programa de pÓs-graduaÇÃo em genÉtica universidade federal de pernambuco centro de ... · 2019....
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
Estudo Cromossômico em Morcegos Hematófagos: Zoo-FISH com Sondas
Cromossômicas de Carollia brevicauda e Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae -
Chiroptera).
Cibele Gomes de Sotero Caio
Recife 2008
Cibele Gomes de Sotero Caio
Estudo Cromossômico em Morcegos Hematófagos: Zoo-FISH com Sondas
Cromossômicas de Carollia brevicauda e Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae -
Chiroptera).
Recife
2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Genética.
Orientador: Profª. Drª. Neide Santos, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE. Co-orintador: Profª. Drª. Maria José de Souza Lopes, Depto. de Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE.
SoteroCaio, Cibele Gomes de Estudo Cromossômico em Morcegos Hematófagos: Zoo-FISH com Sondas Cromossômicas de Carollia brevicauda e Phyllostomus hastatus (Phyllostomidae -Chiroptera). / Cibele Gomes de Sotero Caio. – Recife: O Autor, 2008.
109 folhas : il., fig. tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Genética, 2008.
Inclui bibliografia. 1. Mamíferos - morcegos 2. homeologias cromossômicas 3. Pintura cromossômica. I. Título. 599.4 CDU (2.ed.) UFPE
599.4 CDD (22.ed.) CCB – 2008 098
À minha família, dedico.
AGRADECIMENTOS
Acima de tudo aos meus pais, pelo amor, apoio, incentivo e ensinamentos, sem
os quais não teria conquistado tudo o que tenho até agora. Pelo exemplo de caráter que
tem servido como referência para guiar meus passos ao longo de minha jornada. Ao
meu pai José Raimundo, por não medir esforços quando se trata de participar de minhas
batalhas e à minha mãe Veralúcia pela amizade e confiança nas quais se baseia nossa
relação. As poucas palavras deste agradecimento estão aquém de descrever seu papel
em minha vida.
À minha irmã Tássia, pela amizade e carinho. Por ser responsável pelas boas
risadas no dia-a-dia e em momentos difíceis. Pela companhia inigualável e pela falta
que faz quando estamos separadas. Ao meu irmão Lucas, pela amizade e agradável
relação fraterna apesar da distância. Aos meus avós, tios e primos, em especial à vó
Iracema e ao vô Pedro, cada um de sua forma tendo um importante valor em minha
vida.
À minha orientadora Neide Santos, pela confiança em mim depositada, pela
valiosa relação travada durante todos esses anos de convivência, mas principalmente por
me fazer acreditar em meu potencial, sempre que vacilo, tornando a realização de um
ideal possível. À professora Maria José por sua disponibilidade, tendo me auxiliado
sempre que necessário, como minha co-orientadora.
Aos professores Cleusa Nagamachi e Júlio Pieczarka pela colaboração para a
realização deste trabalho. Pelo bom exemplo como profissionais e receptividade não só
em seu laboratório, mas também durante minha estadia em Belém.
Aos técnicos Cirlene e Francisca (UFPE) e Conceição e Jorge (UFPA) pela
ajuda durante o desenvolvimento deste trabalho e a Anderson Gomes (UFPA) pelo
auxílio com as hibridizações.
A Rodrigo Sotero pela indispensável ajuda com o CorelDraw e dicas para a
elaboração do idiograma..
Aos colegas do Laboratório de Citogenética da UFPE: Adriana, Carol, Dani,
Ituza, Jefferson, Jéssica, Luzia (Luzitânia), Marcela, Merilane, Nara e Thati pela boa
convivência e agradáveis conversas nos corredores do departamento. Luzia, ainda te
espero na genética animal! A Diogo por ser bem mais que um companheiro de
laboratório, pelas experiências compartilhadas e estima que espero perdurar ao longo de
nossas vidas. À minha amiga Sárah, grande companheira, presente nos momentos de
alegria e tristeza, exemplo de competência que procuro seguir. À Pollyanna pela
surpreendente amizade. Pelas confidências, apoio e carinho fortalecido durante os
últimos dois anos.
