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Anhanguera Educacional Ltda. Correspondência/Contato Alameda Maria Tereza, 2000 Valinhos, SP - CEP 13278-181 [email protected] [email protected] Coordenação Instituto de Pesquisas Aplicadas e Desenvolvimento Educacional - IPADE Publicação: 30 de junho de 2011

Trabalho realizado com o incentivo e fomento da Anhanguera Educacional

Marcos Antonio P. Júnior Flavio Marques Lopes

Curso: Biomedicina

FACULDADE ANHANGUERA DE ANÁPOLIS

Trabalho apresentado no 10º Congresso Nacional de Iniciação Científica – CONIC.

RESUMO

Atualmente, o maior desafio na produção de monoculturas está ligado com os problemas de saúde e de ordem ambiental relacionados com o manejo de agrodefensivos, pouca atenção dada à destinação dos resíduos e perda da fertilidade dos solos. O objetivo deste trabalho foi selecionar e caracterizar microrganismos presentes em resíduos de agrodefensivos. Para isto foram coletadas alíquotas de resíduos dos agrotóxicos em reservatórios de empresas responsáveis por realizar a higienização dos recipientes vazios. Os microrganismos foram isolados e corados pela técnica de Gram, sendo 4 Gram-negativos e 4 Gram-positivos. As bactérias Gram-negativas foram selecionadas, por apresentarem uma cinética de resistência maior aos resíduos de agrodefensivos. Os microrganismos apresentam-se em forma de bacilos, sendo negativo para a Reação de Oxidase. A identificação por BACTRAY apresentou para os isolados Citrato negativo uma correlação maior para Hafnia alvei 33,49% e Escherichia coli 24,98%. Para os isolados Citrato positivo tiveram uma correlação maior para Serratia liquefaciens 95% e Serratia fonticola 87,14%. Os testes de sensibilidade mostraram que os microrganismos foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Teste Biológico utilizando os fungos Aspergillus niger, Colletotrichum truncatum e Trichoderma asperellum mostraram a ação efetiva do resíduo coletado e que os microrganismos apresentaram-se resistentes ao mesmo, o teste de resistência dos microrganismos aos resíduos de agrodefensivos e o teste de resistência dos microrganismos a diferentes classes de agrodefensivos mostraram a resistência e a capacidade de sobreviver ou mesmo degradar os compostos dos resíduos dos agrodefensivos testados, possibilitando o seu possível uso em técnicas de biorremediação.

Palavras-Chave: microrganismos; caracterização morfológica; caracterização bioquímica; biorremediação.

ANUÁRIO DA PRODUÇÃO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DISCENTE

Vol. 13, N. 17, Ano 2010

PROSPECÇÃO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES A AGRODEFENSIVOS

82 Prospecção de microrganismos resistentes a agrodefensivos

Anuário da Produção de Iniciação Científica Discente • Vol. 13, N. 17, Ano 2010 • p. 81-102

1. INTRODUÇÃO

A agricultura brasileira mostrou uma grande capacidade de adaptação ao mercado,

superando a crise econômica de 2008 e exibindo uma safra recorde de grãos 2009/2010

com 146,9 milhões de toneladas. O agronegócio no Brasil foi responsável por 42,3% do

saldo de exportação em 2009, equivalente a US$ 60 bilhões e serão investidos mais 8% no

financiamento da agricultura empresarial para a safra 2010/2011 (CONAB, 2010).

O agronegócio ocupa papel de destaque na economia goiana, nesta temporada

resultou de uma série de fatores, tais como a condição climática, que favoreceu o

desenvolvimento das culturas, o renegociamento de dívidas antigas e a disponibilidade

de recursos para este setor (SAFRA, 2007).

Atualmente vários produtos são sintetizados para o combate das pragas que

acometem as plantações. O Brasil é um dos maiores consumidores desses produtos em

função do modelo agrícola adotado e da ampla diversidade biológica, que favorece a

incidência de pragas e moléstias, sendo o oitavo maior consumidor mundial de pesticidas

(GALLI et al.,2006; MORAGAS; SCHNEIDER, 2003; SILVA; FAY, 2004; VEIGA, 2007).

Como a função do defensivo agrícola é matar, exterminar e combater pragas

agrícolas, para que esse produto seja considerado eficiente, deve proporcionar a

eliminação de aproximadamente 95% da praga (VEIGA, 2007). Na agricultura estão

registrados cerca de 600 princípios ativos utilizados nas formulações de pesticidas

(RICHARDSON, 1998).

Atualmente, o maior desafio na produção de monoculturas está relacionado com

os problemas de saúde e de ordem ambiental ligados ao manejo de agrodefensivos,

exposição dos trabalhadores, contaminação do ambiente intradomiciliar, descarte

inadequado de embalagens vazias, pouca atenção dada à destinação dos resíduos do

processo produtivo, transtornos e modificação ambiental, acúmulo nos segmentos bióticos

dos ecossistemas (biota, água, ar, solo, sedimentos) e perda da fertilidade dos solos

(BALSAN, 2006; PERES; MOREIRA, 2007).

