proteases ta 502 - 2005 profa. gláucia maria pastore laboratório de bioaromas e profa. gabriela...
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Proteases
TA 502 - 2005
Profa. Gláucia Maria Pastore
Laboratório de Bioaromas
e
Profa. Gabriela Macedo
Laboratório de Bioquímica de Alimentos
10 de Novembro de 2005
Proteases: Definição
Definição: Proteases catalisam a quebra das ligações peptídicas em proteínas.
E.C: Classe 3 das hidrolases, e subclasse 3.4, das peptídeo-hidrolases ou peptidases.
Classificação das proteases:
FONTE: vegetais, animais ou microbianas– Presentes no alimento– Excretadas por microrganismos presentes nos alimentos– Adicionadas como coadjuvantes de processo
AÇÃO DO SÍTIO CATALÍTICO: – Endopeptidases ou Exopeptidases– Proteólise Limitada ou Ilimitada
NATUREZA DO SÍTIO CATALÍTICO: Serina Cisteína Metaloproteases Aspartico proteases
Classificação das proteases (Hartley)
Classificação Exemplos CaracterísticasPEPSINAProteases ácidasRENINA ANIMAL
pH ótimo ácídico
PAPAÍNABROMELINA
Proteases sulfridrílicas
FICINA
Grupo SH no sítio ativo
QUIMOTRIPSINATRIPSINAELASTASE
Serina proteases
TROMBINA
Resíduo serina no sítio ativo
EXOPEPTIDASESMetalo proteasesCARBOXIPEPTIDASES
Íon metálico no sítio ativo
Proteases: Tipos catálise
1) Proteólise limitada: a protease cliva somente uma ou um número limitado de ligações peptídicas: uma proteína alvo para ativação como a conversão de prohormônios em hormônios.
2) Proteólise Ilimitada: quando as proteínas são degradadas em amino ácidos e seus constituintes
Aplicações Tradicionais de proteases vegetais e animais
Aplicação Protease
Fabricação dequeijos
Renina (animal)
Amaciamento depeles
Tripsina
Prevenir turvaçãocervejas
Papaína
Bolachas cracker Protease fúngica
Hidrólise deproteínas
Pancreatina,tripsina, proteasebacteriana
Outras aplicações das Proteases
DetergentesCouros: substituição produtos do processo
que são poluentesProdutos farmacêuticos: pomadas
cicatrizantes, auxiliares digestivosAlimentos: amaciamento de carnesReação de plasteínaSolubilização de proteínas
Papaia:Látex do mamão papaya (Carica papaya)
frações : papaína e chimopapainaBromelina:Extração do caule da plantaFicina: Látex de figos verdes, maduro tem 125 menos atividade.
Proteases Sulfidrílicas
ATIVIDADE DEPENDE DE UM OU MAIS GRUPOS
SULFIDRILAS -SH NO SÍTIO ATIVO
PROTEASES VEGETAIS: bromelina, ficina e papainaPROTEASES MICROBINAS ALGUMAS
Ativadas por agentes redutores: cisteínaInativadas por oxidantes, íons metálicos
Mecanismo cisteína-protease
Inativação das proteases sulfidrílicas
SH : oxidado, enzima inativa Atividade inativada por agentes oxidantes
tais como Oxigênio. Atividade pode ser recuperada por agentes
redutores: cisteína.
Proteases vegetais: Cisteína Proteases
Esta família inclui as proteases vegetais tais como papaína, bromelina, ficina e também as catepsinas lisossomais de mamíferos e microbianas.
São enzimas sulfidrílicas e apresentam SH no sítio ativo.
Papaína é a mais estudada possui Cys 25 e His 159 no sítio ativo e a reação ocorre como nas serinas: em duas etapas.
pH neutro, dependente do substrato.
Características proteases vegetais
Papaina Ficina Bromelina
pH ótimo5,0 em gelatina e7,0 albumina
5,0 - 7,5 6,0 - 8,0
Temp. ótima60-70oC
62,5 oC 50- 60 oC
pH estabilidade5,0
pH est. 6,0 - 8,0
Termoestabilidade70oC por 30 min.Perde 20%
Inativada a 80oC
Especificidade:ampla peptídeos eproteina
ampla
Atividadeplastéina: síntese
não
Síntese de Plasteínas
Plasteínas são polipeptídeos obtidos por sínteseutilizando-se a capacidade da papaína de polimerizaramac.