Aos colegas do Lab. de Citogenética da UFPA Adalto, Amanda, Derik, Celina,
Cristiane, Fábio, Luciano, Naty, Pablo, Patrícia Baiana, Patrícia Correia, Paulinho,
Ramon, Renata, Sávio (Uílame), Susana, e Thayse por permitirem minha rápida
integração no laboratório, em especial a Anderson (Mardito!) e Danillo (Negão) por se
revelarem verdadeiros amigos, como se conhecêssemos há muito mais tempo, fazendo
com que me sentisse em casa. Aos amigos paraenses, biólogos e agregados, em especial
Gleice, Patrícia Aleixo e Patrik por tornar a minha estadia em Belém mais prazerosa.
À família Correia, Sra. Amélia, Cristina, Sr. Manoel e Patrícia pela hospedagem
em sua residência. Serei eternamente grata pelo acolhimento.
Aos colegas da pós graduação, principalmente Edilene (fitness), Esteban e
Carlos cuja amizade significa muito para mim. A Iêda (Mamãe), Eduardo (Búbus),
Fagner (Bill), Bruno (Prego), Demétrio, Dimas, Leandro, Rafael (Rafaééh) pela
amizade e momentos de “desestresse” ao longo desses dois anos.
A Thaís Lira pelo auxílio na coleta e identificação taxonômica das espécies
analisadas. Pela amizade, companheirismo e momentos “morcegáticos” passados e
futuros.
A Bruno Tavares pelo apoio e compreensão incondicionais. Por me fazer
conhecer o amor verdadeiro a partir de uma relação baseada em carinho, confiança e
amizade.
Ao CNPq pelo apoio financeiro através da bolsa de mestrado, durante o
desenvolvimento deste projeto.
A todos que de alguma forma contribuíram para que eu pudesse chegar até aqui.
As I stand at the crossroad, I see the sun sinking low... With my cross of indecision, I can't tell which way to go... Now I have seen the seven wonders And I have sailed the seven seas, I've walked and talked with angels, And danced all night with gypsy queens... All in all it's been a rocky road, Twists and turns along the way... But, I still pray for tomorrow, All my hopes, my dreams Don't fade away... Don't fade away... I have painted many portraits, Memories of love and pain, Though cut down by life's deceptions I found the strength to start again... All in all it's been a rocky road, Twists and turns along the way... But, I still pray for tomorrow, All my hopes, my dreams Don't fade away... Don't fade away. Heaven help a man Trying to make up his mind, With the darkness closing in, I feel I'm running out of time... Shine a light for me, Help me find the way to go, And take me where I've never been before... And so I stand at the crossroad, Watching the sun sinking low... With my cross of indecision, Trying to find the way to go...
David Coverdale
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS RESUMO
12
1. INTRODUÇÃO
13
2. REVISÃO DA LITERATURA
16
2.1 ORDEM CHIROPTERA 162.1.1 ASPECTOS GERAIS 162.1.2 ORIGEM E FILOGENIA 19
2.2. FAMÍLIA PHYLLOSTOMIDAE 242.3. SUBFAMÍLIA DESMODONTINAE: ASPECTOS ECOLÓGICOS E EVOLUTIVOS 322.4. CITOGENÉTICA E EVOLUÇÃO 36
2.4.1. IMPORTÂNCIA DOS ESTUDOS CITOGENÉTICOS 362.4.2. TÉCNICAS CITOGENÉTICAS EMPREGADAS NO ESTUDO DE CHIROPTERA 372.4.2.1. TÉCNICAS CLÁSSICAS: UMA ABORDAGEM HISTÓRICA 372.4.2.2. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 412.4.2.3. PINTURA CROMOSSÔMICA (CHROMOSOME PAINTING) 432.4.3. EVOLUÇÃO CARIOTÍPICA NA FAMÍLIA PHYLLOSTOMIDAE 472.4.3.1 SUBFAMÍLIA DESMODONTINAE
54
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
57
4. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO
71
5. CONCLUSÕES
99
6. ABSTRACT 1007. ANEXOS
101
7.1. INSTRUÇÕES PARA AUTORES – CHROMOSOME RESEARCH 1027.2. FOTOGRAFIAS DAS ESPÉCIES ANALISADAS 108
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
Revisão da Literatura
Fig. 1: Árvore de total-evidência proposta por Wetterer et al. (2000) construída a partir de análise de máxima parcimônia usando 150 caracteres. À direita, classificação proposta por esses autores para a família Phyllostomidae. Decay values e valores de bootstrap correspondem aos números acima e abaixo dos ramos, respectivamente.
