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PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS E FUNCIONAIS DE UMA PROTEÍNA LIGANTE À QUITINA PURIFICADA DE SEMENTES DE Moringa oleifera

LAMARCK

JULIANA MENEZES GIFONI

FORTALEZA-CEARÁ

2009

ii

PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS E FUNCIONAIS DE UMA PROTEÍNA LIGANTE À QUITINA PURIFICADA DE SEMENTES DE Moringa oleifera

LAMARCK

JULIANA MENEZES GIFONI

TESE SUBMETIDA À COORDENAÇÃO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA, COMO REQUISITO PARCIAL PARA

OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM BIOQUÍMICA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FORTALEZA-CE

DEZEMBRO - 2009

iii

Esta tese foi apresentada como parte dos requisitos necessários à

obtenção do grau de Doutor em Bioquímica, outorgado pela Universidade

Federal do Ceará, e encontra-se à disposição dos interessados na Biblioteca

de Ciências e Tecnologia da referida Universidade.

A citação de qualquer trecho desta tese é permitida, desde que seja feita

de acordo com as normas da ética científica.

Juliana Menezes Gifoni

TESE APROVADA EM:

Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira

Universidade Federal do Ceará Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular

Dra. Ana de Fátima F. U. de Carvalho

Universidade Federal do Ceará Depto. de Biologia

Dra. Ana Cristina de O. Monteiro Moreira

Universidade de Fortaleza Centro de Ciências da Saúde

Dra. Valdirene Moreira Gomes

Universidade Estadual do Norte Fluminense

Centro de Biociências e Biotecnologia

Dra. Ilka Maria Vasconcelos

Orientadora

Universidade Federal do Ceará Depto. de Bioquímica e Biologia Molecular

iv

DEDICATÓRIA

A Deus;

Aos meus Pais;

Aos meus Irmãos;

Aos meus grandes amores Gontran, Júlia e Gontran Luís,

Dedico, com amor e gratidão.

v

AGRADECIMENTOS

À Dra. Ilka Maria Vasconcelos, pela orientação e ensinamentos, pelas

observações valiosas e, principalmente, pela paciência e confiança

depositadas e pela amizade que cresceu. Agradeço, de coração, por tudo.

Ao Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira, por sua contribuição para a

realização deste trabalho, por meio de sugestões e explicações; pela

dedicação ao ensinar o manuseio dos aparelhos e o entusiasmo ao discutir os

resultados.

À Dra. Ana de Fátima F. U de Carvalho, por disponibilizar seu

laboratório para alguns experimentos e por participar da comissão examinadora

desta tese.

À Dra. Ana Cristina de O. Monteiro Moreira, pela disponibilidade em

participar da comissão examinadora desta tese.

À Dra. Valdirene Moreira Gomes, pela colaboração com nosso

laboratório e pela contribuição através da participação da comissão

examinadora desta tese.

A todos os professores deste Departamento que, de alguma forma,

colaboraram para a realização deste trabalho: seja na disponibilização de seus

laboratótios, no empréstimo de reagentes e equipamentos ou nos

conhecimentos transmitidos durante as aulas.

À Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e

Biologia Molecular, na pessoa da Dra. Norma Maria Barros Benevides.

A todos os funcionários do Departamento.

À Dra. Maria Fátima Grossi de Sá, pela acolhida em seu laboratório na

Embrapa CENARGEN, Brasília, quando não mediu esforços, providenciando

tudo possível para o andamento dos experimentos.

Aos amigos do Laboratório de Toxinas Vegetais: Andréa, Dani,

Henrique, Handerson, Adelina, Daniel, Hellen, Raque l, Mirella,

Hermógenes, Janne e, em especial, à minha amiga Geórgia , que sempre me

ajudou e apoiou em tudo.

vi

Aos demais colegas do Departamento, com destaque especial para

aqueles que sempre se dispuseram a me ajudar, disponibilizando material e

conhecimento: Hélio, Darcy, Fredy, Cristina, Luana, Ariévilo, Éri ka, Thiago,

Camila e Davi.

À minha família : meus pais , por todo o amor, carinho, confiança e

dedicação que resultaram numa sólida formação humana, religiosa e científica,

que levarei comigo para sempre; meus irmãos , tão importantes para mim, pelo

amor, amizade, compreensão e convivência nos momentos de alegria e

dificuldade; meu esposo amado, Gontran , minha força, meu exemplo, meu

estímulo, minha alegria: o grande incentivador desta minha caminhada

científica; aos frutos de nosso amor, que vieram durante esse doutorado, para

encher nossas vidas de felicidade plena: Júlia e Gontran Luís. Amo vocês!

A Deus , por tudo que tenho e tudo que sou.

MUITO OBRIGADA!

vii

Este trabalho foi realizado graças ao auxílio dos seguintes Órgãos Institucionais:

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela concessão da bolsa de Doutorado à autora deste trabalho e

pelo auxílio à pesquisa através do projeto: “Proteínas de Sementes: Aspectos

Moleculares, Funcionais e Potencial Biotecnológico” (N° do Processo: 0015/01-

6 PROCAD/CAPES).

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e T ecnológico

(CNPq), por concessão de auxílio à pesquisa através dos projetos: 1) Moringa

oleifera: Uma fonte alternativa de proteínas como aditivo em ração em

substituição ao milho e/ou soja no setor produtivo avícola (N° do Processo:

503426/2003-2 CT-Agronegócio/MCT/CNPq/MESA 01/2003); 2) Recuperação

e Otimização da Infra-Estrutura do Laboratório de Toxinas Vegetais (N° do

Processo: 412497/2003-4 CNPq); 3) Bioquímica, Biologia Molecular e

Fisiologia de Plantas (N° do Processo: 620231/2004- 1 MCT/CNPq/PADCT) e

4) Proteínas Envolvidas nos Mecanismos de Defesa das Plantas Contra

Herbívoros e Fitopatógenos (N° do Processo: 301060/ 1995-9 CNPq).

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular , do Centro de

Ciências da Universidade Federal do Ceará, em cujos laboratórios foi realizada

esta pesquisa.

viii

SUMÁRIO

Página

LISTA DE FIGURAS xiii

LISTA DE TABELAS xvi

ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES xvii

RESUMO xviii

ABSTRACT xix

1 - INTRODUÇÃO 1

2 - FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 5

2.1 - Moringa oleifera Lamarck 6

2.1.1 - Considerações Gerais 6

2.1.2 - Relação Filotaxonômica 7

2.1.3 - Descrição Morfológica 7

2.1.4 - Aspectos Culturais e Sócio-Econômicos 8

2.1.5 - Aspectos Bioquímicos e Farmacológicos 11

2.1.6 - Aspectos Nutricionais 14

2.2 - Fungos Fitopatogênicos 16

2.3 - Proteínas Vegetais de Defesa 19

2.3.1 - Proteínas Ligantes à Quitina 20

3 - OBJETIVOS 27

4 - MATERIAIS 29

5 - MÉTODOS 32

ix

5.1 - Preparação da Farinha de Sementes de Moringa oleifera 33

5.1.1 - Obtenção da Farinha 33

5.1.2 - Delipidação da Farinha 33

5.2 - Purificação das Proteínas Ligantes à Quitina de M. oleifera 33

5.2.1 - Extração de Proteínas 33

5.2.2 - Obtenção das Frações Albumina e Globulina 35

5.2.3 - Concentração da Fração Albumina 35

5.2.4 - Cromatografia de Afinidade em Coluna de Quitina 35

5.2.5 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna Resource S acoplada a um

Sistema de FPLC 36

5.2.6 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de CM-Celulose 36

5.2.7 - Cromatografia de Exclusão Molecular em Coluna de Sephadex G-50 38

5.2.8 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna de Fenil-Sepharose 38

5.2.9 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C-18 acoplada

a HPLC 38

5.2.10 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C2-18 acoplada

a HPLC 39

5.2.11 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna Resource S Acoplada a um

Sistema de FPLC 39

5.3 - Caracterização Bioquímica de Mo-CBP3 40

5.3.1 - Determinação de Proteínas 40

5.3.2 - Determinação da Massa Molecular por Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida 40

x

5.3.3 - Determinação da Massa Molecular por Cromatografia de Exclusão

Molecular 42

5.3.4 - Determinação do Ponto Isoelétrico (pI) de Mo-CBP3 43

5.3.5 - Avaliação da Mo-CBP3 em Eletroforese sob Condições Nativas 44

5.3.6 - Detecção de Glicoproteína em Gel 44

5.3.7 - Determinação de Carboidratos 45

5.3.8 - Determinação da Sequência NH2-terminal de aminoácidos 45

5.3.9 - Determinação da Atividade Hemaglutinante 46

5.3.10 - Determinação da Atividade de Quitinase (CH; EC 3.2.1.14) 47

5.3.11 - Determinação da Atividade de β-1,3-glucanase (GLU E.C. 3.2.1.6) 48

5.3.12 - Determinação da Atividade Coagulante 48

5.4 - Ensaios Biológicos 49

5.4.1 - Avaliação da Atividade Antifúngica 49

Cultivo dos Fungos 49

Obtenção dos Esporos 50

Ensaio de Inibição da Germinação dos esporos de Fusarium solani 50

Ensaio de Inibição do Crescimento Micelial 51

5.4.2 - Estudos do Mecanismo de Ação 52

Determinação da Natureza da Ação Antifúngica: Atividade Fungicida

x Fungistática 52

Ensaio de Inibição da germinação de esporos e do crescimento do

Oomiceto Pythium oligandrum 53

Ensaio de Inibição da Acidificação do Meio, Induzida por Glicose 53

xi

6 - RESULTADOS 55

6.1 - Purificação da Proteína Ligante à Quitina Mo-CBP3 56

6.2 - Caracterização Bioquímica de Mo-CBP3 58

6.2.1 - Massa Molecular de Mo-CBP3 por Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida na Presença de SDS 58

6.2.2 - Massa Molecular de Mo-CBP3 por Cromatografia de Exclusão

Molecular 62

6.2.3 - Ponto Isoelétrico (pI) de Mo-CBP3 62

6.2.4 - Comportamento de Mo-CBP3 em Eletroforese Nativa 62

6.2.5 - Presença de Carboidratos Covalentemente Ligados a Mo-CBP3 62

6.2.6 - Sequência NH2-terminal de Mo-CBP3 66

6.2.7 - Atividade Hemaglutinante 66

6.2.8 - Atividade de Quitinase (CH; EC 3.2.1.14) 66

6.2.9 - Atividade de β-1,3-glucanase (GLU E.C. 3.2.1.6) 69

6.2.10 - Atividade Coagulante 69

6.3 - Ensaios Biológicos 69

6.3.1 - Atividade Antifúngica 69

Inibição da Germinação dos esporos de Fusarium solani 71

Inibição do Crescimento Micelial 71

6.3.2 - Estudos do Mecanismo de Ação 75

Natureza da Ação Antifúngica: Atividade Fungicida x Fungistática 75

Efeito Inibitório de Mo-CBP3 sobre a Germinação de Esporos e o

Crescimento do Oomiceto Pythium oligandrum 75

Inibição da Acidificação do Meio, Induzida por Glicose 78

xii

7 - DISCUSSÃO 81

8 - CONCLUSÃO 96

ANEXO I 98

9 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 104

xiii

LISTA DE FIGURAS

Página

1 - Árvore da Moringa oleifera Lamarck. 9

2 - Esquema de obtenção do extrato total das proteínas das sementes

de M. oleifera. 34

3 - Esquema geral de purificação das proteínas ligantes à quitina (PNAG

e PAC) a partir do extrato total. 37

4 - Esquema da purificação de Mo-CBP3 a partir da fração protéica

Retida em matriz de quitina e eluída com N-acetil-D-glucosamina

0,1 M (PNAG). 41

5 - Cromatografia de afinidade em coluna de quitina. 57

6 - Cromatografia de troca iônica em coluna Resource S, acoplada a

um sistema de FPLC. 59

7 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) sob condições

desnaturantes (PAGE-SDS), na ausência e presença de

β-mercaptoetanol. 61

8 - Cálculo da massa molecular de Mo-CBP3 por cromatografia de

exclusão molecular em coluna Superose 12 HR 10/30, acoplada a

um sistema de FPLC. 63

9 - Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (15%) de

Mo-CBP3. 64

10 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) para proteínas

xiv

básicas, sob condições nativas. 65

11 - Eletroforese de Mo-CBP3 em gel de poliacrilamida (15%) na

presença de SDS. 67

12 - Atividade de coagulação de matéria em suspensão de Mo-CBP3. 70

13 - Fotomicrografia do ensaio de inibição da germinação dos

esporos de Fusarium solani. 72

14 - Avaliação do efeito de Mo-CBP3 sobre o crescimento de hifas

jovens de Fusarium solani. 73

15 - Avaliação do efeito inibitório de Mo-CBP3 sobre o crescimento

das hifas jovens de Fusarium solani. 74

16 - Avaliação da atividade fungicida x fungistática de Mo-CBP3

sobre a germinação dos esporos de sobre os esporos de Fusarium

solani 76

17 - Avaliação da recuperação da capacidade de germinação dos

esporos de Fusarium solani quando retirados da presença de

Mo-CBP3. 77

18 - Efeito de Mo-CBP3 sobre a germinação dos esporos dePythium

oligandrum. 79

19 - Alteração no pH do meio induzida por glucose 0,5 M sobre esporos

de Fusarium solani na presença da proteína Mo-CBP3. 80

20 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de DEAE-Celulose. 98

21 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de CM-Celulose. 99

22 - Cromatografia de Exclusão Molecular em Coluna de Sephadex G-50. 100

xv

23 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna de Fenil-

Sepharose. 101

24 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C-18

acoplada a HPLC. 102

25 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C2-18

acoplada a HPLC. 103

xvi

LISTA DE TABELAS

Página

1 - Composição química de sementes de Moringa oleifera. 17

2 - Famílias de Proteínas Relacionadas à Patogênese (PR-Proteínas). 21

3 - Teores protéicos das diferentes frações resultantes do processo

de obtenção de Mo-CBP3. 60

4 - Alinhamento da seqüência NH2-terminal de Mo-CBP3 com outras

proteínas vegetais apresentando seqüências similares. 68

xvii

ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES

Ac-AMP Peptídeos Antimicrobianos de Amaranthus caudatus

BSA Albumina Sérica Bovina

DMAB p-dimetilaminobenzaldeído

Ee-CBP Euonymus europaeus “Chitin Binding Peptide”

FPLC “Fast Protein Liquid Chromatography”

GAFP Peptídeo Antifúngico de Gingko biloba

GlcNac N-acetil-D-glucosamina

HEMOCE Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará

HM30 Proteína de Hydrangea macrophylla com massa molecular

de 30 kDa

HPLC “High Performance Liquid Chromatography”

Mo-CBP Moringa oleifera “Chitin Binding Protein”

NAG N-acetil-D-glucosamina

NKat Nanokatal: 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por

segundo

PAGE-SDS Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

PAS Ácido Periódico de Schiff

PDA “Potato-Dextrose Agar“

Pn-AMP Peptídeos Antimicrobianos de Pharbitis nil

PR-proteína Proteína relacionada à patogênese

PTH-aminoácidos Derivados feniltioidantoína-aminoácidos

PVDF Difluoreto polivinilideno

RIPs Proteínas Inativadoras de Ribossomos

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilenodiamina

Tris 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol

UDA Lectina de Urtica dioica

USDA “United States Department of Agriculture”

WGA Lectina de Triticum vulgaris

xviii

RESUMO

Moringa oleifera Lam. é uma planta originária do Noroeste da Índia, bem

adaptada às regiões tropicais. De suas sementes foi isolada uma nova proteína ligante

à quitina, a Mo-CBP3, com propriedades coagulantes e atividade antifúngica contra o

fitopatógeno Fusarium solani. As proteínas foram extraídas da farinha delipidada de

sementes com o tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M. O teor médio

de proteína da farinha correspondeu a 216,44 mgP/gF. O extrato total foi fracionado

em albuminas e globulinas por diálise contra água seguida de centrifugação. As

albuminas foram concentradas com sulfato de amônio a 90% de saturação. A F0-90%

foi submetida à cromatografia de afinidade em coluna de quitina, previamente

equilibrada com o tampão de extração. Foram obtidos um pico não retido e dois picos

retidos, correspondentes às proteínas ligantes à quitina (CBP). O primeiro destes foi

eluído com solução de N-acetil-D-glucosamina 0,1 M (PNAG), e o segundo, com ácido

acético 0,05 M, pH 3,0 (PAC). PNAG foi aplicado em coluna de troca catiônica, Resource

S, acoplada a um sistema de FPLC, equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M,

pH 5,2. Dos picos obtidos, o terceiro correspondeu à proteína Mo-CBP3 - eluída com

0,5 M de NaCl no tampão de equilíbrio. O teor protéico médio calculado para a

proteína purificada Mo-CBP3 foi de 1,17 mgP/gF, representando um rendimento final

de 0,54% das proteínas do extrato total. A massa molecular aparente por SDS-PAGE

foi de 18,0 kDa sem o agente redutor e, de 9,0 kDa, na presença deste. O resultado

sugere que Mo-CBP3 seja uma proteína dimérica formada de subunidades idênticas,

unidas por pontes dissulfeto. A massa molecular de Mo-CBP3, por cromatografia de

exclusão molecular, foi de 14,34 kDa, e o pI de 10,8. Trata-se de uma glicoproteína

com 2,5% de carboidratos, que não apresenta atividade hemaglutinante ou quitinásica.

Sua seqüência NH2-Terminal obtida foi CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, com 22

aminoácidos, confirmando sua característica básica. Mo-CBP3 mostrou-se tão eficiente

quanto o AlK(SO4)2 na capacidade de coagular matéria em suspensão na água. Mo-

CBP3 foi fungicida para esporos de Fusarium solani a 0,1 mg/mL. O aquecimento da

proteína a 98 °C, por 1 h, e a pré-incubação com o açúcar N-acetil-D-glucosamina,

não reverteram sua ação. Mo-CBP3 mostrou-se capaz de retardar o crescimento

micelial do fungo ainda na menor dose testada, 0,05 mg/mL. Mo-CBP3 é inativa contra

o oomiceto Pythium oligandrum, que apresenta celulose no lugar da quitina na parede

celular. A proteína foi, ainda, capaz de inibir cerca de 80% da acidificação do meio, por

esporos de F. solani, induzida por glicose, o que sugere a influência de Mo-CBP3

sobre as bombas de prótons (H+ATPases) presentes na membrana celular dos

esporos deste fungo.

xix

ABSTRACT

Moringa oleifera Lam. is native from Northwest India, well adapted to tropical

regions. From its seeds it was isolated a new chitin binding protein, Mo-CBP3, which

has coagulant properties and antifungal activity against the phytopathogen Fusarium

solani. Proteins were extracted from defatted seeds flour by 0.05 M Tris-HCl buffer, pH

8.0, containing 0.15 M NaCl. The average protein content of the flour was 216.44

mgP/gF. The crude extract was fractionated in albumins and globulins by dialysis and

centrifugation. Albumins were concentrated by 90% ammonium sulfate saturation. This

fraction was applied into a chitin column, previously equilibrated with the same buffer.

An unadsorbed and two adsorbed peaks were obtained. The first adsorbed peak was

eluted with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine (PNAG), and the second one, with 0.05 M

acetic acid, pH 3.0 (PAC). PNAG was applied into a cation exchange column, Resource

S, equilibrated with 0.05 M sodium acetate buffer, pH 5.2. The third peak corresponded

to Mo-CBP3 – eluted with 0.5 M NaCl in equilibrium buffer. The protein content of Mo-

CBP3 was 1.17 mgP/gF. It represents a final yield of 0.54% of crude extract proteins.

Apparent molecular mass by SDS-PAGE was 18.0 kDa in the absence of β-ME, and

9.0 kDa, in its presence. Results suggest that Mo-CBP3 is a dimeric protein, made of

identical subunits, linked by disulfide bonds. By molecular exclusion chromatography,

calculated molecular mass was 14.34 kDa, pI 10.8. Mo-CBP3 is a glycoprotein with

2.5% of carbohydrates, which has not hemagglutinating or chitinase activities. Its NH2-

terminal sequence was CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, with 22 amino acids,

conffirming its basic character. Mo-CBP3 was as efficient as AlK(SO4)2 in the capacity

of coagulating suspended material in water. Mo-CBP3 (0.1 mg/mL) was fungicide to

Fusarium solani spores. Heat treatment of the protein at 98 °C, du ring 1 h, and pre

incubation with N-acetyl-D-glucosamine, did not reverse its action. Mo-CBP3 was able

to retard the mycelial growth of the fungus even at the lowest tested dose of 0.05

mg/mL. Mo-CBP3 was inactive against the oomycete Pythium oligandrum, which has

cellulose in spite of chitin in cell wall. Protein was also able to inhibit about 80% of

medium acidification, induced by glucose, by F. solani spores, that suggests the

influence of Mo-CBP3 over the proton pumps (H+ATPases) present in cellular

membranes of F. solani spores.

Propriedades Bioquímicas... Gifoni, J. M.

1

11.. IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO


2

Um terço de toda a produção agrícola mundial é perdido, a cada ano, devido

ao ataque de pestes e doenças (BAJWA et al., 2003; CHAPAGAIN et al., 2007).

