da célula, estes filamentos

de actina são organizados para formar feixes ou redes tridimensionais. Podemos

verificar na figura 4 que F-actina apresenta uma polaridade estrutural com uma

extremidade mais e outra menos. Cada monômero livre de actina carrega uma

molécula de ATP, a qual é hidrolisada em ADP momentos após a incorporação do

monômero de actina ao filamento. Esta hidrólise reduz a resistência da ligação entre

os monômeros e diminui a estabilidade do polímero favorecendo a despolimerização

e contribuindo assim para a dinâmica da polimerização/despolimerização dos

filamentos de actina requerido pela célula. Assim, a dinâmica dos filamentos de

actina requer ATP, com a polimerização de ATP-actina ocorrendo na extremidade

29

“mais”, enquanto que ADP-actina dissocia-se da extremidade “menos” (Cooper,

2000).

As duas formas de actina, globular e filamentosa, coexistem em um estado

dinâmico sob o controle de múltiplos fatores, incluindo força iônica intracelular, pH e

diversas proteínas ligantes de actina (ABPs) (Remedios et al., 2003).

Extremidade (+) Extremidade (-)

ADP-Pi-actinaATP- actina ADP-actina

Figura 4: Representação esquemática da formação de F-actina e reciclagem de G-actina.

ATP-G-actina liga-se à extremidade (+) dos filamentos. A hidrólise de ATP facilita a

despolimerização removendo moléculas de G-actina da extremidade (-). ADP-G-actina

desassociada pode ser novamente fosforilada, e a ATP-G-actina formada é capaz de nova

polimerização (adaptado de Gungabissoon e Bamburg, 2003).

Células intestinais estão associadas umas com as outras por junções que

separam a membrana plasmática em um domínio basolateral e outro apical (Terra e

Ferreira, 2012). O domínio apical é geralmente modificado em microvilosidades que

são sustentadas por um citoesqueleto abundante em forma de feixes, composto de

filamentos de actina associados às proteínas ligantes destes filamentos. (Mooseker,

1985).

30

As microvilosidades estão onipresentes em células epiteliais em diferentes

filos de invertebrados, inclusive artrópodes e a morfologia das células intestinais de

diferentes espécies foram descritas (Noirot e Noirot-Timothée, 1972; Santos et al.,

1984; Camatini et al., 1993). Esses estudos demonstraram que a morfologia de

microvilosidades é similar a descrita para células intestinais de vertebrados e seu

interior também é constituído por F-actina (Kukulies et al., 1984; Camatini et al.,

1993). O epitélio do intestino de lepidópteros consiste de uma única camada de

células, e é o principal sítio de secreção de enzimas digestivas e absorção de

nutriente além de desempenhar importante papel na regulação de íons. Suas

células colunares são caracterizadas pela presença de microvilosidades cilíndricas

com cerca de 0,1µm de diâmetro e 5-7 µm de comprimento, contendo cerca de 8-12

feixes de F-actina (Camatini et al., 1993). Cerca de dois terços dos feixes de actina

das microvilosidades estão rodeados pela membrana plasmática, e um terço

remanescente projeta-se para o citoplasma apical como radículas (Bretscher, 1991).

A dinâmica da montagem e desmontagem dos filamentos de actina, sua

organização em feixes ou redes e sua associação com outras estruturas, tais como,

membrana plasmática, são reguladas por uma variedade de proteínas ligantes de

actina (ABPs), as quais são componentes críticos do citoesqueleto de actina.

Em 2003 Remedios e colaboradores enumeraram 162 diferentes ABPs

existentes, sem incluir suas isoformas. Tentativas de classificação destas ABPs

resultam em alguns “órfãos” que não se enquadram em nenhumas das famílias

(Remedios et al., 2003). Embora a classificação destas ABPs de acordo com suas

funções seja problemática, estas ABPs podem ser organizados nos seguintes

grupos: proteínas ligantes de monômeros, proteínas despolimerizantes, proteínas

que cortam os filamentos de actina, proteínas que cruzam F-actina, proteínas que

estabilizam os filamentos de actina e proteínas motoras (Ma, 2009).

Existe, portanto, um amplo espectro de ABPs responsáveis pelo rearranjo do

citoesqueleto de actina em uma variedade de processos celulares. Entre essas, as

proteínas da superfamília gelsolina controlam a organização da actina através de

suas funções de cortes dos filamentos e /ou ligação a extremidade do filamento de

actina impedindo nova polimerização.

Todos os membros da família gelsolina contêm de 3 a 6 cópias de um

domínio denominado gelsolina (G) de aproximadamente 120 aminoácidos.

Entretanto, alguns dos membros como, por exemplo, vilina, supervilina, flightless-I,

31

protovilina e EhABPH tem domínios adicionais no N-terminal ou C-terminal ou em

ambos (Figura 5).

A proteína gelsolina é a proteína mais estudada desta família

(Chumnarnsilpa, 2009). Gelsolina é uma proteína reguladora da dinâmica dos

filamentos de actina. Possui 6 domínios homólogos (G1-G6), cada um contendo um

sítio conservado ligante de cálcio. A função ligante de actina de gelsolina resulta de

três sítios ligantes de actina independentes (G1, G2 e G4). A atividade de corte está

localizada na metade N-terminal da molécula, nos segmentos G1-G3 (Way et al.,

1989).

Gelsolina foi isolada pela primeira vez de macrófagos de coelhos em 1979

por Yin e Stossel em estudos baseados na sua habilidade de regular a estrutura

citoplasmática de uma maneira dependente de cálcio. Em humanos existem duas

formas de gelsolina conhecidas, uma intracelular (ou citoplasmática) e uma

extracelular encontrada no plasma (Wen et al., 1996). Muito pouco é conhecido a

respeito da diferença entre as duas formas. Ambas as formas contêm 6 domínios do

tipo gelsolina (G1-G6), entretanto a forma extracelular contém uma extensão da

sequência N-terminal de 25 aminoácidos de função desconhecida (Kwiatkowski et

al., 1988).

Gelsolina está envolvida na regulação da motilidade celular, na transdução de

sinas em rearranjos da arquitetura citoesquelética e até na estimulação da morte

celular programada em certas células de vertebrados (Kwiatkowiski et al., 1989; Yin,

1999; McGough et al., 2003). Devido a sua função de cortes de F-actina,

acreditamos que gelsolina possa estar envolvida no processo de secreção

microapócrina, uma vez que deve ser necessária a desorganização destes

filamentos para permitir a passagem das vesículas de secreção pelo interior da

microvilosidade. Gelsolina controla o remodelamento dos filamentos de actina de

uma maneira regulada por Ca2+, pH intracelular, fosfoinositídeos e fosforilação de

tirosina. O processo de cortes em F-actina ocorre devido ao rompimento de ligações

não-covalentes entre os monômeros de actina do polímero, causado pela ligação de

gelsolina. Este processo é de fundamental importância na fisiologia celular. Células

de camundongo gelsolina knockout exibem uma variedade de defeitos na actina e

na motilidade (Ma, 2009). Fibroblastos gelsolina nulos têm excesso de fibras de

estresse de actina e migram mais lentamente que fibroblastos selvagens. Este

32

resultado é consistente com a incapacidade de corte e remodelamento dos

filamentos de actina na ausência de gelsolina (Witke et al., 1995).

Gelsolina/Adseverina 1 2 3 4 5 6

Severina/Fragmina/CapG 1 2 3

Flightless I 1 2 3 4 5 6LRR

EhABPH 2 3 4 5 6Coronina HP

Supervilina 1 2 3 4 5 6NLS HP

Vilina/Advilina 1 2 3 4 5 6 HP

Protovilina 1 2 3 4 5 6 HPNeck

Figura 5: Representação esquemática da organização dos domínios de proteínas da

superfamília gelsolina. As proteínas que apresentam apenas 3 domínios do tipo gelsolina

conservados (G1-G3) são severina, fragmina e CapG. Gelsolina e adseverina apresentam 6

desses domínios (G1-G6). Flightless I possui 6 domínios do tipo gelsolina e o domínio LRR

(repetições ricas em leucina) adicional na região N-terminal. Vilina e advilina além dos 6

domínios do tipo gelsolina, possuem um domínio headpiece (HP) na região C-terminal.

Supervilina possui G1-G6, HP e um domínio NLS (sinais de localização nuclear) N-terminal.

Protovilina possui G1-G6, HP e um domínio neck adicional. Na EhABPH G1 está ausente e

possui um domínio tipo coronina N-terminal, além do HP C-terminal.

Os filamentos de actina do citoesqueleto estão organizados em feixes e redes

ortogonais (Klein et al., 2004). Quando estes filamentos de actina se dispõem em

feixes, como ocorre nas microvilosidades, eles estão alinhados paralelamente e a

proteína que liga-se à actina sendo uma das responsáveis pela formação dessas

estruturas é a fimbrina.

Fimbrina pertence a uma família de proteínas caracterizada por um domínio

ligante de F-actina (ABD) de aproximadamente 250 aminoácidos. Ela possui 2 ABDs

e se liga aos filamentos de actina como um monômero mantendo os dois filamentos

próximos (Cooper e Hausman, 2004). Esses ABDs são compostos por 2 arranjos

sequenciais de aproximadamente 125 aminoácidos de domínios homólogos à

33

calponina (CH). Além desses domínios, fimbrina possui um headpiece N-terminal

com função ligante de Ca ++.

As miosinas constituem uma grande família de motores moleculares. Atuais

análises filogenéticas organizam as miosinas dentro de 15 classes (Sellers, 2000).

Miosinas geralmente consistem de uma cadeia pesada que contém 3 domínios: um

domínio motor N-terminal com atividade ATPase, um domínio intermediário que age

como uma alavanca mecânica e um domínio cauda C-terminal que medeia

interações com outras proteínas ou lipídeos de membrana (Nambiar et al., 2010).

Embora altamente conservado, diferenças sutis na sequência do domínio motor

resulta em uma ampla gama de propriedades cinéticas e mecânicas que são

utilizadas para funções específicas no interior das células (Nambiar et al., 2010).

As microvilosidades são altamente enriquecidas em miosinas motoras. Uma

das mais abundantes encontradas nas microvilosidades são as miosinas da classe

I. Miosinas I são motores monoméricos conhecidos por interagir com fosfolipídios

ácidos na membrana interna da membrana microvilar através de um domínio C-

terminal altamente básico (Nambiar et al., 2010).

A proteína fator despolimerizante de actina ADF/cofilina é uma das proteínas

essenciais que aceleram a renovação dos filamentos actina através da

despolimerização nos monômeros de actina das extremidades “mais” e cortes nos

filamentos (Bamburg, 1999; Carlier et al., 1999; Maciver e Hussey, 2002; DesMarais

et al., 2005; Mohi et al., 2006). A família da cofilina consiste de proteínas de baixo

peso molecular que são despolimerizantes dos filamentos de actina e que estão

provavelmente presentes em todos os filos eucarióticos de protistas até humanos. A

atividade de cofilina é regulada por diversos mecanismos, incluindo

fosforilação/desfosforilação, pH, fosfoinositídeos e competição com outras proteínas

ligantes de actina (DesMarais et al., 2005; Mohri et al., 2006).

Outra proteína que poderia estar envolvida na secreção microapócrina é a

proteína dissulfeto isomerase (PDI). Ela é membro da superfamília tiorredoxina e da

família PDI a qual têm sido agregados vários outros membros (Ellgaard e Ruddock,

2005). Em humanos há 17 tipos de PDIs, que diferem no número de domínios

catalíticos, na quantidade de sítios de glicosilação, na presença de determinados

resíduos de arginina conservados, no tipo de sinal de retenção no retículo

endoplasmático e no par de resíduos catalíticos envolvido com reações de

transferência de prótons (Ellgaard e Ruddock, 2005).

34

Aparentemente PDI é uma enzima que pode desempenhar diversos papéis.

Ela participa do dobramento e da modificação pós-traducional de proteínas no

retículo endoplasmático (RE) (Wilkinson e Gilbert, 2004). PDI catalisa tanto a

oxidação e isomerização de dissulfetos de polipeptídeos nascentes, funcionando

como uma enzima e como uma chaperona. Atuando como enzima, ela aumenta a

taxa de formação de ligação dissulfeto sem alterar o dobramento de proteína (Noiva,

1999). Como chaperona, ela promove o correto dobramento de proteínas por

prevenir erros no dobramento e agregação de peptídeos parcialmente dobrados ou

mal dobrados e auxilia na maturação e transporte de muitas proteínas que serão

secretadas (Noiva, 1999; Freedman et al., 2002; Barak et al., 2009). Ela está

presente no RE em concentrações razoavelmente altas. Entretanto, algumas

evidências apontam que pelo menos três membros da família PDI, a denominada

PDI, a ERp57 e a ERp72 são encontrados fora do RE e possuem atividades que

podem diferir daquelas exibidas no lúmen do RE (Wilkinson e Gilbert, 2004). PDI

que normalmente possui na região C-terminal um sinal de retenção no RE é

secretada em baixos níveis em uma variedade de tipos celulares, incluindo

hepatócitos, células exócrinas pancreáticas, células endoteliais e plaquetas ativadas

(Turano et al., 2002). Além disso, PDI foi encontrada na superfície celular de

linfócitos B. Pelo menos uma proteína relacionada à PDI, ERp57, foi encontrada no

citosol e no núcleo (Turano et al., 2002). O mecanismo pelo qual as proteínas da

família de PDI que possuem um sinal de retenção no RE podem escapar do RE não

é conhecido e o papel da PDI secretada, ligada à superfície, citosólica e nuclear

permanece desconhecido (Wilkinson e Gilbert, 2004).

A PDI pode estar em alguns casos, relacionada a processos de fusão entre

membranas. O processo de fusão de membranas ocorre devido à atuação de

proteínas de membrana específicas através de interações com lipídeos e outras

proteínas (Ellerman et al., 2006). Os dois sistemas de fusão mais estudados são o

tráfico de vesículas e fusão viral. No caso de fusão de vírus com a célula hospedeira

a ativação de proteínas de fusão pode ser desencadeada, por exemplo, por

mudanças em reações tiol-dissulfeto que são catalisadas por proteínas com

atividade de dissulfeto isomerase (Sanders, 2000). Ellerman et al. (2006)

investigaram se mudanças tiol-dissulfeto estariam envolvidas na fusão de gametas

em mamíferos. Eles verificaram que o pré-tratamento de esperma com inibidores de

35

PDI reduzem a sua capacidade de fusão com o gameta feminino (Ellerman et al.,

2006).

36

2. OBJETIVOS

Nosso objetivo é aumentar o conhecimento sobre a secreção microapócrina

em Lepidóptera, identificando quais são as proteínas secretadas por esse

mecanismo e quais proteínas estariam envolvidas nesse tipo de secreção. Usamos

como modelo a lagarta de S. frugiperda.

Para atingir nosso objetivo, nos propusemos a:

1) Gerar anticorpos contra as proteínas presentes nas preparações de vesículas;

2) Varrer com os anticorpos uma biblioteca de cDNA preparada com material do

intestino médio;

3) Realizar pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos

mRNAs do epitélio do ventrículo, para completar ou aumentar as sequências obtidas

nas varreduras;

4) Reanalisar as sequencias obtidas anteriormente em uma varredura de biblioteca

de cDNA do IM, realizada com anticorpos contra preparação de microvilosidades;

5) Selecionar proteínas possivelmente envolvidas no processo secretório, obter

suas sequências completas, verificar sua distribuição intracelular, suprimir sua

expressão utilizando RNA interferente e verificar alterações causadas por essa

supressão.

37

3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

3.1. Animais

S. frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) foram criadas em laboratório de

acordo com Parra (1986). As lagartas foram colocadas individualmente em frascos

de vidro em uma dieta baseada em feijões roxos (Phaseolus vulgaris), germe de

trigo, levedura e ágar, e foram mantidas em um fotoregime natural a 25ºC. Os

adultos foram alimentados com solução 10 % de mel. Lagartas de quinto instar

(último instar) de ambos os sexos foram usadas nas preparações.

3.2. Preparação das amostras de S. frugiperda

As lagartas de S. frugiperda foram anestesiadas em gelo, sendo em seguida

dissecadas em solução de NaCl 125 mM, exceto quando indicado. O tubo digestório

foi retirado e o epitélio do intestino foi separado da MP mais conteúdo luminal.

Para coletar as vesículas presentes no espaço ectoperitrófico, o epitélio foi

lavado com salina 125 mM para dentro de um tubo de centrífuga (Ferreira et al.,

1994). Esse material foi centrifugado a 600x g, 10 min, 4ºC. O sobrenadante

resultante foi separado do precipitado após a centrifugação e novamente

centrifugado a 25.000x g, 10 min, 4ºC e o precipitado final foi ressuspendido em

água milli-Q gelada e utilizado como fonte de vesículas microapócrinas (VM).

Para a preparação do material do epitélio do ventrículo e da membrana

peritrófica mais conteúdo utilizados nos ensaios enzimáticos eles foram

homogeneizados com água milli-Q gelada com o auxílio de um homogeneizador tipo

Potter-Elvehjem. A membrana peritrófica com seu conteúdo foi a seguir centrifugada

a 10.000x g por 10 min a 4ºC e o sobrenadante foi utilizado nos ensaios, exceto

quando indicado.

As microvilosidades foram preparadas a partir do intestino médio inteiro como

descrito por Ferreira et al. (2007). O método é essencialmente aquele descrito por

Schmitz et al. (1973), onde as microvilosidades são obtidas após sedimentação de

outros tipos de membranas presentes em um homogeneizado por adição de cátions

divalentes. Ferreira e colaboradores (2007) fizeram a sedimentação usando Mg++

por duas vezes para obter microvilosidades mais livres de contaminantes.

38

Para a obtenção das amostras utilizadas na preparação de anticorpos o terço

anterior do epitélio ventricular foi utilizado. Ele foi homogeneizado e submetido a um

fracionamento subcelular como descrito por Ferreira e colaboradores (1994) e os

sedimentos P1 e P3 utilizados separadamente para a obtenção dos anticorpos. O

esquema de centrifugação (Figura 6) mostra como essas preparações foram

obtidas.

Sobrenadante 1

Sobrenadante 2

Homogeneizado

Precipitado 1 (P1)600 x g10 min

Precipitado2 (P2)3.300 x g10 min

Sobrenadante final

25.000 x g10 min

Precipitado 3 (P3)

Figura 6: Esquema representativo da obtenção das amostras P1 e P3 de S. frugiperda

utilizadas para a obtenção de anticorpos.

Para a extração de RNA, a dissecação foi feita utilizando pinças e lâminas

previamente esterelizados em estufa a 150ºC por 4 horas. Os tecidos dissecados

(epitélio intestinal inteiro, epitélio do ventrículo anterior, médio e posterior, túbulos de

Malpighi, corpo gorduroso ou carcaça) foram mantidos em gelo seco e

armazenados a -80°C. O RNA total foi extraído com Trizol (Invitrogen) de acordo

com instruções do fabricante, o qual é baseado em Chomczynski e Sacchi (1987) e

ressuspenso em 100µL de água tratada com DEPC (0,1% (v/v). A contaminação por

DNA genômico foi removida por tratamento com DNase (Turbo DNase, Ambion) por

30 minutos a 37°C. O RNA total foi purificado usando-se o kit RNease Clean up

(Qiagen) seguindo o protocolo do fabricante.

3.3. Microscopia eletrônica

39

As análises de microscopias eletrônicas foram feitas no Instituto de

Biociências da USP-SP em colaboração com o Prof. Dr. Alberto de Freitas Ribeiro.

A preparação de vesículas microapócrinas (VM) foi obtida como descrito no

item anterior e então fixada em glutaraldeído 2,5 % em tampão cacodilato 0,1 M

pH7,4 e ácido pícrico por 2 horas a 4 °C. A amostra foi posteriormente fixada em

tetróxido de ósmio a 1% e em seguida desidratadas em soluções com

concentrações crescentes de etanol embebidas em uma resina acrílica LR White

(Electron Microscopy Sciences, Ft Washington, USA).

Para a realização das imunomarcações, as lagartas de S. frugiperda foram

dissecadas e o IM foi dividido em três partes: ventrículo anterior, ventrículo médio e

ventrículo posterior. O epitélio ventricular foi separado do conteúdo luminal, e

apenas os tecidos epiteliais foram fixados (paraformaldeído 4% (m/v), glutaraldeído

5% (v/v) em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,4) e embebidos na resina acrílica

L. R. White (Agar Aids, USA) por 24 horas a 50ºC. Secções finas de tecidos foram

obtidas em ultramicrótomo e transferidas para telas de níquel. A cada um dos cortes

foi aplicada uma gota de TBS (tris 0,1M, NaCl 0,3M, NaN3 0,1% (m/v)) contendo

albumina sérica bovina 1% (TBS-BSA). Após 30 minutos foi adicionado o anticorpo

desejado, nas diluições de 1:50, 1:100 e 1:200 em TBS-BSA e incubado por 90

minutos a temperatura ambiente. Em seguida, o corte foi lavado com TBS-BSA e

incubado com o anticorpo anti-IgG de coelho, conjugado a partículas de 10 nm de

ouro coloidal. Esse último foi diluído na proporção de 1:15 em tampão TBS-BSA.

Dois tipos de controles foram realizados: utilizando o soro pré-imune e omitindo o

anticorpo primário.

Os cortes foram finalmente lavados com água milli-Q e corados com acetato

de urânio e citrato de chumbo (Reynolds, 1963) e visualizados em um microscópio

eletrônico de transmissão Zeiss EM 900.

3.4. Ensaios de atividades enzimáticas

A concentração de proteína foi determinada de acordo com o método de

Bradford (1976) usando ovoalbumina como padrão.

Aminopeptidase e tripsina foram ensaiadas em 50 mM de tampão Tris-HCL

(pH7.5) usando respectivamente 1 mM de L-leucina-p-nitroanilida (LpNA) ou 1 mM

α-N-benzoil-DL- arginina p-nitroanilida (BApNA) de acordo com Erlanger et al.

40

(1961). Amilase foi medida pela determinação do aparecimento de grupos redutores

(Noelting e Bernfeld, 1948) em tampão glicina–NaCl 50 mM em pH 9.5 com amido

0.5% (w/v) como substrato na presença de 10 mM de NaCl.

Carboxipeptidase A foi determinada usando 15 mM de N-carbobenzoxi-glicil-

L-fenilalanina (ZGlyPhe) em tampão Tris-HCl 50 mM pH 8 na presença de NaCl 50

mM. A liberação de fenilalanina foi seguida como descrito por Micholson e Kim

(1975).

Celobiase e maltase foram ensaiadas usando ou 7mM de celobiose ou 7mM

de maltose em tampão citrato-fosfato de sódio 50 mM de pH 7 e pH 5

respectivamente. A glicose produzida foi detectada como descrito por Dahlqvist

(1968).

Incubações foram realizadas a 30 °C por pelo menos quatro períodos

diferentes de tempo e as taxas iniciais de hidrólise foram calculadas. Todos os

ensaios foram realizados sob condições onde o produto era proporcional a

concentração de enzima e ao tempo de incubação. Controles sem enzimas e outros

sem substratos foram incluídos. Uma unidade de enzima é a quantidade que

hidrolisa 1 µmol de substrato (ou ligação) por minuto. As atividades enzimáticas

foram expressas em miliunidades (mU).