Hidrolisado de soja def.metionina +ésteres de metionina
Plastéinametionina
incorporadaao hidrolisado
Papaína
Proteases na clarificação de cervejas
Turvação da cerveja a baixa temperatura pode ter 2 causa basicamente:
1. Contaminação microbiana2. Complexação de polipeptídeos e taninosquando a cerveja é resfriada.
Taninos são compostos fenólicos presentes no lúpuloque contribuem para o sabor amargo e adstringênciado produto.
A utilização de papaína a fim de diminuir as cadeiasde proteínas presentes e evitar a complexaçãocom taninos é prática comum em algumas cervejarias.
Produção de queijo azul:blue cheese
O papel do Penicillium roqueforti na produção do blue cheese está associado com a proteólise durante a maturação do queijo.
Penicillium roqueforti: Endopeptidase e Exopeptidase
Apesar da proteólise extensiva no blue cheese (baseada na grande quantidade de nitrogênio solubilizado) a texturae coesão ainda é retida.
Renina animal e microbiana. 1874 Christian Hansen Economicamente mais importante na indústria de alimentos
Adição de enzimas para acelerar a maturação de queijos
Tipo deQueijo
EnzimasAdicionadas
Fonte Estágioadição
Cheddar Proteaseácida,neutra,lipase,descaboxilase
Animais Coalho
Cheddar eParmesão
Lipase,protease
ovelha Leite ecoalho
Gouda protease Asp.oryzae
Leite ecoalho
Mussarela Lipase,esterase
bezerro Leite
Blue LipaseProtease
Asp. SppP. roq.
Coalhomassa
Constituintes do leite:
a lfa s1 case in a3 8 %
kap p a case in a3 6 %
b eta ,g am a e a lfa s2 case in a1 6 %
C ase ín a8 0 %
alb u m in a im u n og lob u lin a
p ro teosep ep ton a
ceru lop lasm in a
lac to fe rrin a
P ro te in as d o soro2 0 %
H 2 0 = 8 6 -8 8 %G ord u ra = 3 -6 %P ro te ín a = 3 -4 %L ac tose = 5 %
K- caseina
Propriedade especial: é única fração da caseína do leite solúvel na presença de íons Cálcio.Efeito estabilizante: estabiliza as frações da caseína em solução, pela formação de micélios coloidais.
Hidrólise da kapa caseína
O micélio coloidal formado pela kapa caseínatem PM 10000 e 100 nm. Partes hidrofílicas para fora do micélio.Partes hidrofóbicas: alfa s1 e s2 caseina para dentro.
A kapa caseína é mais facilmente hidrolisada pois está na superfície da micela. A hidrólise da kapa caseína desestabiliza o micéliocausando a coagulação do leite.
K caseína p-k caseína + glicolipídeo
Cálcio
Coagulação
Renina
A hidrólise específica entre fenilalanina-metionina da k caseina pela renina, libera um peptídeo com carga altamente negativa,que se coagula na presença do Calcio.
Renina (quimosina ou coalho animal)
Fonte: Abomasso (4O estômago do bezerro, cordeiro, cabrito)
Renina CaracterísticaspH ótimo 6,3-6,6 ação
3,8Temp. ótima 40oC
pH estabilidade 4,8 - 6,0
Especificidade Rompe ligação peptídicaentre Fenilalanina-Metionina (105-106)
Cofatores Cálcio para ppt p-caseinato
Vantagens Proteólise limitada
Síntese Zimogênio: prorenina
Aplicações Queijos e flans
Obtenção da renina Coalho
In cu b ar 7 2 h rs , 1 0 oC
A ju s te p H 4 ,6A d ic ion ar res in a sep araçã o
A ju s ta r p H 5 ,8
C oa lh o
F iltra r em tec id o e filtro
C oag u laçã o d a p ro te in a e a tiva p ro ren in a
H C l 1 8 % p H 2 ,5 , 1 0 oC , 7 2 h rses te rilizaçã o
F iltra r
1 5 0 m L N aC l 6 % e 2 ,5 % á c b ó ricop H 5 ,4
C orte em tiras
E lim in ar cam ad a g ord u ra
L avag em
4 o E s tô m ag on ovilh os
Pepsina
Pepsina-protease ácida é extraída de estômago de suínos.