A biorremediação é uma técnica que utiliza bactérias, fungos e enzimas para

degradação de substâncias sintéticas poluidoras no ambiente, podendo ser no solo, águas

superficiais e subterrâneas, que se dá pela biodegradação dos compostos que são tóxicos

ao ambiente (EMBRAPA, 2010).

A biorremediação vem sendo explorada para a transformação de contaminantes

em produtos menos tóxicos através da capacidade metabólica microbiana (UETA et al.,

Marcos Antonio Pereira Júnior, Flavio Marques Lopes 83


1999). Nessa técnica a atividade microbiana e crucial na determinação da extensão e da

velocidade da degradação dos resíduos de pesticidas (SILVA, 2001).

Portanto, este trabalho visou isolar e caracterizar possíveis microrganismos

presentes em recipientes de transporte dos agrodefensivos, os quais perante a Lei de

preservação ambiental deverão ser tratados antes de serem desprezados. E a capacidade

desses microrganismos sobreviverem na presença desses resíduos ou mesmo degradar

esses compostos para aplicação em técnicas de biorremediação.

Este artigo está organizado em seções. A primeira seção é essa introdução, a

seção 2 apresenta os objetivos da pesquisa. A metodologia utilizada na realização da

pesquisa é apresentada na seção 3. As informações relacionadas ao desenvolvimento da

pesquisa como a revisão de literatura, o problema abordado, a solução proposta e

implementada são mostradas na seção 4. A forma de abordar os experimentos, os

resultados e as discussões são descritos na seção 5. Por fim, as considerações finais então

são apresentadas na seção 6.

2. OBJETIVO

2.1. Objetivo geral

• Isolar e caracterizar microrganismos de resíduos industriais contendo agrodefensivos.

2.2. Objetivos específicos do trabalho

• Isolar microrganismos de resíduos de agrodefensivos;

• Selecionar microrganismos resistentes aos agrodefensivos;

• Caracterizar morfologicamente os microrganismos que se desenvolverem nos meios YPD (extrato de leveduras, peptona e dextrose) e Nutriente;

• Caracterizar bioquimicamente os microrganismos Gram-negativos;

3. METODOLOGIA

Este trabalho trata-se de uma pesquisa experimental realizada para avaliação de

microrganismo para possível utilização em técnicas de biorremediação.



3.1. Coleta dos resíduos

A Coleta dos resíduos de agrodefensivos foi realizada em uma das unidades de

recebimento de embalagens vazias de agrotóxicos no estado de Goiás, situada na cidade

de Goiânia- GO – Rod. GO-020, Km 8. Que tem como atividade a coleta, higienização e

encaminhamento de embalagens para reciclagem ou incineração.

3.2. Teste da atividade fungicida dos resíduos coletados

O teste da atividade fungicida dos resíduos de agrodefensivos foi realizado frente aos

fungos Aspergillus niger, Trichoderma asperellum e Colletotrichum truncatum. Foram

utilizados 100µl de uma solução de esporos para inoculação com diluição 1:100, sendo a

concentração determinada pela contagem em Câmara de Newbawer (Aspergillus niger =

44x107, Trichoderma asperellum = 61x107 e Colletotrichum truncatum = 10x107) As soluções de

esporos foram plaqueadas em meio de cultura BDA (Ágar Batata Dextrose), e, em seguida

discos impregnados com os resíduos coletados foram colocados sobre a placa. Dois discos

contendo o mix de resíduos de agrodefensivos e um disco contendo fungicida Opera®

(controle positivo). As placas foram, então, incubadas a 37ºC por 96 horas. A análise da

atividade fungicida foi realizada após 24 e 96 horas de incubação e, o surgimento ou não

de halo de inibição foi tomado como resultado do experimento. A intensidade da inibição

foi determinada pela determinação do diâmetro de inibição do crescimento fúngico.

3.3. Isolamento dos microrganismos

Alíquotas de 100µl do mix de resíduos coletados foram inoculados em meios Nutriente,

YPD e Sabouraud sólidos, incubados a 37 ºC por 48 horas. Após a incubação, as colônias

que se apresentaram macroscopicamente diferentes quanto à morfologia, foram isoladas

nos respectivos meios. Após isolamento em meio sólido, as amostras foram cultivadas em

meio YPD líquido.

Os microrganismos isolados foram inoculados em Ágar MacConkey (MAC),

meio seletivo para crescimento de bactérias Gram-negativas e Ágar Manitol Salgado

(MAS) meio diferencial seletivo para crescimento de bactérias Gram-positivas (ANVISA,

2010).



3.4. Manutenção das colônias

Para a manutenção das colônias, alíquotas de 100 μL de meio líquido contendo os isolados

foram inoculados em 5 mL de caldo nutriente, incubados em estufa “Shaker” a 37 ºC e 150

rpm por 24 horas. Após a incubação, os tubos foram centrifugadas a 5000 rpm por 10

minutos, o sobrenadante foi descartado e adicionou-se 2 mL caldo nutriente contendo

50% de glicerol. O material foi, então, armazenado em congelador em temperatura

inferior a 0°C.

A manutenção das colônias em meio sólido foi realizada através da inoculação

dos microrganismos em placas contendo meio nutriente em placa. Após inoculação, as

placas foram incubadas a 37 ºC por 24 horas em estufa bacteriológica. Para efeito de

controle de qualidade foi realizado teste coloração de Gram para todas as colônias antes

da realização dos experimentos.