3.5. Procedimentos para manipulação e análises de ácidos nucléicos

Os procedimentos experimentais de técnicas de DNA recombinante que

serão comentados a seguir foram adaptados de manuais dos fabricantes e de

protocolos descritos por Sambrook e colaboradores (1989).

3.5.1. Iniciadores para amplificação do cDNA codificante de PDIs (1 e 2),

fimbrina, miosina I, cofilina e gelsolina-1.

Para amplificação das sequências de fimbrina, PDIs, cofilina, gelsolina-1 e

miosina-1 de S. frugiperda foram realizadas reações de PCRs utilizando um dos

iniciadores universais T7 (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) ou T3 (5’

ATTAACCCTCACTAAAGGGA 3’) presentes nos “braços” do fago λ Zap II (utilizado

como vetor da biblioteca de expressão com iniciadores específicos.

41

Para a clonagem do cDNA codificante da fimbrina, PDI-1, PDI-2, cofilina e

gelsolina foram inicialmente utilizados iniciadores desenhados a partir de uma

sequência parcial obtida nas varreduras de biblioteca de cDNA com anticorpos.

Para a clonagem do cDNA codificante de miosina 1 foram inicialmente utilizados

iniciadores desenhados a partir de uma sequência parcial obtida no banco de dados

Spodobase (http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/). Conforme a sequência de

cada cDNA era aumentada, novos iniciadores foram sendo desenhados, específicos

para cada sequência. Para amplificação completa dos cDNAs codificantes dessas

proteínas, foram utilizados os seguintes iniciadores presentes na tabela 1.

Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados para a obtenção do cDNA

completo codificante das proteínas de interesse

Proteína Oligonucleotídeo Sequência de DNA

Fimbrina

Fimb-1_FW 5’ ATGGCAGATAATTCAAAATTG 3’ Fimb-2_RV 5’ GTCGGGGCACGAGTGGTTTAT 3’ Fimb-3_FW 5’ ATCAAACCTGGCATTGTTAAC 3’ Fimb-4_FW 5’ AAGATGATCATGACAGTGTTC 3’ Fimb-5_RV 5’ CTAGTGATTATTAACCCTCAC 3’

Cofilina Cof-1_FW 5’ ATGGCGTCTGGTGTGACAGTT 3’; Cof-2_RV 5’ TTATTGGCGGTCGGTGGCGCG 3’;

PDI-1

PDI-1-1_FW 5’ ATGTTGGGGTCACTAAAAATT 3' PDI-1-2_FW 5’ AAGGAACTGAAGACTGTTGCT 3' PDI-1-3_RV 5’ AGCAACAGTCTTCAGTTCCTT 3’ PDI-1-4_FW 5’ AACATCCGTGACTTCACCGAT 3’ PDI-1-5_FW 5’ GCCCCATGGTGCGGACATTGC 3' PDI-1-6_RV 5’ TTAGAGCTCTTCCTTCT 3’

PDI-2

PDI-2-1_FW 5’ ATGAGAGTAATCTTATTTACG3' PDI-2-2_FW 5’ TGGGTGTTCGTCCAGAGCATG 3’; PDI-2-3_RV 5’ ACTCTGAAGTTCTTCAGGAAC 3' PDI-2-4_RV 5’ TCCCAACTTGTCGTAGATAGG 3’; PDI-2-5_RV 5’ TTATAACTCGTCTCTGGATGG 3’;

Gelsolina

Gels-1-1_FW 5’ ATGGCGACACACGAGGCGTTC 3’ Gels-1-2_FW 5’ CCCTGAATAAACCATACAAGC 3’ Gels-1-3_FW 5’ GAGACGGCTGATAACTGGAAG 3’ Gels-1-4_FW 5’ CTTCCAGTTATCAGCCGTCTC 3’ Gels-1-5_FW 5’ GCTGAGGCCGGTGCCAATCCG 3’ Gels-1-6_FW 5’ GGTTCTGCTCAGCATCATCATCA 3’ Gels-1-7_FW 5’ TATGTGGTGAAATACCAGTAC 3’ Gels-1-8_RV 5’ GCTTGTATGGTTTATTCAGGG 3’ Gels-1-9_RV 5' TTACTTAGAATTGGCTGCTTT 3’

Miosina-1

Mio1-1_FW 5’ ATGGAGCACGCCCTCGTGCAC 3’ Mio1-2_FW 5’ CACAGAGAACAGTGCATTTTG 3’ Mio1-3_FW 5’ TTCGAGATTGTCGCCAGCGTC 3’ Mio1-4_FW 5’ ATCAACTTCTGTAACGAGAAG 3’ Mio1-5_FW 5’ CTACCGACGAAGGTACTGGAC 3’ Mio1-6_RV 5’ GCGGAACAGCAGGTCGTTGTT 3’. Mio1-7_RV 5’ GTACGCGAACCCAGCTCGGCG 3’ Mio1-8_RV 5’ TCAGGGAGTTGCGATAACGAG 3’

Mio1-9_RV 5’ TCCAGTACCTTCGTCGGTAG 3’

42

3.5.2. PCR

Nas reações de PCR foram utilizadas a enzima Taq DNA polimerase

(InvitrogenTM Life Technologies) em reações de 50 µL contendo os iniciadores a 1

µM, dNTPs 0,2 mM (para cada nucleotídeo), tampão da Taq DNA polimerase e

cloreto de magnésio 1,5 mM, utilizando como molde a biblioteca de cDNA de S.

frugiperda clonada previamente em fago λ zap II.

As reações foram realizadas em termociclador GeneAmp® PCR System 9700

(AB Applied Biosystems) com desnaturação inicial por 2 minutos a 94ºC. Seguiu-se

uma sequência de 15 a 35 ciclos, sendo que as condições de cada ciclo foram de

94ºC para desnaturação da fita dupla de DNA por 30 segundos, de 50ºC a 65ºC

(variável em relação ao iniciador utilizado) para o pareamento iniciador-molde

(anelamento) por 45 segundos e 72ºC para o passo de alongamento (extensão) por

1 a 2 minutos. Por fim, a solução permaneceu por 10 minutos a 72ºC.

3.5.3. Eletroforese em gel de agarose

Géis de garose foram preparados na concentração de 2% (m/v) em tampão

TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM pH 8,0) e a eletroforese foi realizada nesse

mesmo tampão com cerca de 100 V. O material amplificado a ser analisado foi

misturado com 0,1 volumes de tampão de amostra contendo azul de bromofenol

0,25% (m/v) e glicerol 30% (v/v). Esse corante monitorou a movimentação da

amostra e determinou o encerramento da eletroforese. Posteriormente, o DNA foi

corado utilizando-se solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL) e visualizado em

transluminador de luz UV a 312 nm (Translluminator 2040 EV da Stratagene). Os

tamanhos dos fragmentos foram estimados mediante comparação com a mobilidade

de fragmentos de DNA conhecidos.

3.5.4. Purificação do produto de PCR a partir do gel de agarose

Os produtos amplificados em reações de PCR foram recuperado diretamente

do gel de agarose usando o protocolo do produto QIAquick gel extraction kit

43

(Qiagen), o qual se baseia na dissolução da agarose em uma tampão de alta força

iônica e ligação do DNA em uma resina de troca iônica. O procedimento foi

realizado seguindo as instruções do fabricante.

3.5.5. Ligação de produtos de PCR em plasmídeo

Para clonagem dos fragmentos de cDNAs obtidos a partir da amplificação por

PCR, foi utilizado o kit de ligação pGEM-T EASY vector System (Promega). Foi

utilizada uma mistura de reação que consistia de 1 unidade de T4 DNA ligase,

tampão apropriado, plasmídeo (pGEM-T) e produto de PCR (purificado do gel de

agarose). O plasmídeo e o produto de PCR foram utilizados em uma concentração

1:3. Essa mistura foi incubada por 16 horas 4ºC. O produto de ligação foi utilizado

para transformar bactérias competentes.

Para inserir fragmentos de cDNAs ao vetor pAE (Ramos et. al., 2004), tanto o

inserto quanto o vetor foram digeridos com enzimas de restrição apropriadas,

purificadas do gel de agarose e a seguir foram misturados em uma proporção de 3

volumes de inserto para 1 volume de plasmídeo adicionando 1 unidade de T4 DNA

ligase e tampão apropriado. A amostra foi incubada a 16ºC por 16 horas e a seguir

usada para transformar bactérias competentes.

3.5.6. Transformações de células competentes

Alíquotas de 1 uL dos respectivos plasmídeos foram adicionadas a 50uL de

células XL1-blue competentes e mantidas em gelo por 30 minutos. Em seguida as

células foram submetidas a um choque térmico a 42ºC por 30 segundos e

novamente transferidas para o gelo por mais 2 minutos. Adicionamos então, 1 mL

de meio LB, e essa solução foi incubada por 1 hora a 37ºC, para recuperação das

bactérias e expressão das proteínas envolvidas na resistência ao antibiótico de

seleção. Em seguida a mistura era plaqueada em LB ágar com o antibiótico

apropriado e incubada overnight a 37 ºC, obtendo-se dessa forma colônias isoladas.

44

3.5.7. Purificação de plasmídeos

Os plasmídeos foram purificados utilizando-se o protocolo do kit wizard Miniprep

(Promega) a partir de 3,0 mL de cultura de bactérias cultivadas durante 16 horas a

37 ºC. O rendimento e a pureza da amostra de plasmídeo foram avaliados através

da determinação da absorbância a 260 nm e 280 nm.

3.5.8. Sequenciamento de DNA

A reação de sequenciamento foi realizada utilizando-se 2 µL da mistura da

reação Big Dye terminator mix (Applied Biosystems), 100-200 ng de DNA, 15 pmol

de iniciador, Tris-HCl 200 mM pH 9, contendo MgCl2 5 mM em volume final de 15

µL. A reação foi incubada por 2 minutos a 95ºC, seguindo-se 35 ciclos de 45

segundos a 96ºC, 30 segundos a 50ºC e 4 minutos a 60ºC em termociclador Applied

Biosystems GeneAmp® 9700.

Uma vez encerrada a amplificação, as amostras foram precipitadas com

etanol 100% e glicogênio 1 mg/mL, lavadas com etanol 70%, suspensas em

formamida, desnaturadas. Em seguida as amostras foram sequenciadas pelo

serviço de sequenciamento de cDNA do Departamento de Bioquímica, Instituto de

Química, utilizando um sequenciador automático ABI PRISMTM 3100 (Applied

Biosystems).

3.5.9. RT-PCR semi-quantitativa

O RNA total dos tecidos dissecados (ventrículo total, ventrículo dividido em

anterior, médio e posterior, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça) foi

extraído com Trizol (item 3.2) e usado para a síntese dos cDNAs correspondentes,

utilizando-se da transcriptase reversa fornecida pelo kit SuperScript First-Strand

Synthesis for RT-PCR (Invitrogen).

O cDNA resultante foi usado como molde para a amplificação das sequências

por PCR com iniciadores específicos para as sequências das proteínas

selecionadas. Os iniciadores estão apresentados na tabela 2. Os iniciadores para as

45

sequências das proteínas anexina, cofilina, fimbrina, gelsolina-1, PDIs (1 e 2) e

miosina VI foram desenhados a partir de ESTs encontrados nas varreduras de

biblioteca de cDNA de S. frugiperda (ver adiante). Os iniciadores para as

sequências das proteínas ARP2/3, gelsolina-2, moesina, profilina, miosina I e

profilina foram desenhados a partir de ESTs encontradas no banco de dados

Spodobase (http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/).

A PCR foi realizada como descrito no item 3.5.2. O número de ciclos foi

escolhido após várias tentativas, assim que a amplificação estava em fase log,

resultando em bandas claras e visíveis. O tamanho dos produtos de PCR foi

compatível com os tamanhos teóricos esperados, assim eliminando a possibilidade

de contaminação por DNA genômico na preparação.

Tabela 2: Sequência dos iniciadores utilizados na realização da RT-

PCR semi-quantitativa

Oligonucleotídeo Sequência de DNA

Anexina_FW 5’ ATGAGTGGACAACAGTACTAC 3’ Anexina_RV 5’ TTAAGCACAAAGTGTGACTAG 3’ ARP 2/3_FW 5' GGAGCAGATGAGCTTCTCAAA 3' ARP 2/3_RV 5' GAACAGCACGAACGTAACATA 3' Cofilina_FW 5’ ATGGCGTCTGGTGTGACAGTT 3’; Cofilina_RV 5’ TTATTGGCGGTCGGTGGCGCG 3’ Fimbrina_FW 5’ GCTAACCTTAAAGCACAACA 3’ Fimbrina_RV 5’ GTCGGGGCACGAGTGGTTTAT 3’ Gelsolina-1_FW 5’ GCTGAGGCCGGTGCTAATCCG 3’ Gelsolina-1_RV 5’ GCTTGTATGGTTTATTCAGGG 3’ Gelsolina-2_FW 5' GTACATCCAGCTTTCGCCAAC 3' Gelsolina-2_RV 5' GATGAAGCAGTCTCCTTTGTT 3' Moesina_FW 5' AACGTCCGTGTGACGACGATG 3' Moesina_ RV 5' GATCTCGAAGTAGTTGACTCC 3' Miosina I_FW 5’ CTGCCGACGAAGGTACTGGAC 3’ Miosina I_RV 5’ TCAGGGAGTTGCGATAACGAG 3’ Miosin VI_FW 5’ CAACTGGTTTGGGTGAGGGAC 3’ Miosin VI_RV 5’ TAGGATGTTGGCTACATATGT 3’ PDI-1_FW 5’ GAGCTGCCGAAGAAGATGT 3’ PDI-1_RV 5’ AGCAACAGTCTTCAGTTCCTT 3’ PDI-2_FW 5’ TGGGTGTTCGTCCAGAGCATG 3’ PDI-2_RV 5’ TTATAACTCGTCTCTGGATGG 3’ Profilina_FW 5' ATGAGCTGGCAAGATTATGTC 3' Profilina_RV 5' CTAATAACCACAGGTAATTAA 3' β-actina_FW 5’ CGATGACGCGCCTGGCGCCGT 3’ β-actina_RV 5’ GACAGGACTGTGTTGGCGTAC 3’

46

3.6. Procedimentos para varreduras de biblioteca de cDNA

3.6.1. Preparação de anticorpos anti-P1, anti-P3 e anti-VM

A produção de anticorpos foi feita de modo semelhante ao descrito em

Jordão et al. (1996). Os procedimentos experimentais realizados com coelhos

seguiram protocolos aprovados pela Comissão de Ética em Cuidados e Uso Animal

(CECUA), do Instituto de Química da USP. Antes da aplicação do material para a

produção do anticorpo, foram retirados 5 mL de sangue do coelho, com o intuito de

se obter o soro pré-imune. Esse (em uma diluição 200x) foi usado em Western blots

para verificar o possível reconhecimento das proteínas presentes em S. frugiperda

antes da imunização dos coelhos com as mesmas. Foram inoculados em diferentes

coelhos 7 mg de proteína total do P1 e P3 e 9 mg de VM.

Às amostras de P1, P3 e material VM de S. frugiperda em um volume total de

1,0 mL foram misturados com igual volume de adjuvante completo de Freund e

aplicadas em coelhos. Uma segunda aplicação contendo igual quantidade de

proteínas foi feita trinta dias após a primeira, utilizando o mesmo procedimento

anterior, mas usando adjuvante incompleto de Freund. Após dez dias o sangue do

coelho foi retirado para se obter o soro imune através de uma punção cardíaca.

O sangue coletado antes da aplicação (pré-imune) e o sangue coletado após

as aplicações (imune) foram deixados por 1 hora a 37ºC e, em seguida, por 18

horas a 4ºC. Esse material foi então centrifugado (3.000x g; 10 minutos; 4ºC). Ao

sobrenadante resultante (soro) foi acrescentada uma solução de sulfato de amônio

saturada preparada em tampão fosfato, 200 mM, pH 6,7 em uma proporção de 1:1.

Após permanecer 18 horas a temperatura ambiente, a suspensão obtida foi

centrifugada (12.000x g; 15 minutos; 4ºC). O precipitado foi então ressuspendido em

solução 50 % saturada de sulfato de amônio pH 6,7 e novamente centrifugado nas

condições anteriores. Este passo foi repetido e o precipitado final obtido

ressuspendido em 0,125 M de NaCl. Esse material foi dialisado por 20 horas contra

1.000 volumes da mesma solução sendo realizada uma troca. O material dialisado

foi aliquotado e mantido a -80ºC até o uso.

47

3.6.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE)

As amostras a serem separadas por eletroforese foram aquecidas durante 5

minutos a 95 °C em tampão de amostra (Tris-HCl 60 mM, pH 6,8; SDS 2,5% p/v; 2-

β-mercaptoetanol 0,36 mM; glicerol 10 % v/v; azul de bromofenol 0,05% p/v).

A eletroforese foi realizada em placa fina de poliacrilamida na presença de

SDS utilizando o equipamento BioRad (USA) Mini-Protein II em um sistema

descontínuo de tampões descrito por Laemmli (1970). Foi usado gel de corrida na

concentração de 12% de poliacrilamida e o gel de empilhamento na concentração

de 4 %, ambos contendo SDS 0,1%. A eletroforese foi realizada em voltagem

constante de 200 V a temperatura ambiente, até que o azul de bromofenol, utilizado

como marcador de frente, estivesse na borda inferior da placa.

Após a eletroforese, o gel foi corado pela técnica de Coomassie Blue R. Essa

consiste em deixar o gel em uma solução contendo 0,1% (p/v) de Coomassie Blue

R-250, 40% (v/v) de metanol e 10% (v/v) de ácido acético por meia hora. Em

seguida, a coloração de fundo do gel era retirada passando diversas vezes por

banhos de metanol 40% (v/v) mais ácido acético 10% (v/v) até que as bandas

pudessem ser visualizadas.

3.6.3. Western blotting

As proteínas foram inicialmente submetidas a uma eletroforese em SDS-

PAGE 12 % em placa de 1,0 mm. Após a separação eletroforética, o gel foi

submetido ao método de transferência de proteínas para membranas de

nitrocelulose descrito por Towbin et al. (1979). Inicialmente o gel foi equilibrado por

15 minutos em tampão Tris-HCl 25 mM ph8,6, glicina 192 mM e metanol 20% (v/v).

Em seguida foi realizada a transferência eletroforética das proteínas do gel para

uma membrana de nitrocelulose de poro de 0,45 μm, também previamente

equilibrada por 15 minutos no mesmo tampão. Foi utilizado o sistema de

transferência de proteínas semi-seco (Bio-Rad) na presença do tampão acima nas

condições indicadas pelo manual do aparelho (15 V; 5,5 mA/cm2 de gel; 30

minutos). A eficácia da transferência das proteínas foi monitorada por marcadores

48

de peso molecular pré-corados Low-Range (Bio-Rad, usados 3 μL) aplicados na

eletroforese.

Antes de serem imunoensaiadas, as membranas de nitrocelulose foram

deixadas imersas em uma solução 5 % (p/v) de leite em pó desnatado dissolvido em

TBS (tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,15 M) por 1 hora a

temperatura ambiente (ou 18h a 4ºC). Esse procedimento é utilizado para bloquear

os sítios da membrana de nitrocelulose que não contêm proteína transferida do gel,

evitando assim ligações inespecíficas nos passos que se seguem. As membranas

de nitrocelulose foram então lavadas 4 vezes por 5 minutos cada com TBS

contendo Tween-20 0,05 % (v/v) (TBS-T) e incubadas por 2 horas com o anticorpo

na diluição apropriada (200x) em TBS-T. As membranas de nitrocelulose foram a

seguir lavadas com TBS-T 4 vezes, por 5 minutos cada, e incubadas por mais 2

horas com uma solução de anti-IgG de coelho acoplada a peroxidase diluída 1:1000

em TBS-T. Após 4 lavagens por 5 minutos cada com TBS, as membranas foram

incubadas com uma solução feita com 20 mg de 4-cloro-1-naftol dissolvidas em 4

mL de metanol, a qual foram adicionados 20 mL de TBS aquecido a 37ºC e 15 μL

de H2O2, até que bandas escuras pudessem ser visualizadas (máximo de 15

minutos). Após serem extensivamente lavadas com água destilada, as membranas

de nitrocelulose foram deixadas para secar entre duas folhas de papel de filtro.

Para determinar a diluição de anticorpo imune a ser usada foram feitos

Western blots (dados não mostrados) onde as diversas preparações foram

submetidas à eletroforese em SDS-PAGE (70 μg de proteína), transferidas para

membrana de nitrocelulose e testadas com diversas diluições do anticorpo imune

gerado pelas respectivas preparações (50, 100, 200, 500 e 800 x). A diluição

escolhida foi aquela onde ainda era observada uma boa marcação na maior diluição

de anticorpo.

3.6.4. Plaqueamento e indução das bibliotecas de cDNA

Células XL1-blue MRF’ foram crescidas em LB-líquido contendo maltose

0,2% (p/v) e MgSO4 10 mM durante cerca de 16 h, a 30ºC e sob agitação a 250

rpm. Em seguida foram precipitadas por centrifugação (2.000x g; 10 minutos;

temperatura ambiente) e então ressuspensas em MgSO4 10 mM para uma Abs600 =

49

0,5. Uma alíquota de 2 mL destas células foi incubada com alíquotas da biblioteca

de cDNA de IM de S. frugiperda que foi preparada como descrito por Marana e

colaboradores (2001). As alíquotas continham 1x104 pfu e a incubação foi feita por

15 minutos a 37ºC. Em seguida, foram adicionados 25 mL de NZY-agarose a 55ºC à

mistura de incubação e essa derramada sobre uma placa NZY-ágar de 240 x

240mm. As placas de NZY-ágar permaneciam por um período de cerca de 6 h a

37ºC para o aparecimento dos primeiros sinais de placas de lise. A escolha da

quantidade de fagos a serem plaqueados foi feita de forma a possibilitar uma

densidade na placa de cultura que permitia a obtenção de clones isolados na

varredura.

Após o aparecimento dos primeiros sinais do surgimento de placas de lise,

iniciava-se o procedimento de indução do promotor da β-Galactosidase com IPTG.

Pra isso eram usadas membranas de nitrocelulose (Bio Agency) previamente

esterilizadas através da exposição por 15 minutos à luz UV de cada face das

membranas. Essas eram então embebidas em IPTG 10 mM estéril e deixadas secar

no fluxo. As membranas contendo IPTG eram então colocadas cuidadosamente

sobre o meio de cultura evitando a formação de bolhas. Em seguida, as placas eram

colocadas novamente para incubar a 37ºC, desta vez, por um período de 4 horas.

Durante o processo de indução, as proteínas de fusão (β-Galactosidase +

polipeptídeo codificado pelo cDNA do inserto) induzidas em cada placa de lise

ficavam aderidas às membranas de nitrocelulose. Após o término da indução, as

placas eram deixadas pelo menos 2 horas a 4ºC para evitar que pedaços de

agarose ficassem aderidos às membranas de nitrocelulose quando essas fossem

retiradas da placa. Marcas eram feitas nas membranas e nas placas de NZY-ágar

usando agulhas, com o intuito de orientar o posicionamento da membrana na placa.

Esse procedimento é importante para permitir a localização dos clones de interesse.

