PROGRAMA FRANCO-BRASILEIRO DE AIDSFortaleza – CE, 22 a 24 de Novembro de 2006.

Genotipagem HIV & Resistência

Laboratoire de MicrobiologieCentre Hospitalier & Universitaire

Saint Louis –Paris

francois.simon@sls.aphp.fr

Laboratoire associéLaboratoire associé au Centre National de Référence du VIHau Centre National de Référence du VIH

Estudos de genotipagem visando os marcadores de progressão de resistência ou

da progressão da aids

Marcadores de progressão relacionados

• com a diversidade do HIV

• avaliação da replicação : cargas virais e reservatorio

• Resistência : testes, algorithmo e consequencia

HIV = HIV-1 : 3 groupos , - 11 sob-typos

HIV-2 : 7 groups

HIV-2

HIV-1 Major M HIV-1 N

Gorilla

Chimpanzee

HIV-1 group O

Mangabey

Diversidade Genetica dos HIVDiversidade Genetica dos HIV

- HIV-1  groupo Major

- HIV -2 : 7 groupos A-G (Africa lusofone)

- groupos N (non-M/non-O) et O (outlier) : algumas cepas altement divergentes (Africa central )

•CRFs (Circulating Recombinant Form)

CRF01_AE = antigo sous-type E (Asia)

CRF02_AG = IbNg-like (Africa do l’oeste, Franca, Portugal, Brasil

CRF03_AB, CRF04_cpx …

non-B em Franca < 1996 : 10 % > 1996 : 21 %> 2006 : 50%

   subtipo B : ainda predominante homo/bisexual

subtipo non -B : 87% contaminação hétérosexual, CRF02 +++

Diversidade molecular dos HIV na Diversidade molecular dos HIV na Franca - 2005 Franca - 2005

   3% dos novos casos = HIV-2 : Resistência natural no INRNT, T20 menor sensibilidade nos IP = HIV-O : Resistência natural no INRNT

Laboratoire associéLaboratoire associé au Centre National de Référence du VIHau Centre National de Référence du VIH

Sub-tipo non B do HIV-1 Origine geografica dos pacientes

81%

21%

84%

23%

80%

22%

78%

22%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20031 20032 20041 20042

Afrique subsaharienne France

CNR du VIH et InVS, données du 31/03/05

2003-1 2003-2 2004-1 2004-2

DiversDiversídade molecular dos HIV na Franca dade molecular dos HIV na Franca

TransmissTransmissão de cepas o de cepas

HIV-1 – HIV-1 – resistênte ao TARV

-- VIH-1 323 pacientes primo- infecção ANRS 2005

HIV-1 subtipo B = 12.3%. HIV-1 non B = 9.4 %

ITRN 6%ITRNN 6% IPs 3%

• Casseb et al 98, USP 108 HIV-1 B : two major V3 motifs, GPGR and GWGR = B

brasielero

• Artur Ramos et UFRJ Al EID F + B, F + D, B + D

• Bongertz et al 2000, Brazilian Network HIV characterization. B (in 83 % of the samples), F (14 %), and C (3%)

• Couto-Fernandes JC 2006 : B, F, D, CRF02 , C

DiversDiversídade molecular dos HIV no Brasil e dade molecular dos HIV no Brasil e consequenciasconsequencias

   Declínio da carga viral HIV e contagem CD4

• O depletion CD4 no HIV crônico é -- Como um grupoum grupo -- na maior parte attribuable ao efeito direto do replication do HIV

Mellors et AL, Science 1996

• - 1512 pts US cohorts ao menos 6 meses

• taxa da perda CD4 predisse por níveis do RNA de plasma HIV

• diminuições medianas dos CD4 entre participants com vários níveis do RNA :

• - 501 to 2000 copies/mL 39 cells/mm3;- 10,001 to 40,000 copies/mL : 56 cells/mm3;- > 40,000 copies/mL 78 cells/mm3