Bilhões de dólares são gastos anualmente na agricultura mundial com manejo e

controle químico de insetos-praga e fungos fitopatogênicos. No entanto, apenas

cerca de 7% dos prejuízos são reduzidos pela ação do controle químico, o qual,

além de se mostrar pouco eficiente, vem causando profundo impacto ambiental e

desequilíbrios ecológicos. A despeito do surgimento contínuo de novos fungicidas,

estima-se que as perdas causadas por fungos fitopatogênicos, no mundo todo,

chegam a 12% do potencial de produção de grãos (LEE et al., 2003). As perdas

podem ocorrer no campo e após a colheita, no transporte, industrialização e

armazenamento. Essas perdas agravam a demanda cada vez maior de alimentos,

necessários para o suprimento mínimo da população mundial, que cresce

geometricamente. Especialmente o fungo filamentoso Fusarium solani causa graves

prejuízos na agricultura, danificando várias espécies de plantas de interesse

econômico no Brasil. Bergamin e colaboradores (1995) atribuem a este fungo a

podridão vermelha da raiz que acomete culturas importantes, como feijão, soja,

ervilha, batata, maracujá e pimenta-do-reino. Esta doença resulta no aparecimento

de murcha na parte aérea da planta infectada, tornando-a inviável.

Uma estratégia promissora para driblar a enorme capacidade de adaptação

dos predadores é a produção de plantas transgênicas expressando proteínas que

lhes conferem resistência; a potencialização dos sistemas defensivos endógenos

das plantas quer seja através da manipulação da expressão de suas próprias

proteínas de defesa, ou daquelas obtidas de vegetais taxonomicamente próximos.

Porém, para que isso seja viável, é fundamental o conhecimento prévio detalhado

sobre as propriedades moleculares, estruturais, biológicas e fisiológicas das

proteínas envolvidas nos sistemas de defesa vegetal.

Dentre as muitas proteínas supostamente envolvidas na proteção das plantas

encontram-se as proteínas ligantes à quitina, as quais merecem um destaque

especial, pois a quitina é o segundo polímero mais abundante na natureza, ficando

atrás apenas da celulose (AUNPAD e PANBANGRED, 2003). Trata-se de um


3

biopolímero insolúvel, linear, composto por subunidades de N-acetil-D-glucosamina

unidas por ligações β-(1,4) (RAIKHEL e LEE, 1993). Juntamente com β-1,3-

glucanos, a quitina é o principal constituinte da parede celular de fungos,

fitopatogênicos ou não, estando também presente no exoesqueleto e membrana

peritrófica de insetos e na cutícula de nematóides (ZEKINS e SCHREMPF, 1995;

ASENSIO et al., 2000). A quitina existe, ainda, como polímero extracelular de

algumas bactérias (KUPIEC e CHET, 1998).

Algumas dessas proteínas envolvidas na defesa de plantas contra

fitopatógenos e herbívoros são capazes de afetar negativamente o crescimento de

tais organismos através da degradação da quitina (agindo como quitinases), ou

mesmo por sua interação como proteínas ligantes, acarretando perda das

propriedades estruturais e funcionais da quitina neles presentes (WANG e

GRANADOS, 2000; ZAREIE et al., 2002).

Moringa oleifera L., uma espécie pertencente à família Moringaceae,

originária do noroeste da Índia, parece apresentar um importante arsenal protéico de

defesa contra predadores, uma vez que é bastante resistente a doenças, sendo

afetada por poucas espécies de insetos (RAMACHANDRAN et al., 1980) e capaz de

inibir o crescimento de várias espécies de bactérias e fungos (NWOSU e OKAFOR,

1995). Gomes (2002) verificou a presença de proteínas ligantes à quitina em

extratos aquosos de sementes de moringa e Gifoni (2005) observou que frações

contendo tais proteínas foram capazes de inibir a germinação de esporos de cinco

espécies de fungos fitopatogênicos: Aspergillus niger, Colletotrichum

lindemuthianum, C. gloeosporioides, Fusarium solani e Rhizoctonia solani, bem

como de retardar o tempo médio de desenvolvimento do inseto Callosobruchus

maculatus.

Em conseqüência destas várias propriedades de interesse biotecnológico,

muitas tentativas foram realizadas no intuito de caracterizar essas frações bioativas.

No entanto, a complexidade do material e a conseqüente irreprodutibilidade dos

resultados impossibilitaram sua caracterização à época. Tais fatos nos levaram a

crer que, ao contrário dos resultados obtidos por eletroforese, o material em estudo


4

não era puro o suficiente para permitir sua caracterização. Logo, surgiram os

questionamentos:

1) Quão heterogênea é a fração composta por proteínas ligantes à quitina em questão;

2) É possível a purificação de uma proteína específica responsável pela atividade

antifúngica desta fração;

3) Caso seja possível sua purificação, sua caracterização bioquímica possibilitará a

compreensão do seu mecanismo de ação antifúngica?

Com base nestes questionamentos, foram formuladas as seguintes hipóteses

de trabalho:

1) “As proteínas ligantes à quitina, presentes em s ementes de M. oleifera ,

representam um grupo de proteínas distintas entre s i, com propriedades

específicas, responsáveis pela alta resistência da planta a fitopatógenos, em

particular, fungos”.

2) “É possível a purificação de, pelo menos, um des tes componentes protéicos

responsáveis pela atividade antifúngica e este poss ui características

específicas que corroboram com tal propriedade”.

Para testar tais hipóteses, foi realizado um estudo bioquímico de purificação,

isolamento e caracterização de uma proteína ligante à quitina, proveniente das

sementes de moringa, mostrado detalhadamente a seguir.


5

22.. FFUUDDAAMMEENNTTAAÇÇÃÃOO TTEEÓÓRRIICCAA


6

2.1 - Moringa oleifera Lamarck

2.1.1 - Considerações Gerais

Moringa oleifera Lamarck (sinônimo: Moringa pterygosperma Gaertner) é

uma planta originária do Noroeste da Índia, da região do sub-Himalaia

(RAMACHANDRAN et al., 1980; JAHN et al., 1986; MAKKAR e BECKER,

1997; BEN SALEM e MAKKAR, 2009). De lá se difundiu pelo mundo por ser

bem adaptada às regiões tropicais (JAHN, 1989; CÁCERES et al., 1991;

BHUPTAWAT et al., 2007), sendo hoje encontrada em países da África, como

Egito e Nigéria, da Ásia, como Afeganistão, Filipinas, Jamaica, Malásia,

Paquistão, Singapura e Tailândia, bem como das Américas do Norte, Central e

do Sul (RAMACHANDRAN et al., 1980; MAKKAR e BECKER, 1997; ANWAR e

BHANGER, 2003; BEZERRA et al., 2004; BHATTI et al., 2007). No Brasil, onde

foi introduzida por volta dos anos 1950, é encontrada na região Nordeste,

principalmente nos estados do Maranhão, Piauí e Ceará.

Moringa oleifera é uma espécie perene pertencente à família

Moringaceae, a qual engloba quatorze espécies em apenas um gênero:

Moringa (JAHN et al., 1986; RASHID et al., 2008). Esta família de plantas é

bastante conhecida e estudada, particularmente pelo fato de sementes de

algumas de suas espécies apresentarem propriedades floculantes ou

coagulantes, sendo utilizadas em diversos países como um método natural,

eficiente e econômico de purificação de água (GASSENSCHMIDT et al., 1995;

OKUDA et al., 2001a; KATAYON et al., 2006). Dentre as espécies do gênero

Moringa, sobressai-se a M. oleifera, devido à sua utilização na alimentação

(frutos, folhas, flores, raízes e sementes comestíveis), na indústria e na

medicina, à sua propriedade coagulante, além de sua resistência a pragas e

doenças, facilidade de cultivo e rapidez no crescimento (RAMACHANDRAN et

al., 1980; CÁCERES et al., 1991; MAKKAR e BECKER, 1997; OLIVEIRA et al.,

1999; ANWAR e BHANGER, 2003; SIDDHURAJU e BECKER, 2003;

BEZERRA et al., 2004; BHATTI et al., 2007; BHUPTAWAT et al., 2007). Além


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disso, M. oleifera é a mais disseminada das espécies de seu gênero, pois se

desenvolve plenamente ainda que em solos pobres e com baixa umidade, bem

como em áreas isoladas de montanhas a 1200 m de altitude (JAHN, 1991;

SUTHERLAND et al., 1994; NDABIGENGESERE et al., 1995). Por tudo isso,

esta planta é, certamente, uma das mais úteis do mundo para o homem, tanto

que é conhecida como “a planta multifuncional” ou, em inglês, “the

multipurpose tree”. Uma característica que demonstra sua enorme importância

e popularidade é a infinidade de nomes vernaculares, de acordo com o país ou

região.

2.1.2 - Relação Filotaxonômica

M. oleifera é classificada taxonomicamente conforme descrito a seguir

(USDA):

• Reino: Plantae

• Sub-reino: Tracheobionta

• Superdivisão: Spermatophyta

• Divisão: Magnoliophyta (Angiosperma)

• Classe: Magnoliopsida (Dicotiledônea)

• Ordem: Brassicales

• Família: Moringaceae

• Gênero: Moringa

• Espécie: Moringa oleifera

2.1.3 - Descrição Morfológica

M. oleifera é conhecida como “drumstick” ou “bastão de tambor”, devido

ao formato de seus frutos, ou ainda como “horseradish tree” ou “raiz-forte”,

devido ao sabor picante de suas raízes (MAKKAR e BECKER, 1997; BHATTI,


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et al., 2007; CHUMARK et al., 2008). No nordeste brasileiro, inclusive no

Ceará, onde é cultivada como planta ornamental e medicinal, é conhecida

como lírio-branco, quiabo de quina, rabanete-de-cavalo ou, simplesmente,

moringa (LORENZI e MATOS, 2002).

Esta espécie apresenta-se em forma de arbusto ou árvore de pequeno

porte (FIGURA 1A), sendo bem menor no Brasil do que na Índia, possuindo

caule grosso, muitas vezes único, e uma copa aberta, em forma de sombrinha

(LORENZI e MATOS, 2002). O seu crescimento é bastante rápido (1,5 cm por

dia), podendo a planta atingir cerca de doze metros de altura (CÁCERES et al.,

1991; MAKKAR e BECKER, 1997; CHUANG et al., 2007). A moringa é uma

planta alógama (de fecundação cruzada) e sua propagação se dá por

sementes e estacas (LORENZI e MATOS, 2002; BEZERRA et al., 2004)

Na casca da moringa é verificada a presença de látex. Na medula

central há ocorrência de uma grande quantidade de mucilagem, rica em

arabinose, galactose e ácido glucurônico. As folhas são decíduas, alternadas,

pecioladas e compostas. O mesófilo foliar contém cristais de cálcio (CÁCERES

et al., 1991; MAKKAR e BECKER, 1997). As flores são diclamídeas, ou seja, o

perianto divide-se em cálice e corola. São, ainda, monoclinas, perfumadas, de

cores creme ou branca, estando agrupadas em inflorescências terminais do

tipo cimosa, as chamadas panículas. Em lugares onde o índice pluviométrico é

maior do que 600 mm/ano, as árvores estão sempre floridas; caso contrário,

somente há florescência na estação chuvosa. O androceu apresenta

estaminóides e estames. O gineceu é sincárpico, tricarpelar, uniloculado,

pluriovulado, com ovário súpero, e apresenta placentação parietal. O fruto,

deiscente, é uma cápsula, apresentando três faces e aspecto de vagem.

Geralmente, apresenta de 20 a 30 cm de comprimento. As sementes (FIGURA

1B e 1C) estão presentes em grande número por fruto, sendo trialadas e

oleaginosas (LORENZI e MATOS, 2002). Estas são gobulares e possuem uma

massa média de 3,0 a 4,0 g. A árvore é diplóide com 2n = 28 (PATEL e

NARAYANA, 1937; RAMACHANDRAN et al., 1980).

2.1.4 - Aspectos Culturais e Sócio-Econômicos


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FIGURA 1 - A) Árvore da Moringa oleifera. B) Sementes aladas. C) Sementes

destegumentadas (amêndoas).

A B

C


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Sementes de moringa representam uma fonte rica de óleo, o qual pode

ser utilizado para as mais diversas finalidades: 1) cozinha; 2) produção de

cosméticos (como fixador de odores voláteis em perfumes); 3) lubrificante e 4)

combustível (assim como a madeira do caule) (MORTON, 1991; BEZERRA et

al., 2004).

Estas, bem como as sementes de outras espécies do mesmo gênero,

apresentam uma propriedade que é, certamente, a mais explorada atualmente:

a de coagulação de matéria em suspensão. Diversos estudos têm sido

conduzidos na tentativa de melhor se conhecer o(s) fator (es) coagulante(s)

presente(s) nas sementes de moringa, com a finalidade de viabilizar a

utilização destas sementes no tratamento de água (OKUDA et al., 2001b).

Muitos países em desenvolvimento têm usado as sementes desta planta como

uma alternativa viável de coagulação para tratamento de água em pequena

escala (NDABIGENGESERE et al., 1995). O uso de sementes trituradas de

moringa para purificação da água, a um custo de apenas uma pequena fração

do tratamento químico convencional, é uma alternativa da mais alta

importância. Isto possibilitaria a substituição de agentes coagulantes usados

atualmente (sulfato de alumínio, por exemplo), muitas vezes prejudiciais à

saúde humana e animal (MAKKAR e BECKER, 1997). A prática de utilização

de farinha de sementes de moringa para a purificação de água, em pequena

escala, já é adotada por nativos em áreas rurais do nordeste do Brasil desde

1987 (GERDES, 1997).

De acordo com Goh (2005) apud Katayon e colaboradores (2006), o

custo de produção de 1 kg de sementes de M. oleifera, o que representa cerca

de 3400 sementes, é de US$ 2,00. Apesar de ser mais caro do que 1 kg de

alumen (sulfato de alumínio e potássio), que custa cerca de US$ 1,00, é muito

mais vantajoso e benéfico para as comunidades utilizar a moringa como

coagulante para tratamento de água, tanto em relação à saúde quanto à

economia. Isto acontece porque muitos produtos úteis podem ser extraídos da

semente antes da obtenção da fração coagulante. Como exemplo, tem-se o

óleo, o qual possui um grande valor comercial, sendo utilizado para diversos

fins, como alimentício, medicinal e industrial. Adicionalmente, os resíduos

sólidos servem como ração animal e fertilizante. O resultado de tudo isso é a


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obtenção do coagulante a um custo extremamente baixo, ou zero

(GHEBREMICHAEL et al., 2005).

Há relatos mostrando que cerca de 30 a 200 mg de farinha de sementes

de moringa por litro são necessários para transformar água turva em água

potável, após uma a duas horas de tratamento (MADSEN et al., 1987;

CÁCERES et al., 1991; OLIVEIRA et al., 1999). Segundo Jahn e colaboradores

(1986), a purificação da água é devida à presença de polipeptídeos que agem

como coagulantes primários, os quais, após isolamento, foram capazes de

coagular completamente uma suspensão de partículas de sílica na

concentração de 50 mg/L, com doses de apenas 0,01 a 0,05 mg/L.

2.1.5 - Aspectos Bioquímicos e Farmacológicos

As sementes de M. oleifera contêm quantidades significantes de uma

série de proteínas de baixa massa molecular, solúveis em água e de carga

líquida positiva. Tais proteínas agem como polieletrólitos catiônicos, que se

ligam predominantemente a partículas carregadas negativamente, como argila

e algumas bactérias, durante o tratamento de água turva (KWAAMBWA e

MAIKOKERA, 2007). Estudos preliminares sobre os componentes ativos

coagulantes de M. oleifera sugeriram que se tratam de peptídeos catiônicos de

massa molecular variando de 6,0 a 16,0 kDa e ponto isoelétrico em torno de

10,0 (GASSENSCHMIDT et al., 1995; NDABIGENGESERE et al., 1995).

Muitos relatos descrevem tais coagulantes como proteínas diméricas,

catiônicas (com carga líquida positiva), solúveis em água, com massa

molecular de 12,0 a 14,0 kDa e ponto isoelétrico (pI) entre 10,0 e 11,0

(NDABIGENGESERE et al., 1995; GHEBREMICHAEL et al., 2005).

Gassenschmidt e colaboradores (1995) isolaram uma proteína floculante

de sementes de moringa, cuja massa molecular aparente determinada por

SDS-PAGE é de 6,5 kDa. Esta proteína é rica em resíduos de glutamina,

arginina e prolina e possui ponto isoelétrico igual a 10,0. Segundo estes

autores, a atividade coagulante poderia ser explicada pela baixa massa


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molecular, associada à alta densidade de cargas, características da proteína.

Broin e colaboradores (2002) clonaram o cDNA codificante dessa proteína e o

introduziram em células de Escherichia coli. Ensaios com a proteína

recombinante purificada demonstraram sua capacidade de coagular, além de

matéria em suspensão, bactérias gram-positivas e gram-negativas. Mais

recentemente, em 2005, Ghebremichael e colaboradores verificaram que

frações enriquecidas de proteínas coagulantes de sementes de moringa

permaneceram ativas após tratamento por 5 horas a 95 °C e foram capazes de

agregar e inibir o crescimento de E. coli (D31), Bacillus thuringiensis (Bt7 e

Bt75) e Pseudomonas aeruginosa (nesta não houve agregação), mostrando-se

mais eficiente que a cecropina A, um peptídeo antimicrobiano (4,0 kDa) de

elevado pI. De acordo com Lorenzi e Matos (2002), tal propriedade coagulante

se deve à atividade de glicoproteínas.

Santos e colaboradores (2005) isolaram e caracterizaram uma lectina

acídica de sementes de moringa, contendo carboidrato, solúvel em água,

termoestável, com massa molecular de 20,0 kDa. Katre e colaboradores (2008)

isolaram por gel-filtração, em Sephadex G-100, uma proteína capaz de

hemaglutinar eritrócitos humanos e de coelhos que se constitui em um dímero

de 14,0 kDa o qual, na presença de β-mercaptoetanol, apresentou-se em uma

banda de 7,1 kDa em PAGE-SDS. Tal proteína, denominada MoL, é uma

glicoproteína que contém 1,5% de açúcares neutros e apresenta pI igual a 10,0

e seqüência N-terminal APGIMYRVQR.

A moringa é conhecida, também, por suas propriedades farmacológicas,

tendo sido utilizada nos mais diversos tratamentos: reumatismo, picadas

venenosas, hipercolesterolemia, melhoramento das funções cardíacas, etc.

(ANWAR e BHANGER, 2003; CHUMARK et al., 2008). Cáceres e

colaboradores (1991) demonstraram que os principais usos medicinais desta

planta são no tratamento de falta de apetite e doenças do sistema digestório

(dores de estômago, diarréia), do trato respiratório (gripes, febres), bem como

de doenças infecciosas da pele e mucosas (queimaduras, manchas, erupções).

Há relatos recentes de pessoas, na China e em Taiwan, que utilizaram, com

sucesso, sementes de moringa no tratamento de dermatoses fúngicas como

“pé-de-atleta” e “tinea” (CHUANG et al., 2007). Usos similares já foram


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relatados na Índia, Paquistão e Sudão (DASTUR, 1977; RAMACHANDRAN et

al., 1980; JAHN et al., 1986). De acordo com estudos realizados por Chuang e

colaboradores (2007), células do dermatófito Trichophyton rubrum, tratadas

com extrato etanólico de sementes de M. oleifera, após 24 horas apresentaram

uma ruptura na membrana plasmática e danos nos componentes intracelulares,

com conseqüente morte celular.

As propriedades medicinais da moringa têm sido atribuídas a todas as

partes da planta. As sementes cruas têm atividade antimicrobiana e podem ser

maceradas e usadas topicamente em ferimentos infectados e na cicatrização

de feridas (LORENZI e MATOS, 2002). Além disso, possuem muitos

compostos bioativos que lhes conferem, ainda, atividades antipirética (BEN

SALEM e MAKKAR, 2009) antiinflamatória, antitumoral e antifúngica (MAKKAR

e BECKER, 1997; MANI et al., 2007). O óleo, extraído das sementes, pode ser

usado para tratamento da gota, dores reumáticas e doenças cardiovasculares

(MANI et al., 2007). Cáceres e colaboradores (1992) observaram que a infusão

de sementes em água quente apresenta atividades antiespasmódica,

antiinflamatória e diurética. Há vários relatos mostrando que as folhas possuem

propriedade hipotensiva, antimicrobiana e abortífera (JAHN et al., 1986;

CÁCERES et al., 1992; UDUPA et al., 1994; FAISI et al., 1995; MARLES e

FARNSWORTH, 1995). Taihliani e Kar (1999) sugeriram que extratos de folhas

de moringa podem ser usados, inclusive, para regulação de hipertireoidismo.

Em outro estudo, o extrato etanólico de folhas de moringa foi capaz de

apresentar atividade antiviral contra o HSV-1 (vírus Herpes simplex tipo 1). O

extrato inibiu o desenvolvimento do vírus in vitro, em ensaio de formação de

placas, e, também, retardou o desenvolvimento de lesões de pele, prolongou o

tempo médio de sobrevivência e reduziu a mortalidade de camundongos

infectados com o HSV-1 (LIPIPUN et al., 2003). As flores, que são comestíveis,

são diuréticas e usadas para aumentar o fluxo biliar (ROY et al., 2007).

Recentemente, foi verificado que suas raízes possuem compostos que podem

ser responsáveis pelas atividades antiviral, antiinflamatória, antiartrítica e

analgésica (ROY et al., 2007; SASHIDHARA et al., 2009).