Após serem retiradas dos meios de cultura, as membranas de nitrocelulose eram

então submetidas aos imunoensaios.

3.6.5. Imunoensaios nas membranas de nitrocelulose

As membranas de nitrocelulose foram imunoensaiadas como descrito no item

3.6.3. Durante o procedimento de revelação, os sinais positivos que fossem

50

aparecendo eram marcados com lápis de ponta fina de forma a evitar que o sinal

fosse perdido após o término da revelação. As diluições dos anticorpos usadas para

os imunoensaios foram de 200 vezes para as varreduras de preparações de

precipitado 1 (P1), precipitado 3 (P3) e VM.

3.6.6. Coleta dos clones positivos

Após o imunoensaio, as membranas de nitrocelulose foram lavadas com

água destilada e usadas para fazer uma réplica com o auxílio de uma transparência.

Essa réplica foi usada para localizar na placa de cultura quais eram as placas de

lise marcadas pelo anticorpo e que, consequentemente continha os fagos

apresentando os cDNAs de interesse. As placas de lise eram então recolhidas do

meio de cultura com o auxílio de uma agulha de seringa com ponta romba. Pedaços

do meio de cultura contendo apenas placas de lise isoladas eram então retirados e

transferidos para um dos poços de uma placa de 96 poços contendo 100 μL de

tampão SM (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 8mM Mg2 SO4; 0,0025 % p/v de

gelatina). Nesse tampão os fagos λ Zap II se mantém estáveis por cerca de 6

meses. Depois de incubados por 2 horas a temperatura ambiente ou 16 horas a

4ºC, a suspensão de fagos já podia ser usada para experimentos posteriores. Após

o preenchimento de uma placa de 96 poços, era feito o procedimento de excisão de

plasmídeos a partir desses fagos.

3.6.7. Excisão do plasmídeo Bluescript

Inicialmente foi feita a preparação do estoque de células XL1-blue MRF’ e

SOLR no dia a ser feita a excisão. Essas células foram crescidas em LB-líquido

contendo maltose 0,2 % (p/v) e MgSO4 10 mM durante cerca de 16 horas a 30ºC

sob agitação de 250 rpm. Em seguida, as células foram precipitadas por

centrifugação (2.000x g; 10 minutos; temperatura ambiente) e ressuspensas em

MgSO4 10 mM para uma Abs600 = 1,0.

O protocolo de excisão foi feito em placas de 96 poços estéreis que tem a

capacidade para 300 L de solução em cada poço. A cada poço foram adicionados

51

13,3 μL de células XL1-blue MRF’ que foram co-infectadas com 10 μL da amostra

de fago λ Zap II isolado, obtido da varredura da biblioteca de cDNA, e 0,06 μL de

fago helper ExAssist. Essa mistura era então incubada a 37ºC por 16 horas.

Em células XL1-blue MRF' coinfectadas por esses dois fagos, proteínas

codificadas pelo fago helper reconhecem especificamente regiões do DNA do fago λ

Zap II e promovem a excisão e circularização de uma fita simples de DNA, dando

origem ao plasmídeo p-Bluescript, plasmídeo esse que contém o cDNA de

interesse. Esse plasmídeo é então encapsulado pelas proteínas do fago helper e

eliminado pelas células XL1-blue MRF'.

Para purificar os fagos, a cultura obtida após a incubação por 16 horas foi

incubada a 65ºC por 15 minutos, período esse suficiente para matar as células XL1-

blue MRF' presentes no meio. A cultura era então centrifugada (2.000x g, 10

minutos, temperatura ambiente) e o sobrenadante, contendo os fagos carregando o

plasmídeo p-Bluescript e fagos λ Zap II, recuperados.

Para finalizar, as células SOLR foram transformadas com 50 μL da

preparação de fagos obtida no passo anterior. Após 15 minutos de incubação a

37ºC essas células foram plaqueadas em meio LB-ágar contendo ampicilina (50

μg/mL). As placas foram incubadas por 16 horas a 37ºC.

Na transformação, os fagos helper ExAssist infectam essas células, mas

essas não são capazes de crescer em meio contendo ampicilina. Os fagos λ Zap II

não são capazes de infectar as células SOLR. Células infectadas pelos fagos helper

ExAssist contendo como material genético o plasmídeo p-Bluescript são

selecionadas positivamente em meios contendo ampicilina.

As colônias isoladas obtidas no meio LB-ágar contendo ampicilina foram

crescidas em meio LB-líquido contendo o mesmo antibiótico (50 μg/mL). Essas

culturas foram feitas em placas de cultura de 96 poços de 300 μL de volume com

fundo em “U”, com tampa e estéreis. Essas culturas foram usadas como fonte de

DNA para a realização da PCR. As reações de PCR foram realizadas como no item

3.5.2 utilizando os iniciadores M13 foward (5' CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG

3') e M13 reverse (5' AGCGGATAACAATTTCACACAGG 3'). Esses iniciadores

anelam nos braços do plasmídeo p-Bluescript nas vizinhanças do sítio múltiplo de

clonagem, permitindo amplificar os cDNAs que estão clonados nesse plasmídeo.

Para a análise dos fragmentos de DNA derivados da amplificação com PCR foram

feitas eletroforeses em gel de agarose como no item 3.5.3. Os produtos das PCR

52

feitos com os DNAs das bactérias transformadas, após terem sido verificados

através de gel de agarose foram utilizados na reação de sequenciamento. A reação

foi realizada com auxílio do carimbo de replicação, e o produto das PCRs foi

carimbado em uma placa de PCR contendo a mistura para a reação de

sequenciamento, usando o iniciador T3. A reação de sequenciamento foi realizada

como no item 3.5.8.

3.7. Procedimentos para o pirosequenciamento

3.7.1. Purificação do mRNA das amostras do IM

O RNA total purificado foi quantificado utilizando o kit Quanti-iT TM Ribogreen

(Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. Em seguida iniciou-se o processo de

purificação do mRNA com a utilização do kit Dynabeads mRNA. Uma quantidade

de 50 µg de RNA total foi utilizada. Este procedimento permite recuperar mRNAs e

excluir todos os demais RNAs contaminantes da amostra, pois as beads presentes

no kit possuem oligo-dT (desoxitimina) covalentemente ligadas onde os mRNAs

através de suas caudas de poliadenilação se ligam e podem ser recuperados

posteriormente. Na sequência o kit RNA 6000Pico Chip do equipamento Agilent

2100 Bioanalyser foi utilizado para verificar a qualidade da amostra de mRNA. Uma

vez aprovada a qualidade e a integridade da amostra de mRNA, iniciou-se o

processo de síntese de cDNA e pirosequenciamento.

3.7.2. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA obtida a partir dos

mRNAs do IM de S. frugiperda

O serviço de pirosequenciamento foi realizado junto ao laboratório CATG (IQ-

USP). A sequência de trabalho do sistema Genome Sequencer FLX Titanium

baseia-se em um sistema de preparação de bibliotecas de cDNA a partir de mRNA

enriquecido. Para a obtenção de cDNA, 200ng de mRNA anteriormente purificado

foi fragmentado por meio de uma solução de ZnCl2, seguida de uma purificação dos

fragmentos de tamanhos desejados. A síntese das duas fitas de cDNA é realizada

53

utilizando o kit cDNA synthesis system (Roche), utilizando Roche random primer.

Em seguida a amostra é enriquecida em uma biblioteca de cDNA que será

quantificada e utilizada posteriormente. Pequenos adaptadores (A e B) específicos

são ligados nas extremidades 3’ e 5’ de cada fragmento de cDNA. Cada fragmento

de cDNA único da biblioteca é imobilizado em uma bead. A amostra é então

purificada gerando microreatores únicos onde cada bead representa uma sequência

única da biblioteca. Cada fragmento único ligado a uma bead é amplificado,

excluindo sequências competidoras e contaminantes, gerando para cada

microreator único, a ligação com vários milhões de sequências idênticas. As beads

carregando sequências únicas são então adicionados em uma placa (Pico Titer

Plate) onde se executa o sequenciamento. O diâmetro de cada cavidade na placa

(Pico Titer Plate) permite a inserção de somente uma bead. Por fim a placa é

carregada no aparelho GS FLX e a leitura é feita por sinais de quimiluminescência e

registrados em uma câmera acoplada ao equipamento.

3.8. Análises de bioinformática

Os arquivos (. sff) resultantes pirosequenciamento, contendo todos os reads

foram processados pelo GS De Novo Assembler (Newbler v.2.3), formando contigs.

Esses e os contigs formados pelo procedimento de Sanger descrito no item 3.5.8

foram anotados com a ajuda do programa dCAS (Guo et al., 2009), o qual deleta a

sequência do vetor, monta contigs e realiza análises através de BLASTX em bancos

de dados (nr, pfam, GO). A anotação das sequências selecionadas foi confirmada

por múltiplos alinhamentos (Bioedit version 7.1.3.0, Hall, 1999) com sequências

referentes.

As sequências obtidas por immunoscreening foram submetidas a um

BLASTN contra as sequências de S. frugiperda originadas do pirosequenciamento

de uma biblioteca de cDNA proveniente dos mRNAs do IM. As sequências foram

consideradas iguais se os e-values fossem menor que 10-10 e a identidade maior

que 95%. Ocasionalmente a identidade foi checada por múltiplos alinhamentos.

Esse procedimento levou a extensão das sequências. As sequências que não

tinham sequências homólogas com aquelas obtidas por pirosequenciamento

correspondiam a clusters com um único EST e foram descartadas.

54

Outras análises foram realizadas para identificar a presença de peptídeo sinal

(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), alça transmembrana

(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI)

(www.mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html) e sítios de glicosilação

(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ ou www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/).

Análises filogenéticas usando sequências de aminopeptidases, amilases ou

lipases foram realizadas usando o programa MEGA 4.1 (Tamura et al., 2007). Os

cladogramas das sequências escolhidas foram inferidos usando o algoritmo

neighbor-joining (Saitou e Nei, 1987). Bootstraps (Felsenstein, 1985; Hillis e Bull,

1993) foram determinados baseados em 10.000 réplicas. Os ramos correspondendo

a separações em menos que 50% das réplicas (10.000) foram colapsados.

Massa molecular teórica foi determinada por Prot Param tool

(http://web.expasy.org/protparam/).

As traduções das sequências de aminoácidos foram determinadas usando

Translate tool (http://web.expasy.org/translate/).

3.9. Procedimentos para obtenção e análise de gelsolina recombinante

3.9.1. Expressão da gelsolina em Escherichia coli

Para a clonagem de três domínios da gelsolina (G1-G3) no vetor de

expressão pAE (Ramos et al., 2004) foram utilizados os iniciadores (GelsG1_FW e

GelsG3_RV) que se pareiam respectivamente com a região equivalente ao N-

terminal e C-terminal da gelsolina recombinante e correspondem à região marcada

em negrito. Foram acrescidos ainda sítios de restrição para XhoI e EcoRI

respectivamente (em itálico) e uma extensão que visa aumentar a eficiência de

digestão pelas respectivas enzimas de restrição (sublinhado): GelsG1_FW: (5’

CCGCTCGAGGAAATCTGGACCATAGAGCAA 3’) e GelsG3_RV (5’

CCGGAATTCTTACCAGCTGACGAAGTATTGCTT 3’).

Os iniciadores utilizados nas reações de sequenciamento do plasmídeo pAE

contendo o inserto do gene correspondente à gelsolina foram o T7 (ver item 3.5.1) e

T7 terminador (5’ GCTAGTTATTGCTCAGCGGCT 3’). Eles se pareiam

respectivamente com a fita sense e antisense do vetor pAE.

55

E. coli BL21 (DE3) foram transformadas com a construção pAE-Gels. Os

clones de interesse foram inoculados em 10 mL de meio LB contendo 50 g/mL de

carbenicilina e crescidos a 37°C, sob agitação contínua de 160 rpm, durante 18 h.

Em seguida, essa cultura foi diluída para uma Abs600nm = 0,1-0,15 em 50 mL de

meio LB contendo antibiótico na mesma concentração anterior, prosseguindo-se a

incubação em diferentes temperaturas (20°C, 25°C e 37°C). Quando a cultura

atingiu uma Abs600nm = 0,4 - 0,8, uma alíquota de 1mL foi retirada (cultura não

induzida), submetida à centrifugação a 16.000 xg, por 5 minutos, a temperatura

ambiente. O sobrenadante foi descartado e o sedimento de bactérias suspenso em

100 L de tampão de amostra para eletroforese. O isopropil -D-

tiogalactopiranosídeo (IPTG) foi então adicionado a essa cultura para concentração

final de 1 mM e alíquotas da suspensão bacteriana (cultura induzida) foram retiradas

após 20 horas de incubação a 20°C, 25°C e 37°C e processadas da mesma forma,

exceto que o sedimento de bactérias foi suspenso em 200 L de tampão de amostra

para SDS-PAGE. As amostras de cultura não induzida e induzida foram

armazenadas a -20°C até a sua utilização. O perfil de indução da proteína

recombinante foi analisado por separação eletroforética em gel de poliacrilamida

12% contendo SDS (SDS-PAGE) (ver item 3.6.2), de acordo com Laemmli et al.

(1970). Os géis foram corados com Coomassie Blue R (item 3.6.2). O restante da

cultura foi submetido à centrifugação a 3.000 xg por, 30 minutos, a 4°C e

armazenado a -80°C, por no máximo uma semana.

3.9.2. Teste de solubilidade da gelsolina recombinante

Para os testes de solubilidade, o sedimento, proveniente das culturas

bacterianas induzidas com IPTG 1mM em diferentes temperaturas (20ºC, 25ºC e

37ºC) (armazenados a -80ºC), foi suspenso em 1mL de tampão de lise [Tris-HCl 10

mM pH 7, NaCl 100 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1mM e glicerol 10% (v/v)] e

submetido a sonicação com 3 pulsos de 15 segundos cada, out put 3 (Branson

Sonifier 450) com intervalos em gelo de 1 minuto entre cada pulso. O lisado foi

centrifugado a 10.000 xg, por 30 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi recolhido e o

sedimento suspenso em 1 mL do mesmo tampão de lise, sendo ambos analisados

em seguida por SDS-PAGE 12% e coloração com Coomassie Blue (item 3.6.2).

56

3.9.3. Purificação parcial da gelsolina recombinante

A gelsolina recombinante foi parcialmente purificada por meio de duas

cromatografias de afinidade, utilizando uma resina de Ni+2-agarose (Qiagen).

Inicialmente o sobrenadante (1 mL), proveniente do lisado bacteriano induzido a

20ºC foi misturado com 200 µL de resina de níquel, previamente equilibrada com 2,5

mL de tampão de lise [Tris-HCl 10 mM pH 7, NaCl 100 mM, imidazol 20 mM, PMSF

1 mM e glicerol 10% (v/v)]. Essa suspensão foi incubada a 4ºC, por 70 minutos, em

homogeneizador (Heavy dietyrotator, Cole Parmer) sob baixa velocidade. Foram

realizadas cinco lavagens com 750 L de tampão de lise por centrifugação a 16.000

xg, por 1 minuto. A proteína foi eluída com 150 L de tampão de lise acrescido de

25, 50, 75, 100, 150 e 300 mM de imidazol, seguindo-se incubação por 15 minutos

em gelo, centrifugação nas condições anteriores e coleta do sobrenadante.

Posteriormente, foi feito um pool do material eluído em condições crescentes

de imidazol e o mesmo submetido a uma diálise em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,

por 18 h, a 4ºC. No processo de diálise, três trocas foram realizadas, sendo que em

cada troca o material foi dialisado contra 1000 volumes de tampão.

O material dialisado foi novamente aplicado na resina de Ni+2-agarose, dessa

vez equilibrada com uma solução tampão um pouco mais estringente [Tris-HCl 10

mM, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1 mM, glicerol 10% (v/v) e β-

mercaptoetanol 5 mM]. As demais condições experimentais foram mantidas em

relação à primeira cromatografia de afinidade, sendo a proteína eluída nesse

mesmo tampão acrescido de 25, 50, 75, 100, 150 e 300 mM de imidazol. O material

eluído foi dialisado em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7 e armazenado a -20ºC.

3.9.4. Produção de anticorpos policlonais anti-gelsolina

Na imunização de um coelho macho foram utilizadas duas alíquotas de 300

g de gelsolina (G1-G3) recombinante. Antes da imunização, um volume total de 5

mL de sangue foram retirados de cada coelho para a obtenção do soro pré-imune.

Para a primeira imunização, alíquotas de proteína recombinante semi-purificada

foram submetidas à eletroforese em SDS-PAGE 12%, seguida de coloração com

57

nitrato de prata (Yan et al., 2000) e as bandas cortadas do gel. Em seguida, o gel foi

descorado com uma solução 1:1 de ferricianeto de potássio 30 mmol/L e tiossulfato

de sódio 100 mmol/L. Após a coloração ser removida, o gel foi lavado com água

Milli-Q e homogeneizado em água Milli-Q com um homogeneizador do tipo Potter-

Elvehjem. A amostra acima com um volume final de 1 mL foi misturada a 1 mL de

adjuvante de Freund completo (Sigma) e injetada no coelho como descrito no item

3.6.1.

3.9.5. Detecção imunológica de proteínas

Após SDS-PAGE (item 3.6.2), foi feita a transferência eletroforética da

proteína recombinante para a membrana de nitrocelulose em sistema semi-seco,

conforme descrito no item 3.6.3. As lavagens e incubações com diferentes

concentrações do anticorpo policlonal anti-gelsolina (G1-G3) em TBS-tween 20

(1:50, 1:100, 1:200 e 1:500) foram feitas de modo semelhante ao descrito em 3.6.3.

Em seguida, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário (anti-IgG

de coelho) (1:2000) diluído em TBS-tween 20, por 2 horas. As membranas de

nitrocelulose foram lavadas por 6 vezes de 10 minutos com TBST e então reveladas

com o método fornecido pelo kit Imobbilon Western Chemiluminescent HRP

substrate (Millipore). Nesse método a atividade enzimática da peroxidase leva a

emissão de luminescência que é detectada utilizando-se filmes específicos (Hyperfil-

ECL, Amersham) através de tempos de exposição de 5 a 30 minutos executada

conforme instruções do fabricante.

3.10. RNA interferente de gelsolina

Os RNAs dupla fita foram produzidos com o auxílio do kit T7Megascript

(Ambion), utilizando-se como template para a T7 RNA polimerase a região

codificante amplificada com iniciadores contendo a sequência do promotor T7. Os

iniciadores utilizados para a amplificação da transcriptase reversa foram:

SfRNAi_RV (5'-TAATACGACTCACTATAGGTTACCACCTTCCATGTATCT-3') e

SfRNAi_FW (5'-TAATACGACTCACTATAGATGGCGACACACGAGGCGTTC-3').

58

A reação de transcrição in vitro foi montada conforme manual fornecido pelo

fabricante, contendo água livre de nucleases, NTPs, 1 µg de DNA template, tampão

e T7 RNA polimerase. A reação é então incubada a 37°C durante seis horas e em

seguida é colocada sobre a bancada por 10 minutos para permitir o anelamento das

fitas complementares. A reação é então tratada com DNase para eliminar o DNA

template. O RNA de dupla fita foi purificado por extração com fenol/clorofórmio

seguido de precipitação com acetato de amônio.

Para a fabricação do dsRNA controle, foi utilizado um gene exógeno à S.

frugiperda, o Green fluorescence protein (GFP). Para a síntese deste dsRNA,

utilizou-se iniciadores desenhados a partir de uma construção de GFP (GFP_FW 5'

TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAACTTTTCACTGGAG 3' e GFP_RV

5'TAATACGACTCACTATAGATCCATGCCATGTGTAATCCC 3'). O dsRNA-gels e

dsRNA-gfp continham 300 pares de base (pb) e às suas sequências foi adicionada

uma região do promotor T7.

As injeções de 5µL de dsRNA-gels (10 µg), 5µL de dsRNA-gfp (10 µg) e 5µL

de água livre de nucleases em lagartas de S. frugiperda foram realizadas utilizando-

se uma microseringa Hamilton (1701LT). Após 3, 4 e 6 dias, o silenciamento do

gene alvo em S. frugiperda foi verificado através da quantificação de transcritos de

gelsolina por RT-PCR semi-quantitativa (item 3.5.9). O peso médio das lagartas

experimental e controle também foi analisado. O efeito do silenciamento na

ultraestura do epitélio do ventrículo foi averiguado após análises de microscopias

eletrônicas (item 3.3).

59

4. RESULTADOS

4.1. Preparação das amostras de vesículas microapócrinas, frações

subcelulares (P1 e P3) e obtenção de anticorpos

Com o objetivo de identificar proteínas relacionadas à secreção

microapócrina, amostras do material do fluido ectoperitrófico rico em vesículas

microapócrinas (VM) e frações subcelulares da região anterior do ventrículo (P1 e

P3) foram inicialmente preparadas.

As frações P1 e P3 foram utilizadas na tentativa de obter proteínas

relacionadas ao citoesqueleto microvilar que poderiam não estar representadas nas

vesículas microapócrinas, mesmo essas sendo revestidas por membranas

plasmáticas microvilares, uma vez que para a vesícula migrar no interior da

microvilosidade é necessário haver desorganização dos microfilamentos de actina

(Jordão et al., 1999). Essas duas frações foram escolhidas porque P1 apresenta a

maior quantidade de aminopeptidase (marcadora de membranas microvilares nesse

tecido) e P3 apresenta a maior atividade específica dessa enzima (Ferreira et al.,

1994).

A preparação de vesículas foi examinada em microscopia eletrônica (Figura

7), onde se verifica vesículas bem preservadas (Figura 7A) que apresentam

tamanhos (0,25 µm) semelhantes aos das vesículas que ocorrem no interior das

microvilosidades (Figura 7B).

Essas três preparações (VM, P1, P3) foram utilizadas separadamente para a

produção de anticorpos em coelhos.

60

A

B

Figura 7: Microscopia eletrônica de transmissão da preparação de VM e ápice de uma

célula intestinal da região anterior do ventrículo de S. frugiperda. As setas apontam

vesículas de secreção microapócrina: presentes no conteúdo do fluido ectoperitrófico (A) e

brotando de microvilosidades (B). Note que as vesículas microapócrinas em (A) e (B)

possuem tamanhos semelhantes. MV, microvilosidade

As amostras VM, P1 e P3 foram submetidas a uma eletroforese e o resultado

está apresentado na figura 8. Verificamos que as três amostras possuem ampla

variedade de proteínas de diferentes tamanhos.

As preparações VM, P1 e P3 foram utilizadas em imunizações de coelhos

para a produção de anticorpos anti-VM, anti-P1 e anti-P3, respectivamente. Para a

obtenção dos anticorpos foram realizadas três imunizações que totalizaram 7 mg de

proteínas para P1 e P3 e 9 mg para VM.