3.5. Caracterização morfológica dos microrganismos

Para a caracterização microscópica dos microrganismos foram preparadas lâminas de

culturas em caldo nutriente para microscopia óptica. As lâminas foram coradas pelo

método de Gram (Conjunto para coloração de Gram, Laborclin) e analisadas utilizando

microscópio óptico Leica DME equipado com câmera Leica EC 3. O programa para a

captura de fotos foi o Leica Application Suíte, versão 2.4.0. Os microrganismos que

apresentaram coloração Gram-negativa foram caracterizados bioquimicamente.

3.6. Caracterização bioquímica dos microrganismos

Inicialmente as amostras Gram-negativas foram inoculadas em Ágar MacConkey (MAC)

a 37ºC por 24 horas, para avaliar a capacidade de fermentação da lactose.

Além disso foi realizado teste de Reação de Oxidase (Tiras de Oxidase,

Laborclin), para identificação de Bacilos Gram-negativos (BGN) não fermentadores da

glicose. foram inoculadas em Meio CLED (Cysteine Lactose Electrolyte Agar Deficience) a

37ºC por 24 horas. Após a incubação, foram retiradas duas colônias do meio de cultura e

espalhadas sobre a superfície da tira de reação de oxidase. O resultado foi analisado após

um minuto de reação.

O teste de motilidade e fermentação da glicose em meio aeróbio e anaeróbio foi

realizado no meio Hugh e Leifson (HL). Os tubos contendo meio HL receberam uma

camada de óleo mineral sobre a superfície do meio para reduzir a concentração de



oxigênio no microambiente. O teste de motilidade foi realizado para avaliar a capacidade

de locomoção dos microrganismos no meio HL.

A caracterização bioquímica foi realizada utilizando-se Kit comercial Bactray I e

II, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Terminada a incubação, foi realizada

a leitura dos compartimentos individuais de reação dos Kit’s, e os dados obtidos foram

analisados por meio de tabela apropriada fornecida pelo fabricante, para obtenção dos

resultados dos testes, gerando uma sequência de sete dígitos utilizada pelo programa

Bactray® (versão 2.1), para determinação do perfil metabólico e similaridade com

determinada espécie bacteriana.

3.7. Análise da sensibilidade a antimicrobianos

O teste de sensibilidade a antimicrobianos foi realizado segundo a “Padronização dos

Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Disco-difusão: Norma Aprovada – Oitava

edição” - ANVISA . Colônias das amostras crescidas em ágar Macconkey a 37ºC por 24

horas foram diluídas em solução salina estéril 0,9%, até atingir uma turbidez óptica

comparável á da solução-padrão de McFarland a 0,5. As soluções dos microrganismos

foram inoculadas em placas contendo meio de cultura Mueller-Hinton e, discos contendo

antimicrobianos foram inoculados sobre a superfície da placa. Após inoculação, as placas

foram incubadas a 37ºC por 24 horas e os resultados dos testes foram analisados por meio

da observação do surgimento de halos de inibição.

3.8. Teste de resistência dos microrganismos aos resíduos de agrodefensivos

As amostras identificadas como Gram-negativas foram inoculadas em meio YPD e sobre a

superfície da placa foram colocados 2 discos contendo o mix de resíduos de

agrodefensivos e 1 disco contendo o fungicida Opera® (controle positivo). As amostras

foram incubadas a 37ºC por 24 horas e os resultados foram realizados por meio de

determinação do diâmetro dos halos de inibição formados.

3.9. Teste de resistência dos microrganismos a diferentes classes de agrodefensivos

As amostras foram inoculadas em meio YPD e na superfície da placa foram aplicados

discos contendo agrodefensivos de classes distintas. Foram escolhidos para o teste os

seguintes agrodefensivos:



PRIORI XTRA® que possui em sua composição Azoxistrobina e Ciproconazol,

pertencendo a classe dos fungicidas sistêmicos dos grupos químicos Azoxistrobina,

Estrobilurina, Ciproconazol e Triazol. Para a realização dos testes, foi diluído 1 mL do

fungicida em 100 mL de água destilada estéril e realizada a impregnação dos discos.

SYSTANE EC® que possui em sua composição Miclobutanil, pertencendo a classe

dos fungicidas sistêmicos do grupo químico triazol. Foram diluídos 250 μl do fungicida

em 100 mL de água destilada estéril e realizada a impregnação dos discos.

ANTRACOL 700 PM® que possui em sua composição Propineb, pertencendo a

classe dos fungicidas protetivos orgânicos do grupo químico dos ditiocarbamatos. Para o

preparo dos discos, 300g do fungicida foi dissolvido em 100mL de água destilada estéril.

A solução foi utilizada para a impregnação dos discos.

As diluições foram realizadas segundo o fabricante nas concentrações que são

aplicadas em lavouras. Os resultados foram realizados por meio da determinação dos

halos de inibição dos microrganismos após incubação por 24h a 37ºC.