Têm sido relatadas ainda atividades antiepilética, antiulcerativa e

hipoglicemiante para diversas partes da planta (CÁCERES et al., 1992; SINGH


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e KUMAR, 1999; MORIMITSU et al., 2000; KAR et al., 2003).

A moringa caracteriza-se por ser bastante resistente a doenças, sendo

afetada por poucas espécies de insetos (RAMACHANDRAN et al., 1980). É

bastante provável que componentes de natureza protéica possam estar

envolvidos na defesa da planta. Cáceres e colaboradores (1991), estudando

quatro partes da planta (raízes, casca, sementes, folhas secas e extrato de

folhas frescas), verificaram que extratos de folhas frescas e de sementes foram

capazes de inibir o crescimento de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus

aureus. Extratos de sementes, obtidos a 56 oC e a 37 oC, e extrato de folhas

frescas, preparado a 25 oC, inibiram o crescimento de P. aeruginosa. O

crescimento de S. aureus foi, também, inibido pelo extrato de sementes

preparado a 56 oC. A extração realizada a temperatura superior a 56 °C não

mostrou atividade inibitória frente às bactérias testadas. Por outro lado,

nenhuma das partes vegetais avaliadas foi ativa contra Escherichia coli,

Shigella flexneri, Streptococcus pyogenes, Candidas albicans e, ainda, contra

seis fungos dermatófitos patogênicos e ovos de Ascaris lumbricoides. Atividade

antifúngica foi, também, detectada em extratos de moringa contra os seguintes

agentes patogênicos: Basidiobolus haptosporus, B. ranarum, Trichophyton

rubrum e T. mentagrophytes (NWOSU e OKAFOR, 1995). Em adição à

atividade antifúngica apresentada pela moringa, Hoan e Davide (1979)

observaram a ação nematicida das raízes da planta contra Meloidogyne

incognita, uma praga do tomate. Os únicos relatos na literatura sobre a

atividade de proteínas de sementes de moringa sobre fungos fitopatogênicos

são os trabalhos de Gomes (2002) e Gifoni (2005).

2.1.6 - Aspectos Nutricionais

A moringa se destaca, também, por sua grande importância na

alimentação. Seus frutos são comestíveis, assim como as folhas, flores e

sementes (MAKKAR e BECKER, 1997; ANWAR e BHANGER, 2003;

SIDDHURAJU e BECKER, 2003; BEZERRA et al., 2004).


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Nas regiões secas, o cultivo da moringa é vantajoso uma vez que suas

folhas podem ser colhidas quando nenhum outro vegetal fresco está disponível.

Na Índia e África, a moringa é encontrada crescendo em áreas próximas à

cozinha e em quintais, onde as folhas são colhidas diariamente para uso em

sopas, molhos e saladas (MATOS, 2002).

Um estudo da composição química das folhas de moringa revelou uma

quantidade razoável de proteínas (aproximadamente 8,1%), carboidratos

(14,1%), minerais e vitaminas (JAHN, 1992). Tais folhas são, particularmente,

ricas em vitamina A, B, C e E, cálcio, ferro e fósforo (PALADA, 1996; MAKKAR

e BECKER, 1997; OLIVEIRA et al., 1999; SHANKER et al., 2007; BEN SALEM

e MAKKAR, 2009), constituindo-se numa boa fonte de antioxidantes naturais

(SIDDHURAJU e BECKER, 2003). A concentração de vitamina A detectada

nas folhas corresponde, em média, a 23 mil UI/100 gramas, destacando-se de

fontes reconhecidas por possuírem altos teores de vitamina A, como brócolis

(5,0 mil UI), cenoura (3,7 mil UI), couve (2,2 mil UI), espinafre (1,9 mil UI) e

alface (1,0 mil UI) (SILVA e KERR, 1999; BEZERRA et al., 2004). Em alguns

países, é recomendado o consumo de folhas de moringa para combater a má

nutrição em crianças (BEN SALEM e MAKKAR, 2009).

As flores podem ser utilizadas, também, na nutrição humana/animal.

Todavia, elas devem ser consumidas cozidas ou misturadas a outros

alimentos. Similarmente, os frutos verdes são muito nutritivos, contendo todos

os aminoácidos e são preparados de forma similar às ervilhas verdes,

possuindo um sabor próximo ao dos aspargos. As raízes são tuberosas e fonte

de condimentos picantes (OLIVEIRA et al., 1999; RICHTER et al., 2003).

O óleo extraído das sementes, conhecido comercialmente por “Ben oil”

ou “Behen oil”, é rico em esterol, tocoferol e flavonóides. Além disso, 72,2% de

seus ácidos graxos correspondem ao ácido oléico, igualando-se ao óleo de

oliva (RASHID et al., 2008). A este percentual de ácido oléico seguem-se 7,5%

de ácido esteárico e, 7,0% de palmítico (ANWAR e BHANGER, 2003). Mais de

80% de seu conteúdo são de ácidos graxos insaturados (BHUPTAWAT et al.,

2007).

A TABELA 1 mostra os dados da composição centesimal de sementes

de moringa. Os resultados obtidos mostram que as sementes possuem


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elevados teores de proteína, chegando a ser maiores do que os valores

calculados para leguminosas de importância na alimentação humana, cujas

sementes, em geral, contêm cerca de 18 a 25% do peso seco de proteínas

(SINGH e SINGH, 1992). Nesta tabela, as variações encontradas nos

componentes determinados podem ser justificadas por diferenças no clima e

solo das regiões de onde foram coletadas as sementes.

Determinação da análise elementar de sementes de moringa, realizada

no Laboratório de Nutrição Animal da Embrapa Tabuleiros Costeiros, revelou

teores de 26% de óleo, 27% de proteína e 44% de digestibilidade. Para o

resíduo das sementes após a extração do óleo, o teor de proteína subiu para

34% e a digestibilidade para 56%. Estes resultados foram considerados

promissores tendo em vista a possibilidade de uso do resíduo das sementes na

nutrição animal. Entretanto, ratos em crescimento alimentados com uma dieta

cujas proteínas (10%) provinham unicamente da farinha de sementes de

moringa sofreram sérios distúrbios no crescimento, hiperplasia do intestino e

atrofia de vários órgãos chaves (OLIVEIRA et al., 1999). Efeitos indesejáveis

foram, também, observados em tilápias quando alimentadas com dietas

artificiais contendo 20% e 30% de folhas de moringa liofilizadas. Estes

incluíram, sobretudo, diminuição significante do crescimento (RICHTER et al.,

2003).

2.2 - Fungos Fitopatogênicos

Diversas espécies de fungos são capazes de causar prejuízos às

plantas (AGIZZIO et al., 2003). Cerca de 20% das perdas anuais na produção

agrícola mundial são devidos a doenças causadas por fungos fitopatogênicos

(CHAPAGAIN et al., 2007). Estes são organismos heterotróficos, eucariotos,

aclorofilados, portadores de esporos, que podem viver como parasitas ou

simbiontes em associação comensal com outros organismos. Suas estruturas

somáticas são, na maioria, constituídas de filamentos ramificados, cujas

paredes contêm quitina (SIQUEIRA e FRANCO, 1988; MENEZES e OLIVEIRA,


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TABELA 1 - Composição química de sementes de Moringa oleifera

Componente Percentual (A) Percentual (B) Percentual (C)

Proteína bruta 38,4 33,3 29,4

Óleo 34,7 41,2 40,4

Carboidrato 23,7 21,1 23,6

Minerais 3,2 4,4 6,6

Fonte: (A) RAMACHANDRAN et al. (1980).

(B) OLIVEIRA et al. (1999).

(C) ANWAR e BHANGER (2003).


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1993). A parede celular deve ser relativamente rígida para proteger a célula

das pressões externas e do próprio turgor, bem como, suficientemente

maleável para permitir o crescimento do fungo (THEIS e STAHL, 2004; De

GROOT et al., 2005). A síntese da parede celular se dá no ápice de cada hifa,

em uma complexa seqüência de montagem (SELITRENNIKOFF, 2001).

Basicamente, a parede celular de fungos é composta por quitina, glucanos,

lipídios, peptídeos e uma matriz protéica, variando a proporção, concentração e

disposição desses elementos entre as espécies, ou entre fases do ciclo de vida

da mesma espécie (HARDHAM e MITCHELL, 1998; LIPKE e OVALLE, 1998;

SELITRENNIKOFF, 2001; De GROOT et al., 2005).

A quitina é um biopolímero insolúvel, linear, composto por subunidades

de N-acetilglucosamina unidas por ligações β-(1,4). É o segundo polímero mais

abundante na natureza, ficando atrás apenas da celulose (AUNPAD e

PANBANGRED, 2003). Juntamente com o β-1,3-glucanos, a quitina é o

principal componente da parede celular de fungos (ZEKINS e SCHREMPF,

1995). A inibição da síntese de quitina em leveduras e fungos filamentosos

resulta na biogênese anormal da parede celular (WANG e GRANADOS, 2000).

A parede confere proteção à célula fúngica ao mesmo tempo em que permite o

transporte de nutrientes, água e minerais. Diante disso, pode-se inferir que a

quitina desempenha um importante papel funcional. A degradação desse

polímero por quitinases, ou mesmo sua interação com proteínas ligantes,

podem alterar ou destruir a estrutura da parede celular. Justamente por causa

disso, esse polissacarídeo torna-se o alvo principal de muitas proteínas de

defesa de plantas.

Para que a infecção da planta pelo fungo aconteça é necessário o

desenvolvimento de uma maquinaria física e química especializada, de acordo

com a seguinte seqüência de eventos: primeiro, há a liberação de moléculas

adesivas para a fixação do fungo à superfície da planta; em seguida, ocorre a

secreção de enzimas hidrolíticas que lisam a parede celular vegetal e outros

componentes, possibilitando a penetração e a nutrição do fungo; por último,

ocorre a diferenciação de estruturas de infecção especializadas para dar

continuidade à colonização (HARDHAM e MITCHELL, 1998).

Como já mencionado, a espécie F. solani causa graves prejuízos na


19

agricultura, danificando plantas de feijão, soja, ervilha, batata, maracujá e

pimenta-do-reino, acometendo-as da podridão vermelha da raiz, que resulta na

murcha na parte aérea da planta infectada, tornando-a inviável. Pelos prejuízos

causados, principalmente, às culturas de soja e feijão, plantas estudadas em

nosso laboratório, e pela praticidade de manuseio e cultivo, escolheu-se este

fungo para os estudos da atividade antifúngica de uma proteína de sementes

de M. oleifera, cujo isolamento e caracterização são descritos neste trabalho.

2.3 - Proteínas Vegetais de Defesa

As plantas acumulam muitos tipos de proteínas de defesa nos seus

tecidos mais vulneráveis. A síntese de algumas destas proteínas é induzida por

agentes bióticos ou abióticos específicos; outras são expressas

constitutivamente (VAN DEN BERGH et al., 2002). Muitos dos mecanismos de

defesa vegetal concentram-se nas sementes, uma vez que elas são o veículo

de propagação e sobrevivência da espécie. Seus tecidos podem acumular,

constitutivamente ou após indução, uma vasta gama de compostos defensivos,

que conferem resistência contra predadores fitófagos e nematóides, bem como

infecção por vírus, bactérias e fungos (CARLINI e GROSSI-DE-SÁ, 2002).

Várias são as proteínas de planta que estão supostamente envolvidas

na defesa vegetal. Exemplos bem conhecidos são as lectinas, as proteínas

inativadoras de ribossomos (RIPs dos tipos 1 e 2), os inibidores de enzimas

proteolíticas e as glico-hidrolases (BOWLES, 1990; CHRISPEELS e RAIKHEL,

1991; PEUMANS e VAN DAMME, 1995; KOIWA et al., 1997). Outras proteínas

envolvidas são as arcelinas, a canatoxina e formas modificadas de proteínas

de reserva (CARLINI e GROSSI-DE-SÁ, 2002). Há também um grupo particular

de proteínas de defesa composto por pequenos peptídeos ricos em cisteína

com propriedades antimicrobianas. Este grupo, chamado AMP (“antimicrobial

peptides”), compreende diferentes famílias de proteínas, tais como tioninas,

defensinas, proteínas de transferência de lipídios, peptídios tipo heveína e tipo

knotina (VAN DEN BERGH et al., 2002).


20

Durante os anos 1990, muitas proteínas de plantas capazes de inibir o

crescimento de fungos in vitro foram isoladas e caracterizadas, mas, nenhuma

delas de Moringaceae. Dentre essas proteínas, genericamente chamadas de

proteínas antifúngicas (AFPs), encontram-se glucanases, quitinases, proteínas

tipo taumatina, muitas famílias de peptídeos básicos ricos em cisteína,

proteínas ligantes à quitina, RIPs e inibidores de proteinases (GIUDICI et al.,

2000; LI e CLAESON, 2003).

Existe um grande grupo de proteínas de defesa vegetal conhecido como

PR-Proteínas ou proteínas relacionadas à patogênese. Este termo foi

primeiramente utilizado para descrever numerosas proteínas extracelulares que

se acumulavam em plantas de fumo (Nicotiana tabacum) infectadas com o

vírus do mosaico do tabaco (TMV) (VAN LOON e VAN KAMMEN, 1970;

GIANINAZZI et al., 1970). Essas plantas se mostraram resistentes ao ataque

de fungos. As PR-proteínas apresentam algumas características físico-

químicas e imunológicas comuns; isto permitiu que elas fossem reunidas em

diferentes grupos, de acordo com o grau de similaridade (STINTZI et al., 1993).

Atualmente, as PR-proteínas estão classificadas em 17 grupos, conforme

mostrado na TABELA 2. Muitas PR-proteínas possuem tanto atividade

antifúngica como atividade antibacteriana in vitro. Algumas delas encontram-se

expressas constitutivamente nas plantas, embora em baixos níveis; entretanto,

quando o vegetal é submetido a condições de estresse, seus níveis são

significativamente elevados. Outras, não são detectadas em condições

fisiológicas normais, porém, em condições de estresse, têm seus genes

correspondentes ativados (CHRISTENSEN et al., 2002).

2.3.1 - Proteínas Ligantes à Quitina

No presente trabalho daremos destaque especial às proteínas ligantes à

quitina, uma vez que a proteína antifúngica isolada de sementes de M. oleifera

e caracterizada aqui, se enquadra neste grupo.


21

TABELA 2 - Famílias de Proteínas Relacionadas à Patogênese (PR-Proteínas)*

Família Membros Atividades

PR-1 Fumo PR-1a Antifúngico, anti-oomicetos

PR-2 Fumo PR-2 Β-1,3-glucanase

PR-3 Fumo P, Q Quitinase

PR-4 Fumo R Quitinase (Classe I)

PR-5 Fumo S Thaumatina-like

PR-6 Tomate Inibidor I Inibidor de protease

PR-7 Tomate P69 Endoproteinase

PR-8 Quitinase pepino Quitinase

PR-9 Peroxidase formadora de lignina/fumo

Peroxidase

PR-10 Salsinha PR-1 Ribonuclease-like

PR-11 Quitinase classe V fumo Quitinase

PR-12 Defensinas Antifúngico

PR-13 Tioninas Antifúngico

PR-14 LTP4 cevada Proteína transferidora de lipídio

PR-15 OxOa cevada Oxalato oxidase

PR-16 OxOLP cevada Oxalato oxidase-like

PR-17 PRp27 fumo Desconhecida

*VAN LOON et al. (2006).


22

Muitas proteínas de plantas são capazes de se ligar à quitina, um

biopolímero de resíduos de N-acetilglucosamina (GlcNac) unidos por ligação β-

1,4, e/ou a seus oligômeros (ASENSIO et al., 2000). Todas as proteínas

ligantes à quitina, cuja seqüência aminoacídica é conhecida, contêm um motivo

estrutural comum de 30 a 43 resíduos de aminoácidos, com muitas cisteínas e

glicinas em posições conservadas, conhecido como domínio de ligação à

quitina ou domínio heveínico (RAIKHEL e LEE, 1993; ASENSIO et al., 2000;

TRINDADE et al., 2006).

Estudos têm sugerido que essas proteínas desempenham um papel na

defesa de plantas (COLOMBO et al., 2005). Tal proposição é devida a dois

fatos: o de nunca ter sido encontrada quitina em vegetais superiores (RAIKHEL

e LEE, 1993) e o de algumas dessas proteínas afetarem negativamente o

desenvolvimento de fungos e insetos, uma vez que polissacarídeos

constituídos por GlcNac estão presentes na constituição desses organismos

(RAUSCHER et al., 1999; ASENSIO et al., 2000; ZAREIE et al., 2002;

COLOMBO et al., 2005).

As proteínas ligantes à quitina podem ser divididas em diferentes

grupos: peptídeos do tipo heveína, lectinas, quitinases e peptídeos do tipo Ac-

AMP (Peptídeos Antimicrobianos de Amaranthus caudatus) (HUANG et al.,

2000). As lectinas ligantes à quitina têm sido bastante estudadas. Destas, a

melhor caracterizada é a lectina de germe de trigo (WGA) (MIRELMAN et al.,

1975). Ela consiste de quatro domínios heveínicos in tandem e não apresenta

atividade antifúngica (YANG e GONG, 2002). Outra proteína é a heveína, uma

merolectina monomérica de 5 kDa encontrada no látex da seringueira (Hevea

brasiliensis), possuindo 43 resíduos de aminoácidos e um único domínio de

ligação à quitina (VAN PARIJS et al., 1991; ASENSIO et al., 2000; COLOMBO

et al., 2005); ela toda é conhecida como domínio heveínico. Outras lectinas

com afinidade por quitina têm sido estudadas, como aquelas encontradas em

sementes de Chelidonium majus, Phytolacca americana, Urtica dioica (UDA),

Oryza sativa, Triticum aestivum, Solanum tuberosum, Lycopersicon

esculentum, dentre outras (RAIKHEL e LEE, 1993; CARLINI e GROSSI-DE-SÁ,

2002; TRINDADE et al., 2006).

Experimentos com preparações purificadas, livres de quitinases,


23

demonstraram que a maioria dessas lectinas não tem atividade antifúngica

(BROEKAERT et al., 1992). Apenas um pequeno número exibe tal propriedade,

como exemplo, a heveína e os Ac-AMPs (VAN PARIJS et al., 1991). De acordo

com esses autores, heveína em altas concentrações (500-2000 µg/mL) inibe o

crescimento de hifas do fungo Pyrenophore triticirepentis, assim como sua

germinação. Além das proteínas citadas, as lectinas de S. tuberosum e U.

dioica (UDA) também inibem o crescimento e desenvolvimento de fungos,

perturbando a síntese e/ou deposição de quitina na parede celular

(BROEKAERT et al., 1989). Como conseqüência, a morfologia do micélio é

afetada. Entretanto, a UDA não chega a ter ação fungicida (VAN PARIJS et al.,

1992).

Outro grupo bastante estudado de proteínas ligantes à quitina é o das

quitinases. Essas são enzimas que hidrolisam a quitina (CHEONG et al., 2000;

YE e NG, 2005). Elas pertencem à família III de PR-proteínas ou PR-3 e têm

sido agrupadas de acordo com suas características estruturais e seqüências de

aminoácidos (SELITRENNIKOFF, 2001). As enzimas da Classe I (hoje

conceituadas como quimerolectinas) possuem 39 a 42 resíduos de

aminoácidos N-terminais (domínio heveínico), apresentando alta similaridade

com os domínios de ligação à quitina presentes na heveína, UDA e WGA. As

quitinases da Classe II, por não possuírem esse grupamento N-terminal, não

são capazes de se ligar à quitina (YE e NG, 2005). Ambas, porém, apresentam

atividade quitinásica, pois a ação do sítio catalítico da enzima independe do

sítio de ligação a carboidratos. As da Classe III não se assemelham

estruturalmente com os outros tipos e apresentam atividade lisozímica. As

outras classes incluem: Classe IV, cujas enzimas apresentam alta similaridade

com as da Classe I (SANTOS et al., 2004); Classe V, tendo como característica

o fato de seus membros possuírem dois domínios de ligação à quitina

(GOMES, 2002) e Classe VI, cujos componentes são similares a algumas

quitinases bacterianas (SANTOS et al., 2004). Atividade contra fungos tem sido

detectada em algumas quitinases. Quitinases de folhas de feijão inibem o

crescimento de alguns fungos in vitro (SCHLUMBAUM et al., 1986). Yamamoto

e colaboradores (1995) isolaram duas isoformas de quitinase (CH-1 e CH-2) de

células do mesófilo de Wasabia japonica, sendo essas capazes de inibir o


24

crescimento do fungo T. hamatum. Além disso, plantas transgênicas “super

expressando” quitinases mostraram aumento de resistência a diversos

patógenos quitinosos (VAN SCHELTINGA et al., 1994).