61

Para testar o reconhecimento das proteínas presentes nas preparações VM,

P1 e P3, estas foram submetidas a uma eletroforese em gel 12% de poliacrilamida e

em seguida transferidas para uma membrana de nitrocelulose e incubadas com os

seus respectivos anticorpos nas diluições 1:100, 1:200, 1:500 e 1:1000. Na figura 8,

os westerns blots após SDS-PAGE revelaram o reconhecimento da maioria das

proteínas presente em cada preparação pelos seus anticorpos feitos após a

detecção padrão com anti-IgG de coelho acoplado com peroxidase e revelado com

TBS contendo água oxigenada 0,075% e 4-cloro-naftol 0,1% previamente dissolvido

em metanol. O reconhecimento das proteínas das preparações VM, P1 e P3 pelos

seus respectivos anticorpos ocorreu em todas as diluições utilizadas (dados não

mostrados). Os soros pré-imunes dos coelhos utilizados na produção dos anticorpos

não reconheceram qualquer proteína nas diluições 1:100 e 1:200 (dados não

mostrados), atestando que antes da imunização nenhuma proteína/anticorpo dos

coelhos reconhecia as proteínas das preparações utilizadas. Grande parte das

proteínas com maior massa molecular são reconhecidas pelos anticorpos.

Resultados semelhantes foram obtidos por Ferreira et al. (2007).

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Figura 8: Especificidade de anticorpos produzidos contra proteínas presentes em VM, P1 e

P3. (A) Western blot feito com anticorpos anti-VM (1) e detecção de proteínas das

preparações de VM após SDS-PAGE 12% (2). (B) Western blot feito com anticorpos anti-P1

(1) e detecção de proteínas das preparações de P1 após SDS-PAGE 12% (2) (C) Western

blot feito com anticorpos anti-P3 (1) e detecção de proteínas das preparações de P3 após

SDS-PAGE 12% (2). O reconhecimento das proteínas pelos anticorpos foi realizado após a

detecção padrão com anti-IgG de coelho acoplado com a peroxidase e revelado com TBS

contendo água oxigenada 0,075% e 4-cloro-naftol 1% previamente dissolvido em metanol.

70 µg de proteína foram aplicadas em cada raia. (P), padrão de massa molecular.

62

4.2. Enzimologia de vesículas microapócrinas

Vesículas microapócrinas já foram preparadas anteriormente, porém usando

diferentes faixas de centrifugação do fluido ectoperitrófico (Ferreira et al.,1994;

Bolognesi et al., 2001). Estes estudos mostraram que essas vesículas carregam

enzimas digestivas (como amilase, carboxipeptidase e tripsina), incluindo algumas

inseridas nas membranas microapócrinas (como a aminopeptidase) e peritrofina

(Ferreira et al., 1994; Bolognesi et al., 2001). Essas vesículas descarregam seus

conteúdos dentro do fluido ectoperitrófico que corresponde ao conteúdo luminal

entre o tecido e a MP e são incorporadas em parte dentro da porção gelatinosa da

MP, explicando assim a atividade enzimática ligada à MP (Ferreira et al., 1994;

Bolognesi et al., 2001).

Apesar de atividades específicas de diferentes enzimas já terem sido

determinadas anteriormente em tecidos intestinais, microvilosidades e conteúdos

intestinais, as condições eram diferentes, dificultando uma apropriada comparação

entre suas atividades específicas. Devido a isso, decidimos reinvestigar a

distribuição de enzimas nas vesículas microapócrinas.

Amostras de epitélio do ventrículo, microvilosidades, VM e conteúdo do

lúmen intestinal foram preparadas como descrito no item 3.2. Nessas amostras

foram determinadas as atividades específicas de aminopeptidase, amilase,

carboxipeptidase, tripsina, celobiase e maltase (Tabela 3).

A atividade específica de aminopeptidase é maior na microvilosidade, quando

comparada ao epitélio intestinal, e diminui nas VM e conteúdo da MP. Este

resultado indica que aminopeptidase é uma enzima microvilar que contamina as

VM.

As atividades específicas de amilase, carboxipeptidase e tripsina aumentam

gradualmente quando se compara epitélio do ventrículo, microvilosidades, VM e

conteúdo luminal. Isso favorece a hipótese que essas enzimas estão

verdadeiramente presentes nas VM, contaminando a microvilosidade e são

acumuladas no conteúdo da MP.

As atividades específicas de celobiase e maltase não estão enriquecidas (em

relação ao tecido intestinal) na microvilosidade nem no conteúdo da MP e suas

atividades nas VM são baixas. Esses resultados sugerem que estas enzimas são

secretadas por uma rota diferente do mecanismo microapócrino e que a maioria

63

delas está associada à superfície celular. Essa localização está de acordo com

aquela sugerida pela distribuição de suas atividades nas frações subcelulares

(Ferreira et al., 1994).

Tabela 3: Atividades específicas (mU/mg proteína) de enzimas digestivas em diferentes

amostras preparadas do intestino de S. frugiperda

Enzima Epitélio do

ventrículo Microvilosidades

Vesículas

microapócrinas

Conteúdo do

lúmen

intestinal

Aminopeptidase 600 ± 80 3500 ± 300 2100 ± 300 140 ± 10

Amilase 100 ± 15 400 ± 50 1100 ± 100 3100 ± 300*

Carboxipeptidase 33 ± 5 50 ± 10 70 ± 10 100 ± 20

Celobiase 30 ± 5 9,1 ± 0,9 3,5 ± 0,8 2,4 ± 0,2

Maltase 800± 100 400± 40 200± 20 47± 3

Tripsina 0,90 ± 0,06 5,9 ± 0,7 32 ± 8 80 ± 5

Dados são média e desvio padrão da média de determinações feitas em preparações

obtidas de 10 lagartas cada para epitélio do ventrículo e conteúdo do lúmen intestinal e 50

lagartas cada para microvilosidades e vesículas microapócrinas. (*) Ensaiada no sedimento

da centrifugação, onde a maior atividade é encontrada.

4.3. Pirosequenciamento de uma biblioteca de cDNA proveniente dos mRNAs

do IM de S. frugiperda

Pirosequenciamento é uma técnica eficiente que tem sido aplicada para a

análise do perfil de expressão gênica em tecidos específicos de insetos (Pauchet et

al., 2009b). Fizemos o pirosequenciamento dos transcritos proveniente do IM de S.

frugiperda, utilizando 200 ng de mRNA com alto grau de pureza e de boa qualidade.

O sequenciamento foi realizado como descrito no item 3.7.2, utilizando-se reagentes

da série titânio (GS-FLX Titanium Series Reagents) e o equipamento 454 Genome

Sequencer FLX (454 Life Sciences/Roche) instalado no laboratório CATG-USP. As

sequências obtidas foram submetidas ao programa Newbler (454 Life

Sciences/Roche) para uma montagem preliminar. Com o pirosequenciamento foram

obtidos 253,998 reads do IM. Os dados resultantes do transcriptoma estão

64

resumidos na tabela 4 e a distribuição do tamanho dos reads está apresentada na

figura 9.

Tabela 4: Resumo dos dados obtidos no pirosequenciamento da biblioteca de cDNA

obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda

IM

Total de bases sequenciadas 91.768.684

Total de reads 253.998

Tamanho médio dos reads 361 pb

Tamanho do maior read 783 pb

Mediana do tamanho dos reads 392 pb

Total de contigs gerados pelo Newbler 3675

Figura 9: Distribuição do número de reads segundo seu tamanho em pb, obtida no

pirosequenciamento da biblioteca de cDNA do IM de S. frugiperda. O gráfico foi fornecido

diretamente pelo software do sequenciador 454 Life Sciences/Roche após o processamento

das imagens e conversão em sequências.

4.4. Identificação de proteínas microvilares intestinais de S. frugiperda

65

As VM que brotam das microvilosidades carregam proteínas microvilares.

Assim, é interessante separar quais das proteínas de VM vieram das

microvilosidades daquelas que efetivamente estão sendo secretadas por

mecanismos microapócrinos. Proteínas microvilares de S. frugiperda foram

identificadas anteriormente em nosso laboratório por Ferreira e colaboradores

(2007) através de varredura de biblioteca de cDNA com anticorpos contra

membranas microvilares purificadas, onde o citoesqueleto é removido. Apesar de

terem sido obtidas 137 sequências únicas, somente clusters com duas ou mais

sequências foram levados em consideração (com apenas uma exceção), resultando

em 27 sequências. A disponibilidade de dados de pirosequenciamento da biblioteca

de cDNA obtida a partir dos mRNAs do IM de S. frugiperda levou-nos a reanalisar

todas as sequências únicas obtidas naquele estudo. Os procedimentos usados para

obter, estender e anotar as sequências foram os mesmos descritos no item 3.8.

O resultado da reanálise gerou um total de 66 proteínas preditas que ocorrem

nessas membranas microvilares. Dessas, 18 foram consideradas como

contaminantes por serem típicas de mitocôndria ou de outra parte celular ou por

serem proteínas desconhecidas (Tabela 5). Concluindo, 48 proteínas foram

associadas às membranas microvilares, quase o dobro das 27 proteínas

microvilares identificadas por Ferreira e colaboradores (2007). Essas sequências

estão apresentadas na tabela 6.

66

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67

Tab

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ymo

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.

69

4.5. Identificação de proteínas presentes nas vesículas microapócrinas de

S. frugiperda

O anticorpo anti-VM foi usado para varrer uma biblioteca de expressão de

cDNA do intestino de S. frugiperda. O resultado esperado era que proteínas de

clones reconhecidas pelo anticorpo correspondessem a proteínas de VM. Essas

proteínas estão em fase de leitura com o gene da β-Galactosidase do plasmídeo p-

Bluescript onde estão clonadas, indicando que elas estão sendo expressas como

proteínas recombinantes na indução da biblioteca de cDNA com IPTG. O

sequenciamento correspondente a 500 clones positivos gerou ESTs que foram

submetidos a filtros de qualidade de sequência de nucleotídeos. Em seguida os

ESTs foram usados em um frame positivo para serem agrupados com o programa

CAP3, resultando em 51 contigs e 196 singlets. As sequências obtidas pela

varredura foram submetidas a BLASTN contra sequências de S. frugiperda

originadas do pirosequenciamento da biblioteca de cDNA obtida a partir dos mRNAs

do IM. Este procedimento levou à extensão de sequências microapócrinas. As

sequências microapócrinas que não tinham sequências homólogas entre aquelas

obtidas por pirosequenciamento foram descartadas e o mesmo foi feito para

proteínas que não tinham sequências similares no GenBank ou tinham muitos

códons de terminação preditos. As sequências microapócrinas aceitas foram

anotadas com o software dCas e submetidas a diversas ferramentas

computacionais.

No total 92 sequências únicas foram aceitas, das quais 50 sequências estão

listadas nas tabelas 7 e 8 e 42 sequências foram descartadas de análises

adicionais, porque elas foram consideradas contaminantes da preparação das VM

ou porque eram muito pequenas para serem identificadas com segurança (Tabela

9).

A tabela 7 apresenta as proteínas preditas que podem ser secretadas por

secreção microapócrina. Os critérios usados para selecionar estas proteínas foram:

(1) elas são encontradas nas VM; (2) apresentam peptídeo sinal predito e (3) elas

supostamente atuam no conteúdo luminal na digestão, mecanismo de

desintoxicação ou estão associadas com a MP. Duas sequências de proteína

dissulfeto isomerases (PDIs) foram incluídas nessa tabela porque, embora seu

papel seja desconhecido, elas podem estar envolvidas em processo de proteção ou

70

fusão de membranas. A tabela 8 mostra as proteínas que podem ser secretadas

pela secreção microapócrina pelos mesmos critérios que aqueles usados na tabela

6, mas para as quais não temos dados sobre a ocorrência de peptídeo sinal.

71

Tab

ela

7:

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73

Tab

ela

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74

Tab

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na; G

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glic

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N-g

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osi

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o p

redi

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licosi

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o pre

dita

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rado

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não

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ava

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orq

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stá in

com

ple

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M +

V,

prese

nte

nas

mic

rovi

losi

dad

es e

nas

vesí

cula

s m

icro

apóc

rinas

.

76

4.6. Comparação das sequências presentes nas microvilosidades e

vesículas micrapócrinas

As proteínas preditas como presentes nas duas preparações podem ser

reunidas em 8 classes: enzimas digestivas, proteínas de MP, envolvidas com

proteção, receptores, transportadores, proteínas da maquinaria secretória, proteínas

de citoesqueleto e proteínas de função desconhecida nesse compartimento celular

(Figura 10 e Tabelas 6, 7 e 8).

Na figura 10 está representada a porcentagem do número de sequências

encontrada em cada classe em cada uma das preparações. Podemos ver que a

composição das duas preparações no que se refere a classes de enzimas é muito

semelhante. Em ambas há um predomínio de sequências de enzimas digestivas (o

que se acentua nas vesículas microapócrinas). As outras classes predominantes na

preparação de membranas microvilares são as proteínas da MP e proteínas

envolvidas com proteção. A quantidade de sequências relacionadas à MP é menor

nas vesículas do que nas membranas microvilares, e nas vesículas acentua-se o

número de transportadores que são principalmente ATPases que devem estar

regulando a concentração de íons (tais como H+) no interior das vesículas.

Como as enzimas digestivas são a classe de proteínas amplamente

predominantes nas duas preparações, nós analisamos a porcentagem de

sequências diferentes de cada enzima digestiva encontrada nas preparações de

membranas microvilares e de vesículas microapócrinas (Figura 10).

77

Classes

MM VM

C,S

ED

MP

PRO

REC

MS

TRA

DES

Enzimas digestivas

Abundância relativa de sequências

VMMM

AMIAACANPASTCCECARQUIDIPECTLIPG

LIPLIPIGLI

SERESFAMITTRI

Figura 10: Porcentagem de sequências diferentes encontradas em membranas microvilares

(MM), ou vesículas microapócrinas (VM). As sequências foram separadas em classes

funcionais e dentro da classe de enzimas digestivas, nos diferentes tipos de enzimas. C,

citoesqueleto; ED, enzimas digestivas; MP, membrana peritrófica; PRO, proteção; REC,

receptor; MS, maquinaria secretória; TRA, transportador; DES, desconhecida; AMI, amilase;

AAC, aminoacilase; ANP, aminopeptidase; AST, astacina; CCE, carboxil-colina esterase;

CAR, carboxipeptidase; QUI, quimotripsina; DIP, dipeptidase; ECT, ectonuclease, LIPG,

lipase gástrica; GLI, glicosídeo hidrolase; LIPI lipase inativa; LIP, lipasse; SER, serina

proteinase; ESF, esfingosina fosfodiesterase; AMIT, amilase semelhante a transportador de

aminoácido; TRI, tripsina.

Essa distribuição apresentou diferenças maiores, sendo que algumas

enzimas pouco representadas aparecem em uma ou na outra preparação (ver

tabelas 6, 7 e 8) e não serão comentadas aqui. As microvilosidades apresentam

uma predominância de aminopeptidases (32%), seguida de carboxipeptidase (18%),

enquanto que nas VM o maior número de sequências encontrado foi de lipases

(20%) que não são detectadas nas membranas microvilares. Além das lipases, as

VM apresentam um número expressivo de sequências de aminopeptidases (16,7%),

carboxipeptidases (10%) e serina proteinases (10%).

78

É interessante notar que enzimas responsáveis pela digestão de proteínas

são as predominantes. Isso deve refletir o fato de enzimas responsáveis pela

digestão de outra classe de compostos, tais como carboidratos, não estão presentes

predominantemente nas membranas microvilares nem são secretadas

majoritariamente pela rota microapócrina.

4.7. Comparação de algumas sequências selecionadas de enzimas digestivas

Seis aminopeptidases têm sequências completas o suficiente para serem

comparadas com sequências pertencentes a diferentes classes identificadas em

outros lepidópteros (Angelucci et al., 2008). As sequências de S. frugiperda estão

agrupadas nas classes 1, 2, 3, 5 e 6, das quais SfAPN546 (classe 1) é a mais

expressa (3701 reads). SfAPN591 não forma um ramo com nenhuma classe de

aminopeptidase conhecida (Figura 11).

As aminopeptidases presentes nas membranas microvilares podem ser

enquadradas nas classes 1, 3, 5 e 6 das aminopeptidases de Lepidoptera, enquanto

as aminopeptidases das vesículas estão presentes na classe 2 ou não puderam ser

classificadas porque no cladograma elas não se agrupam a nenhuma sequência.

Existem 3 sequências de amilase que estão completas (contigs 420 e 438) ou

estão incompletas, mas todas têm os resíduos críticos para sua atividade (resíduos

catalíticos e resíduos ligantes de Ca++) (contig 509). Sfamy420 é encontrada junto

com outras amilases de lepidópteros no cladograma, enquanto que os contigs 438 e

509 formam um ramo diferente com a sequência NP_001182391-1 de Bombyx mori

e um transportador de aminoácido (Figura 12). Proteínas de mamíferos envolvidas

no transporte de aminoácidos têm similaridade com proteínas da família α-amilase

(família 13 das glicosídeo-hidrolases) (Janecek et al., 1997). Não está claro o papel

fisiológico dessas amilases semelhantes aos transportadores de aminoácidos em

Spodoptera frugiperda.

As sequências de lipase ausentes do cladograma são: uma sequência que

não tem a serina catalítica (contig 287) e uma sequência muito curta (contig 516).

Seis sequências de lipases de S. frugiperda formam dois grupos monofiléticos

(bootstrap 58 e 99) que são similares a lipases pancreáticas (Figura 13). A

semelhança com lipases pancreáticas é reforçada pelo fato dos contigs 452, 456 e

448 terem a mesma sequência consenso na região do sítio ativo (GXSLGAH). Os

79

contigs 549, 379 e 584 têm uma região consenso similar, mas não idêntica, com

aquela apresentada pela lipase pancreática. O contig 379 tem uma alça

transmembrana predita, cujo significado ainda não está claro. O contig 456 pode ser

uma proteína citoplasmática contaminando as VM, uma vez que ela está completa e

não possui um peptídeo sinal. O contig 673 forma um ramo com uma lipase gástrica

humana (GHL na figura 13).

As carboxipeptidases digestivas encontradas em insetos ou outros

organismos tais como mamíferos são metalocarboxipeptidases da família M14. Elas

são classificadas em carboxipeptidases A e B. A especificidade primária das

carboxipeptidases A e B é determinada pela interação do resíduo localizado na

extremidade carbóxi-terminal do substrato com a bolsa de especificidade presente

na enzima, a qual tem o aminoácido 255 (numeração da carboxipeptidase A1

humana) no fundo (Titani et al., 1975).

Nas carboxipeptidases do tipo A, o resíduo C-terminal do substrato é

hidrofóbico ou aromático, nas carboxipeptidases do tipo B ele é básico. Em

Helicoverpa armigera Bown e Gatehouse (2004) descreveram uma

metalocarboxipeptidase que atua principalmente em Glu no carboxi-terminal, tendo

uma pequena atividade quando esse resíduo é um Asp. Essa enzima tem uma Arg

no sítio de especificidade. Os autores comentam que a melhor nomenclatura para

essa enzima seria carboxipeptidase C, para enfatizar sua semelhança com as

carboxipeptidases A e B, mas como essa denominação já é usada para uma

subclasse de serina carboxipeptidases, a melhor alternativa seria “Glu

carboxipeptidase MC”, sendo MC o clã ao qual essa enzima pertence (Rawlings et

al., 2012).

Alinhamentos não mostrados permitiram classificar as carboxipeptidases

presentes nas membranas microvilares como sendo tipo A (contigs 418 e 393), do

tipo B (contig 480) e do tipo MC (contig 492). As vesículas apresentam uma

carboxipeptidase tipo A (contig 710), uma tipo B (contig 480, o mesmo presente nas

microvilosidades) e uma carboxipeptidase da família S28, que provavelmente não é

digestiva (contig 577).

80

Figura 11: Cladograma (neighbor joining) de sequências de aminopeptidases de S.

frugiperda (identificadas como SfAPN mais um número do contig) e outros lepidópteros . Os

ramos correspondendo a separações em menos que 50% das réplicas (10000) foram

colapsados. As sequências de Helicoverpa armigera, Spodoptera exigua, e Spodoptera

litura são: Haclass1 AAL34109, Haclass2 HaAAW72993, Haclass3 AAL14117, Haclass4

AAP37950, Haclass5 AAK85539, HaClass6 Eu328183, Haclass7 Eu328183, Seclass1

AAP44964, Seclass2, AAP44965, Seclass3 AAP44966, Seclass4 AAP44967, Slclass4

AAK69605.

81

Figura 12: Cladograma (neighbor joining) de sequências de amilase de S. frugiperda

(identificadas como SfAmy mais um número de contig) e outros lepidópteros, um

transportador de aminoácido (aatransporter AAB26524) e um transportador de ácido

orgânico (oatransporter CAB77184). Os ramos correspondendo a divisões em menos que

50% das réplicas (10000) foram colapsados. As outras sequências são: Bombyx mori

BmAmy ACT64133.1, BmNP001182391.1; Diatraea saccharalis DsAmy1 AAP92665.1,

DsAmy2 AAP97393.1, DsAmy3 AAP97394.1; Helicoverpa armigera HaAmy1 ABU98614.1,

HaAmy2 ABU98613.1.

Figura 13: Cladograma (neighbor joining) de sequências de lipases de S. frugiperda

(identificadas como SfLip mais o número do contig) e sequências similares. Os ramos

correspondendo a divisões em menos que 50% das réplicas (10000) foram colapsados.

GHL, lipase gástrica de Homo sapiens; GPLRP2, galactolipase de Cavia porcellus, proteína

relacionada a lipase pancreática, HPL, lipase pancreática de Homo sapiens; DolmA1,

fosfolipase 1 de Dolichovespula maculate.

82

4.8. Sequências de proteínas que poderiam estar relacionadas ao mecanismo

da secreção microapócrina

Ao mesmo tempo que era feita a varredura com anticorpo contra vesículas

microvilares, nós decidimos utilizar anticorpos gerados contra duas frações

subcelulares (P1 e P3), que continham grande quantidade de membranas

microvilares para fazer varreduras semelhantes. Nosso intuito era conseguir o maior

número possível de proteínas de citoesqueleto ou proteínas envolvidas no processo

de secreção microapócrina.

As preparações feitas anteriormente (Ferreira et al., 2007) utilizaram

membranas microvilares purificadas submetidas a tratamento para remover

citoesqueleto e nós não sabíamos se as VM que nós coletamos do lúmen

apresentariam essas proteínas em grande quantidade.

Na época que esses experimentos foram feitos, não dispúnhamos ainda das

sequências geradas pelo pirosequenciamento e somente depois esses dados foram

utilizados para comparar com as sequências obtidas após a varredura,

completando-as ou aumentando sua sequência.

No que se refere a proteínas componentes de citoesqueleto ou maquinaria

secretória, somente uma sequência parcial de miosina VI foi encontrada. Miosina VI

foi primeiro descoberta em Drosophila como uma proteína ligante de actina sensível

a ATP (Kellerman e Miller, 1992). Miosina VI, diferente de quase todas as outras

miosinas, move-se em direção a extremidade “menos” de filamentos de actina e

está relacionada a uma variedade de processos intracelulares, tais como tráfico de

membrana vesicular, migração celular e mitose (Buss et al., 2004).

No que se refere a enzimas digestivas, várias foram detectadas nas outras

varreduras, mas uma sequência parcial de β-1,3-glucanase foi detectada somente

na varredura com o anticorpo anti-P1. A sequência de nucleotídeos correspondente

a essa enzima foi previamente sequenciada e estudada pelo nosso grupo (Bragatto

et al., 2010).