4. DESENVOLVIMENTO

4.1. Agricultura

No surgimento da agricultura, a aproximadamente 10 mil anos, o principal objetivo era

produzir matéria-prima e alimentos para sobrevivência do homem. Com o passar do

tempo, o homem começou a desenvolver técnicas para obter maiores produções. No final

do século XIX e início do século XX surgiram os primeiros fertilizantes artificiais e

biocidas, que levaram ao melhoramento do solo e a diminuição de pragas que

prejudicavam as plantações. Como conseqüência houve um aumento significativo da

produtividade (MORAGAS e SCHINEIDER, 2003).

A produção agrícola reduz a diversidade biológica dos ecossistemas

transformando-os em um agrossistema. Esse problema se agrava na monocultura, em que

se favorece um grande aumento na população de pragas e patógenos (BERGAMIN et al.,

1995).

O aumento na área de produção tem levado ao desequilíbrio ecológico, para o

melhoramento da produção esta ocorrendo uma artificialização, com o uso de

agrodefensivos e fertilizantes (CAPORAL , 2008). Este fato leva ao desenvolvimento de



resistência das pragas que cada vez necessitam de uma concentração maior para que se

obtenham resultados (PASCHOAL, 1979).

São aplicados a cada safra uma quantidade cada vez maior de agrodefensivos,

simultaneamente cada safra aumentam em número a população dos organismos

resistentes, o que obriga ao aumento no volume de defensivos a serem aplicados,

ocorrendo um ciclo vicioso (ALVES FILHO, 2001).

Na década de 80 a agricultura brasileira sofreu um grande impulso e as áreas de

plantações se estenderam para o cerrado; devido à composição do solo esse bioma exigia

uma grande quantidade de herbicidas, cuja aplicação cresceu numa escala de 540% entre

1978 e 1998 (MINISTÉRIO DO DESENVOLVIMENTO AGRÁRIO, 2006).

Pela Lei Federal nº. 7802, de 11 de julho de 1989 artigo 2º, caracterizam-se como

defensivos agrícolas e produtos afins:

a) os produtos e os agentes dos processos físicos, químicos e biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e também de ambientes urbanos, hídricos e industrias, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, afim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos; b)substancias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (MAPA, 2010).

Os defensivos agrícolas podem ser divididos pelo modo de ação em defensivos

de contato, sistêmicos ou não sistêmicos e quanto ao organismo de combate podem ser

classificados em inseticidas, herbicidas e fungicidas (SILVA; FAY, 2004).

4.2. Agrodefensivos

O Brasil em 2008 passou à frente dos EUA tornando-se o maior consumidor de

agrodefensivos, com 733,9 milhões de toneladas/ano (SINDAG, 2009). Alguns compostos

são altamente tóxicos e estáveis podendo persistir por até 30 anos no ambiente e possuem

um alto poder cancerígeno (OPAS, 1996). Os países desenvolvidos que possuíam

programas de controle a esses produtos, passaram a produzir e exportar-los para países

que não possuíam programas de controle de poluentes (PORTO et al., 2010).

Para substituição dos clorados, o mercado lança novos compostos menos

agressivos ao meio ambiente, os organofosforados e carbamatos. No entanto, estes

compostos são bastante tóxicos aos vertebrados, pois são inibidores da

acetilcoloinesterase, levando ao acúmulo de acetilcolina, o que caracteriza-se como uma

intoxicação aguda (SOARES et al. 2003). Estudos mostram a ligação direta de carbamatos

a alguns tipos de câncer (KAMANYIRE e KARALLIEDDE, 2004).



Na década de 70 foram lançados os piretróides, menos agressivos do ponto de

vista tóxico que os organofosforados, mas com custo mais elevado (COUTO, 2010).

Os herbicidas foram propostos como grandes causadores de câncer em humanos

e também poderiam desenvolver alteração da córnea, diminuindo a capacidade visual

(PERES; MOREIRA, 2003; PINGALI et al., 1994).

No cerrado brasileiro com plantações de monoculturas, foram encontradas áreas

com contaminações de solo e água por uso de agrodefensivos (SOARES e PORTO, 2006).

Alguns agrodefensivos destroem a vegetação, empobrecendo rigorosamente o

solo, levando ao desenvolvimento de erosões. Por outro lado a exposição do solo

desprotegido às chuvas leva ao assoreamento de rios (BRIGANTE e ESPINDOLA, 2003).

Estima-se que cerca de 90% dos agrodefensivos que são aplicados na agricultura, são

disseminados no ambiente contaminando o solo, as águas superficiais e subterrâneas

(CAMPANHOLA e BETTIOL, 2003).

Na agricultura, busca-se a generalização de resultados e com o uso de

agrodefensivos obtêm-se resultados atraentes, de forma simples, previsível e com pouca

necessidade de entendimento dos processos primordiais do agrossistema (CARVALHO,

2003). No controle biológico, os resultados aparecem de forma gradual e o tratamento com

produtos químicos apresentam eficiência em curto prazo, tornando essa técnica mais

atraente à produção da agricultura (CAMPANHOLA e BETTIOL, 2003).