  Declínio da carga viral HIV e contagem CD4

Rodriguez et al. JAMA . Sept 27, 2006

• Carga viral refletiu por níveis do plasma

não é a determinante principal da cinetica do declino dos CD4 no nível individual

• Carga viral elevada e SIV non pathogenic

• HIV-2: carga viral baixos e AIDS

Rodriguez et al. JAMA . Sept 27, 2006

   Declínio da carga viral HIV e contagem CD4

Declínio da carga viral ARN e ADN HIV e contagem CD4 (C. Rouzioux et Al 2005)

% de AIDS a 5 anos

Carga Viral e diversidade HIV

• - PCR sujeito aos riscos da diversidade dos VIH

• - A utilização de sondas bem escolhidas reduz o problema

• - Necessidade de vigilância +++ • Importância de harmonizar os testes • Expressão em UI

  Sub –tipo B

N=7

Sub –tipo A-CRF01N=16

CRF02

N=49

CRF OutrosN=16

Abbott Real time –

Monitor

-0.005 -0.06 0.25 0.05

Monitor

– TaqManRoche

0.15 0.17 0.24 0.33

Abbott –

TaqManRoche

0.2 0.4 0.57 0.41

Carga viral e REAL TIME PCR Comparação Abbott e TaqMan Roche

Mediane das differences em Log

Carga viral HIV e Resistência

A monitoração viral da carga fica fondamental pele evaluaçao da resposta no TARV

• O melhor marcador para o emergence de cepas HIV-1 – HIV-1 – resistênte ao TART

Virus do PlasmaHIV

† † †

0.0010.01

0.11

10100

100010,000

100,0001,000,000

reservatório viral

Ongoing

Tempo (anno)

Pla

sma

HIV

-1 R

NA

(co

pia

s/m

L)

Limite de deteccçao(50 copias/

mL)

Limit of detection

0.001

0.1

10

1000

100,000

0 1 2 3

Release fromstable reservoirs

Pla

sma

HIV

-1 R

NA

(co

pie

s/m

L)

Inicio TARV Stop TARV

Impacto do tratamento no reservatório viral latente

Pressões seletivas da terapia

Seleccçao dos quasispeciesDrogas inadequadas

Potencia inadequada Supressão IncompleteResistência pre- TARVAdherence inadequate

Vir

al lo

ad

Time

Drug-susceptible quasispecies

Drug-resistant quasispecies

Tratamento

• Barreira genética baixa

Mutação isolada

Selecção rápida de mutantes

ITRNN, 3TC

• Barreira genética elevada

Várias mutações podem ser necessárias para provocar uma resistência

Classe da IP

Selecção de mutantes resistentes

Resistência : Testes in vitro

• Genotypagem– detectar os Mutaçãoes conhecidos

• Phenotypagem– Abilidade de um vírus selvagem ou recombinant para

crescer em concentrações diferentes de ARV

• “Virtual” phenotypagem– Uso de resultados do genotype para predizer o

susceptibilidade phenotypica com uma base de dados - genotypos e phenotypos

Vantagens e desvantagens do genotype

Vantagens

• rápido • « barato « • sensível para detectar

misturas resistente • Tipagem do vírus

Desvantagens

• Medida indireta, • incapaz de detectar os

variants minor

• padrões complexos do Mutaçãoal podem ser difíceis de interpretar

Vantagens e desvantagens do Phenotype

Vantagens

• medida quantitative da resistência

• pode ser aplicada a todo o agente antiretroviral, including as drogas novas

• pode avaliar interações entre os Mutaçãoes

• exatos com subtypes, type, groupo HIV

Desvantagens

• cutoff não definidas para alguns agentes

• Carissimo

Susceptibility Phenotypic: Relacionamento entre a concentração da droga e a inibição viral In

ibiç

ão d

o r

eplic

atio

n d

o v

íru

s (%

)

50

0

100

resistance

Wild-type IC50 Resistant IC50

Wild-typeResistant

Concentração Da Droga

Vantagens e desvantagens do “Virtual” Phenotype Testing

Vantagens • Poderai dar uma visão da

atividade parcial das droguas

Desvantagens

• Confiabilidade dependerá da exatidão do genotype

• Valor da ligaçao genotype e dados phenotypicos ??