As proteínas que poderiam estar envolvidas no processo microapócrino

encontradas nas varreduras foram: anexina, cofilina, fimbrina, gelsolina-1, miosina

VI e PDIs (1 e 2). Procuramos também no Spodobase

(http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/) sequências de proteínas preditas que

83

pudessem ter papel na secreção, baseado em pesquisas na literatura. Essas

sequências estão apresentadas na tabela 10.

A sequência completa de nucleotídeos correspondente a anexina tinha sido

obtida anteriormente por nosso grupo usando iniciadores específicos. Como nós

ainda não havíamos realizado o pirosequenciamento, utilizamos iniciadores

específicos para também obter as sequências das PDIs (1 e 2), fimbrina, cofilina,

miosina I e gelsolina-1. Nosso intuito era conseguir todas as sequências completas,

expressá-las em bactéria ou levedura para produção de anticorpos que seriam

utilizados em imunocitolocalização. Também gostaríamos de obter o silenciamento

da expressão de cada uma delas com RNA interferente.

A seguir faremos uma breve apresentação das proteínas que tiveram suas

sequências de nucleotídeos obtidas após sequenciamento dos cDNAs

correspondentes, usando iniciadores específicos desenhados a partir de sequências

parciais obtidas nas varreduras de biblioteca de cDNA (PDI-1, PDI-2, fimbrina,

cofilina e gelsolina) ou no Spodobase (miosina I).

Tabela 10: Proteínas preditas que podem estar envolvidas na maquinaria de

secreção microapócrina de secreção microapócrina selecionadas como candidatas a

partir de pesquisa na literatura e encontradas no Spodobase

(http://bioweb.ensam.inra.fr/spodobase/)

Acesso no GenBank

Acesso no Spodobase

Reads PS AT GPI N-gli O-gli Proteína predita

Obs.

Sf2M09970-5-1 8 N N N S S Arp 2/3 Completa

EF071985 Sf2L00914-5-1 134 N N N N N Moesina Completa

Sf2M00173-5-1 180 N N N S S Miosina I Completa

JX087453 Sf1M08205-5-1 195 N N N S N Profilina Completa

Sf1P09723-5-1 0 - - - S S Gelsolina 2 −

PS, peptídeo sinal; AT, alça transmembrana; GPI, âncora de glicosilfosfatidilinositol; N-gli,

N-glicosilação predita; O-gli, O-glicosilação predita; S, encontrado; N, não encontrado; (−)

a sequência está incompleta.

84

4.8.1. Proteína dissulfeto isomerase (PDI)

Encontramos duas PDIs nas varreduras realizadas nesse trabalho, que

denominamos PDI-1 e PDI-2. A PDI-1 foi encontrada em preparações de VM e

microvilosidades e a PDI-2 foi encontrada somente na preparação de VM. Uma

comparação da arquitetura dessas duas proteínas com as humanas mostra que elas

são mais semelhantes à PDI e a ERp57 (Ellgaard e Ruddock, 2005), pois todas elas

possuem 2 domínios catalíticos (a e a’) separados por 2 domínios não catalíticos (b

e b’) e não possuem sítios de glicosilação (ver figura 14 e 15). Cada um dos

domínios catalíticos possui um sítio ativo com o motivo WCGHCK (Wallis et al.,

2009), sendo que os dois aminoácidos que existem entre os dois resíduos de

cisteína possuem um papel importante na determinação do potencial redox da

enzima e consequentemente na sua função como tiol-dissulfeto redutase, oxidase

ou isomerase (Ellgaard e Ruddock, 2005).

Conforme comentado na introdução, a PDI pode estar envolvida em

processos de fusão de membranas. Uma vez que inúmeras fusões de membrana

ocorrem nas membranas microvilares de S. frugiperda, devido à secreção

microapócrina, talvez essa proteína tenha o papel de possibilitar ou facilitar essas

fusões. É interessante ressaltar que a PDI deve apresentar papel importante nas

microvilosidades, pelo menos em Lepidoptera. Além das duas PDIs que

encontramos em S. frugiperda, uma PDI foi encontrada nas microvilosidades das

células intestinais de Manduca sexta (Pauchet et al., 2009a).

Nas figuras 14 e 15 estão apresentadas as sequências das PDI-1 e PDI-2

respectivamente e na figura 16 as duas sequências são comparadas. A tabela 11

apresenta as proteínas com as quais elas apresentam maiores identidades e

similaridades após a realização de um BLASTP

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

85

1 atgttggggtcactaaaaattgttttattattaggtgtaatttatttatgtagagctgcc 60

1 M L G S L K I V L L L G V I Y L C R A A 20

61 gaagaagatgtattggatcttacagattccgacttttcgtcggtgttgagccaacatgat 120

21 E E D V L D L T D S D F S S V L S Q H D 40

121 actgctcttgtcatgttttacgcaccatggtgcggtcattgtaagagatcgaagccggag 180

41 T A L V M F Y A P W C G H C K R S K P E 60

181 tacgcggtagcggccggcgtgctaaagaacgatgaccctcctgtcgcgctggcgaaggta 240

61 Y A V A A G V L K N D D P P V A L A K V 80

241 gactgtaccgagggtggcaagagcacatgtgagcagttctcagtgtctgggtaccccaca 300

81 D C T E G G K S T C E Q F S V S G Y P T 100

301 ctgaagatcttcagaaagggagaagtttcccaggagtacaatggccccagggaatcaaac 360

101 L K I F R K G E V S Q E Y N G P R E S N 120

361 ggcattgtgaaatacatgcgtgctcaagtcgggcccagctctaaggaactgaagactgtt 420

121 G I V K Y M R A Q V G P S S K E L K T V 140

421 gctgattacgaagcattcctgaagaaggatgaggtgctcgtcatcggcttcttcgagaag 480

141 A D Y E A F L K K D E V L V I G F F E K 160

481 gagactgatctcaagggtgatttcgttaagactgctgacaagatgcgcgaagaagtcacc 540

161 E T D L K G D F V K T A D K M R E E V T 180

541 tttgcacacacttctgctaaggaggtccttgacaaggctggatacaagaacgacgttgta 600

181 F A H T S A K E V L D K A G Y K N D V V 200

601 ttgttccgtcccaaacgcctgcagaacaagtttgaagactcgtccgtcgtgtacaaggga 660

201 L F R P K R L Q N K F E D S S V V Y K G 220

661 gagcctgagacctactcactcaaggctttcatcaaggagaacttccacggtctggtcggc 720

221 E P E T Y S L K A F I K E N F H G L V G 240

721 atccgccagaaggacaacatccgtgacttcaccgatcccctggtggtcgcctactatgat 780

241 I R Q K D N I R D F T D P L V V A Y Y D 260

781 gtggactacgtcaagaaccccaagggcacaaactactggaggaaccgtgtgctcaaagtt 840

261 V D Y V K N P K G T N Y W R N R V L K V 280

841 gccaaggaacagacagaggttacgttcacagtgagcgacaaggacgacttcacccacgaa 900

281 A K E Q T E V T F T V S D K D D F T H E 300

901 ctgaatgagtatggcattgactacgccaagggtgacaagccagtcgtcgccggccgtgac 960

301 L N E Y G I D Y A K G D K P V V A G R D 320

961 gctgatggcaacaagtttgtcatgtccaccgagttcagcattgaaaacctgttggccttc 1020

321 A D G N K F V M S T E F S I E N L L A F 340

1021 acaaaggatctgctggacggtaaattggagcctttcgtcaagtctgagcctgtacctgag 1080

341 T K D L L D G K L E P F V K S E P V P E 360

1081 agcaacgacggaccagtgaaggtagctgtcggcaagaacttcaaggagctggtcaccgac 1140

361 S N D G P V K V A V G K N F K E L V T D 380

1141 agtggacgtgatgccctcatcgagttctacgccccatggtgcggacattgccagaaactc 1200

381 S G R D A L I E F Y A P W C G H C Q K L 400

1201 gctccagtgtgggacgagcttggtgaaaagctcaaggacgaggctgtggacatcgtgaag 1260

401 A P V W D E L G E K L K D E A V D I V K 420

1261 atcgacgctaccgccaacgactggcccaagtcgcagttcgacgtgtctggtttccccacc 1320

421 I D A T A N D W P K S Q F D V S G F P T 440

1321 atctactggaaacccgctgacaactccaagaaacccgtcagatacaatggtggccgtgct 1380

441 I Y W K P A D N S K K P V R Y N G G R A 460

1381 ctcgaaaatttcgtcaagtatgtagctgaacaagcttccagcgagctcaacggctgggac 1440

461 L E N F V K Y V A E Q A S S E L N G W D 480

1441 agaaagggcaagccaaagaaggaagagctctaa 1473

481 R K G K P K K E E L - 490

a b b’ a’N C

Figura 14: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-1 de S. frugiperda.

Os domínios tiorredoxina de PDI (a, b, b’, a’) estão destacados por cores em (A) e

correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em (B). O motivo WCGHCK do sítio

ativo está representado em (A) com caixa preta e em (B) com pontas de setas pretas. A

arginina catalítica está marcada em (A) com caixa vermelha e em (B) com ponta de seta

vermelha. O sinal de residência no RE está destacado em (A) com caixa descontínua. O

códon de terminação está em itálico.

A B

n

B B

n

86

1 atgagagtaatcttatttacggcgatagcccttttgggcgccgctttggctgatgaaata 60

1 M R V I L F T A I A L L G A A L A D E I 20

61 cccacagaagaaaatgtactcgtgctgagcaaatccaacttcgacggtgcaatctcatca 120

21 P T E E N V L V L S K S N F D G A I S S 40

121 aacaacttcattttagttgaatctatgcgccatggtgcggtcactgcaagtccctcgct 180

41 N N F I L V E F Y A P W C G H C K S L A 60

181 ccggaatacgccaaggctgccaccaaattggcggaagaagagtcctccatcaagttggcc 240

61 P E Y A K A A T K L A E E E S S I K L A 80

241 aaggtagatgccacgcaagaacaagagctcgctgagagctacggcgtcaggggatacccg 300

81 K V D A T Q E Q E L A E S Y G V R G Y P 100

301 actctgaagttcttcaggaacggcagccctattgattacacaggtggtcgccaggctgat 360

101 T L K F F R N G S P I D Y T G G R Q A D 120

361 gacatcatcacttggctgaagaagaagaccggtcctcctgctgttgaagtgtcatctgct 420

121 D I I T W L K K K T G P P A V E V S S A 140

421 gagcaagccaaggagctcattgctgccaacaatgtcatcatcttcggtttcttctctgac 480

141 E Q A K E L I A A N N V I I F G F F S D 160

481 tccaacactgctaaagccaacaccttcacaagtgtagccagtgctgttgatgaccatgtc 540

161 S N T A K A N T F T S V A S A V D D H V 180

541 tttgccttggtctctgaccctaaagttattactgaactggaagctgaagccaagtgcgga 600

181 F A L V S D P K V I T E L E A E A K C G 200

601 tcgatcgtgctctacaagaacttcgaagagcccagcgtgaagtatgatgctgagaaattc 660

201 S I V L Y K N F E E P S V K Y D A E K F 220

661 gacgaggacctgttcaagacctgggtgttcgtccagagcatgcccaccattgtggagttc 720

221 D E D L F K T W V F V Q S M P T I V E F 240

721 tcccacgagaccgcctccaagatcttcggtggccagatcaaataccaccttctgttgttc 780

241 S H E T A S K I F G G Q I K Y H L L L F 260

781 ctgtccaagaaaaatggcgatttcgacaagtacactgaggagctcaagcccgttgccaag 840

261 L S K K N G D F D K Y T E E L K P V A K 280

841 aactaccgtgacagggttatgtccgtcgccattgacgctgacgaagatgaacaccagaga 900

281 N Y R D R V M S V A I D A D E D E H Q R 300

901 atccttgagttcttcggcatgaagaaggaggagattccctctgcccgcctgattgccctg 960

301 I L E F F G M K K E E I P S A R L I A L 320

961 gaacaggacatggccaaatacaagcccactagcgacgaactttctgccaactccattgag 1020

321 E Q D M A K Y K P T S D E L S A N S I E 340

1021 gaattcatccagtcattcttcgctggtaccctgaagcagcacttgttgagcgaggacctg 1080

341 E F I Q S F F A G T L K Q H L L S E D L 360

1081 cccgccgactgggccgccaagcccgtcaagaccctggtcgccaccaacttcgatgaagtc 1140

361 P A D W A A K P V K T L V A T N F D E V 380

1141 gtcttcgacaacagcaagaaggtcctcgttgaattctatgccccatggtgcggtcactgc 1200

381 V F D N S K K V L V E F Y A P W C G H C 400

1201 aagcagttggctcctatctacgacaagttgggagagcacttcgagaaggacgatgacgtc 1260

401 K Q L A P I Y D K L G E H F E K D D D V 420

1261 atcatcgccaagatggacgccaccgccaacgagctggaacacaccaagatcacctccttc 1320

421 I I A K M D A T A N E L E H T K I T S F 440

1321 cccaccatcaaactgtacactaaggacaaccaggtgaaagactacaacggcgagagaacg 1380

441 P T I K L Y T K D N Q V K D Y N G E R T 460

1381 ttggcagctatgaccaagttcgtagagaccgatggtgaaggcgccgagcctacacctagt 1440

461 L A A M T K F V E T D G E G A E P T P S 480

1441 gtgagcgaggaggatgaagaagacgaacagccatccagagacgagttataa 1491

481 V S E E D E E D E Q P S R D E L - 496

a b b’ a’N C

Figura 15: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da PDI-2 de S. frugiperda.

Os domínios tiorredoxinas de PDI (a, b, b’, a’) estão destacados por cores em (A) e

correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em (B). O motivo WCGHCK do sítio

ativo está representado em (A) com caixa preta e em (B) com pontas de setas pretas. A

arginina catalítica está marcada em (A) com caixa vermelha e em (B) com ponta de seta

vermelha. O sinal de residência no RE está destacado em (A) com caixa descontínua. O

códon de terminação está em itálico.

B B

n

A B

n

87

Tabela 11: Identidades e similaridades das sequências de PDI-1 e PDI-2 de S.

frugiperda com PDIs presentes em outros insetos

Proteína Organismo % Identidade % Similaridade Número de

acesso (Bank)

Bombyx mori 426/492 (87%) 460/492 (93%) BAD93613.1

Bombyx mori 425/492 (86%) 459/492 (93%) BAD93614.1

PDI-1 Danaus plexippus 410/490 (84%) 454/490 (93%) EHJ76798.1

Papilio xuthus 401/490 (82%) 447/490 (91%) BAM17874.1

Tribolium castaneum 314/488 (64%) 383/488 (78%) EFA11421.1

Papilio xuthus 382/448 (85%) 414/448 (92%) BAM17793.1

Papilio polytes 379/448 (85%) 413/448 (92%) BAM18927.1

PDI-2 Bombyx mori 372/448 (83%) 408/448 (91%) AAG45936.1

Danaus plexippus 352/448 (79%) 395/448 (88%) EHJ68070.1

Culex quinquefasciatus 269/449 (60%) 341/449 (76%) EDS26398.1

Comparando a sequência das duas enzimas de S. frugiperda com as

proteínas humanas, verificamos que a PDI-2 tem maior identidade e similaridade

com a PDI humana do que com a ERp57 humana, sendo que o oposto é verdadeiro

para a PDI-1 (ver tabela 12). É interessante ressaltar que as proteínas de S.

frugiperda têm menor identidade (32%) e similaridade (49%) entre si do que com

uma das proteínas humanas. O mesmo é verdadeiro quando se compara as duas

proteínas humanas, que apresentam 32% de identidade e 54% de similaridade entre

si. O alinhamento das duas sequências de PDIs confirma que elas possuem baixa

similaridade entre si (Figura 16).

A proteína ERp57 com a qual a PDI-1 de S. frugiperda detectada na

membrana apresenta maior identidade, interage com proteínas glicosiladas

secretadas e com proteínas de membrana (Wilkinson e Gilbert, 2004). A proteína

ERp60 (também referida como ERp57, ver Coe e Michalak, 2010) foi detectada em

C. elegans e ela tem atividade de transglutaminase que faz ligações cruzadas entre

Gln e Lys, criando estabilidade tecidual na cutícula desses nematóides (Eschenlauer

e Page, 2003). Embora a detecção de alguns membros da família PDI na superfície

celular esteja cada vez mais frequente seu mecanismo de secreção, sua interação

com a membrana e sua função nessa região ainda não estão completamente

esclarecidos e precisam de um estudo mais detalhado. Como a ERp57 pode ligar

porções glicosiladas de proteínas (Wilkinson e Gilbert, 2004) e pode ser encontrada

em rafts na membrana plasmática (Turano et al., 2002), talvez seu processo de

88

secreção, sua localização e seu papel seja semelhante a da galectina, uma lectina

responsável pelo direcionamento de algumas proteínas para a membrana microvilar

intestinal de mamíferos. É interessante notar que a galectina é uma proteína

secretada sem um sinal para a translocação através da membrana, indicando que

ela é secretada por um mecanismo não clássico de secreção (ver Braccia et al.,

2003).

Tabela 12: Identidades e similaridades das PDIs de S. frugiperda e humanos

PDI humana

ERp57 humana

% Identidade % Similaridade %

Identidade % Similaridade

PDI-1 36 53

46 64 PDI-2 51 70 35 53

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 1 --MLGSLKIVLLLGVIYLCRAAEEDVLDLTDSDFSSVLSQHDTALVMFYAPWCGHCKRSK 58

PDI-2 1 MRVILFTAIALLGAALADEIPTEENVLVLSKSNFDGAISSNNFILVEFYAPWCGHCKSLA 60

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 59 PEYAVAAGVLKNDDPPVALAKVDCTEGGKSTCEQFSVSGYPTLKIFRKGEVSQEYNGPRE 118

PDI-2 61 PEYAKAATKLAEEESSIKLAKVDATQE-QELAESYGVRGYPTLKFFRNG-SPIDYTGGRQ 118

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 119 SNGIVKYMRAQVGPSSKELKTVADYEAFLKKDEVLVIGFFEKETDLKGDFVKTADKMREE 178

PDI-2 119 ADDIITWLKKKTGPPAVEVSSAEQAKELIAANNVIIFGFFSDSNTAKANTFTSVASAVDD 178

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 179 VTFAHTSAKEVLDKAGYKNDVVLFRPKRLQNKFEDSSVVYKGE--PETYSLKAFIKENFH 236

PDI-2 179 HVFALVSDPKVITEL---EAEAKCGSIVLYKNFEEPSVKYDAEKFDEDLFKTWVFVQSMP 235

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 237 GLVGIRQKDNIRDFTDPLVVAYYDVDYVKNPKGTNYWRNR--VLKVAKEQTEVTFTVSDK 294

PDI-2 236 TIVEFSHETASKIFGGQIKYHLLLFLSKKNGDFDKYTEELKPVAKNYRDRVMSVAIDADE 295

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 295 DDFTHELNEYGIDYAKGDKPVVAGRDADGNKFVMS-TEFSIENLLAFTKDLLDGKLEPFV 353

PDI-2 296 DEHQRILEFFGMKKEEIPSARLIALEQDMAKYKPTSDELSANSIEEFIQSFFAGTLKQHL 355

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 354 KSEPVPESNDG-PVKVAVGKNFKELVTDSGRDALIEFYAPWCGHCQKLAPVWDELGEKLK 411

PDI-2 356 LSEDLPADWAAKPVKTLVATNFDEVVFDNSKKVLVEFYAPWCGHCKQLAPIYDKLGEHFE 415

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

PDI-1 412 -DEAVDIVKIDATANDWPKSQFDVSGFPTIYWKPADNSKKPVRYNGGRALENFVKYVAEQ 471

PDI-2 416 KDDDVIIAKMDATANELEHT--KITSFPTIKLYTKDNQVK--DYNGERTLAAMTKFVETD 471

....|....|....|....|....|

PDI-1 472 AS------SELNGWDRKGKPKKEEL 490

PDI-2 472 GEGAEPTPSVSEEDEEDEQPSRDEL 496

Figura 16: Alinhamento de sequências de aminoácidos de duas PDIs de S. frugiperda. PDI-

1 foi encontrada nas preparações de VM e de membranas microvilares, enquanto que a

PDI-2 foi encontrada somente na preparação de VM. Caixas pretas referem-se a resíduos

idênticos, e caixas cinzas representam resíduos com cadeias laterais semelhantes. Os

alinhamentos foram feitos usando o CLUSTALW dentro do Programa Expasy

(http://expasy.org/tools/).