O Brasil foi muito beneficiado com a implantação e uso do programa de Manejo

Integrado de Pragas (MIP), em que o principal objetivo era a diminuição da média de

aplicação de agrodefensivos. Os benefícios obtidos com MIP foram economicamente e

ambientalmente elevados (GAZZONI, 1994). O MIP-Soja gerou muitos benefícios, mas na

última década sofreu um grande declínio e praticamente foi abandonado. Como

conseqüência, as aplicações de agrodefensivos voltaram a atingir uma média de quatro a

seis aplicações por safra e em casos extremos, essas aplicações excedem a seis, sendo um

incremento do uso de agrodefensivos nas lavouras (MORALES e SILVA, 2006;

MOSCARDI et al., 2009; QUINTELA et al., 2006). É fundamental a retomada do MIP e

seus princípios básicos, principalmente para cultura de soja (HOFFMANN-CAMPO et al.,

2000).

4.3. Isolamento e caracterização de microrganismos do bioma

O cerrado é o segundo maior bioma do planeta em diversidade de vida, ficando atrás

apenas da Amazônia (AGUIAR et al., 2004). Em estudo de microrganismos presentes em



solo de cerrado CUPPELS e KELMAN (1973), observaram que entre as bactérias

presentes, 93% eram Gram-positivas e apenas 7% Gram-negativas, e as Gram-negativas

foram classificadas como bacilos Gram-negativos anaeróbios facultativos, fermentadores e

também em bacilos e cocos Gram-negativos, aeróbios/microaerófilos, não fermentadores.

Chama a atenção o baixo percentual de bactérias Gram-negativas no solo, apesar destas

apresentarem grande capacidade de realizar alterações químicas, tais como metabolização

e/ou decomposição de proteínas, celulose, herbicidas e capacidade de fixação de

nitrogênio (HOLDING, 1960).

As enterobactérias da família da Enterobacteriaceae, são classificadas como

anaeróbias facultativas, possuindo portanto metabolismo tanto aeróbico como

fermentativo. Esta família de bactérias possui maior afinidade para desenvolvimento nas

temperaturas entre 25 e 37ºC, e frequentemente são encontradas no trato gastrointestinal

dos seres humanos e animais, na água e no solo (ICMSF, 2000; HOLT et al. 1994). Os

principais gêneros da família das Enterobacteriaceae são Citrobacter spp.; Edwardsiella spp.;

Enterobacter spp.; Escherichia spp.; Hafnia spp.; Klebsiella spp.; Proteus spp.; Providencia spp.;

Salmonela spp.; Serratia spp.; Shigella spp. e Yersinia spp.(HOLT et al., 1994).

Determinados microrganismos presentes em solo são importantes por sua

capacidade de solubilizar P (fósforo) no solo aumentando sua fertilidade. Os principais

solubilizadores de P (fósforo) da população fúngica são os gêneros Aspergillus e Penicillium

(SILVA FILHO et al., 2002). Enquanto que entre as bactérias destacan-se Pseudomonas,

Bacillus e Rhizobium que são bastante eficientes na solubilização de P (fósforo) no solo

(RODRIGUES e FRAGA, 1999).

4.4. Resistência a antimicrobianos

O uso indiscriminado de antimicrobianos nos tratamentos veterinários, agrícolas e

médicos é um dos fatores que levam ao desenvolvimento de microrganismos

multiresistentes. No contato entre os multirresistentes com cepas selvagens pode ocorrer a

transferência de resistência, gerando um processo de seleção de microrganismos.

Linhagens resistentes surgem por meio de pressão seletiva resultante do emprego clínico

humano e animal, industrial, comercial e experimental. Cepas resistentes podem chegar a

ambientes hospitalares onde encontram pacientes já debilitados e imunocomprometidos,

levando aos quadros de infecções hospitalares (GOÑI-URRIZA et al., 2000; ABBOTT,

1999; CAIERÃO et al., 2004).

Estudos demonstraram que, na maioria da vezes, a multirresistência está ligada a

fatores genéticos, e o principal fator é denominado de fator R, presente no plasmídeo,



estabelecendo a resistência por transferência plasmidial para bactérias, principalmente do

gênero das enterobactérias (LIMA et al. 1995).

4.5. Biorremediação

A biorremediação é um conjunto de técnicas que se fundamentam na aplicação de

organismos vivos (microrganismos) ou enzimas, para tratamento de ambientes

contaminados, diminuindo as concentrações dos poluentes a níveis indetectáveis, não

tóxicos ou aceitáveis (LITCHFIELD, 2005). A biorremediação está voltada para tratamento

e descontaminação de locais poluídos, pois possui bons resultados aplicados a solos,

sedimentos e águas. Os processos biológicos de biorremediação estão sendo empregados

por serem mais viáveis que os métodos químicos e físicos e por possuir grande eficácia e

ser um procedimento econômico (SINGH et al., 2006).

Pode ser classificada em “ex situ”, em que o material é retirado do local da

poluição para ser tratado, ou “in situ”, no qual o tratamento se dá no local onde ocorreu a

contaminação (BOOPATHY, 2000).

A biorremediação vem sendo estudada para degradação de diversos compostos

químicos. A biorremediação “in situ” de solo contaminado com resíduos de combustível

foi bem sucedida utilizando-se microrganismos autóctones, sendo observada uma

redução significativa nas taxas de diesel no solo e dos subprodutos da degradação desse

combustível (NAMKOOG et al. 2002). Na biorremediação de resíduos de hidrocarbonetos

em fundo de tanques de destilação de petróleo, foi utilizado um consórcio entre bactérias

e leveduras, que foi bem avaliado (GALLEGO et al., 2007). Na biorremediação de solo

contaminado com hidrocarbonetos por compostagem em biopilhas e bioestimulação da

microbiota autóctone, foi observada uma significativa redução na concentração desses

resíduos (JORGENSEN et al., 2000).