• Mais caro

consequencias da resistencia do HIV / TARV :

• 679 pacientes

• - Resistência genotypic a qualquer classe de drogas antiretroviral observados em 53 assuntos (8%).

 - Emergence de resistência associado com o mortalidade aumentado e mais elevadas com a resistência de NNRTI

• (HR 1.75; 95% CI 1.27-2.43)

•

British Columbia Centre for HIV & San Francisco General Hospital

Randomized Controlled Trials

• GART– Genotype + expert advice (EA)

vs standard of care (SOC)

• Viradapt– Genotype vs SOC

• Havana– Genotype vs EA vs

genotype + EA vs SOC

• VIRA 3001– Phenotype vs SOC

• RealVirfen– VirtualPhenotype vs phenotype

• ARGENTA– Genotype vs SOC; benefit at 12

weeks lost at 6 months; outcome related to adherence

• NARVAL– Genotype or phenotype vs SOC;

no difference at 12 weeks; highly experienced pts

• CCTG 575– Phenotype vs SOC; no benefit at 6

or 12 months due to excellent performance of SOC

• CERT– Phenotype vs genotype vs SOC

Estudos Positivos Estudos Negativos/Equivocal

37218743N =

6543210

2.0

1.0

0.0

-1.0

-2.0

-3.0

-4.0

Número dos Mutaçãoes entre um set de 9 MutaçãoesNúmero dos Mutaçãoes entre um set de 9 Mutaçãoes :: L10I, V32I, M46I/L, I47V, I54V/L/M, G73S, V82A/F/T/I, I84V, L90ML10I, V32I, M46I/L, I47V, I54V/L/M, G73S, V82A/F/T/I, I84V, L90M

Mu

de

no

RN

A d

o p

lasm

a H

IV-1

(L

og

co

pie

s/m

l) )

Resposta a APV de acordo com o número dos Mutaçãoes (in Narval trial )

CCTG 575 : Phenotype vs SOC

• 238 pacientes com IP, estável para > 6 meses

No mês 6, a redução no RNA do HIV era 0.71 e 0.69 log10 copies/ml para PHENO e SOC

A proporção com < 400 copias/ml (48%) era a mesma para ambos os grupos. Nenhuma diferença foi vista no mês 12

HAVANA Trial resuldados:HAVANA Trial resuldados:

Pacientes com RNA HIVPacientes com RNA HIV <400 c/ml <400 c/ml na semanana semana 24 (ITT)24 (ITT)

Genotype sem GenotypeGenotype sem Genotype

ExpertExpert 69 %69 % 49 % 59 %49 % 59 % p = 0.002

sem Expertsem Expert 46 %46 % 36 %36 % 41 %41 %

58% 58% 42%42%

Tural, 4th ICAAC 2000,

p = 0.02p = 0.02

4 4 4 4

11 11 12 121014 12

43

3033

29

71

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Impacto da resistência da linha de base no resultado do tratamento: Estudo do

FTC

Borroto-Esoda K, et al. CROI 2004. Abstract 672.

Inci

den

ce

of

Vir

olo

gic

Fa

ilure

(%

)

Any NNRTI NRTI K103N Any NNRTI NRTI K103N

FTC + ddI + EFVn = 270

d4T + ddI + EFVn = 276

Without baseline Mutação

With baseline Mutação

Mutação type:

Naive pts, baseline VL > 5000 copies/mL

Resposta no Tipranavir na semana 24 de acordo com o gene Mutaçãoes do

protease

50,4

39,443,6

31,729,826,3

13

7,7

0

10

20

30

40

50

60

12 13–15 16–18 19

TPV/r CPI/r

Pe

rce

nta

ge

of

pa

tien

ts

0.0015 0.0119 <0.0001 <0.0001P=

Algoritmos da interpretação da

resistência genotypic HIV-1

O grupo da resistência AC11 de ANRS fornece algoritmos da interpretação genotypic da resistência das drogas anti- HIV-1(« REDAGEN Frances »)