Além de lectinas e quitinases que se ligam à quitina, outras classes de

proteínas com afinidade a este polímero são bastante estudadas. Huang e

colaboradores (2000) purificaram um peptídeo antifúngico ligante à quitina de

folhas de Ginkgo biloba, o GAFP, que possui massa molecular de 30 kDa e

apresenta atividade quitinásica. O peptídeo foi capaz de inibir o crescimento de

Pellicularia sasakii, Alternaria alternata, Fusarium graminearum e F.

moniliforme. No entanto, não teve efeito sobre o crescimento de Phytophthora

boehmeriae. Van den Bergh e colaboradores (2002) descreveram um novo

AMP tipo heveína, isolado da casca de Euonymus europaeus. Tal peptídeo

ligante à quitina, denominado Ee-CBP, caracteriza-se pela presença de 10

resíduos de cisteína ligados por pontes dissulfeto e por apresentar forte

atividade antifúngica. Ensaios de difusão em ágar demonstraram que Ee-CBP

foi capaz de inibir o crescimento dos fungos fitopatogênicos Botrytis cinerea e

Neurospora crassa em concentrações tão baixas quanto 5 µg/mL, e dos fungos

Alternaria brassicicola e Fusarium culmorum em concentrações de 10 µg/mL.

Ensaios comparativos em placas de microtitulação mostraram que Ee-CBP

exibiu uma atividade antifúngica mais forte do que Ac-AMP2, para a maioria

dos fungos testados. Note-se que esse peptídeo (Ac-AMP2) é considerado

como um dos polipeptídeos antifúngicos do tipo heveína mais potentes (VAN

DEN BERGH et al., 2002). Os mesmos pesquisadores verificaram um efeito

severamente deletério de Ee-CBP sobre a morfologia dos esporos de A.

brassicola e N. crassa.

Yang e Gong (2002) purificaram e caracterizaram uma proteína ligante à

quitina, induzida por etileno, com atividade antifúngica, de folhas de Hydrangea

macrophylla. Tal proteína foi denominada HM30 e sua massa molecular

aparente determinada por SDS-PAGE foi de 33,0 kDa. Apesar de se ligar à

quitina, HM30 não apresentou níveis detectáveis de atividade quitinásica nem

de atividade hemaglutinante. Quando testada contra dez fungos

fitopatogênicos, HM30 exerceu potente efeito inibitório sobre o crescimento de

oito destes. Além disso, inibiu a germinação de esporos de Aspergillus niger e


25

Alternaria alternata, sem, no entanto, afetar o crescimento de A. niger.

Lee e colaboradores (2003) verificaram que dois peptídeos ligantes à

quitina de Pharbitis nil, denominados de Pn-AMP1 (41 resíduos de

aminoácidos) e Pn-AMP2 (40 resíduos), exibiram atividade antifúngica contra

um largo espectro de patógenos. É interessante notar que esses peptídeos

interagiram tão fortemente com a quitina, que a eluição requereu aquecimento

do complexo com SDS a 100 oC, por 3 minutos. Mesmo após esse tratamento,

os peptídeos inibiram o crescimento de B. cinerea. Por outro lado, quando

reduzidos por DTT, os peptídeos foram incapazes de se ligar à coluna e de

apresentar atividade contra fungos. Os autores verificaram, ainda, que o fato de

os Pn-AMPs se ligarem à quitina não estava relacionado à atividade

antifúngica, pois, Phytophthora capsici, que não possui quitina na parede

celular, foi também afetado pelos Pn-AMPs. Os resultados indicam que quitina

na parede celular não é um requerimento para o efeito antifúngico dos Pn-

AMPs. No entanto, as pontes dissulfeto são essenciais tanto para a ligação à

quitina, quanto para a atividade antifúngica.

Li e Claeson (2003) descobriram uma proteína “PR-like” rica em cisteína

e glicina. Trata-se de uma pequena proteína ligante à quitina do tipo heveína,

presente em sementes de aveia, designada avesina A, representando a

primeira proteína do tipo heveína isolada de grãos de cereais.

De uma forma particular, as proteínas ligantes à quitina, propriamente

ditas, poderiam agrupar-se na família IV de PR-proteínas, ou PR-4. Esta família

caracteriza-se por reunir proteínas de pI básico, baixa massa molecular,

variando de 3,1 a 20 kDa (THEIS e STAHL, 2004), capazes de se ligar à

quitina, mas que não apresentam atividade hemaglutinante ou quitinásica.

Tem sido proposto que o mecanismo de ação antifúngica das proteínas

que se ligam à quitina esteja relacionado ao tamanho dessas moléculas, visto

que lectinas de gramíneas com massa molecular de 36 kDa não apresentam

atividade antifúngica, enquanto que a UDA (8,5 kDa) e a heveína (5 kDa)

apresentam atividade comprovada (HUANG et al., 2000). Talvez, o pequeno

tamanho da proteína seja necessário para a entrada pelos poros e interação

com a parede celular dos fungos (RAIKHEL e LEE, 1993). Money (1990),

analisando o fungo Achyla bisexualis, mostrou que proteínas com massas


26

moleculares maiores que 15-20 kDa não eram capazes de passar através dos

poros da parede celular.


27

33.. OOBBJJEETTIIVVOOSS


28

3.1 - Objetivo Geral

Purificar e caracterizar físico-química e biologicamente uma proteína

antifúngica, ligante à quitina, presente em sementes de Moringa oleifera

Lamarck.

3.2 - Objetivos Específicos

� Purificar uma proteína ligante à quitina presente em sementes de

moringa;

� Caracterizar físico-quimicamente a proteína;

� Avaliar a atividade antifúngica in vitro da proteína sobre Fusarium solani

por meio de ensaios de inibição da germinação de esporos e do

crescimento micelial;

� Avaliar o mecanismo de ação da atividade antifúngica da proteína.


29

44.. MMAATTEERRIIAAIISS


30

4.1 - Sementes

Sementes de Moringa oleifera Lamarck foram coletadas de árvores

situadas na Avenida Mister Hull e no Campus do Pici, da Universidade Federal

do Ceará (UFC), na cidade de Fortaleza, Ceará, durante o último trimestre de

cada ano, de 2005 a 2008.

4.2 - Eritrócitos

Eritrócitos utilizados nos ensaios de aglutinação foram obtidos de

amostras de sangue de coelho albino adulto (linhagem Nova Zelândia),

mantido no biotério do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da

UFC, bem como de sangue humano, dos tipos A, B e 0, proveniente do

HEMOCE (Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará).

4.3 - Modelo Experimental

Fungo

O fungo fitopatogênico Fusarium solani e o oomiceto Pythium

oligandrum foram obtidos da coleção mantida no Laboratório de Proteínas

Vegetais de Defesa, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da

UFC.

4.4 - Reagentes Químicos


31

Acrilamida, ácido sulfúrico, albumina sérica bovina (BSA), bisacrilamida,

“Coomassie Brilliant Blue” G e R, p-dimetilaminobenzaldeído (DMAB), glicerol,

glucoronidase (Tipo HP-2, 132.000 Unidades/mL), N-acetil-D-glucosamina,

guaiacol, marcadores de massa molecular, persulfato de amônio, quitina,

quitina coloidal, quitinase e TEMED foram obtidos da Sigma Chemical Co., St.

Louis, EUA. β-mercaptoetanol e dodecil sulfato de sódio foram obtidos da

Merck, Darmstadt, Alemanha. Os demais reagentes utilizados foram de grau

analítico e obtidos comercialmente.


32

55.. MMÉÉTTOODDOOSS


33

5.1 - Preparação da Farinha de Sementes de Moringa oleifera

5.1.1 - Obtenção da Farinha

Sementes de M. oleifera Lam. foram destegumentadas manualmente. As

amêndoas foram trituradas em liquidificador e, posteriormente, em moinho

elétrico para café.

5.1.2 - Delipidação da Farinha

A farinha obtida foi tratada com n-hexano, na proporção 1:10 (m/v), sob

exaustão de capela à temperatura ambiente, até a completa remoção dos

lipídios. Após delipidação, a farinha foi deixada sobre papel de filtro até a

evaporação total do solvente. Uma vez delipidada, a farinha foi acondicionada

em frascos hermeticamente fechados e conservada a 4 °C.

5.2 - Purificação das Proteínas Ligantes à Quitina de M. oleifera

5.2.1 - Extração de Proteínas

O esquema de extração das proteínas presentes na farinha das

sementes de moringa está mostrado na FIGURA 2. A farinha delipidada (30 g)

foi posta em contato com o tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl

0,15 M, na proporção de 1:10 (m/v) e deixada sob agitação contínua por 4 h,


34

FIGURA 2 - Esquema de obtenção do extrato total das proteínas das sementes

de M. oleifera.

FARINHA DE SEMENTE DE

MORINGA DELIPIDADA

Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M

4 h sob agitação, 4 oC

Filtração em pano de trama fina

RESÍDUO FILTRADO

Centrifugação 15 000 x g, 30 min, 4 oC

RESÍDUO SOBRENADANTE

EXTRATO TOTAL

Filtração em papel


35

a 4 °C. Em seguida, a suspensão foi filtrada em pano de trama fina. O resíduo

obtido foi descartado. O filtrado foi centrifugado a 15.000 x g, 30 minutos, 4 °C;

o precipitado foi descartado e o sobrenadante obtido foi filtrado em papel e

denominado de Extrato Total.

5.2.2 - Obtenção das Frações Albumina e Globulina

O extrato total foi dialisado exaustivamente contra água destilada, 4 ºC,

sob agitação, em membranas de poro de 12 kDa, com o objetivo de separar as

albuminas e globulinas. A suspensão obtida foi centrifugada a 15.000 x g, por

30 minutos, 4 ºC. O precipitado (globulinas) foi descartado e o sobrenadante

(albuminas) utilizado para prosseguimento da purificação.

5.2.3 - Concentração da Fração Albumina

Para a obtenção das proteínas ligantes à quitina, a fração albumina foi

concentrada por precipitação com sulfato de amônio, 90% de saturação. Após

um tempo de contato de 12 h, tal suspensão foi centrifugada a 15.000 x g, 40

minutos, 4 ºC. O precipitado foi ressuspenso em tampão de extração (vol.

aprox. 20 mL), dialisado contra o mesmo tampão (para a retirada do sulfato de

amônio) e utilizado na etapa cromatográfica posterior.

5.2.4 - Cromatografia de Afinidade em Coluna de Quitina

A matriz de quitina (Sigma), cujo volume era 93 mL, foi equilibrada com

tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M. A fração albumina


36

(835 mgP) foi centrifugada a 8.000 x g, 5 minutos, 4 oC e aplicada na coluna

(31,0 x 3,0 cm). As proteínas não retidas foram eluídas com o mesmo tampão

de equilíbrio; já a fração retida na coluna foi eluída, primeiramente, com N-

acetil-D-glucosamina 0,1 M (PNAG) e, em seguida, com ácido acético 0,05 M

(PAC). As frações eluídas foram monitoradas por leitura de absorbância a 280

nm (espectrofotômetro tipo Novaspesc II, Pharmacia). O material não retido na

coluna foi descartado, enquanto que PNAG e PAC foram dialisados contra ácido

acético 0,1 M (para a retirada de carboidratos) e água destilada, liofilizados e

acondicionados em frascos hermeticamente fechados, a 4 oC. O esquema

geral de obtenção das proteínas ligantes à quitina pode ser visualizado na

FIGURA 3.

5.2.5 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de DEAE-Celulose

A matriz de DEAE-Celulose (Sigma), cujo volume era 21,6 mL, foi

equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0. PNAG (5 mg) diluído em 2 mL

do mesmo tampão foi aplicado na coluna. O material não retido foi eluído com

o mesmo tampão de equilíbrio. O retido foi eluído com um gradiente linear de 0

a 1 M de NaCl adicionado ao tampão de equilíbrio. As frações eluídas foram

monitoradas por leitura de absorbância a 280 nm (espectrofotômetro tipo

Novaspesc II, Pharmacia). O resultado pode ser visto no Anexo.

5.2.6 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de CM-Celulose

A matriz de CM-Celulose (Sigma), cujo volume era 21,6 mL, foi

equilibrada com tampão acetato de sódio 0,1 M, pH 4,5. PNAG (5 mg) diluído em

2 mL do mesmo tampão foi aplicado na coluna. O material não retido foi eluído

com o mesmo tampão de equilíbrio. O retido foi eluído com gradiente linear


37

FIGURA 3 - Esquema geral de purificação das proteínas ligantes à quitina

(PNAG e PAC) a partir do extrato total.

EXTRATO TOTAL

Diálise exaustiva em água destilada (poro de 12 kDa) Centrifugação 15.000 x g, 30 min, 4 oC

SOBRENADANTE PRECIPITADO

ALBUMINA GLOBULINA

MATERIAL NÃO RETIDO

MATERIAL RETIDO

Precipitação a 0-90% (NH4)2SO4

Centrifugação 15.000 x g, 40 min, 4 °C Diálise em Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M Cromatografia em coluna de Quitina

Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M

PAC

Eluição com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M

Eluição com ácido acético 0,05 M

PNAG


38

de 0 a 1 M de NaCl adicionado ao tampão de equilíbrio. As frações eluídas

foram monitoradas por leitura de absorbância a 280 nm (espectrofotômetro tipo


5.2.7 - Cromatografia de Exclusão Molecular em Coluna de Sephadex G-50

A matriz de Sephadex G-50 (Sigma), cujo volume era 188 mL, foi

equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0. PNAG (5 mg) diluído em 2 mL

do mesmo tampão foi aplicado na coluna, cujo void era de 60,5 mL. O material

foi eluído com o mesmo tampão de equilíbrio. As frações eluídas foram

monitoradas por leitura de absorbância a 280 nm (espectrofotômetro tipo


5.2.8 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna de Fenil-Sepharose

A matriz de Fenil-Sepharose (Sigma), cujo volume era 20 mL, foi

equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo Sulfato de amônio 1

M. PNAG (10 mg) diluído em 2 mL do mesmo tampão foi aplicado na coluna. O

material não retido foi eluído com o mesmo tampão de equilíbrio. O retido foi

eluído em step wise, com concentrações decrescentes de sulfato de amônio, a

saber: 0,8, 0,6, 0,4, 0,2 e 0 M. Em seguida, a coluna foi lavada com água e

etanol 70%. As frações eluídas foram monitoradas por leitura de absorbância a

280 nm (espectrofotômetro tipo Novaspesc II, Pharmacia). O resultado pode

ser visto no Anexo.

5.2.9 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C-18 acoplada a

HPLC


39

A coluna de C-18 foi equilibrada com ácido trifluoracético (TFA) 0,1%.

PNAG (300 µg) diluído em 50 µL de TFA 0,1% foi aplicado na coluna. O material

não retido foi eluído com a mesma solução de equilíbrio. O retido foi eluído em

gradiente de 0 a 100% de acetonitrila. As frações eluídas foram monitoradas

por leitura de absorbância a 280 nm. O resultado pode ser visto no Anexo.

5.2.10 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C2-18 acoplada a

HPLC

A coluna de C2-18 foi equilibrada com ácido trifluoracético (TFA) 0,1%.

PNAG (1 mg) diluído em 100 µL de TFA 0,1% foi aplicado na coluna. O material

não retido foi eluído com a mesma solução de equilíbrio. O retido foi eluído em

gradiente de 0 a 100% de acetonitrila. As frações eluídas foram monitoradas

por leitura de absorbância a 280 nm. O resultado pode ser visto no Anexo.

5.2.11 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna Resource S Acoplada a um

Sistema de FPLC

A coluna (1 mL) foi previamente equilibrada com o tampão acetato de

sódio 0,05 M, pH 5,2. A 15 mg de PNAG foram adicionados 2 mL do mesmo

tampão e, após solubilização, a amostra foi centrifugada a 15.000 x g por 15

minutos, a 4 °C (centrífuga refrigerada de bancada eppendorf). O sobrenadante

foi aplicado à coluna e o material não retido eluído com o tampão de equilíbrio.

As proteínas retidas na matriz foram eluídas em step wise pela adição de

concentrações crescentes de NaCl ao tampão de eluição. A princípio, foram

testadas as concentrações de 0,1 a 1 M de NaCl, aumentando em 0,1 a

molaridade. O resultado deste teste revelou que os materiais retidos eram

eluídos com 0,4, 0,5, 0,6 e 0,7 M de NaCl no tampão. As frações eluídas foram


40

monitoradas por leitura de absorbância a 280 nm. O esquema de purificação

das proteínas ligantes à quitina de M. oleifera, denominadas Mo-CBP, é

mostrado na FIGURA 4.

5.3 - Caracterização Bioquímica de Mo-CBP3

5.3.1 - Determinação de Proteínas

Para determinação de proteínas do extrato total, da fração albumina e

dos picos cromatográficos foi utilizada a metodologia descrita por Bradford

(1976). A 100 µL de amostra, em diferentes concentrações, foram adicionados

2,5 mL do reagente de Bradford. A mistura foi agitada e após 10 minutos em

repouso foram feitas leituras das absorbâncias a 595 nm (espectrofotômetro

tipo Novapesc II, Pharmacia). A concentração protéica foi estimada através de

uma curva padrão obtida a partir de concentrações conhecidas de albumina

sérica bovina (BSA).

5.3.2 - Determinação da Massa Molecular por Eletroforese em Gel de

Poliacrilamida

O perfil eletroforético das frações resultantes do processo de purificação

foi analisado segundo a técnica de Laemmli (1970), adaptada para o uso de

placas medindo 10,0 x 8,0 cm. O gel de aplicação encerrava 3,5% de

acrilamida e 1,0% de SDS, preparados em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8; o de

separação, 15,0% de acrilamida e 1,0% de SDS, em tampão Tris-HCl 3,0 M,

pH 8,8.


41

FIGURA 4 - Esquema da purificação de Mo-CBP3 a partir da fração protéica

retida em matriz de quitina e eluída com N-acetil-D-glucosamina

0,1 M (PNAG).

PNAG (Proteínas Ligantes à Quitina eluídas com N-acetil-D-glucosamina)

Diálise em ácido acético 0,1 M e água destilada Liofilização Ressuspensão em tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2 Centrifugação 15.000 x g, 15 min, 4 °C Cromatografia de troca iônica em Resource S – FPLC, equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2

Tampão de equilíbrio

P1 (Mo-CBP1)

P2 (Mo-CBP2)

Tampão de equilíbrio contendo NaCl 0,4 M

Tampão de equilíbrio Contendo NaCl 0,5 M

P3 (Mo-CBP3)

P4 (Mo-CBP4)


P5 (Mo-CBP5)



42

As amostras foram dissolvidas, na concentração de 1 mg/mL, em

tampão Tris-HCl 0,0625 M, pH 6,8, contendo SDS 1,0%, na presença ou não

de β-mercaptoetanol 1,0%. Em seguida, as amostras foram aquecidas a 100

°C, por 10 minutos, e centrifugadas a 10.000 x g, 5 minutos, a 10 °C. Aos

sobrenadantes, foram acrescentados cristais de sacarose e azul de bromofenol

a fim de conferir densidade e cor às amostras, respectivamente. Alíquotas das

amostras foram aplicadas no gel, o qual foi submetido a uma corrente de 20

mA, durante 2 h. As bandas protéicas foram visualizadas por coramento com

“Coomassie Brilliant Blue” R-250 0,05%, dissolvido em uma solução de

metanol, ácido acético e água (1,0:3,5:8,0 v/v/v), por um período de 2 h. Em

seguida, foi procedido o descoramento do gel com solução de metanol, ácido

acético e água (1,0:3,5:8,0 v/v/v). Como marcadores de massa molecular foram

usados: fosforilase B (97,0 kDa), albumina sérica bovina (67,0 kDa), albumina

do ovo (45,0 kDa), anidrase carbônica bovina (29,0 kDa), inibidor de tripsina de

soja tipo Kunitz (20,1 kDa) e α-lactalbumina (14,2 kDa). Comparação das

mobilidades das bandas protéicas em relação àquelas dos marcadores foi

empregada para o cálculo da massa molecular aparente das proteínas em

análise.

5.3.3 - Determinação da Massa Molecular por Cromatografia de Exclusão

Molecular

Uma alíquota de 100 µL de Mo-CBP3 (2 mg/mL), preparada em tampão

acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,15 M, foi filtrada em

membrana de 0,45 µm (Millipore) e submetida à cromatografia de exclusão

molecular em coluna de Superose 12 HR 10/30, equilibrada com o mesmo

tampão. O processo cromatográfico foi desenvolvido em sistema FPLC (coletor

Pharmacia LKB FRAC-100) e monitorado por meio de leituras de absorbância a

280 nm. Antes da corrida com a amostra, a coluna foi calibrada com os

seguintes marcadores de massa molecular: álcool desidrogenase (150,0 kDa),


43

albumina sérica bovina (67,0 kDa), ovalbumina (45,0 kDa), tripsinogênio (24,0

kDa) e citocromo C (12,4 kDa). A massa molecular de Mo-CBP3 foi calculada

relacionando-se os volumes de eluição e massas moleculares dos marcadores

com o volume de eluição da proteína.

5.3.4 - Determinação do Ponto Isoelétrico (pI) de Mo-CBP3

Para determinação do ponto isoelétrico, a proteína Mo-CBP3 foi

submetida à eletroforese bidimensional, utilizando-se um aparelho Multiphor II

(Amersham Pharmacia Biotech), seguindo as instruções do fabricante e

modificações feitas por Görg et al. (2000). Na primeira parte do experimento,

uma tira de gel do tipo “immobiline dry strip” (13 cm, pH 3-10) foi reidratada

com 200 µL de uma solução de reidratação contendo a proteína (0,25 mg/mL).