30
Fig. 2: Filograma mostrando as relações de divergência de seqüências entre os gêneros de Phyllostomidae, apresentado por Baker et al. (2003). À direita, classificação proposta por esses autores.
31
Manuscrito de Artigo Científico
Fig. 1: Cariótipos haplóides G-bandeados e idiogramas mostrando os segmentos cromossômicos correspondentes entre as espécies Phyllostomus hastatus-PHA (a), Diphylla ecaudata-DEC (b), Diaemus youngi-DYO (c) e Desmodus rotundus-DRO (d). Os pontos pretos nos cromossomos marcados com asteriscos correspondem às RONs. Bandeamentos G cedidos por Varella-Garcia et al. (1989), Santos et al. (2001) e Pieczarka et al. (2005). Barra = 5 µm.
95
Fig. 2: Cariótipos haplóides G-bandeados e idiogramas mostrando os segmentos cromossômicos correspondentes entre as espécies Carollia brevicauda-CBR (a), Diphylla ecaudata-DEC (b), Diaemus youngi-DYO (c) e Desmodus rotundus-DRO (d). Os pontos pretos nos cromossomos marcados com asteriscos correspondem às RONs. Bandeamentos G cedidos por Varella-Garcia et al. (1989), Santos et al. (2001) e Pieczarka et al. (2005). Barra = 5 µm.
96
Fig. 3: Pintura cromossômica em metáfases mitóticas de Desmodus rotundus (a-c), Diphylla ecaudata (d-f) e Diaemus youngi (g-i) com sondas de Phyllostomus hastatus: (a, g) PHA8, (b, h) PHA11, (c) PHAX, (d) PHA7, (e) PHA10, (f) PHA14 e (i) PHA15. Barras = 10 µm.
97
Fig. 4: Zoo-FISH com sondas de Carollia brevicauda em metáfases mitóticas de Desmodus rotundus (a-c), Diphylla ecaudata (d-f) e Diaemus youngi (g-i): CBR3 (a), CBR6 (b), CBR9 (c, e, h), CBR8 (d, g) e CBRY2 (f, i). Barras = 10 µm.
98
LISTA DE TABELAS
Tabela
Página
Revisão da Literatura
Tabela 1. Classificação tradicional da Ordem Chiroptera.
17
Tabela 2. Algumas das classificações propostas para a ordem Chiroptera.
22
Tabela 3. Algumas das classificações propostas para a família Phyllostomidae.
26
Tabela 4. Classificações atualmente adotadas para a família Phyllostomidae.
27
Manuscrito de Artigo Científico
Tabela 1. Espécies analisadas
93
Tabela 2. Correspondências cromossômicas entre Phyllostomus hastatus (PHA), Carollia brevicauda (CBR), Diphylla ecaudata (DEC), Diaemus youngi (DYO) e Desmodus rotundus (DRO) obtidas através da pintura cromossômica comparativa com sondas das duas primeiras espécies.