89

4.8.2. Fimbrina

A sequência de fimbrina foi encontrada na varredura usando anticorpo contra

preparação de membranas microvilares. Devido a suas propriedades, a fimbrina

auxilia na organização do citoesqueleto no interior das microvilosidades e poderia

estar implicada nas propriedades particulares apresentadas por essa estrutura no

ventrículo anterior de S. frugiperda. A figura 17 mostra a sequência de nucleotídeos

e a sua sequência deduzida de aminoácidos que possui 666 resíduos e apresenta

todos os 4 domínios CH que formam 2 ABDs, além do headpiece N-terminal. A

tabela 13 apresenta as proteínas com as quais a fimbrina de S. frugiperda apresenta

maiores identidades e similaridades após a realização de um BLASTP

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

1 atggcagataattcaaaattgaccgacgaggagagggctgagatcagggagcagtttgag 60

1 M A D N S K L T D E E R A E I R E Q F E 20

61 cagttggacacaaacagcagcggttatatcgacctgaaagaattgaaagaagcactcgac 120

21 Q L D T N S S G Y I D L K E L K E A L D 40

121 agtgtcggatacaaaattccacaatggaaggtccggtgtatgatcgaggagtactacgac 180

41 S V G Y K I P Q W K V R C M I E E Y Y D 60

181 aatggcaacaagcgcggtgtcaacggcagcatgaatggagacgccaggaagaatgccatc 240

61 N G N K R G V N G S M N G D A R K N A I 80

241 agtctcaccgagttcgaggagctttgcgctaaccttaaagcacaacaggtgtccagcacg 300

81 S L T E F E E L C A N L K A Q Q V S S T 100

301 ttcaaacaggcggtcagtaaaaaggagaacctggaacacttgggcggtatgagcgaagcc 360

101 F K Q A V S K K E N L E H L G G M S E A 120

361 tccagtgatggcacaactcactcggttcgacttgaggagcagatggcgttctctggctgg 420

121 S S D G T T H S V R L E E Q M A F S G W 140

421 ataaacagcaacctggaacacgaccccgacctgaagcacctgctgcccatagaccacgag 480

141 I N S N L E H D P D L K H L L P I D H E 160

481 gggaagcagctgtatgagaagctgaaagacggtctcatattatgtaaagtgataaaccac 540

161 G K Q L Y E K L K D G L I L C K V I N H 180

541 tcgtgccccgacacgatagacgagcgtgccatcaacaacaagaacctgactctgtacacg 600

181 S C P D T I D E R A I N N K N L T L Y T 200

601 aagcacgagaacctcacgctggcgctcgtctcctcgcaggctatcggctgcagtatcgtc 660

201 K H E N L T L A L V S S Q A I G C S I V 220

661 aatattgatgctcatgatttggctaaaggcaaacctcacttggtgttgggtctgctgtgg 720

221 N I D A H D L A K G K P H L V L G L L W 240

721 cagatcatccgaatcggtttgttcaaccagatcacattggaacactgccccggtcttact 780

241 Q I I R I G L F N Q I T L E H C P G L T 260

781 gagctgctcaatgaccaggaacgcatcgaggacctgctggcactgtcaccagaggcgatc 840

261 E L L N D Q E R I E D L L A L S P E A I 280

841 ctgctgcgctgggtgaaccaccagctgcagagcgccggcgtcacgcgccgctgcaccaac 900

281 L L R W V N H Q L Q S A G V T R R C T N 300

901 ttccagcaggatgtcgccgactccgagatctactcgtacctgctcaaacagatcgcgcct 960

A n

90

301 F Q Q D V A D S E I Y S Y L L K Q I A P 320

961 gacgactctggagttacgcttgatgctttgagggaaaccgacctactccgtcgtgcggaa 1020

321 D D S G V T L D A L R E T D L L R R A E 340

1021 ctcatgctgcaacaagcggcgaagctcaggtgtcgcgcgttcgtgactccggccgacgtg 1080

341 L M L Q Q A A K L R C R A F V T P A D V 360

1081 gtgggcggagtatacaagctgaacttggcgttcgtggccaacctgttcaaccagcatcct 1140

361 V G G V Y K L N L A F V A N L F N Q H P 380

1141 ggcctgcagcgcactgctgacactgaggaactgcaccagctagacgagaccagggaggag 1200

381 G L Q R T A D T E E L H Q L D E T R E E 400

1201 aagacttaccgcaactggatgaactcgatgggcgtggcgccgcacgtgaactggctgtac 1260

401 K T Y R N W M N S M G V A P H V N W L Y 420

1261 tcggacctgacggacgggctcgtcatcttccagctctacgacatcatcaaacctggcatt 1320

421 S D L T D G L V I F Q L Y D I I K P G I 440

1321 gttaactggaagaaggtgcaccgccagttctcgaagctgcgtaagttcatggagcggctg 1380

441 V N W K K V H R Q F S K L R K F M E R L 460

1381 gagaactgcaactacgccgtggagctcggccggcagctcgggttctcgctcgtcggcatc 1440

461 E N C N Y A V E L G R Q L G F S L V G I 480

1441 gcgggcgccgacatcaacgaggggaatgctacgcttacactcgccctgatctggcagttg 1500

481 A G A D I N E G N A T L T L A L I W Q L 500

1501 atgcgcgcgtacacgctgtcggtgctgacccggctggccaataccgggaaccccatcatc 1560

501 M R A Y T L S V L T R L A N T G N P I I 520

1561 gagaaggagatcgtgcagtgggtcaacaacaaactcgccggcgccggcaagacctcatct 1620

521 E K E I V Q W V N N K L A G A G K T S S 540

1621 attaggagcttccaggatgaggtgttggctgacggtaaggtggtgatcgacctgatcgac 1680

541 I R S F Q D E V L A D G K V V I D L I D 560

1681 gccatcaagcctggctccatcaactacgacctcgtgctgcccggaggcaacgaggaggag 1740

561 A I K P G S I N Y D L V L P G G N E E E 580

1741 aacctagccaacgcgaaatacgcgatttcaatggcgcgtcgttgcggagcgcgcgtatac 1800

581 N L A N A K Y A I S M A R R C G A R V Y 600

1801 gcgctaccggaggacattacggagaggaaaccgaagatgatcatgacagtgttcgcgtgc 1860

601 A L P E D I T E R K P K M I M T V F A C 620

1861 ctcatggcgctcgactacatcccggctcgtgccgaattcctgcagcccgggggatccact 1920

621 L M A L D Y I P A R A E F L Q P G G S T 640

1921 agttctagagcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggtt 1980

641 S S R A A A T A V E L Q L L F P L V R V 660

1981 Aataatcactag 1992

661 N N H - 663

Figura 17: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da fimbrina de S.

frugiperda. O domínio headpiece e todos os domínios CH estão destacados por cores em

(A) e correspondem ao diagrama dos domínios da sequência (B). O códon de terminação

está em itálico.

B B

n

91

Tabela 13: Identidades e similaridades da sequência de fimbrina de S. frugiperda com as

de outros insetos

Organismo % Identidade % Similaridade Número de

acesso (GenBank)

Danaus plexippus 584/631 (93%) 605/631 (96%) EHJ77539.1

Aedes aegypti 458/612 (75%) 528/612 (86%) EAT46255.1|

Anopheles gambiae 456/622 (73%) 535/622 (86%) EAA05335.4

Anopheles darlingi 452/628 (72%) 529/628 (84%) EFR22119.1

Anopheles gambiae 451/628 (72%) 531/628 (85%) EGK96319.1

4.8.3. Miosina I

As miosinas presentes nas microvilosidades intestinais poderiam estar de

alguma maneira relacionadas com os processos de secreção microapócrina devido

as suas funções motoras e sua capacidade de conectar os filamentos de actina com

a membrana microvilar. Na figura 18 está apresentada a sequência completa de

uma miosina I de S. frugiperda, obtida a partir de um EST encontrado no banco de

dados Spodobase (Sf 2M00173-5-1). A proteína possui 1032 aminoácidos e todos

os domínios presentes na classe I das miosinas. A tabela 14 apresenta as proteínas

com as quais a miosina I de S. frugiperda apresenta maiores identidades e

similaridades após a realização de um BLASTP

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

1 atggagcacgccctcgtgcaccgcgagcgcgtcggagtgcaagacttcgtgctgctcgag 60

1 M E H A L V H R E R V G V Q D F V L L E 20

61 gacttccgatctgaagccgctttcattgacaacctcaggaaacgattcaacgagaacatt 120

21 D F R S E A A F I D N L R K R F N E N I 40

121 atttatacgtacatcggcaacgtgcttatatccgtgaacccgtacaagaacctgcctatc 180

41 I Y T Y I G N V L I S V N P Y K N L P I 60

181 tacacggaggagaagaccaaactatactacaaaaaggctttctttgaggcaccaccacac 240

61 Y T E E K T K L Y Y K K A F F E A P P H 80

241 gtattcgcaattgcagacaacgcctacaggtccttggtatacgaacacagagaacagtgc 300

81 V F A I A D N A Y R S L V Y E H R E Q C 100

301 attttgatctcaggtgaatctggttcaggcaaaacagaggcgtccaaaaaagtcctagag 360

101 I L I S G E S G S G K T E A S K K V L E 120

361 tacatagcagcaagaacaaatcaccttcgcaacgtagaaactgttaaggacaaacttctt 420

A B

n

92

121 Y I A A R T N H L R N V E T V K D K L L 140

421 caaacgaaccccctacttgaagccttcggtaatgctaaaacacacagaaatgacaactct 480

141 Q T N P L L E A F G N A K T H R N D N S 160

481 agtcgttttggaaagtacatggacgtccagttcaactatgaaggagcccctgaaggtgga 540

161 S R F G K Y M D V Q F N Y E G A P E G G 180

541 cacatccttaactaccttttggagaagtccagggtagtcagtcaaatgtctggagagagg 600

181 H I L N Y L L E K S R V V S Q M S G E R 200

601 aacttccacatcttctatcagctattggctggagcagaccaggacttgttaagacagttg 660

201 N F H I F Y Q L L A G A D Q D L L R Q L 220

661 aagctgcaaggaaggccggaagcttacaaatacactactgatgcgggtgcccaaggaaac 720

221 K L Q G R P E A Y K Y T T D A G A Q G N 240

721 caacgtaaccaagacgccgagcagttccgtacagtgcaggaagccatgaaagtcatcgag 780

241 Q R N Q D A E Q F R T V Q E A M K V I E 260

781 atcaaccaaacggaacagactgagattttcgagattgtcgccagcgtccttcatctagga 840

261 I N Q T E Q T E I F E I V A S V L H L G 280

841 aatgcgaagttcgtgcagaatgacaagggatatgctgaaattctgtcacacgatgctaac 900

281 N A K F V Q N D K G Y A E I L S H D A N 300

901 tctaacaatgtcgctgagcttctgaaagtggacagcacaaaattaaaagaggtacttacc 960

301 S N N V A E L L K V D S T K L K E V L T 320

961 agccgtaccatcagcgctcgtggggatgtagtcaacacccccctggacctggagcaggcg 1020

321 S R T I S A R G D V V N T P L D L E Q A 340

1021 cagtacgccagagatgccctcgccaaggccatctatgacaagcacttcagctggctggtc 1080

341 Q Y A R D A L A K A I Y D K H F S W L V 360

1081 tccaggctgaacgcctccctcgcacccaaggacaaagacagtcagtcgtccgtcattggt 1140

361 S R L N A S L A P K D K D S Q S S V I G 380

1141 attctggacatctacggatttgaaatcttccctaagaatagcttcgagcagttctgcatc 1200

381 I L D I Y G F E I F P K N S F E Q F C I 400

1201 aacttctgtaacgagaagctgcagcagctgttcatccagctgacgctgaagcaggagcag 1260

401 N F C N E K L Q Q L F I Q L T L K Q E Q 420

1261 gaggagtatctgcgcgagggcatcgagtgggagcccgtcgagtacttcaacaacatcgtc 1320

421 E E Y L R E G I E W E P V E Y F N N I V 440

1321 atctgcgacctcatcgaggccaggcacactggtataatcgcgatcctggacgacgagtgc 1380

441 I C D L I E A R H T G I I A I L D D E C 460

1381 ctgaggccgggagacgccacggacctgagcttactggagaagctgacgcagaacctggaa 1440

461 L R P G D A T D L S L L E K L T Q N L E 480

1441 ccccacccccactacaagtcacatcgccgctccgacatcaagacacagaagatcatggga 1500

481 P H P H Y K S H R R S D I K T Q K I M G 500

1501 cgtgatgagttctgcctggtgcactacgcgggcgaggtgacgtacaacgtgagcacgttc 1560

501 R D E F C L V H Y A G E V T Y N V S T F 520

1561 ctggagaagaacaacgacctgctgttccgcgacatccagagcctcatggccaccagcggg 1620

521 L E K N N D L L F R D I Q S L M A T S G 540

1621 aacaccatcgtcgccacctgcttcaaggacatcaacctaacgagcaagaagcgaccagag 1680

541 N T I V A T C F K D I N L T S K K R P E 560

1681 acagcgatcactcagttcaagaactcgttgaacgagctgatcaagatcctgagcagcaag 1740

561 T A I T Q F K N S L N E L I K I L S S K 580

1741 gagccttcctacatccgatgcatcaagcctaatgacttcaaggcgcctatgcaatttgac 1800

581 E P S Y I R C I K P N D F K A P M Q F D 600

1801 gacaagctcgtgtctcaccaagtgaagtacctcgggctgatggagaacttgcgcgtgcgc 1860

601 D K L V S H Q V K Y L G L M E N L R V R 620

1861 cgagctgggttcgcgtacaggagaacttacgaggccttccttgagagatacaagtgcctg 1920

621 R A G F A Y R R T Y E A F L E R Y K C L 640

1921 tcccgcgacacatggcccaacttccgcggcgcgccgcgagatggcgcgcagaaactggtc 1980

641 S R D T W P N F R G A P R D G A Q K L V 660

1981 gaagtactcaacttcgagaaggaagactataggatgggcaacacaaaaatcttcatccgt 2040

661 E V L N F E K E D Y R M G N T K I F I R 680

2041 ttcccgaagacgctattcgagacagaaaacgcttaccagatcaagaagaatgacatcgcg 2100

93

681 F P K T L F E T E N A Y Q I K K N D I A 700

2101 accatcatccagagcaggtggcgagggtactggcagaggaagcagtacctcaagatgcga 2160

701 T I I Q S R W R G Y W Q R K Q Y L K M R 720

2161 gaggcggccatcgtcatacagaagtgggtgcgaaggttcctcgcgcaaaggcttctggcc 2220

721 E A A I V I Q K W V R R F L A Q R L L A 740

2221 aggagaaagaaggccgcgatggtcatcagagcttttatcaaaggcttcatcacccgcaac 2280

741 R R K K A A M V I R A F I K G F I T R N 760

2281 ggtccggagactccagagaacctgctgttcctgggtatcgcgaaggtccactggctgaag 2340

761 G P E T P E N L L F L G I A K V H W L K 780

2341 cggctggcgagccaactaccgacgaaggtactggacttatcatggccgacatgtcccgcc 2400

781 R L A S Q L P T K V L D L S W P T C P A 800

2401 acgtgccaggcggcctcccgcgagctgcaccgcctgcaccgcgcccacctcgcgcgcaag 2460

801 T C Q A A S R E L H R L H R A H L A R K 820

2461 taccgcctcgcgctctccccgcaggacaagaagcagttcgagctcaaagtactcgctgag 2520

821 Y R L A L S P Q D K K Q F E L K V L A E 840

2521 aagatgttcaagggcaagaagaacagctaccaagccagcgtcggcgagcggttccaggac 2580

841 K M F K G K K N S Y Q A S V G E R F Q D 860

2581 gaccgcctgacttcggaacaccagacactcaggaataccttcatggcgtcaccttcctgg 2640

861 D R L T S E H Q T L R N T F M A S P S W 880

2641 cctaccggggaacaacttatttactcatgcgaggcagtgaagtacgaccgccgtgggtac 2700

881 P T G E Q L I Y S C E A V K Y D R R G Y 900

2701 aagccccgcgagcgcgccctgctggcctcggacaaggcgctgtacgtactggacgcggcc 2760

901 K P R E R A L L A S D K A L Y V L D A A 920

2761 ggccgcaagacgtacaagctcaagcatcgcctgccgctggacaaactgcgcgtcgtcgtt 2820

921 G R K T Y K L K H R L P L D K L R V V V 940

2821 accaacgagactgacacgctcgtactcatcaagataccgcaggaacttaagaaggataag 2880

941 T N E T D T L V L I K I P Q E L K K D K 960

2881 ggcgacctgatcatctccgtgtcgcacctgatcgaggcgctgaccatcgtcaccgactac 2940

961 G D L I I S V S H L I E A L T I V T D Y 980

2941 accaagaaacccgaacttatcgagatcgtcgacaccaggactatcgcgcacaactttgtg 3000

981 T K K P E L I E I V D T R T I A H N F V 1000

3001 aatggtaagcagggcggcaccatcgaggtacagaacggtccgcaggccaacatacaccgc 3060

1001 N G K Q G G T I E V Q N G P Q A N I H R 1020

3061 gccaagaagggaaacctgctcgttttcgcaactccctga 3099

1021 A K K G N L L V F A T P - 1032

Domínio motor de miosina IQ

Cauda de miosinaN C

Sítio ligante de actina

Figura 18: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da miosina I de S.

frugiperda. Os domínios: motor, IQ (motivo ligante de calmodulina) e da cauda estão

destacados por cores em (A) e correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em

(B). Os sítios ligantes de ATP estão representados em (A) com caixa preta e em (B) com

setas pretas. O códon de terminação está em itálico.

B B

n

94

Tabela 14: Identidades e similaridades da sequência de miosina I de S. frugiperda com

as de outros insetos

Organismo % Identidade % Similaridade Número de acesso

Megachile rotundata 632/1034 (61%) 797/1034 (77%) XP_003701694.1

Harpegnathos saltador 629/1030 (61%) 797/1031 (77%) EFN88334.1

Apis mellifera 630/1034 (61%) 792/1034 (76%) XP_394436.2

Bombus impatiens 629/1034 (61%) 793/1034 (77%) XP_003489473.1

Drosophila grimshawi 637/1034 (62%) 784/1034 (76%) XP_001984060.1

Apis florea 628/1034 (61%) 790/1034 (76%) XP_003698773.1

Embora a miosina I não tenha sido encontrada em nossas varreduras,

achamos interessante avançar um pouco os estudos com ela, para futuramente

cloná-la, sequenciá-la e produzir anticorpos uma vez que sua sequência é

específica de IM (ver a seguir).

4.8.4. Cofilina

A proteína cofilina encontrada na varredura de VM pode estar envolvida no

processo de secreção microapócrina atuando na desorganização dos filamentos de

actina presentes nas microvilosidades das células epiteliais, permitindo assim, a

passagem das vesículas de secreção pelo interior dessas microvilosidades. Na

figura 19 mostramos a sequência completa da cofilina. Esta proteína apresenta 148

aminoácidos e um único domínio denominado fator despolimerizante de actina

(ADF). A tabela 15 apresenta as proteínas com as quais a cofilina de S. frugiperda

apresenta maiores identidades e similaridades após a realização de um BLASTP

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Podemos verificar que ela demonstra-se bem

conservada entre as espécies da ordem Lepidoptera e Diptera.

95

1 atggcgtctggtgtgacagtttcggacgcgtgcaaaacgacgtacgaggagattaagaaa 60

1 M A S G V T V S D A C K T T Y E E I K K 20

61 gacaagaagcaccgctacgtggtgttctacatcagggatgagaaacaaattgacgtagag 120

21 D K K H R Y V V F Y I R D E K Q I D V E 40

121 accgtcggcgaacgtaacgcggaatacgatcagttccttgaggatctgcagaagggtggc 180

41 T V G E R N A E Y D Q F L E D L Q K G G 60

181 accggagagtgcagatatggcctcttcgacttcgagtatacgcaccagtgtcaaggcacg 240

61 T G E C R Y G L F D F E Y T H Q C Q G T 80

241 tcggaagccagtaagaaacagaagctcttcctcatgtcatggtgccccgacaccgctaag 300

81 S E A S K K Q K L F L M S W C P D T A K 100

301 gttaagaagaagatgttgtactccagctctttcgacgcactgaagaagtcgctggtcggc 360

101 V K K K M L Y S S S F D A L K K S L V G 120

361 gttcagaagtacatccaggcgaccgacctctcggaggcctcgcaggaggctgttgaagag 420

121 V Q K Y I Q A T D L S E A S Q E A V E E 140

421 aagctgcgcgccaccgaccgccaataa 447

141 K L R A T D R Q - 148

Figura 19: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da cofilina de S.

frugiperda. O domínio ADF (fator despolimerizante de actina) está destacado por cor em (A)

e corresponde ao diagrama do domínio da sequência (B). O códon de terminação está em

itálico.

Tabela 15: Identidades e similaridades da sequência de cofilina de S. frugiperda com as de

outros insetos

Organismo % Identidade % Similaridade Número de acesso

(GenBank)

Bombyx mori 147/148 (99%) 148/148 (100%) ABF51212.1

Biston betularia 146/148 (98%) 147/148 (99%) AD033068.1

Drosophila willistoni 138/147 (94%) 143/147 (97%) EDW72067.1

Drosophila melanogaster 138/148 (93%) 143/148 (96%) NP_477034.1

Anopheles gambiae 137/148 (92%) 143/148 (96%) EAL38771.2

4.8.5. Gelsolina-1

Gelsolina é uma proteína reguladora da dinâmica dos filamentos de actina

Possui 6 domínios homólogos (Figura 5), cada um contendo um sítio conservado

B B

n

A

B

96

ligante de cálcio. Devido a sua função de cortes de F-actina, acreditamos que esta

proteína possa estar envolvida no processo de secreção microapócrina, uma vez

que deve ser necessária a desorganização destes filamentos para permitir a

passagem das vesículas de secreção pelo interior da microvilosidade.

A proteína gelsolina-1 foi encontrada com anticorpos contra preparação de

membrana microvilar (Ferreira et al., 2007) e também com anticorpos contra fração

P1 do fracionamento celular. Após seu sequenciamento completo usando

iniciadores específicos obtivemos uma sequência que provavelmente codifica uma

proteína de 748 aminoácidos e todos os domínios conservados e sítios ligantes de

actina, como podemos ver na figura 20. A tabela 16 apresenta as proteínas com as

quais a gelsolina de S. frugiperda apresenta maiores identidades e similaridades

após a realização de um BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Observamos que a gelsolina mostrou-se muito pouco conservada entre os insetos,

com apenas 40% de identidade com a gelsolina de Aedes aegypti.