Moléculas orgânicas halogenadas são mais persistentes do que os resíduos de

hidrocarbonetos, por possuirem maior estabilidade química (JONG e FIELD, 1997). A

biorremediação por bioestimulação de microrganismos autóctones no solo obteve uma

significativa redução na concentração de clorobenzenos (GUERIN, 2008).

Os principais degradadores de pesticidas relatados, tem sido os microrganismos

do solo, principalmente bactérias e fungos. A temperatura, umidade e aeração do solo são

as principais condições do ambiente para o desenvolvimento microbiano e favorecem a

degradação de pesticidas (MONTEIRO, 2001) Os microrganismos possuem um papel



importante na degradação e transformação de agrodefensivos através de sua capacidade

biodegradativa (CASTILLO et al., 2006).

No desenvolvimento de uma técnica eficaz de biorremediação é necessário o

isolamento e caracterização de microrganismos específicos, com capacidade de

degradação de compostos químicos poluidores do meio ambiente em estudo. A influencia

da biorremediação é influenciada pela estrutura química do composto, concentração,

propriedade do contaminante e condições ambientais. A degradação do contaminante

pode ser de forma parcial ou total, tornando-o em um composto menos tóxico ou atóxico

(GIANFREDA e RAO, 2004).

Este trabalho busca o isolamento e caracterização de microrganismos resistentes

a agrodefensivos, visando sua utilização em técnicas de biorremediação de locais

contaminados.

5. RESULTADOS

5.1. Teste da atividade dos resíduos coletados

A atividade do resíduo coletado foi avaliada, observando-se a formação de halos de

inibição frente aos fungos testados (Figura 1).

Figura 1. Teste de atividade antifúngica do resíduo coletado.

Trichoderma asperellum crescimento após 24 horas (A1) e 96 horas (A2); Aspergillus

níger após 24 horas (B1) e 96 horas (B2); Colletrichum truncatum após 24 horas (C1) e 96

horas (C2) a 37ºC. Disco 1 – Agrodefensivo Opera® (controle positivo). Discos 2 e 3 – Mix

dos resíduos de agrodefensivos.

Os resultados da atividade fungicida do material coletado foram analisados

medindo-se o diâmetro do halo de inibição formado frente aos fungos testados. Os halos

de inibição apresentaram diâmetro entre 1,4 cm e 2,6 cm . Esses resultados evidenciam

que o mix de resíduos de agrodefensivos não apresenta atividade antagonista mesmo em

uma solução (mistura), demonstrando ainda atividade fungicida.



5.2. Isolamento dos microrganismos

Após inoculação do resíduo em meios de cultura Nutriente, YPD e Sabouraud foi possível

verificar o crescimento de 8 colônias macroscopicamente diferentes quanto à morfologia.

Uma seleção prévia foi realizada utilizando meios de cultura seletivos, MacConkey para

microrganismos Gram-negativos e Agar Manitol Salgado para microrganismos Gram-

positivos (ANVISA...,2010). Além disso foi realizada confirmação utilizando coloração de

Gram que confirmaram a existência de 4 microrganismos Gram-positivo e 4 Gram-

negativos. As colônias Gram-negativas foram nomeadas como A10, B12, C13 e D14 e

foram utilizadas nas etapas seguintes do trabalho.

5.3. Caracterização morfológica

A caracterização morfológica dos microrganismos Gram-negativos foi realizada através

da análise macroscópica e microscópica. A analise macroscópica foi efetuada seguindo os

parâmetros utilizados por FONSECA et al (2000). Sobre a massa molecular das estrias

mais densas foram observados a cor, muco e elasticidade e nas colônias isoladas foram

analisadas o tamanho, forma, borda, homogeneidade, transparência e elevação.

As colônias apresentaram coloração variando entre o creme e o branco. Houve

pouca produção de muco e pouca elasticidade. As colônias A10 e C13 apresentaram

tamanho entre 2 e 3 milímetros, a colônia B12 entre 1 e 2 milímetros e a D14 tamanho

superior a 3 milímetros. As colônias apresentaram-se circulares, bordas regulares,

homogêneas, opacas e com presença de elevação. A caracterização macroscópica sugere

que os microrganismos apresentam propriedades morfológicas diferentes.

A análise microscópica foi realizada utilizando-se o método de coloração de

Gram, que diferencia as bactérias em Gram-negativas e Gram-positivas pela composição

da parede celular (TORTORA, 2005). A microscopia óptica dos microrganismos A10, B12,

C13 e D14, evidenciou coloração variando de rosa escuro a avermelhada. As células

apresentaram forma cilíndricas, em forma de bastonete, podendo ser, então, definidas

como Bacilos Gram-negativos.