94
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AgNO3 Nitrato de prata
Ag-RON Coloração com nitrato de prata
BA(OH)2 Hidróxido de bário
CBG Técnica de Bandeamento C
Conv. Convencional
Cy3 Cyanine dye
DAPI 4’-6-diamidino-2-fenil-indol
DEC Cromossomo de Diphylla ecaudata
DNA Ácido desoxirribonucléico
DNAr DNA ribossomal
DOP-PCR Degenerate oligonucleotide primed PCR
DRO Cromossomo de Desmodus rotundus
dUTP 2’-deoxyuridine 5’-triphosphate
DYO Cromossomo de Diaemus youngi
F Sexo feminino
Fig. Figura
FISH Fluorecence in situ hybridization
FITC Fluorescein isothiocyanate
g Grama
GTG Técnica de bandeamento G
HC Heterocromatina constitutiva
HCl Ácido clorídrico
HIS Hibridização in situ
Hz Hertz
LINE Long Interspersed element
M Sexo masculino
m Metro
mL Mililitro
mm Milímetro
N Concentração Normal
NF Número fundamental
pH Potencial de hidrogênio
RNA Ácido ribonucléico
RNAr Ácido ribonucléico ribossomal
RON Região organizadora de nucléolo
S Svedberg (medida de velocidade de sedimentação de uma partícula)
SSC Solução de citrato de sódio
TTAGGG Repetição telomérica de nucleotídeos
Zoo-FISH Pintura cromossômica em animais
2n Número diplóide
°C Grau Celsius
% Porcentagem
µg Micrograma
µL Microlitro
RESUMO
A família Phyllostomidae constitui a terceira maior dentre os Chiroptera, sendo
caracterizada por exibir mais variações morfológicas do que qualquer outro grupo de
mamíferos, o que gera considerável discordância no estabelecimento de suas relações
sistemáticas e evolutivas. Citogeneticamente é caracterizada por cariótipos conservados
entre espécies proximamente relacionadas, bem como por intensa variabilidade
intergenérica, o que dificulta o estabelecimento de suas relações evolutivas por
bandeamentos clássicos. A partir da análise comparativa de cariótipos com
bandeamento G tem-se tentado estabelecer relações entre as várias espécies da família.
Entretanto, a similaridade entre bandas não homeólogas dificulta o esclarecimento da
história evolutiva de segmentos cromossômicos. Recentes estudos têm contornado este
problema através do emprego da pintura cromossômica para a detecção de segmentos
sintênicos entre espécies. Dessa forma, neste trabalho foi realizada a pintura
cromossômica comparativa para a identificação de homeologias cromossômicas entre
cinco espécies, pertencentes a três subfamílias de Phyllostomidae. A partir do emprego
de sondas cromossômicas totais de Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) e Carollia
brevicauda (Carolliinae) foram enfatizados os prováveis eventos ocorridos na
diferenciação dos cariótipos de Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus
youngi (Desmodontinae). As sondas de P. hastatus detectaram 23, 22 e 21 segmentos
conservados nos cariótipos de D. rotundus, D. ecaudata e D. youngi, respectivamente,
enquanto 28, 27, e 27 segmentos conservados foram respectivamente detectados com
sondas de C. brevicauda. Os dados obtidos evidenciaram certa conservação cariotípica
entre os membros de Desmodontinae, com D. rotundus apresentando o cariótipo mais
rearranjado das três espécies. Com base nas relações evolutivas propostas por dados
moleculares, morfológicos e citogenéticos são apresentadas as possíveis seqüências de
eventos que ocorreram durante a evolução cromossômica dos morcegos hematófagos.
Adicionalmente, o estudo comparativo entre as cinco espécies permitiu concluir que
Desmodontinae se apresenta mais proximamente relacionada à subfamília
Phyllostominae do que a Carolliinae.
Palavras-chave: Desmodus, Diaemus, Diphylla, homeologias cromossômicas, pintura
cromossômica.