A focalização isoelétrica (corrida de primeira dimensão) foi realizada de acordo

com o seguinte programa: 1 h a 200 V; 1,5 h a 500 V; 2,5 h a 5.000 V e 10.000

V até atingir 18.000 Vhs. Na segunda parte do experimento, foi realizada a

eletroforese em presença de SDS. Para a corrida em segunda dimensão, foram

utilizadas placas medindo 18,0 x 16,0 cm e gel de separação encerrando 15%

de acrilamida. Depois de corrida a primeira dimensão, a tira de gel foi colocada

em contato com o gel, sendo a segunda corrida realizada a uma corrente

constante de 50 mA, por 6 h. Como marcadores de massa molecular foram

usados: fosforilase B (97,0 kDa), albumina sérica bovina (67,0 kDa), albumina

do ovo (45,0 kDa), anidrase carbônica bovina (29,0 kDa), inibidor de tripsina de

soja tipo Kunitz (20,1 kDa) e α-lactalbumina (14,2 kDa). O gel foi então corado

com “Coomassie Brilliant Blue” R-250 0,05% dissolvido em uma solução de

metanol, ácido acético e água (1,0:3,5:8,0 v/v/v), por um período de 2 h. Em

seguida, procedeu-se o descoramento do gel com solução de metanol, ácido

acético e água (1,0:3,5:8,0 v/v/v) até a visualização das bandas. Os discos

foram analisados por medições segundo variação de pH da tira, utilizando-se o


44

programa ImageMaster 2D Platinum v6.0 (Amersham Biosciences). O

procedimento foi ainda refeito, utilizando-se uma tira de pH de 6,0 a 11,0.

5.3.5 - Avaliação da Mo-CBP3 em Eletroforese sob Condições Nativas

Os experimentos de eletroforese nativa para proteínas básicas foram

conduzidos de acordo com o método descrito por Reisfeld et al. (1962) e

adaptado para géis em placas. O gel de aplicação, encerrando uma

concentração de 3,5% de poliacrilamida, foi preparado em tampão acetato de

potássio 0,25 M, pH 6,8. O gel de separação foi preparado na concentração de

15% de poliacrilamida em tampão acetato de potássio 1,5 M, pH 4,3. A solução

utilizada nas câmaras catódica e anódica foi o tampão β-alanina-ácido acético

0,35 M, pH 4,5. A proteína liofilizada foi dissolvida em tampão acetato de

potássio 0,25 M, pH 6,8 (2,5 mg/mL). A amostra foi centrifugada a 7000 x g, por

3 minutos. Em seguida, foram adicionados ao sobrenadante obtido 2 mg de

sacarose e 2 µL de fucsina básica, e aplicados de 10 a 20 µL por poço. As

condições estabelecidas para a corrida foram 160 V e 30 mA. A corrida durou

cerca de 5 h, a 4 °C. Ao término da corrida, o gel foi corado em solução corante

“Coomassie Brilliat Blue” 1%, durante 2 h e descorado em solução de ácido

acético, água destilada e metanol (1:8:3,5, v/v/v).

5.3.6 - Detecção de Glicoproteína em Gel

A determinação da natureza glicídica de Mo-CBP3 foi avaliada por meio

de eletroforese na presença de SDS, cujo gel foi revelado pelo método do

Ácido Periódico de Schiff (PAS), descrito por Zacharius e colaboradores (1969).

Os géis e a amostra foram preparados como descrito no item “5.3.2”, bem

como as condições de corrida utilizadas. Ao término da corrida, o gel foi


45

embebido em uma solução fixadora de ácido acético a 7,5% e, após 1 h, foi

transferido para uma solução de ácido periódico a 0,2%, na qual permaneceu

por 45 minutos, a uma temperatura de 4 °C. Em segui da, o gel foi corado com

o Reagente de Schiff (Sigma), a 4 °C, por mais 45 m inutos. O descoramento foi

feito com uma solução de metabissulfito de potássio 0,5% em HCl 0,05 M.

5.3.7 - Determinação de Carboidratos

O conteúdo de carboidratos totais neutros de Mo-CBP3 foi determinado

pelo método fenol-sulfúrico descrito por Dubois et al. (1956), tendo glucose

como açúcar padrão, adaptado para o uso de placas de microtitulação

(MASUKO et al., 2005).

5.3.8 - Determinação da Sequência NH2-terminal de aminoácidos

A seqüência de aminoácidos NH2-Terminal de Mo-CBP3 foi determinada

através do método de degradação de Edman, utilizando-se um seqüenciador

automático de proteínas (Shimadzu, modelo PPSQ). Para tanto, uma amostra

da proteína (2 mg/mL) foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida

contendo SDS (LAEMMLI, 1970) e, em seguida, eletrotransferida (sistema

“trans blot”, Multiphor II Pharmacia-LKB) para membrana de polivinil difluoreto

(PVDF). A eletrotransferência foi conduzida a 50 V, 150 mA, por 90 minutos. Ao

término, a membrana foi saturada com metanol 100%, para retirada do excesso

de glicina e, em seguida, lavada com água grau milli-Q e corada com

“Coomassie Brilliant Blue” R-250 0,1% em metanol 50% e ácido acético 1%,

por 15 minutos. Decorrido esse tempo, a membrana foi descorada com uma

solução de metanol 50% e ácido acético 1%, a qual foi trocada várias vezes até

a visualização das bandas protéicas. As regiões da membrana


46

correspondentes às bandas foram cortadas com uma lâmina de bisturi e, após

serem totalmente descoradas em tubos do tipo eppendorf, foram lavadas

exaustivamente com água grau Milli-Q e submetidas à determinação da

seqüência de aminoácidos NH2-terminal. Os derivados feniltioidantoína dos

aminoácidos (PTH-aminoácidos) foram detectados a 269 nm, após separação

em uma coluna de fase reversa C18 (4,6 x 2,5 mm), conduzida sob condições

isocráticas de acordo com as instruções do fabricante. A seqüência obtida foi

submetida ao alinhamento automático com outras sequências já depositadas

em banco de dados por meio do sistema NCBI-BLAST.

5.3.9 - Determinação da Atividade Hemaglutinante

O ensaio de atividade hemaglutinante foi realizado seguindo a

metodologia descrita por Moreira e Perrone (1977). As amostras a serem

dosadas foram submetidas a diluições seriadas em tubos de ensaio na

presença de NaCl 0,15 M (1/2, 1/4, 1/8, 1/16 etc). A 100 µL de cada diluição, foi

adicionado igual volume de uma suspensão de hemácias (2%), tratadas ou não

com a enzima proteolítica tripsina. Foram utilizados sangue de coelho e sangue

humano dos tipos A, B, AB e O. A amostra foi também testada na presença de

cátions divalentes Ca++ e Mn++ (0,005 M). Os tubos foram incubados a 37 °C,

por 30 minutos e, posteriormente, deixados em repouso por mais 30 minutos, à

temperatura ambiente, sendo, então, centrifugados a 3.000 x g, 30 segundos. A

visualização dos aglutinados foi feita a olho nu e os resultados foram expressos

em unidade de hemaglutinação (UH), definida como o inverso da maior diluição

da amostra ainda capaz de aglutinar hemácias.

A técnica utilizada para tratamento enzimático dos eritrócitos foi a

descrita por Lis e Sharon (1972). Inicialmente, as amostras de sangue foram

lavadas três vezes com NaCl 0,15 M. Em seguida, foi adicionada a enzima

tripsina na proporção de 0,1 mg para 10 mL da suspensão de eritrócitos 2%.

Essa suspensão foi incubada por 1 h, 4 °C, sob agitações ocasionais e


47

centrifugada a 3.000 x g, 5 minutos. Os eritrócitos tratados foram novamente

lavados com NaCl 0,15 M (6 vezes) e o "pellet” de células resultante suspenso

em um volume de NaCl 0,15 M para obtenção de hemácias a 2%.

5.3.10 - Determinação da Atividade de Quitinase (CH; EC 3.2.1.14)

As atividades endo- e exoquitinolíticas foram determinadas segundo o

método colorimétrico descrito por Boller (1993), usando como parâmetro a

liberação de N-acetil-D-glucosamina (NAG) a partir da ação hidrolítica das

enzimas sobre a quitina coloidal. Inicialmente, a atividade quitinolítica total foi

determinada por incubação de 250 µL da amostra com 250 µL da quitina

coloidal (BOLLER, 1992), a 37 °C, durante 2 h e, em seguida, fervidos em

banho-maria por 5 minutos. Os tubos, após resfriamento, foram centrifugados a

10.000 x g, 25 °C, por 10 minutos, e alíquotas de 300 µL foram retiradas e

incubadas com 10 µL da solução de glucoronidase (EC 3.2.1.31), a 37 °C, por

1 h. A solução de glucoronidase usada nos ensaios foi preparada por diálise da

preparação bruta de Helix pomatia (Tipe HP-2, 132.000 Unidades/ml) com

tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, e diluição (10 vezes) com o mesmo

tampão de reação. Nas atividades exoquitinolíticas, apenas 250 µL da amostra

foram incubados com 250 µL da quitina coloidal, a 37 °C, por 2 h e, após esse

tempo, os tubos foram fervidos por 5 minutos. Para avaliar a liberação de NAG,

em ambos os ensaios, 310 µL do hidrolisado foram misturados com 190 µL de

acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, e 100 µL de tetraborato de sódio e potássio

0,6 M. Os tubos foram novamente fervidos por 5 minutos, resfriados e a estes

acrescentados uma solução de p-dimetilaminobenzaldeído (DMAB), preparada

dissolvendo-se 10,0 g de DMAB em 100 mL de ácido acético glacial contendo

12,5% (v/v) de ácido clorídrico 11,5 M. As leituras foram realizadas a 585 nm

(espectrofotômetro tipo Novapesc II, Pharmacia). Para cálculo da quantidade

de açúcar liberado na reação, uma curva padrão construída com

concentrações variadas (100 a 500 µM) de N-acetil-D-glucosamina foi utilizada

(REISSIG et al., 1955). A atividade quitinolítica foi expressa em nKat/mgP,


48

onde 1 nKat equivale a 1 nmol de N-acetil-D-glucosamina liberado por

segundo.

5.3.11 - Determinação da Atividade de β-1,3-glucanase (GLU E.C. 3.2.1.6)

A atividade de β-1,3-glucanase foi avaliada de acordo com o método

descrito por Boller (1993), pelo qual se detecta a glucose liberada no meio

reacional como conseqüência da hidrólise da laminarina, usada como

substrato. A solução de laminarina (2 mg/mL), diluída em tampão acetato de

sódio 0,05 M, pH 5,2, foi aquecida a 60 °C, por 10 minutos, e exaustivamente

dialisada contra o mesmo tampão para remoção de glucose livre. Alíquotas de

100 µL da amostra Mo-CBP3 (2 mg/mL) foram incubadas com 900 µL da

solução de laminarina, a 50 °C, por 30 minutos. Em seguida, foi adicionado 1

mL da solução “D” (1 mL da solução “B” + 25 mL da solução “A”) e a mistura

incubada a 100 °C, por 20 minutos. A solução “A” co ntinha 25 g de carbonato

de sódio + 25 g de tartarato de sódio e potássio + 20 g de bicarbonato de sódio

+ 200 g de sulfato de sódio anidro + H2O grau Milli-Q q.s.p. 1000 mL. A solução

“B” continha 15 g de sulfato de cobre pentahidratado + 20 µL de ácido sulfúrico

concentrado + H2O grau Milli-Q, q.s.p. 100 mL. Após resfriamento dos tubos, foi

adicionado 1 mL da solução “C” (3 g de arseniato de sódio heptahidratado +

H2O grau Milli-Q q.s.p. 25 mL), e estes agitados até a completa remoção de

gases sendo, então, deixados em repouso por 5 minutos. As leituras de

absorbância foram feitas a 520 nm. Para cálculo da quantidade de açúcar

liberado na reação foi utilizada uma curva padrão construída a partir de

concentrações variadas de glucose (7,5 a 240 µg/mL), preparadas em tampão

acetato de sódio 0,05 M, p H 5,2. A atividade de β-1,3-glucanase foi expressa

em nKat/mgP, onde 1 nKat equivale a 1 nmol de glucose liberado por segundo.

5.3.12 - Determinação da Atividade Coagulante


49

A Determinação da atividade coagulante de Mo-CBP3 foi realizada de

acordo com o protocolo descrito por Ghebremichael e colaboradores (2005),

com algumas modificações. Uma suspensão de argila (obtida da lagoa do

Porangabussu) em água, na concentração de 5 g/100 mL, foi preparada sob

agitação contínua por 15 minutos. Em seguida, a suspensão foi deixada em

bancada, à temperatura ambiente, overnight, para sedimentar o excesso de

partículas. A absorbância a 500 nm (OD500) do sobrenadante foi de 1,296. A 2

mL do sobrenadante, em cubetas de plástico de 3 mL, foram adicionados 10 µL

de uma solução de Mo-CBP3, a 10 mg/mL, resultando numa concentração final

de 50 mg/L. O mesmo foi válido para o controle, que consistiu de uma solução

de sulfato de alumínio e potássio; este reagente é usado comercialmente para

precipitar matéria em suspensão na água durante seu tratamento para torná-la

potável. Foram feitos ainda um segundo controle, que consistiu da adição de

10 µL de água aos 2 mL de água barrenta, e um terceiro, com BSA. Após a

adição da amostra teste e controle, os sistemas foram agitados e deixados

sedimentar naturalmente, em bancada, enquanto procedidas as leituras das

absorbâncias de cada cubeta, a 500 nm. As absorbâncias foram lidas antes e

imediatamente após a aplicação das amostras, seguindo-se a cada 5 minutos,

por 2 h. Todos os testes foram feitos em triplicata. Um gráfico comparativo de

absorbâncias foi gerado a partir dos dados resultantes. Os resultados também

podem ser visualizados por fotografias no tempo final do experimento.

5.4 - Ensaios Biológicos

5.4.1 - Avaliação da Atividade Antifúngica

Cultivo dos Fungos


50

As culturas foram mantidas em meio ágar batata-dextrose (PDA), à

temperatura ambiente. O meio de cultura consistiu em 39 g de ágar batata-

dextrose (Difco) dissolvidos em 1 L de água grau Milli-Q, q.s.p., preparado sob

banho-maria com água em ebulição, sendo este meio autoclavado por 20

minutos, a 120 oC, 1,5 kgf/cm2 (14,71 x 104 Pa) e distribuído (20 mL) em placas

de Petri com 10 cm de diâmetro, nas quais o fungo foi repicado. Os “pellets”

repicados do meio de cultura foram colocados no centro das placas de Petri,

que foram fechadas sob condições estéreis em capela de fluxo laminar.

Obtenção dos Esporos

Após os fungos terem tomado todo o diâmetro da placa de Petri,

aproximadamente doze dias do repique (cultura fresca), essas foram abertas

em câmara de fluxo laminar e adicionados 5 mL de água grau Milli-Q. Com o

auxílio de uma alça de Drigalski, manuseada suavemente sobre a superfície da

cultura, os esporos foram retirados deixando-os suspensos em água. A

suspensão contida em cada placa foi filtrada em malha de nylon para a

remoção das hifas. A concentração dos esporos foi ajustada para 2,0 x 105

esporos/mL após contagem em câmara de Neubauer, ao microscópio óptico

(Olympus System Microscope BX 60), com aumento de 400 x.

Ensaio de Inibição da Germinação dos Esporos de Fusarium solani

O efeito in vitro da proteína sobre a germinação de esporos foi

determinado usando-se placas de Petri de poliestireno com depressões

(Prolab), seguindo metodologia adaptada por Ji e Kué (1996), como descrito a

seguir. 10 µL de uma suspensão de esporos de F. solani (2 x 105 esporos/mL)

foram adicionados por célula. 10 µL da solução de Mo-CBP3, nas


51

concentrações de 0,1, 0,075, 0,05 e 0,025 mg/mL (1, 0,75, 0,5 e 0,25 µg), em

água, foram adicionados às células contendo a suspensão de esporos.

Também foram testadas as amostras nas concentrações anteriores pré-

incubadas com o açúcar N-acetil-D-glucosamina 0,15 M, por 30 minutos, ou

pré-aquecidas a 98 °C por 1 h. Para fins de control e, foram utilizados água

destilada, peróxido de hidrogênio 0,1 M e N-acetil-D-glucosamina 0,15 M. Cada

tratamento e controle foram realizados em triplicata. As placas foram deixadas

em recipiente contendo papel de filtro embebido em água destilada e

incubadas no escuro, à temperatura ambiente, sendo a análise monitorada a

partir de 24 h em microscópio óptico (Olympus System Microscope BX 60).

Esporos foram considerados germinados caso apresentassem tubo germinativo

de, ao menos, duas vezes o seu comprimento.

Ensaio de Inibição do Crescimento Micelial

O ensaio de inibição do crescimento fúngico foi conduzido

essencialmente como descrito por Mauch et al. (1988) e Broekaert et al. (1989),

adaptado para o uso de placas de microtitulação (JI e KUÉ, 1996). Foi utilizada

a mesma espécie de fungo. 200 µL de ágar batata-dextrose (Difco Lab.) foram

adicionados aos poços das placas. Após a solidificação do meio, 10 µL de uma

suspensão de esporos na concentração de 2,0 x 105 esporos/mL foram

adicionados a cada poço. Os esporos foram postos para germinar no escuro, à

temperatura ambiente. Doze horas depois, foram adicionadas as amostras de

Mo-CBP3 dissolvidas em água grau Milli-Q estéril (solução filtrada em

membrana de 0,22 µm, Millipore) nas concentrações finais de 0,5, 0,1 e 0,05

mg/mL. Cada tratamento foi conduzido com três repetições. Os controles

utilizados foram água grau Milli-Q e H2O2 0,1 M. O crescimento fúngico foi

monitorado visualmente.

Para avaliar mais detalhadamente o efeito de Mo-CBP3 sobre as hifas

jovens de F. solani, um novo protocolo experimental foi desenvolvido. 40 µL da


52

suspensão de esporos a 2 x 105 esporos/mL foram colocados em tubos do tipo

“eppendorf” e deixados germinar no escuro, à temperatura ambiente. Ao final

de 24 h, os tubos foram centrifugados a 5.000 x g, por 1 minuto, para que as

hifas se depositassem no fundo do tubo e o excesso de água fosse retirado. O

“pellet” foi transferido para placas de Petri com meio PDA. 20 µL das amostras

e controles foram adicionados às hifas somente no meio de cultura. As placas

foram vedadas e o resultado visualizado após 48 h, sendo monitoradas por

uma semana. Para quantificação dos dados, os micélios formados em cada

tratamento e controle, tiveram seus raios medidos com o auxílio de um

paquímetro (Vonder) a cada 24 h, por cinco dias.

5.4.2 - Estudos do Mecanismo de Ação

Determinação da Natureza da Ação Antifúngica: Atividade Fungicida x

Fungistática

Para melhor compreender o tipo de ação antifúngica que Mo-CBP3

desempenha sobre os esporos de F. solani, foi desenvolvido um protocolo

experimental que atendesse às necessidades de elucidação de nossas

perguntas. O ensaio foi procedido em condições estéreis, tendo sido as

amostras filtradas em membrana de 0,22 µm e tudo manuseado em câmara de

fluxo laminar. 40 µL da suspensão de esporos a 2 x 105 esporos/mL foram

colocados em tubos do tipo “eppendorf” e, em seguida, adicionados 40 µL de

uma solução de Mo-CBP3 em água, nas concentrações finais de 0,1 e 0,05

mg/mL. Os tubos foram levemente agitados em vortex e deixados em repouso,

no escuro, à temperatura ambiente, por 24 h. As amostras foram também

testadas após tratamento a 98 °C, por 1 h ou depois de incubação com N-

acetil-D-glucosamina 0,15 M, por 30 minutos, a 37 °C. Os controles utilizados

foram água, peróxido de hidrogênio 0,1 M e N-acetil-D-glucosamina 0,15 M.


53

Tratamentos e controles foram feitos em triplicata. Ao final de 24 h, os tubos

eppendorf foram centrifugados a 5.000 x g, por 1 minuto, para que os esporos

se depositassem no fundo do tubo. Com o intuito de se retirar o excesso de

proteína da presença dos esporos, e de saber se, sendo estes transferidos de

volta para um ambiente adequado ao seu desenvolvimento seriam ainda

capazes de crescer, ou não, foram desprezados, com a ajuda de uma pipeta,

60 µL do sobrenadante. Em seguida, foram acrescentados 20 µL de água e

seguiu-se nova agitação e centrifugação. 20 µL do sobrenadante foram

desprezados e o material restante precipitado foi homogeneizado com uma

pipeta e transferido para placas de Petri contendo meio de cultura ágar-batata-

dextrose (PDA), solidificado. As placas foram vedadas com filme plástico e o

resultado foi visualizado após 48 h.

Ensaio de Inibição da Germinação de Esporos e do Crescimento do Oomiceto

Pythium oligandrum

Para saber se a ação de Mo-CBP3 envolve sua interação com a quitina

da parede celular, os experimentos descritos nos subtópicos do tópico “5.4.1”

foram realizados também com o oomiceto Pythium oligandrum, o qual não

apresenta quitina na parede celular, mas sim, celulose.