1 atggcgacacacgaggcgttcgctgaggccggtgctaatccgggaatcgaaatctggacc 60

1 M A T H E A F A E A G A N P G I E I W T 20

61 atagagcaatttgaaccagtcgctataccatcaaaatcctatggaaaattttacaatgga 120

21 I E Q F E P V A I P S K S Y G K F Y N G 40

121 gattcgtacatcgtattaaagacatcaggccaatccaacgctacattgagctatgacgcc 180

41 D S Y I V L K T S G Q S N A T L S Y D A 60

181 catttttggctcggcagcaaaactacccaggacaagaagggatccgcggctatctggaca 240

61 H F W L G S K T T Q D K K G S A A I W T 80

241 gtcaccctggatgatatgttgggcggcaaggcagttcatcatagggaggtccagggccat 300

81 V T L D D M L G G K A V H H R E V Q G H 100

301 gagtccagcaggttcctcgggtatttcaaacctgctatcagatacatggaaggcggtaac 360

101 E S S R F L G Y F K P A I R Y M E G G N 120

361 gagtcaggttttactgaggtagagactaacgcgggagctgagaagagactcctgaaactt 420

121 E S G F T E V E T N A G A E K R L L K L 140

421 tcaggatgtgagaacatgaggattgaggaggtaccagccgaatcctcatccctgacgaaa 480

141 S G C E N M R I E E V P A E S S S L T K 160

481 gaccactgcttcattctggaggtagaccatgacatcttcgtgctgatgcccgagggtgcc 540

161 D H C F I L E V D H D I F V L M P E G A 180

541 aaggctactcaacgaaggaagatcatcagcgtggccaatcagctaagagatgacaatcat 600

181 K A T Q R R K I I S V A N Q L R D D N H 200

601 aatggaagagctaccattgaaattattgatgagttctcttctgatgaagactatgaccaa 660

201 N G R A T I E I I D E F S S D E D Y D Q 220

661 ttcttccaagcccttggatcaggatccaaagatgaaattgcaagcgacgattctggcaca 720

221 F F Q A L G S G S K D E I A S D D S G T 240

721 acttactaccgtgatgatatttctgctgtctatctgtaccgagtgatgctgggtgatggt 780

241 T Y Y R D D I S A V Y L Y R V M L G D G 260

781 tttgatgtggtggccctgaataaaccatacaagcagagccatttgacttctgatgaagtc 840

261 F D V V A L N K P Y K Q S H L T S D E V 280

841 ttcatcctggacactccctgctcaggagtgtacatctggatcggttccgaagtcagcgcc 900

281 F I L D T P C S G V Y I W I G S E V S A 300

901 gatgtcaggaaggcataccacgatattgcgaaccagtacttcgaagctaaaaactatcct 960

301 D V R K A Y H D I A N Q Y F E A K N Y P 320

A B

n

97

961 tcttgggtgaacgtgacgaaggtggctgaaggctccgaatgctcgaccttcaagcaatac 1020

321 S W V N V T K V A E G S E C S T F K Q Y 340

1021 ttcgtcagctggaacactgtcatcaccaggagcatgggagccgtctctgatgatgctgga 1080

341 F V S W N T V I T R S M G A V S D D A G 360

1081 tacgactctgatgatgctgagcagaaccagaaggtggctcagtacatcggtaagagtgcg 1140

361 Y D S D D A E Q N Q K V A Q Y I G K S A 380

1141 gctgcgagggagtacatgcctgataacggagagggatctcttactgtcaccagggttggt 1200

381 A A R E Y M P D N G E G S L T V T R V G 400

1201 gacggcgctgacgtgactgaagacttcacctcgggctgcggcatgctgtaccagagcgag 1260

401 D G A D V T E D F T S G C G M L Y Q S E 420

1261 gtctatgtggtgaaataccagtacaccgaggaggatggagaggataattacattgtttat 1320

421 V Y V V K Y Q Y T E E D G E D N Y I V Y 440

1321 tactggattggttccaaagcatcagctgaggacaagcaggcgggtgctgagctggtggct 1380

441 Y W I G S K A S A E D K Q A G A E L V A 460

1381 cagctggaagacgagctcggagacgatgctgcagtcgtgaaggtgccccaaggaaaagag 1440

461 Q L E D E L G D D A A V V K V P Q G K E 480

1441 cccagacatttcctcattatcttcaaaggcaacctggccatcgtatttggaggcaaggac 1500

481 P R H F L I I F K G N L A I V F G G K D 500

1501 accgactacaagcccaccaacgccgaaggaaactatgatgaaaacagtactcgtctgttt 1560

501 T D Y K P T N A E G N Y D E N S T R L F 520

1561 agggtggaaggtacagatttgagcgacatgcgagccgttcaggtcggagagacggctgat 1620

521 R V E G T D L S D M R A V Q V G E T A D 540

1621 aacttggaagacgatgatgtctacgtgttggagttagctgacattgtctatgtgtggatt 1680

541 N L E D D D V Y V L E L A D I V Y V W I 560

1681 ggaaacgaatcgaatgagaaagagaaggcggcggtgaagaccttcgtcacgatgctggta 1740

561 G N E S N E K E K A A V K T F V T M L V 580

1741 ggagaggagaaggagatcagcaccgtggagcaaggcagtgaaccgccagagttctgggac 1800

581 G E E K E I S T V E Q G S E P P E F W D 600

1801 gctttgggcggcgaaccagaagagaaaagtggttctggctggaggaacgcggtcaaccgc 1860

601 A L G G E P E E K S G S G W R N A V N R 620

1861 agagtgacagcccctcgcaccctcacagctgtgaacgtcagcatcaccaagaagattacc 1920

621 R V T A P R T L T A V N V S I T K K I T 640

1921 ttcgaagatctcgacacggagttcacgcaacaggatctgtctgatgatggagtgtacatc 1980

641 F E D L D T E F T Q Q D L S D D G V Y I 660

1981 ctggacactggtgaggagctctacttgtggcaaggaaagaaaattcctgagcgagtcaag 2040

661 L D T G E E L Y L W Q G K K I P E R V K 680

2041 atggccaggagcgatatcatcaaggagtacatagaagacgatggcttggaccgtacagtg 2100

681 M A R S D I I K E Y I E D D G L D R T V 700

2101 gacaacgccctggtggtcttcgtgaagcagggagagggaccgggagccttccggaaactc 2160

701 D N A L V V F V K Q G E G P G A F R K L 720

2161 ttccccgaatgggacaccgctatgtgggataaccaaacatcttatgaagacatcaagaat 2220

721 F P E W D T A M W D N Q T S Y E D I K N 740

2221 gaaacgaaagcagccaattctaagtaa 2247

741 E T K A A N S K - 748

G1 G2 G3 G4 G5 G6N C

Figura 20: Sequência de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos da gelsolina-1 de S.

frugiperda. Os domínios: gelsolina (G1 a G6) estão destacados por cores em (A) e

correspondem ao diagrama dos domínios da sequência em (B). O códon de terminação

está em itálico.

B B

n

98

Tabela 16: Identidades e similaridades da sequência de gelsolina de S. frugiperda com as

de outros insetos

Organismo % Identidade % Similaridade Número de acesso

(GenBank)

Aedes aegypti 300/749 (40%) 429/749 (57%) EAT 42351.1

Culex quinquefasciatus 296/751 (39%) 434/751 (57%) EDS 42860.1

Drosophila willistoni 300/766 (39%) 423/766 (55%) EDW 83060.1

Drosophila ananassae 295/770 (38%) 424/770 (55%) EDV 42840.1

Anopheles gambiae 281/751 (37%) 415/751 (55%) EAL 39527.3

A gelsolina 1 mostrou-se específica de intestino (ver a seguir) e por isso

estudos com ela foram aprofundados.

4.9. RT-PCR semi-quantitativa das proteínas que poderiam estar envolvidas na

secreção microapócrina

Para determinar a expressão e localização dos transcritos correspondentes a

todas as sequências de proteínas que teoricamente poderiam estar envolvidas na

secreção microapócrina, iniciadores foram desenhados (Tabela 2) e análises por

RT-PCR semi-quantitativa em diferentes tecidos de S. frugiperda, foram realizadas.

Os resultados mostraram que os mRNAs codificantes da maioria das proteínas são

expressos em todos os tecidos analisados (ventrículo total, ventrículo dividido em

anterior, médio e posterior, túbulos de Malpighi, corpo gorduroso e carcaça) (Figura

21). Apenas a gelsolina-1 e miosina I foram transcritas somente no tecido intestinal,

enquanto que miosina VI foi encontrada no tecido intestinal e em túbulos de

Mapighi. Gelsolina-2 foi a única cujos transcritos não foram encontrados no tecido

intestinal.

99

Fimbrina

Gelsolina 1

Moesina

Miosina I

Miosina VI

Profilina

PDI 1

PDI 2

β-actina

Cofilina

Anexina

ARP 2/3

IM EVA EVM EVP TM CG C

Gelsolina 2

Figura 21: Padrão de expressão dos mRNAs codificantes de proteínas possivelmente

envolvidas com a maquinaria da secreção em diferentes tecidos de lagartas de S.

frugiperda são mostrados por RT-PCR semi-quantitativa. Quantidades iguais (5ug) de RNA

dos diferentes tecidos extraídos, tratados com DNase e utilizados como molde para a

reação da RT. O produto dessa reação foi usado para amplificação em termociclador,

utilizando oligonucleotídeos específicos para cada sequência de cDNA e para a β-actina

(controle endógeno). O produto da amplificação foi analisado em gel de agarose 2% em

TAE. As bandas amplificadas aparecem quando o mRNA da proteína correspondente é

transcrito. O número de ciclos de amplificação foi escolhido após diversas tentativas, para

assegurar que a amplificação estivesse na fase log e resultando em uma banda amplificada

clara e visível em gel. IM, intestino médio inteiro; EVA, epitélio do ventrículo anterior; EVM,

epitélio do ventrículo médio; EVP, epitélio do ventrículo posterior; TM, túbulos de Malpighi;

CG, corpo gorduroso; C, carcaça.

4.10. Gelsolina-1: Expressão heteróloga, produção de anticorpos e supressão

da expressão com RNA interferente

100

Como os RNAs codificantes da gelsolina1 foram encontrados somente no IM,

essa proteína foi escolhida para ser estudada com mais detalhes.

4.10.1. Produção de gelsolina recombinante

A sequência de cDNA codificante dos domínios G1 a G3 (G1-G3) de

gelsolina-1 (ver figura 20) foi amplificada através de uma reação de polimerização

em cadeia (PCR), usando como molde o plasmídeo pGEM-T (contendo o cDNA

codificante para gelsolina), juntamente com os iniciadores GelsG1_FW e

GelsG3_RV (ver item 3.9.1), contendo os respectivos sítios de restrição para a

endonuclease de restrição. O produto de PCR foi digerido com as enzimas XhoI e

EcoRI e posteriormente clonado no vetor pAE (Ramos et al., 2004) previamente

digeridos com as mesmas enzimas, resultando no plasmídeo pAE/gels (Figura 22).

A gelsolina recombinante tem em seu N-terminal um peptídeo de fusão que contém

6 resíduos de histidina, para facilitar sua purificação por cromatografia de afinidade

em coluna de níquel.

pb

BA

1 2

Figura 22: Análise da construção pAE-gelsolina. (A) Esquema da construção pAE/gelsolina

que consiste do plasmídeo pAE com o cDNA que codifica a gelsolina (domínios G1-G3)

inserida. (B) Eletroforese em gel de agarose 1% da digestão da construção pAE/gelsolina

com enzimas de restrição EcoRI e XhoI. (1) Padrão de DNA e (2) produto da digestão. A

seta aponta para o fragmento de aproximadamente 1010 pb correspondente ao inserto

liberado da construção após a digestão.

101

A construção pAE/gels foi utilizada para transformar bactérias XL1-blue

competentes, seguida da seleção com 50 µg/mL de carbenicilina. A partir de

colônias resultantes de cada transformação foi feita a minipreparação de

plasmídeos, que foram submetidos a um sequenciamento, utilizando os iniciadores

T7 e T7 terminador, específicos para o vetor pAE, e iniciadores internos, específicos

dessas sequências. Esse experimento revelou que a sequência de DNA que

codifica a gelsolina estava intacta e que a amplificação por PCR não introduziu

nenhuma alteração em suas sequências de bases (dados não mostrados). Além

disso, pelo sequenciamento foi possível visualizar que as sequências de DNA

estavam em fase de leitura na porção N-terminal com a sequência do vetor pAE que

codifica os seis resíduos de histidina.

A construção pAE/gels (Figura 22 A) foi então utilizada na transformação por

choque térmico da bactéria de expressão E. coli BL21(DE3) utilizada para obtenção

da proteína recombinante. As cepas BL21 (DE3) vêm sendo utilizadas por vários

grupos na obtenção de gelsolina de diversos organismos (Chhabra et al., 2005;

Solomon et al., 2009).

O nível de expressão da gelsolina foi avaliado após indução com IPTG 1 mM

a 20ºC, 25ºC e 37ºC por cerca de 20 horas (Figura 23). Como controle negativo das

induções foi utilizado bactéria BL21(DE3) transformada com o vetor pAE sem

inserto (Figura 23). Verifica-se que ocorreu a indução na célula testada a 20°C do

polipeptídio de aproximadamente 37kDa calculado de acordo com Shapiro et al.

(1967), que é correspondente à massa molecular estimada para gelsolina (Figura

23).

102

kDaP

Figura 23: Análise do perfil de indução de células de E. coli BL21(DE3) transformadas com

o vetor pAE/gelsolina com IPTG 1 mM a 37ºC, 25ºC e 20ºC por 20 h. Separação

eletroforética foi realizada em gel de poliacrilamida 12% na presença de SDS e o gel foi

corado com Coomassie Blue R. Nas raias localizadas a esquerda estão marcadores de

massa molecular conhecidos. A seta indica o polipeptídeo de aproximadamente 37 kDa

correspondente aos domínios gelsolina (G1-G3) recombinante que é induzida. (NI) não

induzido. (I) induzido. (pAE) vetor sem inserto. (Gel) pAE/gelsolina. (P) padrão de massa

molecular.

Em seguida, a solubilidade do extrato bacteriano foi analisada. Para isso, as

células bacterianas expressando gelsolina, recolhidas por centrifugação após

indução a 20ºC, 25ºC e 37ºC, foram lisadas por sonicação e submetidas à

centrifugação. Os sobrenadantes foram recuperados e os precipitados suspensos

no mesmo tampão de lise. Na figura 24 temos a distribuição da gelsolina entre o

sobrenadante (proteína solúvel) e o precipitado (proteína como corpo de inclusão)

nas diferentes temperaturas. Verifica-se que a 20°C, a proteína recombinante

gelsolina encontra-se expressivamente presente na forma de proteína solúvel para a

linhagem testada.

103

kDaP

Figura 24: Solubilidade da gelsolina recombinante de S. frugiperda a 37ºC, 25ºC e 20ºC. O

sobrenadante (S) e o sedimento (Sd) proveniente do extrato bruto centrifugado de células

BL21(DE3) lisadas foram aplicados em gel de poliacrilamida 12%. O gel foi corado com

Coomassie Blue R. A seta indica o polipeptídeo de aproximadamente 37kDa na fração

solúvel do lisado bacteriano. (P) padrão de massa molecular.

Para purificarmos a fração solúvel contendo a proteína recombinante

gelsolina de lisados bacterianos de E. coli BL21(DE3), obtida de culturas induzidas a

20ºC por 20 horas foram realizadas duas cromatografias. Inicialmente, a fração

solúvel foi submetida à cromatografia de afinidade em resina de Ni+2-agarose na

seguinte condição: Tris-HCl 10 mM pH 7, NaCl 100 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1

mM, glicerol 10% (v/v). Foram feitas 5 lavagens e a eluição do material adsorvido à

resina foi realizada com concentrações crescentes de imidazol. A proteína começou

a ser eluída com 75 mM de imidazol e continuou a ser eluída em todas as

concentrações de imidazol testadas.

Em seguida, o material eluído, que não se encontrava puro, foi reunido,

dialisado em tampão Tris-HCl 10 mM pH 7 e submetido a uma segunda

cromatografia de afinidade, utilizando novamente a resina de níquel em uma

segunda condição [Tris-HCl 10 mM pH 7, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PMSF 1

mM, glicerol 10% (v/v) e β-mercaptoetanol 5 mM]. O aumento da concentração de

cloreto de sódio e a adição de β-mercaptoetanol em baixa concentração foram

104

realizados com o objetivo de diminuir interações de proteínas inespecíficas com a

resina de níquel (Ni-NTA Agarose Qiagen). Esse procedimento experimental foi

similar ao realizado previamente, sendo também feitas cinco lavagens (Figura 25,

raias L1 a L5) e as eluições realizadas em tampão contendo de 25 a 300 mM de

imidazol (Figura 25; raias E25mM a E300mM).

De fato, como analisado por SDS-PAGE 12%, corado com Comassie Blue, a

segunda cromatografia de afinidade favoreceu a especificidade de interação da

proteína recombinante com a resina e a remoção de proteínas intrínsecas da

bactéria, que não continham a cauda de histidina. Consequentemente, como pode

ser visualizado na figura 25 (raias E300mM) o material eluído contendo a gelsolina

apresenta pouca contaminação.

kDa

P

Figura 25: Análise por SDS-PAGE 12% das frações obtidas após a segunda cromatografia

de afinidade para purificação da gelsolina expressa em E. coli BL21(DE3). A raia FT (flow

through) representa a fração do material incubado por 70 minutos a 4ºC com a resina, mas

não adsorvido a ela. As raias L1-L5 representam as cinco lavagens da resina realizadas

com o tampão contendo 20 mM de imidazol. As eluições foram feitas com 25, 50, 75, 100,

150 e 300 mM de imidazol e são representadas pelas raias E25mM, E50mM, E75mM, E100mM,

E150mM e E300mM respectivamente. O gel foi corado com Coomassie Blue R. A seta indica o

polipeptídeo de aproximadamente 37kDa correspondente à gelsolina (G1-G3) recombinante

praticamente purificado na raia E300mM. (P) padrão de massa molecular.

105

4.10.2. Produção do anticorpo anti-gelsolina e imunocitolocalização no epitélio

intestinal de S. frugiperda

Após a purificação da proteína gelsolina recombinante (correspondente aos

domínios G1-G3), iniciou-se o processo de imunização em coelho para a produção

de anticorpos anti-gelsolina. Foram realizadas três imunizações de 300 µg cada.

Para testar o reconhecimento do anticorpo, a proteína gelsolina recombinante e um

homogeneizado do epitélio ventricular de S. frugiperda foram submetidos a uma

eletroforese em gel 12% de poliacrilamida, em seguida transferidos para uma

membrana de nitrocelulose e incubados com o anticorpo anti-gelsolina nas diluições

1:50, 1:100, 1:200, 1:500 e 1:1000. Como controle, incubação com o soro pré-imune

do coelho foi realizada.

Na figura 26, o western blot após SDS-PAGE revelado pelo método

Imobbilon Western Chemiluminescent HRP substrate (Millipore) mostrou que o

anticorpo anti-gelsolina reconhece o peptídeo recombinante correspondente aos

domínios G1 a G3 da gelsolina-1, cuja massa molecular é de 37 kDa. No EV, o

anticorpo reconheceu uma banda apenas, de 83 kDa, que corresponde a massa

molecular predita para a gelsolina-1. O soro pré-imune na diluição 1:100 não

reconheceu a proteína gelsolina, atestando que antes da imunização do coelho

nenhum anticorpo do coelho reconhecia a proteína recombinante gelsolina.

83 kDa

37 kDa

Figura 26: Western blot após SDS-PAGE (12%) da proteína recombinante do epitélio do

ventrículo com o anticorpo anti-gelsolina. A detecção padrão foi realizada com anti-IgG

(coelho) acoplado com a peroxidase e revelado com o kit Imobbilon Western

Chemiluminescent HRP substrate (Millipore).

106

Uma vez atestada a especificidade do anticorpo, ele foi usado na

imunocitolocalização em microscopia eletrônica de transmissão no ventrículo de

lagartas de S. frugiperda. As marcações são evidenciadas por partículas de ouro

coloidal ligadas ao anticorpo secundário de coelho, que reconhece o anticorpo anti-

gelsolina.

A marcação foi muito pouca para podermos tirar conclusões sobre a

localização da proteína. Isso pode ter ocorrido pelo fato da gelsolina distribuir-se de

forma dispersa na célula, não ficando concentrada em nenhuma região, ou porque

os epítopos foram destruídos pelo processo de fixação utilizado na microscopia

eletrônica. Os cortes deverão ser feitos agora após fixação por congelamento na

tentativa de preservar melhor o material.

4.10.3. Diminuição da expressão de gelsolina utilizando RNA interferente

Para investigarmos um possível envolvimento da proteína gelsolina no

processo de secreção microapócrina, tentamos suprimir a expressão dessa proteína

e posteriormente analisar as possíveis alterações na morfologia das

microvilosidades intestinais de S. frugiperda. Havia uma suspeita que sua supressão

poderia diminuir a despolimerização da actina no interior das microvilosidades,

dificultando a passagem das VM.

Para isso, RNA interferente foi preparado e o dsRNA específico para mRNA

de gelsolina foi injetado na hemolinfa das lagartas em estágios iniciais de

desenvolvimento que estavam se alimentando ativamente. Para confirmar a

especificidade do silenciamento da gelsolina, foram feitos dois grupos controles: um

injetado com dsRNA-GFP (green fluorescent protein) e outro grupo injetado com

água livre de nucleases. A análise da eficiência da supressão do gene da gelsolina

foi feita através de RT-PCR semi-quantitativa usando como molde o RNA extraído

do IM dos insetos 3 dias após a injeção de dsRNA-gelsolina, que causou diminuição

da expressão do gene da gelsolina (Figura 27).

107

Figura 27: RT-PCR semi-quantitativa para confirmação da diminuição do número de

transcritos do gene da gelsolina de S. frugiperda. A análise foi realizada 3 dias após a

injeção de água livre de nucleases (C), dsRNA-GFP (GFP) e dsRNA-gelsolina (Gels).

Quantidades iguais (5ug) de RNA dos insetos submetidos às diferentes injeções foram

extraídos, tratados com DNase e utilizados como molde para a reação da RT. O produto

dessa reação foi usado para amplificação em termociclador, utilizando oligonucleotídeos

específicos para a sequência de gelsolina e para a β-actina (controle endógeno). O produto

da amplificação foi analisado em gel de agarose 2% em TAE. As bandas amplificadas

aparecem quando o mRNA da proteína correspondente é transcrito. O número de ciclos de

amplificação foi escolhido após diversas tentativas, para assegurar que a amplificação

estivesse na fase log e resultando em uma banda amplificada clara e visível em gel.

O crescimento foi monitorado determinando-se o peso das lagartas e o

desenvolvimento verificando-se o período em que ocorria a muda e a mortalidade. A

figura 28 mostra o peso médio de lagartas controle e experimentais, onde podemos

verificar que não houve alteração nesse parâmetro. A mortalidade e tempo para

muda também não foram alterados.

Figura 28: Peso médio das lagartas de S. frugiperda após injeções com água livre de

nucleases e dsRNA-gelsolina. Dados obtidos a partir de 30 lagartas em cada grupo.

108

No que se refere a morfologia das células, em todas as réplicas biológicas

observou-se alterações nos animais experimentais, mas essas alterações variaram

entre os lotes de animais.

As alterações encontradas apareceram somente nos animais onde foi feita a

injeção de RNA dupla fita referente a gelsolina e nunca nos controles. Também foi

sempre observado em vários animais, em vários cortes e em vários campos de cada

corte. As diferenças observadas nas alterações referem-se a preparações

realizadas em dias diferentes.

Algumas dessas alterações são estruturas que parecem corresponder a

vesículas achadas dentro das microvilosidades. Essas vesículas sempre são

observadas próximas a base das microvilosidades, não aparecendo em regiões

mais apicais, indicando que as vesículas não estavam migrando ao longo da

microvilosidade (Figura 29).

Na figura 30 podemos observar que em microvilosidades controle, as bases

das microvilosidades apresentam um diâmetro em torno de 0,07-0,13 µm (Figura 30

A e B), enquanto que nas microvilosidades de animais injetados com dsRNA-

gelsolina algumas bases mostraram-se mais alargadas, chegando a apresentar

diâmetro de 0,28 µm (Figura 30 C). Em alguns casos observa-se esse alargamento

até a altura em que se apresenta uma vesícula (Figura 30 D).

109

Figura 29: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3 dias

após a injeção de água livre de nucleases (A) ou dsRNA-gelsolina (B). As setas apontam:

(A) a presença de vesículas normais nas microvilosidades (Mv) de células de larvas

injetadas com água livre de nucleases e em (B) estruturas achatadas no interior das

microvilosidades de células de larvas injetadas com dsRNA-gelsolina

110

Figura 30: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas S. frugiperda 3 dias

após a injeção de água livre de nucleases (A e B) ou dsRNA-gelsolina (C e D). As setas

apontam (A e B) microvilosidades com bases normais de células de larvas injetadas com

água livre de nucleases, (C) microvilosidades com bases alargadas e (D) alargamento até a

altura em que se apresenta uma vesícula de células de larvas injetadas com dsRNA-

gelsolina. Microvilosidade (Mv).

Outra alteração encontrada foi a presença de grandes massas globosas entre

as microvilosidades, que somente apareceram nos animais experimentais (Figura

31). Essas massas apresentam diâmetro médio de 0,3 µm e nada têm a ver com as

vesículas de secreção, pois elas não são marcadas com anticorpos anti-amilase.

111

Figura 31: Células colunares da região anterior do ventrículo de larvas de S. frugiperda 3

dias após a injeção de RNA interferente. As setas apontam a presença de grandes massas

globosas no interior e entre microvilosidades (Mv).

É possível que essas diferenças encontradas nas microscopias eletrônicas

reflitam pequenas diferenças entre o horário da injeção e da dissecção dos animais.

Alternativamente essas diferenças podem ser devido a níveis diferentes de

supressão da gelsolina ou ao fato de outras proteínas estarem assumindo o papel

da gelsolina conforme já foi observado em outros casos. Witke et al. (2001)

inativaram genes de gelsolina e CapG e verificaram que ratos CapG-nulo e

CapG/gelsolina duplo nulo eram normais e não apresentavam anormalidades

funcionais graves. Em outro experimento Pinson et al. (1998) interromperam através

de recombinação homóloga o gene de vilina, proteína pertencente à família

gelsolina e verificaram que as microvilosidade de células estudadas estavam

intactas, sugerindo que outra proteína ou proteínas pode compensar eficientemente

a perda de vilina.