1. INTRODUÇÃO
A Ordem Chiroptera é representada pelos morcegos, um grupo de mamíferos
voadores que apresentam várias adaptações morfológicas e fisiológicas para explorar
diferentes tipos de refúgios e de alimentos. Em muitas regiões tropicais e subtropicais,
os morcegos constituem a maior parte da fauna de mamíferos, não apenas em número
de espécies, mas também de indivíduos. A ordem compreende 18 famílias e duas
subordens: Megachiroptera e Microchiroptera. A subordem Megachiroptera está
representada por uma única família, Pteropodidae, enquanto Microchiroptera abrange
17 famílias, nove das quais ocorrem nas Américas, estando todas representadas no
Brasil: Emballonuridae, Furipteridae, Molossidae, Mormoopidae, Natalidae,
Noctilionidae, Phyllostomidae, Thyropteridae e Vespertilionidae (Simmons, 2005; Reis
et al., 2007).
A família Phyllostomidae possui o maior número de gêneros e espécies entre os
Chiroptera Neotropicais, incluindo 57 gêneros e cerca de 160 espécies. Considerável
discordância existe no que diz respeito às suas relações de parentesco, por conta da sua
ampla gama de adaptações aos mais diversos nichos ecológicos. A citogenética por sua
vez, representa uma das áreas de estudo que procura reconstruir a história filogenética
do grupo com base em sua evolução cariotípica, usando diferentes técnicas de
identificação e coloração cromossômicas (Varella-Garcia e Taddei, 1989; Simmons,
2005; Reis et al., 2007).
As técnicas de análise cromossômica mais utilizadas no estudo de morcegos têm
sido o bandeamento G, que permite a identificação de cromossomos homólogos,
homeólogos e de seus eventuais rearranjos, além do bandeamento C e da marcação com
nitrato de prata (AgNO3) que marcam regiões de heterocromatina constitutiva (HC) e
regiões organizadoras de nucléolos (RONs), respectivamente. Adicionalmente, a técnica
de hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas de DNA repetitivo tem sido
empregada em morcegos, permitindo a detecção precisa da localização dessas
seqüências nos cromossomos. Recentemente, uma variação da FISH vem sendo
utilizada para a análise de homeologias cromossômicas entre diferentes espécies com
maior precisão. Esse método, designado Zoo-FISH, utiliza sondas cromossômicas
totais de uma espécie hibridizadas em cariótipos de outras, na tentativa de determinar as
regiões cromossômicas conservadas correspondentes (Varella-Garcia e Taddei, 1989,
Baker et al. 1992, Pieczarka et al., 2005).
A subfamília Desmodontinae compreende apenas as três espécies de morcegos
hematófagos existentes: Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi.
Para a maioria dos estudos filogenéticos da família Phyllostomidae, esta subfamília
aparece como um grupo bem estabelecido, sendo um dos únicos cuja monofilia é
apoiada a partir de diferentes classes de dados e representando um dos clados mais
basais dentro da família. De acordo com a teoria mais amplamente aceita, derivada de
estudos morfológicos e moleculares, as espécies D. rotundus e D. youngi aparecem
como taxa irmãos que divergiram logo após a linhagem que deu origem a D. ecaudata.
Contudo, estudos cromossômicos clássicos (principalmente dados gerados pela técnica
de bandeamento G) mostram diferentes resultados, nos quais D. rotundus parece estar
mais proximamente relacionado à D. ecaudata, com D. youngi apresentando um
cariótipo mais próximo ao cariótipo ancestral da família Phyllostomidae (Baker et al.,
1988; Wetterer et al., 2000).