Ensaio de Inibição da Acidificação do Meio, Induzida por Glucose

Este ensaio foi conduzido para avaliar a influência de Mo-CBP3 sobre as

bombas de prótons (H+ATPases) presentes na membrana celular do esporo do

fungo F. solani. O influxo de glucose para o interior da célula resulta num efluxo

de H+ para o meio externo, e, conseqüente acidificação do meio, em condições

normais. O experimento foi realizado como descrito por Agizzio e


54

colaboradores (2003), tendo sido modificado para o uso com F. solani. O

cultivo do fungo e a obtenção dos esporos se deram como descritos

anteriormente. A 3.990 µL de uma suspensão de esporos (2 x 105 esporos/mL)

em tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 7,2, foram adicionados 10 µL de diferentes

quantidades de Mo-CBP3 dissolvida no mesmo tampão, de modo que as

concentrações finais fossem de 0,1 e 0,05 mg/mL. No controle, os esporos não

entraram em contato com a proteína. Após um período de incubação de 2 h,

em frascos de vidro de 10 mL, sob agitação (barra de 6 mm) e à temperatura

ambiente, o pH do meio foi medido. Em seguida, foi adicionado 1 mL de uma

solução de glucose 0,5 M, sempre sob agitação e, imediatamente depois, foi

novamente medido o pH do meio e a cada 5 minutos, por 1 h. Os testes foram

feitos em triplicata e os resultados representados como percentual de

acidificação em relação ao controle, considerado 100% de acidificação.


55

66.. RREESSUULLTTAADDOOSS


56

6.1 - Purificação da Proteína Ligante à Quitina Mo-CBP3

O protocolo de extração e purificação da proteína ligante à quitina

presente nas sementes de Moringa oleifera, Mo-CBP3, está sumarizado nas

FIGURAS 2, 3 e 4, mostradas em “Métodos”. O teor médio de proteína extraída

da farinha de sementes correspondeu a 216,44 mgP/gF. As albuminas

representaram 144,71 mgP/gF e a fração 0-90% apresentou um teor médio de

proteínas de 122,33 mgP/gF, representando, assim, 56,52% das proteínas do

extrato total.

A F 0-90% (835 mgP) quando submetida à cromatografia de afinidade em

coluna de quitina, previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH

8,0, contendo NaCl 0,15 M, resultou na obtenção de um material protéico não

retido, retirado em um único pico com o tampão de equilíbrio, e de duas outras

frações protéicas retidas. Parte dessas proteínas adsorvidas à quitina foi eluída

com solução de N-acetil-D-glucosamina 0,1 M, e a outra pelo tratamento da

coluna, em seguida, com ácido acético 0,05 M, pH 3,0. As siglas PNAG e PAC

foram arbitrariamente adotadas para designar as frações protéicas eluídas com

N-acetil-D-glucosamina e ácido acético, respectivamente, e serão, doravante,

empregadas neste trabalho (FIGURA 5). O teor médio de proteína obtido para

PNAG (fração utilizada para dar prosseguimento à purificação de Mo-CBP3) foi

de 6,5 mgP/gF. O rendimento protéico em relação ao extrato total

correspondeu a 3,0%.

Na tentativa de avançar na purificação da fração PNAG, várias matrizes

cromatográficas foram utilizadas, sem êxito: troca iônica (DEAE-celulose, CM-

celulose e Resource S acoplada a FPLC), exclusão molecular (Sephadex G-

50), interação hidrofóbica (Phenil-Sepharose e C-18 e C2-18 acopladas a

HPLC). Os gráficos de tais cromatografias encontram-se no Anexo. No entanto,

a cromatografia realizada em Resource S possibilitou a purificação do material

de interesse. A fração PNAG (15 mgP) aplicada à coluna de troca catiônica,

Resource S (Pharmacia Biotech), equilibrada com tampão acetato de sódio

0,05 M, pH 5,2 foi fracionada em um pico não retido (Mo-CBP1) e em mais


57

FIGURA 5 - Cromatografia de afinidade em coluna de quitina. Amostra (835

mg) da fração albumina concentrada com sulfato de amônio (F0-

90%), obtida a partir do extrato total de farinha de sementes de

Moringa oleifera, foi aplicada em coluna de quitina (31,0 x 3,0 cm)

equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl

0,15 M. Pico 1 (P1) representa o material não retido eluído com

tampão de equilíbrio; Picos 2 (PNAG) e 3 (PAC) correspondem às

frações protéicas eluídas com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M e

ácido acético 0,05 M, respectivamente. Fluxo: 60 mL/h; Frações:

3,5 mL.

0

1

2

3

0 50 100 150 200 250 300

Ab

s 2

80

nm

Frações (3,5 mL)

Glc-Nac0,1 M

Ác. Acético 0,05 M

P1

PNAG

PAC


58

quatro outros picos retidos (Mo-CBP2 a Mo-CBP5) (FIGURA 6). Este padrão de

fracionamento obtido permitiu responder ao primeiro dos três questionamentos

formulados no início do trabalho. Das frações retidas na Resource S, aquela

eluída com o tampão de equilíbrio contendo NaCl 0,5 M se apresentou pura e

ativa contra F. solani. Assim sendo, essa proteína passou a ser chamada de

Mo-CBP3, sendo submetida às etapas de caracterização bioquímica e

funcional. O teor protéico médio calculado para a proteína purificada Mo-CBP3

foi de 1,17 mgP/gF, representando um rendimento final de 0,54% das proteínas

do extrato total (TABELA 3).

6.2 - Caracterização Bioquímica de Mo-CBP3

6.2.1 - Massa Molecular de Mo-CBP3 por Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

na Presença de SDS

A FIGURA 7 mostra o perfil eletroforético da fração PNAG e de Mo-CBP3

sob condições desnaturantes (presença de SDS). A massa molecular aparente

da proteína foi em torno de 18,0 kDa, na ausência do agente redutor β-

mercaptoetanol, e 9,0 kDa, na presença deste. A comparação dos perfis

eletroforéticos na presença e ausência de β-mercaptoetanol sugere que Mo-

CBP3 é uma proteína oligomérica, porém, formada de subunidades idênticas.

Estas, provavelmente, estariam unidas por pontes dissulfeto, uma vez que o

tratamento com o agente redutor resultou numa única banda protéica. É

bastante provável que essas proteínas predominem na forma oligomérica nas

sementes, já que, durante o procedimento de purificação, as amostras obtidas

em cada etapa foram exaustivamente dialisadas em sacos com poros de

exclusão igual a 12 kDa, o que acarretaria a saída de proteínas com massas

moleculares menores ou iguais a esta para o meio.


59

FIGURA 6 - Cromatografia de troca iônica em coluna Resource S, acoplada a

um sistema de FPLC. A fração retida na matriz de quitina e eluída

com N-acetil-D-glucosamina (PNAG; 15 mg), oriunda de sementes

de Moringa oleifera, foi aplicada na coluna (1,0 mL) de Resource

S, equilibrada com tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. Mo-

CBP1 representa o material não retido eluído com tampão de

equilíbrio; Mo-CBP2, Mo-CBP3, Mo-CBP4 e Mo-CBP5

correspondem aos picos eluídos com adição de 0,4, 0,5, 0,6 e 0,7

M de NaCl ao tampão, respectivamente. Fluxo: 1 mL/min; Frações:

2,0 mL.

0

20

40

60

80

100

120

0

0,03

0,06

0,09

1 11 21 31 41 51 61 71 81

Per

cent

ual d

e N

aCl 1

,0 M

no

tam

pão

(%)

Abs

280

nm

Frações (2,0 mL)

Mo-CBP1

Mo-CBP2Mo-CBP3

Mo-CBP4

Mo-CBP5


60

TABELA 3 - Teor protéico e rendimento das diferentes frações resultantes do

processo de obtenção de Mo-CBP3

Amostras

Teor Protéico

(mgP/gF) a Rendimento (%) b

Extrato total 216,44 ± 4,72 100,0

Albuminas 144,71 ± 1,74 66,63

F 0-90% 122,33 ± 2,04 56,52

PNAGc (Quitina) 6,50 ± 0,38 3,00

Mo-CBP3d (Resource S) 1,17 ± 0,07 0,54

Os resultados representam a média e o desvio padrão de seis experimentos

similares. a Valores calculados pelo método de Bradford (1976). Quantidade total de

proteína recuperada (mg), em cada etapa de purificação, a partir de 1 g de

farinha de Moringa oleifera. b Recuperação da proteína em cada etapa de purificação (extrato bruto igual a

100%). c Proteína ligante à matriz de quitina eluída com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M. d Proteína ligante à quitina eluída da Resource S com tampão acetato de sódio

0,05 M, pH 5,2, contendo 0,5 M de NaCl.

Propriedades Bioquímicas... Gifoni, J. M

PNAG s/β c/β

FIGURA 7 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) sob condições

desna

mercaptoetanol. As proteínas foram coradas com

Brilliant Blue” R

Marcadores de massa molecular

ausência e presença de

Mo-CBP

presença de

Marcadores de massa molecular. C) PAGE

1: marcadores de massa molecular (diferentes fragmentos de

globina d

Raia 2:

A

- 18,0 kDa

9,0 kDa -


Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) sob condições

desnaturantes (PAGE-SDS), na ausência e presença de

mercaptoetanol. As proteínas foram coradas com

Brilliant Blue” R-250 a 0,05%. A) PNAG (10 µg). Raia 1

Marcadores de massa molecular; Raias 2 e 3

ausência e presença de β-mercaptoetanol, respectivamente. B)

CBP3 (10 µg). Raias 1 e 2 – Mo-CBP

presença de β-mercaptoetanol, respectivamente

Marcadores de massa molecular. C) PAGE-SDS (17,5%). Raia


globina de coração de cavalo. A proteína inteira tem 16,9 kDa).

Raia 2: Mo-CBP3 em condições redutoras.

B

18,0 kDa

Mo-CBP3

s/β c/β


61

Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) sob condições

SDS), na ausência e presença de β-

mercaptoetanol. As proteínas foram coradas com “Coomassie

(10 µg). Raia 1 -

; Raias 2 e 3 - PNAG na

, respectivamente. B)

CBP3 na ausência e

mercaptoetanol, respectivamente; Raia 3 -

SDS (17,5%). Raia


e coração de cavalo. A proteína inteira tem 16,9 kDa).

1 2

C

Mo-CBP3 c/β


62

6.2.2 - Massa Molecular de Mo-CBP3 por Cromatografia de Exclusão Molecular

Relacionando-se os volumes de eluição e massas moleculares dos

marcadores ao volume de eluição da proteína, por cromatografia de exclusão

molecular, a massa molecular calculada de Mo-CBP3 foi de, aproximadamente,

14,34 kDa (FIGURA 8).

6.2.3 - Ponto Isoelétrico (pI) de Mo-CBP3

Após análise do disco obtido através da eletroforese 2D de Mo-CBP3

(ImageMaster 2D Platinum v6.0 - Amersham Biosciences), o ponto isoelétrico

determinado para a proteína foi de, aproximadamente, 10,8 (FIGURA 9).

6.2.4 - Comportamento de Mo-CBP3 em Eletroforese Nativa

Dada a natureza extremamente básica de Mo-CBP3, sua visualização

em gel de poliacrilamida, sob condições nativas, só foi possível utilizando-se

um protocolo para gel ácido, apropriado para proteínas básicas. Em condições

nativas, a proteína se comporta como sendo de cadeia única e não tem a

mobilidade muito alterada em relação ao gel com SDS. O resultado pode ser

observado na FIGURA 10.

6.2.5 - Presença de Carboidratos Covalentemente Ligados a Mo-CBP3


63

FIGURA 8 - Cálculo da massa molecular de Mo-CBP3 por cromatografia de

exclusão molecular em coluna Superose 12 HR 10/30, acoplada a

um sistema de FPLC. Uma amostra (200 µg P) de Mo-CBP3 foi

aplicada na coluna (24 mL) equilibrada com tampão acetato de

sódio 0,05 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,15 M, previamente

calibrada com as proteínas de massas moleculares conhecidas.

Fluxo: 0,3 mL/min. Frações: 1,5 mL/tubo.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 5 10 15 20 25

Ab

s 2

80

nm

Frações (1,5 mL)

Mo-CBP3


64

FIGURA 9 - Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (15%) de Mo-

CBP3 (100 µg). A massa molecular e o ponto isoelétrico (pI)

calculados foram 14,3 kDa e 10,8, respectivamente.

pH 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 kDa

97,0

67,0

45,0

Mo-CBP3 14,3 kDa

pI 10,8


FIGURA 10 - Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) para proteínas

básicas, sob condições nativas.

condições aplicadas foram 160 V e 30 mA, por 5 h, a 4 °C. Ao

término da corrida, o

Blue” R

ácido acético, água destilada e metanol (1:8:3,5, v/v/v).


Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) para proteínas

básicas, sob condições nativas. Mo-CBP


término da corrida, o gel foi corado com “Coomassie Brilliant

Blue” R-250 a 1,0%, durante 2 h e descorado em solução de



65

Eletroforese em gel de poliacrilamida (15%) para proteínas

CBP3 (20 µg). As


“Coomassie Brilliant

250 a 1,0%, durante 2 h e descorado em solução de



66

Eletroforese na presença de SDS, revelada pelo método do Ácido

Periódico de Schiff (PAS) (FIGURA 11), mostrou que Mo-CBP3 trata-se de uma

glicoproteína. O teor de carboidratos, analisado segundo Dubois (1956), foi de

2,5% de açúcares neutros.

6.2.6 - Sequência NH2-terminal de Mo-CBP3

Uma vez confirmada, através de PAGE-SDS, a pureza de Mo-CBP3,

esta foi usada para a determinação da seqüência de aminoácidos NH2-

terminal. A seqüência NH2-terminal obtida foi CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ,

com 22 aminoácidos (TABELA 4). Ao ser submetida ao alinhamento automático

com outras seqüências já depositadas em banco de dados (NCBI/BLAST), a

seqüência de Mo-CBP3 apresentou 84% de identidade com uma proteína

recombinante com atividade floculante-coagulante de sementes de M. oleifera

(BROIN et al., 2002). Ao mesmo tempo, apresentou 73% de identidade com

outras três proteínas coagulantes de moringa isoladas por Gassenschmidt e

colaboradores (1995).

6.2.7 - Atividade Hemaglutinante

Mo-CBP3 (2 mg/mL) não foi capaz de aglutinar eritrócitos de coelho nem

de humanos, quer do tipo A, B, AB ou 0, mesmo quando tratados com tripsina

e na presença de cátions divalentes (Ca++ e Mn++).

6.2.8 - Atividade de Quitinase (CH; EC 3.2.1.14)


67

FIGURA 11 - Eletroforese de Mo-CBP3 (10 µg) em gel de poliacrilamida (15%)

na presença de SDS. O gel foi revelado pelo método do Ácido

Periódico de Schiff (PAS), no qual as glicoproteínas são coradas.


68


69

Nas condições testadas, Mo-CBP3 não apresentou atividade quitinolítica,

apesar de ter, pelo menos, um sítio de ligação à quitina.

6.2.9 - Atividade de β-1,3-glucanase (GLU E.C. 3.2.1.6)

Seguindo o procedimento descrito no item “5.3.11”, Mo-CBP3 não

apresentou atividade β-1,3-glucanásica.

6.2.10 - Atividade Coagulante

Durante todo o tempo do experimento, os controles que continham água

e BSA adicionados à suspensão de argila permaneceram com a absorbância

(500 nm) praticamente inalterada, sendo lenta a sedimentação. O controle

positivo com sulfato de alumínio e potássio apresentou queda constante na

absorbância, desde os primeiros minutos do experimento, até atingir

absorbância igual a zero dentro de 2 h. Mo-CBP3 comportou-se de maneira

similar ao AlK(SO4)2, na mesma concentração, mostrando-se tão eficiente

quanto este na capacidade de coagular matéria em suspensão na água. Um

gráfico comparativo de absorbâncias (FIGURA 12) foi gerado a partir dos

dados obtidos.

6.3 - Ensaios Biológicos

6.3.1 - Atividade Antifúngica


70

FIGURA 12 - A) Atividade de coagulação de matéria em suspensão de Mo-

CBP3. 10 µL de uma solução de Mo-CBP3 (10 mg/mL) foram

adicionados a 2 mL de uma suspensão de argila em H2O

destilada (50 mg/mL), cuja absorbância inicial, a 500 nm, foi

1,296. Como controle negativo e positivo, respectivamente,

foram utilizados albumina sérica bovina (BSA) e sulfato de

alumínio e potássio [AlK(SO4)2], ambos na mesma concentração

de Mo-CBP3. H2O destilada foi também usada como controle

negativo. A atividade foi medida por meio de monitoramento da

Abs500 nm a cada 5 minutos, por 2 h. B) Fotografia ilustrativa das

cubetas que continham 2,0 mL de suspensão de argila, após 2 h

da adição dos controles e amostra-teste. Cubeta 1 – Água;

cubetas 2, 3, 4 e 5 - Suspensão de argila adicionada de água

destilada, Mo-CBP3, AlK(SO4)2 e BSA, respectivamente.

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

Abs

500

nm

Tempo (min)

Argila

AlKSO4

Mo-CBP

BSA

1 2 3 4 5

A

B

3


71

Inibição da Germinação dos Esporos de Fusarium solani

O efeito in vitro de Mo-CBP3 sobre a germinação de esporos de F. solani

está mostrado na FIGURA 13. O ensaio durou 48 h, desde o contato dos

esporos com as amostras. Foram testadas as concentrações de 0,1, 0,075,

0,05 e 0,025 mg/mL da proteína pura. A menor concentração utilizada capaz de

causar inibição da germinação dos esporos foi 0,05 mg/mL, sendo total a

inibição (100% dos esporos testados). Na concentração de 0,025 mg/mL, todos

os esporos germinaram. Para avaliar a termoestabilidade da proteína, esta foi

aquecida a 98 °C durante os intervalos de tempo de 10, 20, 30 e 60 minutos. O

aquecimento da proteína a 98 °C, por 1 h, não foi s uficiente para desestabilizar

a molécula, mantendo sua atividade antifúngica mesmo nestas condições. Ao

ser pré-incubada com o açúcar N-acetil-D-glucosamina por 30 minutos, a 37

°C, Mo-CBP3 não teve sua ação revertida, mantendo-se ainda capaz de inibir a

germinação dos esporos.

Inibição do Crescimento Micelial

O resultado do ensaio em placas de microtitulação foi observado 48 h

após a adição dos controles e tratamentos. Mo-CBP3 não inibiu o crescimento

micelial de F. solani nas condições do ensaio. Contudo, a avaliação da inibição

do crescimento das hifas jovens pela medição do raio micelial (FIGURAS 14 e

15) mostrou que Mo-CBP3 não pára o crescimento do fungo, mas o inibe por

meio do retardo deste crescimento e que, o retardo é tanto maior quanto maior

for a dose administrada. A proteína pré-aquecida a 98 °C por 1 h ou pré-

incubada com N-acetil-D-glucosamina 0,15 M não inibiu o crescimento das

hifas jovens de F. solani, nas condições do experimento.


72

FIGURA 13 - Fotomicrografia do ensaio de inibição da germinação dos

esporos de Fusarium solani. A) H2O destilada. B) Mo-CBP3

0,05 mg/mL (0,5 µg/2000 esporos). C) Mo-CBP3 (0,05

mg/mL) após aquecimento 98 °C, por 1 h. D) Mo-CBP3 (0,05

mg/mL) pré-incubada com o açúcar N-acetil-D-glucosamina

0,15 M. Visualização em microscópio óptico com 48 h.

Aumento de 400 x.

A B

C D


73

H2O NAG 0,15 M

Mo-CBP3 0,1 mg/mL

FIGURA 14 - Avaliação do efeito de Mo-CBP3 sobre o crescimento de hifas

jovens de Fusarium solani. 48 h após a germinação dos

esporos, o excesso de H2O foi retirado da presença do fungo

por meio de centrifugação a 5000 x g, 1 min, desprezando-se o

sobrenadante. Após homogeneização, as hifas foram

transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura

ágar-batata-dextrose (PDA), com o auxílio de uma pipeta.

Foram adicionadas as amostras-teste e controle aos fungos já

no meio de cultura. O resultado foi visualizado 48 h após a

transferência. As diferentes amostras avaliadas foram: 1) H2O;

H2O2 0,1 M; Mo-CBP3 0,1 mg/mL e Mo-CBP3 0,05 mg/mL. 2)

NAG 0,15 M; Mo-CBP3 (0,1 mg/mL) 98 °C, 1 h; Mo-CBP3 (0,1

mg/mL) + NAG 0,15 M.

1 2

Mo-CBP3 0,05 mg/mL

H2O2 0,1 M

Mo-CBP3 0,1 M, 98°C, 1 h

Mo-CBP3 0,1 M, + NAG 0,15 M


74

FIGURA 15 - Avaliação do efeito inibitório de Mo-CBP3 sobre o crescimento

das hifas jovens de Fusarium solani. O monitoramento do

crescimento do micélio foi feito a cada 24 h por meio da medição

do raio micelial. P0,1 e P0,05 correspondem à proteína Mo-CBP3

nas concentrações de 0,1 mg/mL e 0,05 mg/mL,

respectivamente. Em azul é mostrado o desenvolvimento normal

do fungo na ausência da proteína.