112

Qualquer que seja a razão, infelizmente não pudemos chegar a uma

conclusão sobre os efeitos da supressão da expressão da gelsolina devido a

irreprodutibilidade dos resultados, embora acreditemos que essas alterações

realmente são derivadas da ausência da proteína e não a outro artefato.

113

5. DISCUSSÃO

5.1. Proteínas presentes em diferentes compartimentos celulares

Há dois grandes métodos para determinar a identidade das proteínas

expressas em um determinado tecido: transcriptoma e proteoma. No caso de um

compartimento celular específico, tal como membranas microvilares ou vesículas de

secreção os transcriptomas não podem ser usados, porque não é possível isolar um

grupo de mRNAs (e então preparar uma biblioteca de cDNA) que expressem

somente proteínas de um determinado local. O sequenciamento de grandes

quantidades de cDNA presentes em uma biblioteca não é uma alternativa, pois não

há como reconhecer entre as sequências, aquelas relacionadas com o

compartimento em questão.

O enfoque proteômico é assim o método mais adequado. Ele se baseia na

resolução das proteínas presentes em um determinado compartimento, seguido

pela espectrometria de massa para sua identificação.

Um novo enfoque descrito para identificar proteínas associadas a uma

determinada fração celular consiste em gerar anticorpos que são usados para varrer

uma biblioteca de expressão de cDNA, seguindo-se o sequenciamento de clones

positivos e busca por sequências semelhantes em bancos de dados. Esse método

tem algumas vantagens sobre a proteômica tais como: a) permitir a identificação

das proteínas por pesquisa de similaridade em banco de dados mesmo que a

sequência específica daquele organismo (ou de organismo semelhante) não esteja

depositada; b) os clones muitas vezes permitem a obtenção da sequência completa

do gene, que pode ser usado em estudos funcionais sobre o papel das proteínas

cujas sequências não tem similaridade com outras proteínas já conhecidas ou sua

função seja desconhecida.

O enfoque proteômico é limitado pelos problemas de solubilidade de

proteínas, pelo fato de proteínas detectadas em géis não terem massa suficiente

para gerar um espectro de massa que possa ser usado e por problemas de

detecção da proteína quando o organismo em questão não tem sequências

abundantes em banco de dados, como muitas vezes ocorre em insetos

(Kishnamoorthy et al., 2007). A varredura por anticorpos também tem fontes de

erros possíveis tais como a não detecção de algumas proteínas pelos anticorpos,

114

porque os antígenos estão em baixa concentração ou porque eles não são

suficientemente imunogênicos; a detecção de contaminantes que são muito

imunogênicos; a detecção de proteínas presentes em outros compartimentos que

não o de interesse porque suas proteínas compartilham epítopos, além de falha na

expressão do cDNA inserido no fago.

Embora os dois métodos tenham limitações, muitas proteínas microvilares

intestinais de insetos tem sido descritas usando ambos métodos (Candas et al.,

2003; McNall e Adang, 2003; Krishnamoothy et al., 2007; Ferreira et al., 2007;

Bayyareddy et al., 2009; Popova-Butler e Dean, 2009; Pauchet et al., 2009a).

Para a detecção de proteínas contidas nas vesículas presentes no fluido

ectoperitrófico nós optamos pela utilização da varredura com anticorpos que já havia

sido usada anteriormente em nosso laboratório para a detecção de proteínas

presentes nas microvilosidades do mesmo S. frugiperda (Ferreira et al., 2007).

5.2. Proteínas presentes nas microvilosidades de S. frugiperda

Um total de 66 proteínas preditas foram detectadas nas membranas

microvilares intestinais purificadas após varredura de biblioteca de cDNA com

anticorpos. Dessas, 18 foram consideradas contaminantes por serem típicas de

mitocôndrias (tais como acil-CoA desidrogenase, succnil-CoA sintetase e ADP/ATP

translocase) ou de outras partes celulares que não as microvilosidades (tais como

proteína ribossomal acídica 60S ou a glutamato desidrogenase) ou porque eram

proteínas desconhecidas (Tabela 5).

Após a retirada desses contaminantes, ainda restam 48 proteínas que

conseguimos associar às microvilosidades, praticamente dobrando o número

dessas proteínas identificadas nesse mesmo organismo por Ferreira e

colaboradores (2007) e em outro inseto por outros autores (Candas et al., 2003;

McNall e Adang, 2005; Krishnamoothy et al., 2007; Bayyareddy et al., 2009;

Popova-Butler e Dean, 2009; Pauchet et al., 2009a).

As funções dessas 48 proteínas microvilares de S. frugiperda (Tabela 6)

podem ser classificadas em 8 grupos: (1) enzimas digestivas (amilase,

aminoacilase, aminopeptidase, astacina, carboxipeptidase, quimotripsina, glicosil-

hidrolase, serina proteinase e tripsina); (2) proteínas de MP (peritrofina, quitina,

mucina, Lsti99); (3) proteção (aldeído desidrogenase, ferritina, epóxido hidrolase do

115

HJ, serpina e tiorredoxina peroxidase); (4) receptor (receptor de neuropeptídeo); (5)

transportador (bombas de próton e carreadores de soluto); (6) maquinaria secretória

(anexina IX, calmodulina, gelsolina, actina 3, fimbrina e miosina VIIa); (8) função

desconhecida (epsilon, proteína ligante Pk 506 e PDI).

As proteínas preditas que tiveram suas sequências de aminoácidos

completadas puderam ser analisadas por ferramentas de bioinformática, procurando

por características associadas com classe (1) inserção na membrana plasmática

(peptídeo sinal mais alça transmembrana ou âncora de GPI); classe (2) secreção

(possuindo apenas peptídeo sinal) ou classe (3) localização citoplasmática

(proteínas sem as características mencionadas).

As proteínas preditas que possuem sinal de inserção na membrana são todas

as aminopeptidases, uma carboxipeptidase (contig 418), um transportador (contig

467) e um receptor desconhecido (contig 434). As proteínas que tem peptídeo sinal,

mas não têm nada que as retenha na membrana são amilase, astacina, algumas

carboxipeptidases, ferritina, proteína Lsti99, serina proteinases, tiorredoxina

peroxidase e tripsina. As proteínas apresentadas que não possuem peptídeo sinal

nem elementos para inserção na membrana e que, portanto, deveriam ser

citoplasmáticas são a aldeído desidrogenase e bombas de prótons.

As verdadeiras proteínas microvilares são esperadas pertencerem a primeira

classe de proteínas, ou seja, aquelas que possuem peptídeo sinal e são inseridas

na membrana. Aquelas que possuem peptídeo sinal, mas não se inserem na

membrana podem ser proteínas secretadas por secreção microapócrina

encontradas contaminando as preparações de membranas microvilares. Finalmente

aquelas sem peptídeo sinal devem ser proteínas citoplasmáticas carregadas pelas

VM em brotamento e que de alguma forma também contaminaram essas

preparações.

As aminopeptidases são enzimas tipicamente microvilares do intestino de S.

frugiperda. Elas são classificadas em 5 das classes conhecidas de aminopeptidases

de Lepidoptera (Angelucci et al., 2008). Entre as aminopeptidases de S. frugiperda,

a mais expressa é o contig 546 para o qual encontramos 370 reads no

pirosequenciamento.

De acordo com essas conclusões está o fato de encontrarmos muitas

proteínas da classe 2 (com peptídeo sinal, mas sem elementos de inserção na

membrana) na varredura com anticorpos anti-VM (Tabela 7). As exceções podem

116

ter ocorrido por uma falha na detecção pelos anticorpos das proteínas presentes

nas VM ou por uma falha na identificação do elemento estrutural da proteína que

seria responsável por sua inserção na membrana. A discussão abaixo sobre tripsina

e amilase pode revelar como esses resultados podem ser complicados. Eguchi et al.

(1982) e Kuriyama e Eguchi (1985) foram os primeiros a reportarem que uma

tripsina integrante de membrana no lepidóptero Bombyx mori é de alguma forma

transportada do tecido para o lúmen, onde é solubilizada e parcialmente incorporada

na MP. Em outros estudos, Santos e Terra (1986) e Santos et al. (1984), baseados

em métodos bioquímicos e citológicos, sugeriram que uma amilase solúvel e uma

tripsina solúvel provém de precursores ligados à membrana e são secretadas por

um processo microapócrino e depois são associadas em parte com a MP.

Estudos bioquímicos realizados com lagartas de S. frugiperda fornecem

evidências adicionais que membranas de VM, carregando tripsina e amilase,

ocorrem no conteúdo ectoperitrófico de lepidópteros e que elas são parcialmente

incorporadas na MP (Ferreira et al., 1994). Essa incorporação é significativa uma

vez que membranas peritróficas lavadas podem conter até 13% e 18% da atividade

luminal intestinal de amilase e tripsina, respectivamente (Ferreira et al., 1994).

Tripsina ligada à membrana de S. frugiperda é solubilizada por papaína e

detergentes não sendo afetada por fosfolipase C que quebra âncoras de GPI. Além

disso, em um experimento de partição com Triton X-114, ela distribui-se dentro da

fase rica em detergente. Isso sugere que tripsina é ligada à membrana celular por

um peptídeo hidrofóbico (Jordão et al., 1999). Uma única proteína foi predita por nós

como sendo uma tripsina (contig 378), a qual é altamente expressa (5609 reads) e

indiscutivelmente deve corresponder à atividade de tripsina ensaiada no conteúdo

do lúmen intestinal. Esta sequência, entretanto, não tem alça transmembrana (ou

âncora de GPI) inferida por ferramentas de bioinformática.

Assim, talvez a melhor hipótese seja que a tripsina permanece ancorada à

membrana da vesícula pelo peptídeo sinal que não foi clivado. Assim, a tripsina

seria liberada no lúmen intestinal quando da ativação após a clivagem do

propeptídeo, o que se daria no aminoácido R22. Essa certamente é uma hipótese

que necessita de maiores estudos.

Amilase ligada à membrana de S. frugiperda é significantemente solubilizada

em tampão e papaína e detergentes aumentam em certo grau sua solubilização.

Todavia, moléculas de amilase de S. frugiperda uma vez solubilizadas em Triton X-

117

114 a 4°C, particionam predominante a 30 °C dentro da fase pobre em detergente,

como se elas fossem proteínas hidrofílicas. Assim, moléculas de amilase ligadas à

membrana de S. frugiperda devem mudar sua conformação durante a solubilização,

ocultando o peptídeo hidrofóbico e tornando-se mais hidrofílicas. A hipotética

mudança conformacional provavelmente depende do pH, uma vez que a

solubilização de amilase é grandemente afetada pelo pH do meio (Jordão et al.,

1999). Assim, o comportamento de amilase ligada à membrana de S. frugiperda é

similar ao da tripsina ligada à membrana de Musca domestica (Jordão et al., 1996).

Duas sequências completas foram preditas ser amilases presentes no

intestino de S. frugiperda e são liberadas por secreção microapócrina: uma (contig

420) é homóloga à amilase digestiva, enquanto que a outra (contig 438) é uma

amilase semelhante a transportador de aminoácido (Ferreira et al., 2007). A amilase

referente ao contig 420 é de longe a mais expressa (2057 reads contra 689 reads da

outra). Esta proteína mais expressa deve corresponder à atividade de amilase

ensaiada nos conteúdos intestinais. Entretanto, esta sequência não tem alça

transmembrana (ou âncora de GPI) inferida por ferramentas de bioinformática.

Assim, como discutido para tripsinas, a melhor hipótese é que ela permanece ligada

à vesícula pelo peptídeo sinal. Pesquisas adicionais são necessárias para

esclarecer esse assunto.

5.3. Secreção microapócrina em S. frugiperda

As VM que brotam das microvilosidades possuem 4 compartimentos: (1) a

membrana externa originada da membrana microvilar; (2) o espaço entre a

membrana externa e interna que pode conter proteínas microvilares, citoplasmáticas

e provavelmente proteínas citoesqueléticas e proteínas associadas com a

maquinaria microapócrina secretória; (3) a membrana interna que é a membrana da

vesícula secretória e finalmente (4) o compartimento interno, que corresponde ao

conteúdo da vesícula secretória e inclui as proteínas verdadeiramente secretadas.

Proteínas típicas de outros compartimentos celulares podem ser vistas como

“acidentes” do processo de secreção microapócrina.

Apesar das claras definições de compartimentos acima, sua separação

experimental não foi possível, por causa da contaminação cruzada e do

comportamento inesperado de algumas proteínas, como amilase e tripsina. Como

118

visto anteriormente, preparações microvilares contêm, além da contaminação por

proteínas derivadas de mitocôndrias e outras organelas, proteínas sem predições de

alça transmembrana ou âncora de GPI. Uma possibilidade sugerida é que as

membranas microvilares são contaminadas por VM em brotamento e sua

maquinaria associada.

Levando em consideração a discussão anterior, as proteínas

verdadeiramente secretadas pela secreção microapócrina podem ser aquelas

listadas na tabela 7 que possuem um peptídeo sinal predito, mas carecem de uma

alça transmembrana e âncora de GPI. A maioria dessas proteínas são enzimas

digestivas (amilase, aminoacilase, carboxipeptidase, lipases, serina protease,

fosfodiesterase, tripsina), mas a lista inclui proteínas envolvidas na proteção

(ferritina, policalina), formação da MP (quitina desacetilase), além de duas proteínas

dissulfeto isomerase com função ainda desconhecida nessas preparações.

O critério usado para identificar proteínas secretadas pelo processo

secretório microapócrino foi apoiado pela demonstração que amilase e tripsina são

secretadas por VM através de dois métodos. O primeiro foi pela demonstração

nessa tese de que as atividades específicas dessas enzimas são maiores nas VM

do que no tecido intestinal de microvilosidades. O outro foi pelo uso de anticorpos

heterólogos, onde amilase e tripsina foram encontradas por métodos

imunocitoquímicos, com a ajuda de um microscópio eletrônico, associadas com

pequenas vesículas brotando das microvilosidades no intestino anterior de S.

frugiperda (Jordão et al., 1999; Bolognesi et al., 2001). Pelos mesmos métodos,

uma peritrofina também foi encontrada sendo liberada de vesículas de membrana

dupla brotando das microvilosidades do intestino anterior de S. frugiperda

(Bolognesi et al., 2001).

Apoio adicional para o procedimento usado aqui para identificar as proteínas

liberadas pela secreção microapócrina vem da ausência de celobiase e maltase na

tabela 7. Acredita-se que essas enzimas sejam secretadas por exocitose,

baseando-se em dados de fracionamento celular (Ferreira et al., 1994) e por sua

baixa atividade específica em VM comparado às microvilosidades e às células

intestinais (Tabela 3).

Carboxipeptidase A foi encontrada com atividade solúvel e atividade ligada à

membrana em estudos de fracionamento celular intestinal (Ferreira et al, 1994) e

sua atividade específica aumenta do tecido intestinal ao conteúdo de MP. Essa

119

descrição é similar ao que foi descrito para amilase e tripsina e pode ser

interpretado como uma carboxipeptidase A que está verdadeiramente presente em

VM, contaminando as preparações de microvilosidades e sendo acumulada no

conteúdo da MP. Entretanto, como uma das carboxipeptidases A (contig 418) tem

uma âncora GPI predita, é altamente provável que a atividade de carboxipeptidase

detectada membrana seja devido a uma proteína verdadeiramente microvilar,

enquanto que aquelas solúveis sejam secretadas por secreção microapócrina.

Seis lipases são similares às lipases pancreáticas e supostamente são

liberadas por secreção microapócrina. Uma das lipases pancreáticas (contig 379)

possui alça transmembrana, mas o seu significado ainda não está esclarecido.

Exceto para proteínas que supostamente são parte da maquinaria secretória

ou transportadores, outras proteínas preditas que podem ser secretadas por

secreção microapócrina estão listadas na tabela 8, apesar da falta de dados para a

predição da presença de peptídeo sinal. A maioria das potenciais proteínas

supostamente secretadas (aminopeptidase, carboxilesterase, prolilcarboxipeptidase,

lipase e serina protease) são enzimas digestivas e algumas são proteínas

envolvidas na proteção e na formação da MP. As ATPases (contigs 435 e 500) são

provavelmente bombas de prótons que acidificam o conteúdo de vesículas como é

usual em vesículas secretórias (Alberts et al., 2008). O transportador de cátion

orgânico (contig 631) pode provir da membrana microvilar, embora não exista apoio

experimental para essa afirmação.

Proteínas preditas que supostamente estão envolvidas na maquinaria

secretória estão listadas nas tabelas 6 e 8. As proteínas preditas são calmodulina,

fimbrina, anexina, miosina VIIa, cofilina e gelsolina-1 que não são ancoradas nas

membranas. Elas podem ser recuperadas nas preparações de membranas

microvilares porque podem estar associadas à membranas ou a elementos do

citoesqueleto que contaminam essas preparações. Calmodulina é uma proteína

ligante de Ca ++ (que é parte, junto com a miosina I) do braço lateral que conecta o

feixe de actina à membrana plasmática recobrindo a microvilosidade intestinal

(Bemet e Mooseker, 1996). Adicionalmente, calmodulina pode também participar em

numerosos processos regulatórios (Tong et al., 2006), talvez incluindo os eventos

que ocorrerm nas microvilosidades de S. frugiperda (ver abaixo). Resumindo e

reunindo o que foi comentado anteriormente, anexina é uma família de proteínas

estruturalmente relacionadas com propriedades de ligação de Ca++ dependente de

120

fosfolipídeos e isso pode promover fusões de membrana (Rescher e Gerke, 2004).

Proteínas semelhantes a anexina são ativadas por Ca++ citosólico e corta filamentos

de actina (McGough et al., 2003). Miosinas pertencem a uma grande superfamília

de proteínas que compartilham um domínio comum que interage com actina,

hidrolisa ATP e produz movimento (Sellers, 2000). O envolvimento de miosina V no

transporte vesicular foi estabelecido indubitavelmente, mas outras miosinas

parecem ter um papel similar, como as miosinas Ic e VIIa (Soldati e Schiliwa, 2006).

Calmodulina, anexina, miosinas (I, VI e VIIa) e gelsolina provavelmente

participam conjuntamente no processo de secreção microapórina de enzimas

digestivas descritas em S. frugiperda (Ferreira et al., 1994; Jordão et al., 1999;

Bolognesi et al., 2001; Ferreira et al., 2007), como segue. Calmodulina pode

controlar a concentração de Ca++ no interior da microvilosidade em reposta a algum

processo de sinalização e assim afetar a atividade da anexina e da gelsolina. O

movimento das vesículas secretórias através das microvilosidades é supostamente

realizado pela miosina VIIa (a única miosina com esta função encontrada nas

nossas varreduras), operando ao longo dos filamentos de actina. Esse movimento

pode ser ajudado pela atividade de cortes em filamentos de actina apresentada pela

gelsolina-1 (e/ou pela cofilina, contig 533). A fusão das vesículas secretórias com as

membranas microvilares pode ser promovida pela anexina (contig 30). Certamente

os eventos relacionados a esse tipo de secreção ainda não estão esclarecidos,

assim como o que faria o comportamento do citoesqueleto diferente na região

anterior e posterior do ventrículo de Lepidoptera. Muitos estudos ainda são

necessários para esclarecer esses pontos.

121

6. CONCLUSÕES

As membranas microvilares intestinais e as vesículas microapócrinas

apresentam proteínas pertencentes a oito classes: a) enzimas digestivas, b)

proteínas de MP, c) envolvidas com proteção, d) transportadores, e)

receptores, f) proteínas da maquinaria secretória, g) proteínas de

citoesqueleto e h) proteínas sem função conhecida nesses compartimentos

celulares.

Nas membranas microvilares a maior quantidade de sequências diferentes de

enzimas digestivas são aminopeptidases, enquanto em VM essas

sequências são lipases.

Nas VM encontram-se 6 sequências de lipase pancreáticas e 1 sequência de

lipase do tipo gástrica.

As aminopeptidases encontradas nas membranas microvilares podem ser

enquadradas nas classes 1, 3, 5 e 6 das aminopeptidases de Lepidoptera,

enquanto as aminopeptidases das vesículas estão presentes na classe 2 ou

não puderam ser classificadas.

As carboxipeptidases presentes nas nas microvilosidades são da família M14

e compreendem 2 carboxipeptidases tipo A, uma tipo B e uma tipo MC. Nas

vesículas há 2 enzimas da família M14, uma carboxipeptidase A e uma B e

uma da família S28.

A gelsolina-1 e a miosina I são proteínas expressas no intestino de S.

frugiperda enquanto que gelsolina-2 é expressa somente nos demais

tecidos.

Miosina VI é expressa em intestino e túbulos de Malpighi.

122

Anexina, ARP, cofilina, fimbrina, moesina, PDI 1 e 2 e profilina são expressas

em todos os tecidos da lagarta de S. frugiperda.

O anticorpo da proteína gelsolina recombinante (anti-gelsolina) é capaz de

reconhecer (além da proteína recombinante) uma proteína apenas no

epitélio intestinal que apresenta a massa molecular predita para gelsolina.

123

7. REFERÊNCIAS

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SÚMULA CURRICULAR

DADOS PESSOAIS Nome: Walciane da Silva Local e data de nascimento: Aparecida do Taboado, MS, 06/09/1983 EDUCAÇÃO Ensino fundamental Escola Estadual Frei Vital de Garibaldi, Aparecida do Taboado, MS, Brasil Período: 1990-1997 Ensino médio Fundação Lowtons de Educação e Cultura (Funlec), Aparecida do Taboado, MS, Brasil Período: 1998-2000 Graduação em Licenciatura em Ciências Biológicas. Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Três Lagoas, MS, Brasil Período: 2002 - 2006 Mestrado em Biologia Funcional e Molecular. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil Orientadora: Maria Lígia Rodrigues Macedo Período: 2006 - 2008 Doutorado em Ciências Biológicas (Bioquímica). Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil Orientadora: Clélia Ferreira Período: 2008-2012 OCUPAÇÃO Bolsista de Iniciação Científica, CNPq, 2003-2005 Bolsista de Mestrado, Capes, 2006-2008 Bolsista de Doutorado, Capes, 2008-2012 ARTIGOS COMPLETOS Silva W., Cardoso C., Ribeiro A.F., Terra W.R., Ferreira C. (2012). Midgut proteins released by microapocrine secretion in Spodoptera frugiperda. Journal of Insect Physiology (no prelo). Silva W., Freire M.G.M., Parra J.R.P. Marangoni S., Macedo M.L.R. (2012). Evaluation of the Adenanthera pavonina seed proteinase inhibitor (ApTI) as a bioinsecticidal tool with potential for the control of Diatraea saccharalis. Process Biochemistry 47, 257 - 263. Silva L.B., Silva W., Macedo M.L.R., Peres M.T.L.P. (2009). Effects of Croton urucurana extracts and crude resin on Anagasta kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae). Brazilian Archives of Biology and Technology 52, 653 - 664. Boleti A.P.A., Freire M.G.M. Coelho M.B., Silva W., Baldasso P.A.G., Melo V., Marangoni S., Macedo M.L.R. (2007). Insecticidal and antifungal activity of a protein from Pouteria torta seeds with lectin-like properties. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 2653 - 2658.

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