Aplicações:•Nas preparações de renina comocontaminante ou substituto de renina;•Auxiliar da digestão•Preparações de cereais e alimentos infantis
Propriedades:• pH ótimo: 1,0 - 4,0•pH estabilidade máxima: 5,0 - 5,5•Especificidade: relativamente ampla hidrolisandoprincipalmente ligações peptídicas entre amac aromáticos.
Metaloproteases
ATIVIDADE DEPENDE DO GRUPO ÍON METÁLICO
SÍTIO ATIVO: Mg; Zn; Co, Fe, Hg, Cad, Cu, Ni
O metal pode estar fortemente ligado e dificilmenteser removido ou estar fracamente ligado e ser
removido por diálise contra EDTA.
A remoção do íon inativa a enzima.
São classificadas em exo e endo peptidases
Proteases: Endo e Exo peptidases
Endopeptidases : atuam nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as
regiões N e C terminal.
Exopeptidases:
Atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal.
Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido Aminopeptidases.
As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido Carboxipeptidases.
Carboxipeptidase A
Remove aa do terminal carboxilia e favorece a liberação de aa com cadeias laterais aromáticas:
• Leucina•Isoleucina
Não hidrolisa substratos aa terminal: •Arginina•Lisina•Prolina,
É adequada para remoção do sabor amargo em hidrolisados proteicos:O sabor amargo é devido ao aparecimento de peptídeos que apresentam aa hidrofóbicos no terminal carboxílico:• Leucina•Prolina•Valina•Fenilalanina
AmAc amargos
Peptídeos com cadeias laterais hidrofóbicas:
Carboxipeptidases A - exopeptidaseou Aminopeptidase
Sabor amargo desaparece
SABOR AMARGO
Serinas proteases
Serina no sítio ativo Tripsina, Quimitripsina, Elastase, Subtilisina Endoproteases Alcalinas pH 7,0 - 11,0 Inibidas por DFP (diisopropil fluorofosfato)
Tripsina
Tripsina é extraída do pâncreas de suínos e bovinos. Serina protease.
Produção de hidrolisado protéico: Aplicação. pH ótimo: 7- 9 Temperatura ótima: 50oC
Especificidade: Mais específica para as ligações peptídicas envolvendo grupos carboxilas dos aa básicos: Lisina e Arginina.
• Tripsina é muito estudada é muito estudada devido às suas propriedades de ativação de outras proteases.• E também porque alguns alimentos possuem inibidores desta enzima.
Tripsina
TripsinogênioInativo
Tripsina
Quimotripsinogenio inativo Quimotripsin
aativa
Procarbosipeptidase Ainativa
Carboxipeptidase
Tripsina
Proteases em panificação
As propriedades reológicas da massa de farinha de trigo são devidas às proteínas do Glúten.
Glúten: responsável pela força da farinha e viscoelasticidade. A força está ligada à capacidade de reter gás durante a fermentação do pão. Rede de gluten.
Agentes oxidantes: BromatoPeróxido melhoram a farinhaIodato
Redutores: pioram a farinha: cisteína e glutation
Proteases em panificação:
Proteases fúngicas de Asp. Oryzae são misturas de exo e endo peptidases.
Rompem a rede do Glúten por hidrólise das ligações peptídicas diminuindo elasticidade e viscosidade da massa. Reduzem o tempo de mistura.
Vantagens:•elasticidade e textura melhores•retenção de gás maior•Melhor simetria•Aroma•tempo de estocagem maior.
Proteases
TA 502 - 2005
Profa. Gláucia Maria Pastore
Laboratório de Bioaromas
e
Profa. Gabriela Macedo
Laboratório de Bioquímica de Alimentos
10 de Novembro de 2005
Agradecemos à Agradecemos à todos pela todos pela Atenção ...Atenção ...
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