Essa diferença está provavelmente relacionada às dificuldades de interpretação
dos resultados derivados de bandeamento G, como por exemplo, problemas no que diz
respeito à identificação de homeologias e distinção de caracteres primitivos e derivados,
de forma que bandas G similares são equivocadamente consideradas homeólogas, não
fornecendo a verdadeira história evolutiva de segmentos cromossômicos, dificultando,
portanto, a reconstrução filogenética do grupo. Como até o presente não foram
utilizadas técnicas de identificação cromossômica mais acuradas nos cariótipos dos
Desmodontinae, no presente trabalho foi realizada a Zoo-FISH com sondas
cromossômicas totais de Carollia brevicauda (2n=21,XY1Y2) e Phyllostomus hastatus
(2n=32,XX) nos cariótipos de Desmodus rotundus, Diaemus youngi e Diphylla
ecaudata, na tentativa de elucidar suas verdadeiras homeologias cariotípicas, para a
reconstrução dos eventos que levaram aos cariótipos apresentados atualmente por essas
espécies. Além disso, pela comparação entre os cariótipos dessas cinco espécies, tentou-
se estabelecer quais cromossomos estariam presentes no cariótipo ancestral da família
Phyllostomidae, para a reconstrução futura de suas relações evolutivas por métodos
citogenéticos.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. ORDEM CHIROPTERA
2.1.1. Aspectos gerais
A ordem Chiroptera está representada pelos morcegos, um dos grupos mais
diversificados e bem sucedidos de mamíferos placentários. Esses animais apresentam
características singulares como o vôo impulsionado, capacidade de ecolocalização,
hibernação e torpor. Além disso, a ordem é caracterizada por uma ampla variação
morfológica, relacionada aos seus hábitos, que permitiram que seus membros
ocupassem os mais variados nichos ecológicos, tornando-os indispensáveis para a
manutenção das relações tróficas nos ecossistemas. Compreendem o segundo maior
grupo da classe Mammalia, sendo superados apenas pela ordem Rodentia (Simmons,
2005).
O nome Chiroptera, proveniente do grego “cheir” (mão) e “pteron” (asa), sugere
a principal adaptação morfológica sofrida por esses animais, que apresentam asas como
membros anteriores. O alongamento dos ossos metacarpais e falanges para o auxílio e
controle de uma membrana alar (o patágio) foi um evento crucial para o
desenvolvimento do vôo sustentado, apresentado por esses organismos. Além disso, em
comparação a outros mamíferos, os morcegos são diferenciados por uma complexa série
de modificações estruturais no esqueleto axial juntamente com a clavícula e escápula,
bem como reorientação lateral dos membros posteriores, características que estão
relacionadas à capacidade de vôo e à postura invertida adotada por estes animais quando
em repouso (Jones, 2002; LaVal e Rodríguez-H., 2002; Gunnell e Simmons, 2005).
Tradicionalmente, a ordem tem sido dividida em duas subordens:
Megachiroptera, representada por uma única família (Pteropodidae) com 42 gêneros e
185 espécies e Microchiroptera, que por sua vez, abrange 17 famílias, 157 gêneros e
928 espécies (Simmons, 2005). A Tabela 1 apresenta dados sobre as famílias que
compõem as subordens, destacando as encontradas no Brasil, com o respectivo número
de espécies registradas para o país.
Tabela 1. Classificação tradicional da ordem Chiroptera.
Ordem Chiroptera
Classificação
Número de espécies brasileiras
Subordem Megachiroptera Pteropodidae -
Subordem Microchiroptera Rhinolophidae -
Hipposideridae -
Megadermatidae -
Rhinopomatidae -
Craseonycteridae -
Emballonuridae 15
Nycteridae -
Myzopodidae -
Mystacinidae -
Phyllostomidae 90
Mormoopidae 04
Noctilionidae 02
Furipteridae* (1) 01
Thyropteridae 04
Natalidae 01
Molossidae 26
Vespertilionidae 24
Fonte: Simmons (2005); Reis et al. (2007).
Devido à similaridade de sua face com a das raposas, os Megachiroptera são
popularmente denominados raposas voadoras. São morcegos de médio a grande porte,
podendo alcançar até 1,5 kg e 1,7 m de envergadura, sendo encontrados apenas nos
trópicos e subtrópicos do velho mundo. A maioria desses morcegos possui hábito
frugívoro e depende principalmente da visão e do olfato para a detecção de alimento.