0

5

10

15

20

25

30

35

72 96 120

Ra

io d

o m

icé

lio

(m

m)

Tempo (h)

água

P 0.05

P 0.1


75

6.3.2 - Estudos do Mecanismo de Ação

Natureza da Ação Antifúngica: Atividade Fungicida x Fungistática

O objetivo deste experimento foi verificar se os esporos de F. solani

ainda seriam capazes de voltar a germinar após serem transferidos do meio

hostil na presença de Mo-CBP3 para um ambiente com condições ideais para a

germinação como o meio de cultura PDA livre de proteína. Analisando as

FIGURAS 16 e 17, o tipo de ação antifúngica que Mo-CBP3 (0,1 mg/mL)

exerceu sobre os esporos de F. solani foi fungicida, uma vez que, retirados da

presença da proteína e de volta às condições favoráveis à sua germinação, os

esporos não mais foram capazes de se desenvolver. Entretanto, quando na

concentração de 0,05 mg/mL, os esporos conseguiram germinar, porém, com

um considerável retardo em relação ao controle com água. Quando os esporos

foram tratados com a proteína (0,1 mg/mL) aquecida a 98 °C, por 1 h, ainda

assim tiveram sua germinação inibida em 100% (FIGURA 13 C). No entanto,

ao serem devolvidos a condições ideais de germinação, na ausência da

proteína aquecida, se desenvolveram normalmente. A pré-incubação de Mo-

CBP3 (0,1 mg/mL) com N-acetil-D-glucosamina 0,15 M não reverteu a atividade

da proteína e a germinação dos esporos se manteve inibida mesmo depois da

transferência para a placa com meio de cultura.

Efeito Inibitório de Mo-CBP3 sobre a Germinação de Esporos e o Crescimento

do Oomiceto Pythium oligandrum

Para saber se Mo-CBP3 age no fungo por meio da interação com a

quitina da parede celular, os experimentos descritos nos subtópicos do tópico


76

H2O NAG 0,15 M

Mo-CBP3 0,05 mg/mL

FIGURA 16 - Avaliação da atividade fungicida x fungistática de Mo-CBP3

sobre a germinação dos esporos de Fusarium solani. 48 h

após a inibição (ou não) da germinação dos esporos, o

excesso de amostra foi retirado da presença do fungo por meio

de centrifugação a 5000 x g, 1 min, desprezando-se o

sobrenadante. O precipitado foi ressuspenso em H2O (20 µL) e

transferido para placas de Petri contendo meio de cultura ágar-

batata-dextrose (PDA). O resultado foi visualizado 48 h após a

transferência. As diferentes amostras avaliadas foram: 1) H2O;

H2O2 0,1 M; Mo-CBP3 0,1 mg/mL e Mo-CBP3 0,05 mg/mL. 2)

NAG 0,15 M; Mo-CBP3 (0,1 mg/mL) 98 °C, 1 h; Mo-CBP3 (0,1

mg/mL) + NAG 0,15 M.

1 2

Mo-CBP3 0,1 mg/mL

H2O2 0,1 M

Mo-CBP3 0,1 M, 98°C, 1 h

Mo-CBP3 0,1 M, + NAG 0,15 M


77

FIGURA 17 - Avaliação da recuperação da capacidade de germinação dos

esporos de Fusarium solani quando retirados da presença de

Mo-CBP3. O monitoramento do crescimento do micélio foi feito a

cada 24 h por meio da medição do raio micelial. P0,1

corresponde à proteína Mo-CBP3 na concentração de 0,1

mg/mL, quantidade que foi capaz de matar, completamente, os

esporos do fungo. P0,05 corresponde à Mo-CBP3 na

concentração de 0,05 mg/mL. Em azul, é mostrado o

desenvolvimento normal do fungo na ausência da proteína.

0

5

10

15

20

25

30

35

72 96 120

Ra

io d

o m

icé

lio

(m

m)

Tempo (h)

água

P 0,05

P0,1


78

“5.4.1” foram realizados também com a espécie de oomiceto Pythium

oligandrum, que não apresenta quitina na parede celular, mas sim, celulose.

Mo-CBP3 não apresentou nenhum efeito inibitório sobre os esporos ou hifas da

espécie (FIGURA 18), quando testada nas mesmas condições e concentrações

utilizadas para a espécie F. solani.

Inibição da Acidificação do Meio, Induzida por Glicose

Como mostrado na FIGURA 19, Mo-CBP3 foi capaz de inibir cerca de

80% da acidificação do meio, por esporos de F. solani, induzida por glicose, o

que sugere a influência de Mo-CBP3 sobre as bombas de prótons (H+ATPases)

presentes na membrana celular dos esporos deste fungo.


FIGURA 18 - Efeito de

esporos de

incapaz de causar efeito inibitório sobre os esporos ou hifas

do oomiceto. A) H

µg/2000 esporos). Fotografia em tamanho real.


Efeito de Mo-CBP3 (0,1 mg/mL) sobre a germinação dos

esporos de Pythium oligandrum. Após 48 h: a proteína foi

capaz de causar efeito inibitório sobre os esporos ou hifas

do oomiceto. A) H2O destilada. B) Mo-CBP


A B

Mo-CBP3

0,1 mg/mL


79

(0,1 mg/mL) sobre a germinação dos

. Após 48 h: a proteína foi

capaz de causar efeito inibitório sobre os esporos ou hifas

3 0,1 mg/mL (1



80

FIGURA 19 - Alteração no pH do meio induzida por glucose 0,5 M sobre

esporos de Fusarium solani na presença da proteína Mo-CBP3.

Os esporos (2,0 x 105/mL) foram incubados com a proteína (50

µg/mL) num volume final de 4 mL em Tris-HCl 0,005 M, pH 7,2,

por 2 h. 1 mL de glucose 0,5 M foi adicionado ao meio e o pH

foi medido a cada 5 minutos por 1 h. O ensaio foi feito em

triplicata.

0

20

40

60

80

100

Controle Mo-CBP3

Per

cent

ual d

e A

cidi

ficaç

ão d

o M

eio

(%)


81

77.. DDIISSCCUUSSSSÃÃOO


82

Este trabalho relata a purificação, bem como a caracterização físico-

química e biológica, de uma proteína ligante à quitina, isolada de sementes de

Moringa oleifera Lam., denominada de Mo-CBP3 (Mo: M. oleifera e CBP: “Chitin

Binding Protein”). A designação “3” é proveniente do fato de que a proteína em

estudo, Mo-CBP3, é eluída no terceiro pico da cromatografia em coluna de

Resource S, que compreende uma etapa crucial em seu processo de

purificação.

O procedimento de extração de proteínas da farinha de sementes de

moringa resultou na obtenção de quantidade considerável de proteína, tendo o

extrato total apresentado teor médio de 216,44 ± 4,72 mgP/gF. Este resultado é

condizente com os elevados teores de proteína encontrados por

Ramachandran et al. (1980), Oliveira et al. (1999) e Anwar e Bhanger (2003),

mostrados na TABELA 1. Os resultados obtidos nesses estudos mostraram

que as sementes de moringa possuem um teor de proteína capaz de elevá-las

ao patamar de algumas leguminosas e cereais de grande importância na

alimentação humana, como a soja (MAEHLER et al., 2003) e o feijão comum

(MESQUITA et al., 2007). Gifoni (2005) encontrou um teor médio de proteínas

do extrato total de sementes de moringa igual a 75,74 ± 5,85 mgP/gF. O atual

teor calculado, cerca de 2,8 vezes (ou 190,5%) maior para o mesmo extrato,

pode ser explicado pela diferença no local e na época do ano em que a coleta

das sementes foi realizada, juntamente com um maior rigor no procedimento de

extração.

Após a etapa de separação das frações albumina e globulina, o teor

médio de proteínas da primeira fração foi calculado como sendo de 144,71 ±

1,74 mgP/gF, o que resultou em um rendimento de 66,63% de albumina em

relação ao extrato total. O processo de concentração acarretou uma pequena

perda de proteína, em torno de 15,5%, passando a ser de 122,33 ± 2,04

mgP/gF o teor médio calculado para a F 0-90%.

A cromatografia de afinidade da fração F 0-90% em coluna de quitina

mostrou que existe diferença na intensidade de interação com a matriz, entre

as frações PNAG e PAC. PNAG foi eluída da coluna por meio da competição pelo

sítio de ligação da proteína entre o açúcar e a matriz. Entretanto, PAC parece


83

interagir mais fortemente com a coluna, pois N-acetil-D-glucosamina, na

concentração 0,1 M, não foi forte o suficiente para desprendê-la. Sua eluição

foi possível apenas através da adição de uma solução bastante ácida (ácido

acético 0,05 M, pH 3,0). Somente o abaixamento do pH foi capaz de eluir PAC

da matriz, provavelmente, devido à conseqüente desnaturação da proteína,

abrindo sua estrutura tridimensional e alterando a conformação do sítio de

interação. O procedimento de diálise exaustiva das proteínas ligantes à quitina

(CBP; “Chitin Binding Proteins”), após serem eluídas da coluna, contra água

destilada, deve ter sido capaz de promover a renaturação das proteínas, devido

à “normalização” do pH, voltando estas à sua forma nativa.

Considerando juntas, as frações PNAG e PAC, pode ser afirmado que as

proteínas ligantes à quitina de sementes de M. oleifera correspondem a pouco

mais de 30% das proteínas do extrato total, bem como a 53,58% (ou seja, mais

da metade) das proteínas presentes na F 0-90%. Este resultado mostra que as

proteínas ligantes à quitina estão presentes em abundância nas sementes de

moringa, em relação às demais. Isoladamente, PNAG perfaz 5,31% das

proteínas da fração F 0-90%, enquanto PAC, 48,27%. A quantidade de proteína

obtida pelo tratamento da coluna com ácido acético é cerca de nove vezes

maior do que aquela retirada por competição com o monossacarídeo N-acetil-

D-glucosamina.

A fração escolhida para dar prosseguimento à purificação de Mo-CBP3

foi PNAG, por se tratar de um material eluído estritamente por afinidade –

portanto, mais puro – uma vez que para a eluição foi utilizado o monômero da

quitina, o monossacarídeo N-acetil-D-glucosamina, e não, a alteração de pH

referente ao segundo pico.

Ao ser aplicada em coluna de troca catiônica, Resource S, a fração PNAG

(15 mgP) resultou em um pico não retido (contendo proteínas de carga

negativa nas condições da corrida) e quatro picos retidos (FIGURA 6), dos

quais o segundo correspondeu à proteína Mo-CBP3, eluída com 0,5 M de NaCl

no tampão de equilíbrio. Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

(PAGE-SDS), de Mo-CBP3 revelou que a proteína purificada possui uma única

subunidade protéica de massa molecular aparente de cerca de 18,0 kDa em


84

condições não redutoras e de 9,0 kDa na presença do agente redutor β-

mercaptoetanol. Uma explicação plausível para este fato seria a preservação,

em condições não redutoras, de possíveis pontes dissulfeto, por ventura

presentes na estrutura da proteína e/ou entre cadeias. Isto pode ser reforçado

pela grande proporção de cisteínas presentes na seqüência NH2-terminal da

proteína mostrada no item “6.2.8”. A comparação dos perfis eletroforéticos da

proteína na ausência e presença de β-mercaptoetanol, sugere que Mo-CBP3

seja uma proteína oligomérica, formada de subunidades idênticas que,

provavelmente, estão unidas por pontes dissulfeto (formando dímeros), uma

vez que o tratamento com o agente redutor resultou numa única banda

protéica, apresentando em torno de metade da massa apresentada pela banda

em condições não redutoras. Ademais, visto que, a cada etapa do processo de

purificação da proteína, as frações foram exaustivamente dialisadas em sacos

com poros de “cut off” de 12,0 kDa, e Mo-CBP3 foi recuperada, é bastante

provável que tal proteína predomine na forma oligomérica nas sementes.

Ainda com relação à massa molecular da proteína, os resultados dos

experimentos de cromatografia de exclusão molecular em coluna Superose 12

HR 10/30 (FIGURA 8), revelaram que Mo-CBP3 se trata de uma proteína com

massa molecular de 14,34 kDa, o que difere da massa molecular aparente

sugerida pelo ensaio de PAGE-SDS mostrado (FIGURA 7), que seria de cerca

de 18,0 kDa e 9,0 kDa na ausência ou presença, respectivamente, do agente

redutor β-mercaptoetanol. Uma explicação para tal fato pode ser a presença de

uma porção glicídica na estrutura da proteína Mo-CBP3, o que é constatado

pelo resultado mostrado na FIGURA 11. Por não sofrer desnaturação, e

geralmente apresentar ramificações, a porção de carboidratos de uma

glicoproteína dificulta sua mobilidade na malha do gel de poliacrilamida,

causando retardo que pode ser interpretado como uma massa molecular mais

elevada, depois de revelado o gel. A proteína que deveria aparecer na altura da

banda de 14,2 kDa (α-lactalbumina) no gel, aparece mais acima, próximo a

18,0 kDa. Uma vez que na cromatografia de exclusão molecular a proteína

corre intacta, não dependendo de desnaturação, tem-se como resultado a sua


85

massa molecular real. Sendo assim, as cadeias formadoras do dímero devem

apresentar massa molecular em torno de 7 kDa.

O conteúdo de cisteína pode ser considerado de grande relevância no

estudo das frações protéicas ligantes à quitina, visto que Mo-CBP3 mostrou

perfis eletroforéticos distintos quando tratada ou não com β-mercaptoetanol. A

presença do aminoácido cisteína em Mo-CBP3 é compartilhada com a WGA

(MIRELMAN et al., 1975) e com a heveína (VAN PARIJS et al., 1991). Acredita-

se que ele seja responsável pela ligação dessas proteínas à matriz de quitina.

Esse mesmo padrão também foi encontrado em proteínas com afinidade à

quitina de batata (Solanum tuberosum) (ALLEN et al., 1978), Chelidonium

majus (PEUMANS et al., 1985) e Datura stramonium (BROEKAERT et al.,

1987).

Ao final do procedimento de eletroforese bidimensional (item “6.2.3”) foi

possível calcular o ponto isoelétrico (pI) de Mo-CBP3, sendo este de,

aproximadamente, 10,8. Isto demonstra que Mo-CBP3 é uma proteína

extremamente básica, devendo ser formada, em sua estrutura primária,

predominantemente pelos aminoácidos arginina (R), lisina (K) e histidina (H). A

própria seqüência de aminoácidos NH2-terminal da proteína, explicitada no item

“6.2.6”, confirma esta hipótese, pois a predominância é de carga positiva a pH

7,0: dos 22 aminoácidos, três são arginina (carga positiva), sete são apolares

(sem carga) e doze possuem cadeia lateral polar não carregada. Por causa

dessa característica bastante básica de Mo-CBP3, só foi possível realizar

eletroforese nativa utilizando-se um protocolo especial com gel ácido,

adequado às proteínas básicas, como descrito no item “5.3.5” e visualizado na

FIGURA 10. Mo-CBP3 se apresenta com uma única banda, aparentemente

mantendo a mesma mobilidade que no gel desnaturante.

Seguindo a caracterização de Mo-CBP3, amostras (2 mg/mL) da proteína

não foram capazes de aglutinar eritrócitos de coelho ou de humanos (A, B, AB

e 0), mesmo quando tratados com tripsina e na presença dos cátions

divalentes Ca++ e Mn++. A ausência de atividade hemaglutinante em níveis

detectáveis nas amostras estudadas demonstra que, apesar de interagir com

quitina, a proteína pode não ser uma “lectina verdadeira” ou hololectina.


86

Entretanto, o fato de Mo-CBP3 não se comportar como hololectina pode ser

devido ao não reconhecimento de carboidratos presentes na superfície dos

eritrócitos estudados, ou por possuir apenas um sítio de ligação, não

possibilitando a hemaglutinação direta. Isto poderia ocorrer se, quando na

forma dimérica, uma das subunidades tivesse seu sítio de ligação a carboidrato

impedido estericamente, por exemplo, ficando apenas um disponível. È

possível, também, que a proteína apresente uma preferência de ligação a

oligossacarídeos em relação a mono, di ou trissacarídeos. De acordo com a

classificação de lectinas mais aceita atualmente, por apresentar ao menos um

sítio não catalítico de interação com carboidrato, Mo-CBP3 pode ser

considerada uma merolectina, que é incapaz de aglutinar células ou precipitar

glicoconjugados, devido à presença de um único sítio de ligação a carboidrato

(PEUMANS e VAN DAMME, 1995). Por outro lado, Mo-CBP3 poderia ser

considerada uma proteína “lectin-like”, como, por exemplo, os peptídeos Ac-

AMPs (BROEKAERT et al., 1992) e a heveína (VAN PARIJS et al., 1991), pois

possuem apenas um sítio de reconhecimento a carboidrato, ligam-se à quitina

e não possuem a capacidade de aglutinar eritrócitos.

Amostras (2 mg/mL) de Mo-CBP3, quando avaliadas segundo a

metodologia de Boller (1993), não apresentaram atividade de quitinase.

Existem na literatura alguns relatos de proteínas ligantes à quitina destituídas

de atividade hemaglutinante e quitinásica, como, por exemplo, a HM30, uma

proteína de folhas de Hydrangea macrophylla ligante à quitina que, mesmo

sem essas propriedades, possui atividade antifúngica (YANG e GONG, 2002).

O alinhamento automático da seqüência NH2-terminal de Mo-CBP3 com

outras seqüências já depositadas em banco de dados (NCBI/BLAST) revelou

84% de identidade com uma proteína recombinante com atividade floculante-

coagulante de sementes de M. oleifera (BROIN et al., 2002). Ao mesmo tempo,

Mo-CBP3 apresentou 73% de identidade com outras três proteínas coagulantes

de moringa isoladas por Gassenschmidt et al. (1995). Diante disso, foram

realizados novos experimentos para caracterizar Mo-CBP3, na busca de saber

se ela também apresentava as propriedades das outras proteínas identificadas

e descritas acima. Mo-CBP3 apresentou atividade coagulante de argila em


87

suspensão em água barrenta tão potente quanto a do sulfato de alumínio e

potássio [AlK(SO4)2] na mesma concentração, composto que é usado

comercialmente para a purificação da água (FIGURA 12). De fato, Sutherland

et al. (1994) relataram que um extrato de sementes de M. oleifera apresentou

performance comparável ao alumen [AlK(SO4)2] em um estudo de coagulação

para tratamento de água corrente barrenta, em Malawi. Outros autores também

já fizeram observação semelhante (NDABIGENGESERE e NARASIAH, 1998;

BROIN et al., 2002). Vários relatos mostram que, de forma amadora, as

sementes de moringa são utilizadas para a purificação da água, transformando-

a em potável, em diversas regiões do mundo, principalmente nos continentes

africano e asiático, como no Malawi, na Nicaragua e na Índia (SUTHERLAND

et al., 1994; TAUSCHER, 1994; MAKKAR e BECKER, 1997).

Acredita-se que o mecanismo de coagulação da moringa consiste da

adsorção e neutralização das cargas coloidais (NDABIGENGESERE et al.,

1995). Estudos mostram que proteínas positivamente carregadas se ligam a

superfícies de partículas negativamente carregadas, como argila e bactérias,

por exemplo, através de interações eletrostáticas. Isto leva à formação de

partículas maiores, com cargas positivas e negativas em sua superfície, as

quais colidem entre si e se neutralizam, formando flocos maiores que decantam

(BROIN et al., 2002). Muitos autores já identificaram algumas proteínas que

apresentam esta propriedade (OKUDA et al., 2001a; BROIN et al., 2002).

Alguns relatos descrevem as proteínas coagulantes de moringa como proteínas

catiônicas diméricas, com massa variando entre 12,0 e 14,0 kDa e pI entre 10,0

e 11,0 (NDABIGENGESERE et al., 1995; GASSENSCHMIDT et al., 1995;

GHEBREMICHAEL et al., 2005). Mo-CBP3 apresenta características bastante

semelhantes a estas, enquadrando-se neste rol, no entanto, sua seqüência

NH2-terminal é diferente. Na realidade, as diferentes proteínas com

propriedade coagulante extraídas de sementes de moringa são bastante

semelhantes, quase idênticas entre si. As seqüências da proteína isolada por

Broin e colaboradores (2002) e a MO2.1 (GASSENSCHMIDT et al., 1995)

diferem entre si por dois resíduos de cisteína. As três proteínas isoladas por


88

Gassenschmidt e colaboradores (1995) diferem entre si por apenas um resíduo

de aminoácido em cada.

Independentemente destas diferenças, Mo-CBP3 e as demais proteínas

descritas acima tornam-se uma alternativa ao sulfato de alumínio e potássio, já

que coagulantes naturais apresentam a vantagem de ser biodegradáveis,

produzirem volume bem menor de resíduo sedimentado e também de não

causarem danos ao meio ambiente (NDABIGENGESERE et al., 1995;

KATAYON et al., 2007). Além disso, em muitos países subdesenvolvidos ou

em desenvolvimento, coagulantes químicos como alúmen e polieletrólitos

sintéticos não estão disponíveis, ou estão a um custo bastante elevado

(SUTHERLAND et al., 1994). Destaca-se, ainda, a vantagem de se utilizar um

composto orgânico natural (como os das sementes de moringa) para o

tratamento da água frente aos riscos à saúde humana trazidos pelos

compostos inorgânicos e orgânicos sintéticos utilizados comercialmente, além

do fato do tratamento com moringa propiciar a descontaminação bacteriana da

água por coprecipitação destas com a argila (BROIN et al., 2002; KWAAMBWA

e MAIKOKERA, 2007). Alguns estudos comprovaram que o alumínio pode

induzir a doença de Alzheimer (CRAPPER et al., 1973; OKUDA et al., 1999) e,

a acrilamida, polímero orgânico sintético, também utilizado para tratamento de

água em alguns países, apresenta neurotoxicidade e forte propriedade

carcinogênica (McCOLLISTER et al., 1964; OKUDA et al., 1999). No entanto,

vale ressaltar a importância de se realizarem testes acerca dos efeitos de Mo-

CBP3 em mamíferos, principalmente humanos, para que se avalie a viabilidade

de seu uso para o tratamento de água para a ingestão.