• Algoritmos baseados na correlação entre Mutaçãoes da resistência da droga e o resultado virological

• atualizadas regularmente http://www.hivfrenchresistance.org/

NUCLEOSIDE AND NUCLEOTIDE REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS ANRS 2006

Mutations associated to resistance Mutations associated to «

possible resistance »

ZDV T215Y/F At least 3 mutations among : M41L, D67N, K70R, L210W, T215A/C/D/E/G/H/I/L/N/S/V, K219Q/E [1, 2, 3, 4]

Q151M Insertion at codon 69

T215A/C/D/E/G/H/I/L/N/S/V [1, 2, 3, 4]

3TC/FTC M184V/I Insertion at codon 69

K65R [11, 12, 16] Q151M

ddI At least a score of + 2 among: M41L + T69D + L74V + T215Y/F + K219Q/E – K70R – M184 V/I [5, 14, 15, 17, 18]

L74V without any mutations among M41L, T69D, K70R, M184 V/I, T215Y/F, K219Q/E [19]

Q151M Insertion at codon 69

K65R [11, 12]

d4T V75M/S/A/T T215Y/F [6] At least 3 mutations among : M41L, D67N, K70R, L210W, T215A/C/D/E/G/H/I/L/N/S/V, K219Q/E [4, 7, 14, 15]

Q151M Insertion at codon 69

T215A/C/D/E/G/H/I/L/N/S/V [4, 7]

ABC At least 5 mutations among : M41L, D67N, L74V, M184V/I, L210W, T215Y/F [8, 19]

K65R and L74V and Y115F and M184V/I Q151M Insertion at codon 69

4 mutations among : M41L, D67N, L74V, M184V/I, L210W, T215Y/F [8, 19]

K65R [9, 11, 12]

TDF At least 6 mutations among: M41L, E44D, D67N, T69D/N/S, L74V, L210W, T215Y/F [13, 20]

K65R [9, 10, 11, 12] Insertion at codon 69

3, 4 or 5 mutations among: : M41L, E44D, D67N, T69D/N/S, L74V, L210W, T215Y/F [13]

K70E [21, 22, 23]

Resistance Patterns After Initial Failure of Common NRTI Backbones

ZDV/3TC

d4T/3TC M184V TAMs

ZDV/3TC/ABC

ABC/3TC M184V L74V or K65R

TDF/FTC M184V K65R

Gallant JE. Top HIV Med. 2005;13:138-142.

Padrões da resistência após a falha initial do ITRN

K70E

41, 67, 7O, 210, 215, 219

TAMs : Dichotomous resistências

ZDV ou d4T

Fatores desconhecidos

ZDV resistanceNível mais baixo

Resistência mais alta ZDV

TAMs emerge sequencialmente com regimens de ZDV- e de d4T-containing

após M184V

6 identified: M41L, D67N, K70R,

L210W, T215Y/F, K219Q/E/N/R

41L210W215Y

67N70R

219Q

TAMs : Dichotomous resistências

41-210-215 • resistência dos níveis mais elevados• mais resistente ao outro NRTIs, including o tenofovir,• menos sensitized/M184V• Hypersusceptibilidade ao ITRNN

67-70-219 - resistência dos níveis mais baixos- menos cruz-resistente ao outro NRTIs - mais sensitized/M184V

O « caso » M184V

• M184V emerge ràpidamente nos regimens nonsuppressive que contêm 3TC ou FTC

• mas também a redução na capacidade do replication

• Aumenta a sensibilidade na ZDV, no d4T, no TDF; diminuições no ABC e ddI,

Abacavir & M184V, L74V, K65R

• ABV

- M184V, L74V, e K65R se nenhum analogue do thymidine estiver no regimen

- M184V e TAMs na presença de um analogue do thymidine

NON-NUCLEOSIDE REVERSE TRANSCRIPTASE INHIBITORS ANRS 2006

Mutations associated to resistance

EFV L100I K101E K103H/N/S/T [1] V106M [2] Y181C/I Y188C/L G190A/C/E/Q/S/T/V P225H M230L

NVP L100I K101E K103H/N/S/T [1] V106A/M [2] Y181C/I Y188C/H/L G190A/C/E/Q/S/T/V M230L

ETV TMC125

Y181C [3]