5.4. Caracterização bioquímica

No intuito de diferenciar os isolados A10, B12, C13 E D14, foram realizados testes

bioquímicos. Inicialmente foi realizado o crescimento em Ágar MacConkey (MAC), para

avaliar a capacidade do microrganismo em fermentar a lactose. Segundo BARTELT

(2000), a utilização da lactose é um importante teste na diferenciação das bactérias da



família Enterobacteriaceae. As amostras A10, B12, C13 e D14 apresentaram reação negativa

para o teste de fermentação da lactose, alterando a coloração do meio para uma

tonalidade amarelada. No teste de oxidase verifica-se a secreção de enzimas com

capacidade oxidante. Trata-se de um teste importante para distinguir grupos de bacilos

Gram-negativos fermentadores e não fermentadores e direcionar o sistema de

identificação. A coloração violeta caracteriza a prova da oxidase positiva enquanto que, a

ausência da atividade de oxidase não provoca alteração na cor da fita teste (MACFADIN,

1976).

Os resultados encontrados indicaram que todos os microrganismos isolados

(A10, B12, C13 e D14) não apresentaram atividade de oxidase, o que os caracterizam com

resultado negativo para o teste de Bacilos Gram-Negativos não fermentadores da glicose,

caracterizando-os como pertencentes à família das Enterobacteraceae.

No teste de fermentação da glicose em meio aeróbio e anaeróbio, ocorreu

crescimento nos dois tubos alterando a coloração do meio, onde o indicador de pH azul

de bromotimol, avaliou a capacidade de fermentação da glicose, que quando positiva

altera a cor do meio de verde para amarelo, em reações negativas o meio não sofre

alteração de cor, permanecendo verde e em reações onde não ocorre o crescimento do

microrganismo, o meio sofre uma leve alcalinização se tornando azul. Foi verificado

crescimento nos tubos sem a camada de óleo mineral, com presença de oxigênio e nos

tubos com a camada de óleo mineral, com baixas concentrações de oxigênio, o que

caracterizou os microrganismos A10, B12, C13 e D14, como fermentadores da glicose e

anaeróbios facultativos. O teste de motilidade foi avaliado, seguindo os padrões onde

bactérias imóveis só crescem no local da inoculação e nas bactérias móveis ocorre o

crescimento disperso no meio. No teste de motilidade foi verificada a capacidade do

microrganismo se mover em meio semi-sólido HL, o que o caracteriza como móvel.

Foram realizadas provas bioquímicas para caracterização, segundo estabelecido

no “Bergey’s Manual of Bacteriology”, que diferencia as enterobactérias pela sua

capacidade de metabolização e produção de enzimas (HOLT et al., 1994).

Os microrganismo selecionados foram submetidos à caracterização bioquímica

para diferenciação dos isolados utilizando kit comercial Bactray® I e II. Dentre todos os

testes realizados, apenas o teste para Citrato mostrou diferença de resultados (Tabela 1).

Os microrganismos A10 e B12 apresentaram resultados negativos para o citrato,

enquanto que os C13 e D14 apresentaram resultados positivos. O teste para citrato avalia

a capacidade da bactéria em utilizar citrato como única fonte de carbono e energia. A

presença de duas enzimas, a citrato permease e a citrase, são responsáveis pelo transporte



do Citrato para o interior da célula do microrganismo e pela conversão do Citrato de

sódio em acetato, ácido oxaloacético e posteriormente em ácido pirúvico e CO2. A leitura

do resultado é feita pela alteração de cor provocada pela mudança de pH, quando o

metabolizado, resulta num produto alcalino de coloração azul ou azul esverdeado o teste

apresenta resultado positivo e a coloração verde apresenta resultado negativo (QUINN et

al., 2005).

Tabela 1. Testes Bioquímicos, utilizando kit comercial Bactray® I e II.

Testes A10 B12 C13 D14

ONPG- hidrólise da b-galactosidase + + + +

ADH – Arginina dehidrolase - - - -

LDC – Lisina descarboxilase + + + +

ODC – Ornitina descarboxilase + + + +

H2S – Sulfeto de hidrogênio - - - -

URE – Urease + + + +

VP – Degradação da glicose - - - -

PD – Desaminação da Fenilalanina - - - -

IND – Triptofanase produção Indol - - - -

CIT – Utilização do Citrato - - + +

MAL – Utilização do Malonato - - - -

RHA – Utilização de Rhamnose + + + +

ADO – Utilização de Adonitol - - - -

SAL – Utilização de Salicina + + + +

ARA – Utilização de Arabinose + + + +

INO – Utilização de Inositol - - - -

SOR – Utilização de Sorbitol - - - -

SAC – Utilização de Sacarose + + + +

MAN – Utilização de Manitol + + + +

RAF – Utilização de Rafinose + + + +

Os métodos bioquímicos de identificação usando o kit comercial Bactray® foram

analisados em sistema Bactray (versão 2.1), que identifica o microrganismo através da

geração de código de sete digitos para o Bactray® I e II, que caracteriza a probabilidade de

identificação do microrganismo pelo resultado das provas bioquímicas. Para os

microrganismos citrato negativo a leitura dos resultados forneceu o código 5504643, o que

reporta um índice de 33,49% com Hafnia alvei; 24,98% com Escherichia coli; 24,34% com

Serratia liquefaciens e 7,19% para Klebsiella azaenae. Para os microrganismos citrato positivo,

a leitura dos resultados forneceu o código 5505643, o que reporta um índice de 95% com



Serratia liquefaciens; 87,14% com Serratia fonticola; 8,34% com Serratia odorifera; 3,20% com

Klebsiella ozaenae e 2,26% para Serratia marcescens.