Um dos grandes objetivos desse trabalho foi purificar e caracterizar

físico-química e biologicamente uma proteína antifúngica de sementes de M.

oleifera, daí encontrou-se Mo-CBP3. Como modelo experimental foi

selecionada a espécie de fungo fitopatogênico Fusarium solani, responsável

por perdas severas na agricultura mundial em diversas espécies vegetais,

principalmente soja e feijão. Esta espécie é de fácil manuseio e rápido

desenvolvimento, tornando-se ideal para ensaios in vitro.


89

Primeiramente, a proteína foi testada com relação ao seu efeito sobre a

germinação de esporos do fungo (FIGURA 13). O ensaio, descrito no item

“5.4.1”, durou 48 h, desde o contato dos esporos com a proteína. Na

concentração de 0,05 mg/mL, Mo-CBP3 foi capaz de inibir a germinação de

100% dos esporos testados. Essa atividade não foi perdida mesmo após o

aquecimento da proteína a 100 °C, por 1 h, o que mo stra uma estabilidade

estrutural merecedora de atenção. Esta estabilidade pode ser atribuída, pelo

menos em parte, à proporção do aminoácido cisteína na seqüência de Mo-

CBP3. As pontes dissulfeto formadas entre os radicais de duas cisteínas

conferem estabilidade crescente à proteína, à medida que o número de

interações aumenta. Porém, outros fatores como a posição destas pontes na

estrutura terciária da proteína são também responsáveis pela estabilidade da

molécula. Tomando-se como base a seqüência NH2-terminal de Mo-CBP3, com

22 resíduos de aminoácidos, os resíduos de cisteína perfazem 27,3% do total.

Ao ser pré-incubada com o açúcar N-acetil-D-glucosamina por 30

minutos, a 37 °C, Mo-CBP3 não teve sua ação inibitória da germinação de

esporos revertida. Algumas razões podem ser enumeradas para tentar explicar

este fato. De início, poder-se-ia pensar que a quantidade de açúcar e/ou o

tempo de incubação não foram suficientes para a ocupação dos sítios de

ligação e a reversão da atividade. Uma vez que Mo-CBP3 mostrou-se incapaz

de aglutinar eritrócitos, apesar de interagir com quitina, a mesma comporta-se

como uma merolectina que, portanto, apresenta apenas um sítio de ligação

disponível a carboidratos. Assim sendo, pode-se considerar que 1,0 mol do

açúcar interage com 1,0 mol da proteína. Nessas condições, a quantidade de

N-acetil-D-glucosamina utilizada (0,15 M) foi mais que suficiente para

neutralizar os sítios reativos. Quanto ao tempo de incubação, o mesmo se

aplica, pois o contato entre as moléculas foi de 30 minutos sob agitação

contínua (tempo necessário para os eritrócitos serem aglutinados por uma

lectina, por exemplo). Uma hipótese que parece plausível é a de que o sítio de

ligação à quitina, ou a N-acetil-D-glucosamina, não deve ser o mesmo sítio

ativo responsável pela atividade antifúngica, já que a inibição do primeiro não

faz com que a atividade seja perdida. No entanto, a presença de quitina na


90

parede do esporo do fungo parece ser primordial para que a proteína possa

exercer sua atividade, uma vez que o fungo oomiceto Pythium oligandrum, o

qual não tem quitina na sua parede celular, mas sim, celulose, não sofreu

qualquer ação por parte de Mo-CBP3 (FIGURA 18). No entanto, o que parece

mais lógico, é que a proteína tenha uma maior afinidade pela quitina ou seus

oligossacarídeos presentes na parede celular dos esporos de F. solani, sendo

capaz de substituir o monossacarídeo da pré-incubação por estes.

Uma vez que a proteína exerceu tão forte atividade sobre a germinação

dos esporos de F. solani, foi verificada também sua ação sobre o crescimento

micelial do fungo. Neste ensaio, conduzido como descrito no item “5.4.1”, foram

utilizadas as concentrações de 0,5, 0,1 e 0,05 mg de Mo-CBP3 por mL. Mesmo

na maior concentração utilizada, Mo-CBP3 não inibiu o crescimento micelial de

F. solani nas condições do ensaio. Isto pode ser explicado pela diferença na

constituição da parede celular do fungo em seus diferentes estágios de

desenvolvimento (HARDHAM e MITCHELL, 1998). De alguma forma, quando

em desenvolvimento após a germinação, o fungo não é mais susceptível à

ação de Mo-CBP3, por uma mudança na concentração, localização ou

qualidade de seus constituintes da parede celular.

Procurou-se então compreender um pouco o efeito causado por Mo-

CBP3 sobre o fungo F. solani. Para tanto, foi desenvolvido um protocolo (item

5.4.2) que pudesse responder se a ação exercida pela proteína sobre os

esporos do fungo era de natureza fungicida (irreversível) ou fungistática (que

paralisa, mas deixa o fungo se desenvolver se for retirada do meio). O objetivo

deste experimento foi verificar se os esporos de F. solani ainda seriam capazes

de voltar a germinar após saírem da presença hostil de Mo-CBP3 e serem

transferidos para um ambiente com condições ideais para a germinação como

o meio de cultura PDA. Como mostrado pelos dados das FIGURAS 16 e 17, o

tipo de ação antifúngica que Mo-CBP3 (0,1 mg/mL) exerceu sobre os esporos

de F. solani foi fungicida, uma vez que não mais foram capazes de se

desenvolver. Na dose de 0,05 mg/mL os esporos conseguiram germinar

depois, porém, com um considerável retardo em relação ao controle com água.

Isto nos leva a crer que Mo-CBP3 atua de forma dose-dependente.


91

Ainda de acordo com os resultados, ao ser aquecida a 98 °C por 1 h, a

proteína continuou inibindo 100% da germinação dos esporos, mas, diferente

do ocorreu com a proteína não aquecida e na mesma concentração, ao serem

retirados da presença da proteína e devolvidos a condições ideais de

germinação, os esporos voltaram a germinar. O aquecimento a 100 °C não foi

suficiente para desnaturar completamente a proteína, porém, parece ter

causado alguma modificação estrutural, ainda que pequena, a qual resultou

numa alteração da atividade, passando de fungicida a fungistática. A pré-

incubação de Mo-CBP3 (0,1 mg/mL) com N-acetil-D-glucosamina 0,15 M não

reverteu a atividade da proteína, efeito este que se manteve mesmo depois da

transferência para a placa com meio de cultura. Isto mostra que a interação

prévia da proteína com o açúcar em nada altera sua atividade, que deve ser,

provavelmente, exercida por outro sítio da molécula.

Tomando-se a idéia deste experimento, foi desenvolvido um protocolo

similar para verificar com mais detalhes se Mo-CBP3 realmente não atuava

sobre as hifas jovens de F. solani. As FIGURAS 14 e 15 mostram que Mo-

CBP3 não pára o crescimento do fungo, mas o retarda. Seu efeito é tanto maior

quanto maior for a dose administrada. O ensaio, nestas condições, mostrou-se

mais adequado que o primeiro (em placas de microtitulação) para avaliar a

atividade de Mo-CBP3 sobre o crescimento micelial de F. solani, por permitir

uma visualização comparativa mais nítida e indubitável, bem como a

mensuração dos raios miceliais. Ao contrário do que causou nos esporos, a

proteína pré-aquecida a 98 °C por 1 h ou pré-incuba da com N-acetil-D-

glucosamina 0,15 M não exerceu qualquer efeito sobre o crescimento das hifas

jovens de F. solani, nas condições do experimento. Mais uma vez é reforçada a

hipótese de que a diferença na constituição molecular da parede celular entre

esporos e hifas do mesmo fungo resulta na diferença de atividade de Mo-CBP3,

já que, na presença da proteína tratada termicamente, os esporos não

germinam, mas as hifas já crescidas continuam a se desenvolver.

Quanto à pré-incubação com o açúcar N-acetil-D-glucosamina, foram

formuladas algumas hipóteses para a explicação de seus efeitos. É possível

que durante o período pré-germinativo o sítio de ligação à quitina não seja


92

primordial ou ainda, necessário, para a ação de Mo-CBP3 sobre o esporo. Isto,

porque mesmo estando este sítio bloqueado pelo carboidrato, a proteína

continua exercendo sua ação fungicida sobre o esporo, como visto na FIGURA

13. No entanto, a quitina deve estar presente na constituição do fungo para que

a proteína atue, já que esta não inibiu a germinação do oomiceto Pythium

oligandrum, o qual não tem quitina na parede celular, mas sim, celulose. Já na

fase germinativa, os resultados mostram que o sítio de ligação à quitina deve

estar livre para que a proteína possa atuar sobre o fungo (hifas), pois a

proteína livre retardou o desenvolvimento micelial de F. solani, mas a mesma

“bloqueada” não mais exerceu este efeito. A necessidade da presença de

quitina na parede celular fúngica para que Mo-CBP3 possa agir se confirma na

não inibição do crescimento micelial do oomiceto P. oligandrum.

Diante do exposto pode então ser sugerido que, quando Mo-CBP3

reconhece e se liga ao açúcar N-acetil-D-glucosamina – seja na quitina

presente no fungo, seja disperso em solução – sofre mudança conformacional

que a deixa apta para atuar de forma inibitória sobre o fungo. Esta atuação

pode ser dada diretamente na própria quitina ou em outra molécula da parede,

causando um desarranjo em sua estrutura, com conseqüências várias como

perda de solutos e nutrientes, perda do turgor, e até a morte celular. Pode

ainda ocorrer que a proteína seja internalizada (dada à baixa massa da

molécula) e interfira na deposição ou síntese de novos polímeros de quitina,

desta vez, pela membrana celular, impedindo a germinação do esporo ou

retardando o crescimento da hifa.

A necessidade da ligação ao N-acetil-D-glucosamina, para que haja uma

mudança conformacional na estrutura da proteína e, então, ela possa exercer

sua atividade, explicaria porque a proteína se comporta de acordo com os

dados mostrados:

1. Tem ação sobre o esporo de um fungo que tem quitina na parede –

primeiramente, ela se ligaria à quitina do fungo e sofreria a mudança,

agindo sobre este;


93

2. Tem ação sobre o esporo do fungo mesmo quando pré-incubada com o

carboidrato - ligando-se previamente ao açúcar, sofreria a mudança

conformacional que a deixaria apta a agir sobre o esporo;

3. Não atua sobre fungo que não tem quitina - pois sem se ligar ao açúcar,

não sofreria a mudança conformacional e não atuaria.

Com relação ao crescimento micelial de F. solani, Mo-CBP3 precisaria

se ligar à quitina do próprio fungo para poder agir e mostrar sua atividade, não

conseguindo fazê-lo quando ligada previamente ao N-acetil-D-glucosamina

livre. A diferença estrutural da parede que existe entre as fases do fungo

poderia ser a responsável por essa diferença de atividade que há no esporo e

na hifa. Talvez a estrutura da hifa cause um impedimento estérico para a

proteína acoplada ao açúcar e por isso se torne inativa (ao contrário do que

ocorre com o esporo).

Buscando alguns dados que norteassem o entendimento sobre o

mecanismo de ação de Mo-CBP3, foi realizado um ensaio para avaliar a

influência de Mo-CBP3 sobre as bombas de prótons (H+ATPases) presentes na

membrana celular do esporo do fungo F. solani. Mo-CBP3 (FIGURA 19) foi

capaz de inibir cerca de 80% da acidificação do meio, por esporos de F. solani,

induzida por glicose, nas condições do ensaio. Isto sugere que Mo-CBP3

poderia atravessar a parede celular do esporo e interagir diretamente com as

bombas de prótons (H+ATPases) presentes na membrana celular, ou ainda,

agir indiretamente, causando um desarranjo da membrana e/ou da parede que

culminasse com o prejuízo do funcionamento da bomba de prótons e até a

morte celular.

A atuação de proteínas vegetais contra fungos fitopatogênicos ganhou

repercussão com o trabalho de Mirelman et al. (1975), que observaram que a

WGA, uma lectina isolada do germe de trigo específica para quitina, inibia a

germinação dos esporos e o crescimento dos fungos Trichoderma viride e

Fusarium solani. Segundo Melo et al. (2001), na tentativa de entender o

mecanismo de ação desta lectina nos fungos, tais autores sugeriram que a

ligação da WGA às hifas provocava um efeito na síntese e deposição de nova


94

quitina, prejudicando o crescimento e desenvolvimento fúngico. No entanto,

Schlumbaum et al. (1986) demonstraram que a inibição do fungo T. viride era

causada por quitinases contaminantes, e não pela WGA. Anos depois,

Ciopraga et al. (1999) demonstraram que a WGA pura é ativa contra Fusarium

graminearum e F. oxysporum.

Broekaert et al. (1989) demonstraram que a UDA, lectina quitina

específica isolada do rizoma de Urtica dioica, livre de contaminação por

quitinase, inibia o crescimento de vários fungos. Embora o mecanismo de ação

fungistática não tenha sido elucidado, certamente a atividade não foi devida à

quitinase. Outra proteína de ligação à quitina com reconhecida atividade

antifúngica é a heveína, uma merolectina isolada do látex de Hevea

brasiliensis, possuindo apenas 43 resíduos de aminoácidos (VAN PARIJS et

al.,1991).

De acordo com Lee e colaboradores (2003), o mecanismo preciso de

inibição da germinação e crescimento fúngicos por proteínas ligantes à quitina

sem atividade quitinásica não é claro. Especula-se que o mecanismo de ação

antifúngica das proteínas que se ligam à quitina esteja relacionado ao pequeno

tamanho dessas moléculas, visto que lectinas de gramíneas com massa

molecular de 36 kDa não apresentam atividade antifúngica, enquanto que a

UDA (8,5 kDa) e a heveína (5 kDa) apresentam atividade comprovada (HUANG

et al., 2000). Realmente, Money (1990) mostrou que proteínas com massas

moleculares maiores que 15-20 kDa não foram capazes de passar através dos

poros da parede celular do fungo Achyla bisexualis.

Raikhel e colaboradores (1993) afirmaram que o pequeno tamanho da

proteína seria necessário para a entrada pelos poros e interação com a parede

celular dos fungos. Vários autores sugerem que o pequeno tamanho dessas

proteínas seja suficiente para penetrarem através da parede celular dos fungos

e alcançarem a membrana plasmática, onde poderiam afetar sítios ativos da

morfogênese da parede celular (VAN PARIJS et al., 1992; RAIKHEL et al.,

1993; HUANG et al., 2000; VAN DEN BERGH et al., 2002). Isso está de acordo

com Wang e Granados (2000), que afirmaram que a inibição da síntese de


95

quitina em leveduras e fungos filamentosos resultava na biogênese anormal da

parede celular.

O efeito da proteína ligante à quitina Mo-CBP3 sobre o fungo

fitopatogênico F. solani está, possivelmente, relacionado à inibição da

germinação dos esporos e do desenvolvimento das hifas, pela interação desta

proteína com a parede celular, danificando-a de alguma maneira. Entretanto,

estudos mais aprofundados devem ser conduzidos para verificar se a proteína

inteira ou suas subunidades de massa molecular aparente de 9,0 kDa são,

também, capazes de penetrar pelos poros da parede dos esporos e atingirem a

membrana celular, ocasionando transtornos na síntese e deposição de quitina

na parede celular. Para confirmar as explicações aqui mostradas, são ainda

necessários estudos mais aprofundados acerca das características de Mo-

CBP3, como a determinação de sua seqüência completa e de sua estrutura

tridimensional, por exemplo. De toda forma, Mo-CBP3 mostra-se como uma

ferramenta com potencial bioativo para uso no estudo de combate a

fitopatógenos que atacam culturas de interesse econômico. Mostra-se, ainda,

valiosa em estudos de purificação de água, merecendo estudos de

biossegurança.


96

88.. CCOONNCCLLUUSSÃÃOO


97

8.1 - Resumo dos Resultados

� Mo-CBP3 é uma nova glicoproteína ligante à quitina, presente em

sementes de Moringa oleifera, com massa molecular aparente de 14,34

kDa e pI 10,8;

� Apesar da interação com a matriz de quitina, não se trata de uma

quitinase nem de uma hololectina;

� Em relação à função, Mo-CBP3 exibiu uma potente atividade antifúngica

frente ao fitopatógeno Fusarium solani, sendo este efeito fungicida,

termoestável, não inibido pelo açúcar N-acetil-D-glucosamina;

� Esta proteína interfere com a bomba de H+/ATPase, impedindo a

acidificação do meio gerada pela internalização de glucose;

� Mo-CBP3 apresentou uma apreciável atividade coagulante e se mostrou

tão eficaz quanto o sulfato de alumínio e potássio na capacidade de

coagular matéria em suspensão na água.

8.2 - Conclusão

Mo-CBP3 é uma proteína ligante à quitina, presente em sementes de

Moringa oleifera, responsável, pelo menos em parte, pela atividade antifúngica

apresentada pela planta. Por conseguinte, é possível que esteja envolvida na

resistência da planta frente a patógenos.

Sua ação antifúngica parece estar relacionada à interação com as bombas

de H+ ATPase na membrana dos esporos, prejudicando a ingestão de açúcar e

ocasionando a morte celular.

Propriedades Bioquímicas...

ANEXO – Gráficos das cromatografias testadas na tentativa de purificar

FIGURA 20 - Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de

aplicada na coluna (12 x 1,8 cm) equilibrada com tampão

8,0. O material não retido foi eluído com o

retido foi eluído com um

tampão de equilíbrio.


Gráficos das cromatografias testadas na tentativa de purificar Mo-CBP

Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de DEAE-Celulose

aplicada na coluna (12 x 1,8 cm) equilibrada com tampão Tris

O material não retido foi eluído com o mesmo tampão de equilíbrio. O

etido foi eluído com um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl adicionado ao

tampão de equilíbrio. Fluxo: 35 mL/h. Frações: 5 mL.

Gifoni, J. M.

98

CBP3, sem êxito.

Celulose. PNAG (5 mg) foi

Tris-HCl 0,05 M, pH

mesmo tampão de equilíbrio. O

gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl adicionado ao


FIGURA 21 - Cromatografia de Troca

na coluna (12 x 1,8 cm) equilibrada com tampão

material não retido foi eluído com o

eluído com um

equilíbrio. Fluxo: 35 mL/h. Frações: 5 mL.


Cromatografia de Troca Iônica em Coluna de CM-Celulose. PNAG (

na coluna (12 x 1,8 cm) equilibrada com tampão acetato de sódio 0,1 M

material não retido foi eluído com o mesmo tampão de equilíbrio. O r

eluído com um gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl adicionado ao tampão de

Fluxo: 35 mL/h. Frações: 5 mL.

Gifoni, J. M.

99

(5 mg) foi aplicada

acetato de sódio 0,1 M, pH 4,5. O

mesmo tampão de equilíbrio. O retido foi

gradiente linear de 0 a 1 M de NaCl adicionado ao tampão de


100

FIGURA 22 - Cromatografia de Exclusão Molecular em Coluna de Sephadex G-50. PNAG (5 mg)

foi aplicada na coluna (94 x 2 cm) previamente equilibrada com tampão Tris-HCl

0,05 M, pH 8,0. Void: 60,5 mL. Fluxo: 15 mL/h. Frações: 1 mL.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 50 100 150 200

Ab

s 2

80

nm

Frações (1 mL)


101

FIGURA 23 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna de Fenil-Sepharose. PNAG (10

mg) foi aplicada na coluna (20 mL) equilibrada com tampão Tris-HCl 0,05 M, pH

8,0, contendo Sulfato de amônio 1 M. O material não retido foi eluído com o

mesmo tampão de equilíbrio. O retido foi eluído em step wise, com

concentrações decrescentes de sulfato de amônio, a saber: 0,8, 0,6, 0,4, 0,2 e 0

M. Em seguida, a coluna foi lavada com água e etanol 70%. Fluxo: 35 mL/h.

Frações: 2 mL.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0

0,2

0,4

0,6

1 30 59 88 117 146

Co

nce

ntr

açã

o d

e s

ulf

ato

de

am

ôn

io (

M)

Ab

s 2

80

nm

Frações (2 mL)


102

FIGURA 24 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C-18 acoplada a HPLC. PNAG

(300 µg) foi aplicada na coluna. O material não retido foi eluído com ácido

trifluoracético (TFA) 0,1%. O retido foi eluído em gradiente de 0 a 100% de

acetonitrila. Fluxo: 1 mL/min.

Minutes0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Abs

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Per

cent

0

20

40

60

80

100Detector A - 1 (216nm)PAC_c3PAC_c2003

B.CONCJu_SP1.met

Detector A - 2 (280nm)PAC_c3PAC_c2003


103

FIGURA 25 - Cromatografia de Interação Hidrofóbica em Coluna C2-18 acoplada a HPLC. PNAG (1

mg) foi aplicada na coluna. O material não retido foi eluído com ácido

trifluoracético (TFA) 0,1%. O retido foi eluído em gradiente de 0 a 100% de

acetonitrila. Fluxo: 0,5 mL/min.


104

99.. RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS BBIIBBLLIIOOGGRRÁÁFFIICCAASS


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