EFV: efavirenz, NVP: nevirapine, ETV (TMC125): etravirine

Mutaçãoes com o signification incerto:

K101H/N/P/Q

Resistência no NNRTI = Reduz Marcada A Resposta Do Tratamento

Gallant JE, et al. N Engl J Med. 2006;354:251-260.

84

9

73

9

0102030405060708090

TDF/FTC + EFV ZDV/3TC + EFV

No B/L NNRTI resistance B/L NNRTI resistance

% V

L <

400

c/m

L a

t W

k 48

NNRTIs: Mutaçãoes Importantes

• O mais comum: K103N, Y181C

• Estes conduzem também à resistência de NNRTI: L100I, V106A, V108I, Y188L, G190A/S, P225H

• Outras substituições nos loci pertos podem induzir a resistência de NNRTI

Conseqüências clínicas da resistência à NNRTIs

– cruz-resistência extensiva de NNRTI entre drogas

– nenhum impairment da capacidade do replication

– Nevirapine quando o zidovudine ou o stavudine estão no regimen, o Mutação de K103N é selecionado preferivelmente

– Subtipo C : V106M ++

PROTEASE INHIBITORS ANRS 2006 Mutations associated to resistance

Mutations associated to « possible resistance »

IDV M46I/L V82A/F/M/S/T [11] I84A/V [8] L90M and at least 2 mutations among : K20M/R, L24I, V32I, M36I, I54V/L/M/T, A71V/T, G73S/A, V77I

L90M

SQV/RTV 1000/100 mg BID

G48V

At least 4 mutations among: L10F/I/M/R/V, I15A/V, K20I/M/R/T, L24I, I62V, G73S/T, V82A/F/S/T, I84V, L90M [9]

3 mutations among: L10F/I/M/R/V, I15A/V, K20I/M/R/T, L24I, I62V, G73S/T, V82A/F/S/T, I84V, L90M [9]

NFV D30N I84A/V [8] N88S/D L90M

V82A/F/S/T and at least 2 mutations among: L10I, M36I, M46I/L, I54V/L/M/T, A71V/T, V77I [1]

fosAPV/RTV 700/100 mg BID

I50V V32I and I47A/V [2, 13, 14]

At least 4 mutations among: L10F/I/V, L33F, M36I, I54A/L/M/S/T/V, I62V, V82A/C/F/G, I84V, L90M [2]

LPV/r At least 8 mutations among : L10F/I/R/V, K20M/R, L24I, L33F, M46I/L, I50V, F53L, I54M/L/T/V, L63P, A71I/L/V/T, V82A/F/S/T, I84V, L90M [3, 4, 5]

I47A [15, 16]

6 or 7 mutations among: L10F/I/R/V, K20M/R, L24I, L33F, M46I/L, I50V, F53L, I54M/L/T/V, L63P, A71I/L/V/T, V82A/F/S/T, I84V, L90M [3, 4, 5]

ATV/RTV 300/100 mg QD

I50L [6]

At least 3 mutations among: L10F/I/V, G16E, L33F/I/V, M46I/L, D60E, I84V, I85V, L90M [7, 12]

TPV/RTV 500/200 mg BID

At least 8 mutations among: L10V, I13V, K20M/R/V, L33F, E35G, M36I, K43T, M46L, I47V, I54A/M/V, Q58E, H69K, T74P, V82L/T, N83D, I84V [10]

4, 5, 6 or 7 mutations among: L10V, I13V, K20M/R/V, L33F, E35G, M36I, K43T, M46L, I47V, I54A/M/V, Q58E, H69K, T74P, V82L/T, N83D, I84V [10]