As enterobactérias estão presente no meio ambiente (solo, água, plantas) e são

patógenos oportunistas para humanos. O gênero Serratia compreende as espécies S.

marcescens, S. liquefaciens, S. plymuthica, S. rubidacea, S. odorifera, S. ficaria, entre

outras (HOLT et al., 1994).

Os resultados sugerem que os microrganismos A10 e B12 se comportam

bioquimicamente diferente dos microrganismos C13 e D14, referente ao teste do Citrato e

apenas o microrganismo B12 tem a capacidade de fermentar lactose.

5.5. Teste de sensibilidade a antimicrobianos

Os microrganismos apresentaram alta sensibilidade aos antibióticos dos principais

grupos, utilizados no teste para determinação da concentração bactericida mínima

inibitória (MBC – Minimal Bactericidal Concentration) (FALKINER, 1988).

Como pode ser observado na Tabela 2, todos os isolados foram sensíveis aos

vários antibióticos testados. Esse resultado sugere que os microrganismos A10, B12, C13 e

D14 são altamente sensíveis a todos os antimicrobianos testados, refletindo que os

isolados não tiveram um contato direto com tais drogas, sugerindo que os mesmos sejam

cepas selvagens. O surgimento de uma resistência aos antimicrobianos pode ocorrer por

contato direto ou mecanismos de mutação genética e alterações bioquímicas após a

exposição desses microrganismos a essas drogas (SILVA, 2006).



Tabela 2. Teste de Sensibilidade de Disco Difusão em Ágar. R: resistente ao antimicrobiano; S: sensível ao antimicrobiano.

Antimicrobianos Concentração A10 B12 C13 D14

Amicacina 30µg S S S S

Amoxilina 10µg S S S S

Amoxilina/Ac. Clavulônico 20µg/10µg S S S S

Cefalexina 30µg S S S S

Cefalotina 30µg S S S S

Cefepima 30µg S S S S

Cefoxetina 30µg S S S S

Ciprofloxacina 5µg S S S S

Cotrimoxazol 25µg S S S S

Gentamicina 10µg S S S S

Norfloxacina 10µg S S S S

Ofloxacina 5µg S S S S

Tetraciclina 30µg S S S S

Tobramicina 10µg S S S S

5.6. Teste de resistência dos microrganismos aos resíduos de agrodefensivos

Os resultados para os testes de resistência aos resíduos de agrodefensivos evidenciaram

que não houve a formação de halos de inibição em nenhum dos discos. Tais resultados

demonstram que os microrganismos A10, B12, C13 e D14 são resistentes a esses resíduos

podendo até mesmo degradar esses compostos.

5.7. Teste de resistência dos microrganismos a diferentes classes de agrodefensivos

Foram aplicados 3 discos na superfície da placa inoculada com os microrganismos, sendo

o disco 1 o fungicida PRIORI XTRA, o disco 2 o fungicida SYSTANE EC e o disco 3 o

fungicida ANTRACOL 700 PM. Não houve a formação de halos de inibição em nenhum

dos discos o que mostra que os microrganismos A10, B12, C13 e D14, possuem resistência

e a capacidade de sobreviver na presença desses resíduos ou mesmo a capacidade de

realizar a degradação desses compostos.

Vários estudos vêm sendo realizados para utilização das técnicas de

biorremediação, e dados da literatura descreveram técnicas de biorremediação para óleo

diesel no solo, resíduos de hidrocarbonetos de tanques de petróleo, hidrocarbonetos e

resíduos de clorobenzeno no solo entre outros compostos químicos, em que os principais

microrganismos envolvidos nesses processos foram bactérias e fungos presentes nos solos



e águas contaminadas (NAMKOOG et al., 2002; GALLEGO et al., 2007; JORGENSEN et

al., 2000; GUERIN, 2008).

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os testes realizados mostraram que os microrganismos A10, B12, C13 e D14, são

resistentes aos resíduos presentes em recipientes de agrodefensivos. Os isolados foram

caracterizados morfologicamente como bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos.

Os microrganismos gram-negativos, não foram capazes de fermentar a lactose, em um

período de até 24 horas de encubação. O teste de oxidase evidenciou que os isolados

apresentam a capacidade de fermentar glicose, o que sugere que pertencam à família das

Enterobactereaceae, que estão presentes no ambiente e possuem uma boa adaptabilidade

e resistência. As cepas A10 e B12 apresentaram comportamento bioquímico diferente das

C13 e D14 para o teste de Citrato, sugerindo que possam ser microrganismos distintos.

Os microrganismos foram sensíveis a todas as classes de antibióticos testados, o

que os leva a serem caracterizados como cepas selvagens, que não adquiriram

mecanismos de resistência a antimicrobianos.

Os microrganismos selecionados foram resistentes a diferentes classes químicas

de agrodefensivos de amplo espectro, o que nos sugere que esses microrganismos possam

ser utilizados em técnicas de biorremediação de ambientes contaminados.

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