DRV/RTV TMC114/rtv 600/100 mg BID

At least 4 mutations among: V11I, V32I, L33F, I47V, I50V, I54L/M, G73S, L76V, I84V, L89V [17]

3 mutations among: V11I, V32I, L33F, I47V, I50V, I54L/M, G73S, L76V, I84V, L89V [17]

Vista geral da resistência do PI

Mutaçãoes do PI podem ser limitada sem resistência transversal

• NFV: D30N (L90M non subtipo B) – ATV: I50L

– FPV: I50V (reduz o susceptibility o LPV)

• Resposta to ritonavir-boosted PI (LPV/r, FPV/r, SQV/r)

Vista geral da resistência do PI

• Major PI Mutaçãoes: M46I/L, V82A/F/T/S, I84V/A/C, L90M afetarão todo o PIs atual

• Minor PI Mutaçãoes: L10F/I/R/V, V32I, I54V/M/L

Número crescente = resistência crescente,

Em caso de grande número mutaçãoes PI phenotyping poderia ajudar ??

FUSION INHIBITOR ANRS 2006

• T20

• G36A/D/E/S/V V38A/E/K/M Q40H/K/P/T N42D N43D/H/K/S N42T + N43S L44M L45Q/M

Resposta individual altamente variavel

Complexidade da interpretaçao do genotipe

Dosagens plasmaticos dos ARV

quociente inhibiteur– Ratio Cmin / CI50 ou CI90– Cmin : concentration résidual plasma do IP– CI50-CI90 de l’IP : teste phénotypico réal ou virtual

quociente Inhibiteur Génotypique (GIQ)– Ratio Cmin de l’IP / numero de mutaçãoes – critèrios

• Génotypiques de resistência• Pharmacocinétique

– Posologie individualizado – Valor preventivo sobre resposta virulógica ??

Relacionamento do quociente inhibitory à resistência da droga

0.01

0.1

1

10

CI50 (wild-type HIV)

Dru

g c

on

cen

trat

ion

(g

/mL

)

Ctrough

0 2 4 6 8 10 12

IQ (wild-type HIV)

CI50 (mutant HIV)

Smaller IQ for mutant

Time after dosing (hours)

HIV- 2resistência genotypic ANRS 2006

• NRTI Q151M : resistência d4T, ABC Q151M + M184V : resistência NRTI except TDF M184V : resistência 3TC/FTC

NNRTI Naturalmente resistência natural a tudos os a NNRTI [3, 4]

PROTEASE INHIBITORS

resistência a APV e aos dados contradictory do fosAPV e para ATV

• FUSION INHIBITOR Naturalmente resistente a T20 [3, 4]

Limitações dos testes da resistência

• Falta de controles de qualidade uniformes através dos laboratórios diferentes

• O custo elevado • Não pode ser executado com o RNA < 1000

copies • Não pode poder detectar populações do vírus

resistente < 20% • reservatórios viral também não detectados

HIV Resistance Testing Using Dried Blood Spots

(Plantier JC et Simon F Aids 2005)

• Coleção do plasma e do sangue secado num papel filtro dos pacientes HIV sendos da África

• Taxa do sucesso para genotyping • Plasma: 100%• Dried blood spots: 90 %

• Dried blood spots, Taxa do sucesso para amplification– VL > 5000 copies/Ml = 100%

• Concordance entre plasma and sangue secado sequences

As recomendações de prescrição de génotipagem de résistance

infecção aguda e infecção récente (<1ano)

recomendado

Ao momento da descoberta Diagnostico

recomendado

Fahla terapêutica recomendado

Prophylaxia post exposition Individualmente

Gravidez * Antes da iniciação de 1 tratamento

Crianças Mesmas indicações que para o adulto

Resistência na prática clínica: Sumário

- Genotype preferido• Antes do Tratamento : infecção aguda ou crônica • Fahla do TARV

- Phenotype or combined phenotype/genotype

en caso de alta resistência no NRTIs or PIs on genotype

• Falha múltipla do regimen com opções limitadas do tratamento