Apenas algumas espécies do gênero Rousettus utilizam um tipo de ecolocalização com
ultra-sons de baixa freqüência para a orientação, baseada em estalidos produzidos pela
língua (Findley, 1993; Reis et al., 2007).
Morfologicamente, as “raposas voadoras” são caracterizadas pela presença de
olhos grandes, que conferem uma capacidade visual extremamente desenvolvida. As
asas e caracteres anatômicos relacionados ao vôo são bem menos especializados do que
as de Microchiroptera, bem como os caracteres associados à ecolocalização. As orelhas
apresentam-se pequenas, simples e destituídas de especializações para a intensificação
sonora. Além disso, os Megachiroptera apresentam cauda curta, rudimentar ou ausente,
uropatágio reduzido, garras no polegar e, na maioria dos gêneros, garras adicionais no
segundo dedo (Nowak, 1994).
A subordem Microchiroptera abrange os morcegos que, ao contrário dos
Megachiroptera, apresentam a capacidade de ecolocalização com ultra-sons de alta
freqüência (acima de 15 kHz). Em estreita associação a esta capacidade, esses morcegos
apresentam nas orelhas um trago com extrema sensibilidade com função de receber e
intensificar ondulações sonoras. Em muitas espécies, o pavilhão auditivo apresenta uma
forte proeminência longitudinal (quilha) em seu centro e um outro aparato membranoso
(antitrago) em sua base. Várias adaptações nos ouvidos interno e médio estão também
relacionadas à percepção de sonar nesses morcegos. A ocorrência de Microchiroptera
abrange praticamente todas as regiões do globo, exceto as regiões polares e ilhas muito
afastadas de áreas continentais. No Brasil, são conhecidas nove famílias, 64 gêneros e
167 espécies (Tabela 1), distribuídas por todos os estados, ocorrendo nos mais diversos
biomas (Jones, 2002; Airas, 2003; Reis et al., 2006; 2007).
2.1.2 Origem e Filogenia
Os registros fósseis mais antigos de representantes da ordem Chiroptera datam
do início do Eoceno (49-53 milhões de anos). Este período revela uma fauna de
morcegos extremamente rica, compreendendo centenas de espécimes fósseis, completos
em boa parte dos casos, abrangendo cerca de 24 gêneros (Simmons e Geisler, 1998). A
reunião de informações sobre todos os fósseis encontrados até o presente indica que os
morcegos viventes no Eoceno apresentavam conjuntos de adaptações ao vôo e
ecolocalização, o que sugere uma origem mais antiga para o grupo, uma vez que a este
ponto seu ancestral já havia evoluído para as formas atuais (Speakman, 2001). Apesar
da abundância de fósseis do Eoceno, a ausência de amostras provenientes de períodos
mais antigos tem dificultado consideravelmente estudos sobre a história natural do
grupo (Teeling et al., 2005).
Até o início dos anos 80, dados de estudos morfológicos vinham propondo a
monofilia da ordem, bem como das duas subordens, o que implicava em uma única
origem para a ecolocalização laringiana e o vôo em morcegos. Contudo, estudos
realizados por Smith e Madkour (1980), Hill e Smith (1984), Pettigrew (1986; 1995) e
Pettigrew et al. (1989), baseados em morfologia do pênis e sistema nervoso,
propuseram a polifilia para a ordem, na denominada hipótese do “primata voador”.
Segundo esses autores, Megachiroptera estaria mais proximamente relacionada à
Dermoptera e aos primatas do que à Microchiroptera. Essa proposta resultou no
interesse dos sistematas mastozoólogos, o que desencadeou uma série de estudos
independentes para a resolução das controvérsias. Como conseqüência, estudos
baseados em morfologia, bioquímica, e genética molecular acabaram por refutar esta
última hipótese, confirmando a monofilia da ordem. Esses novos trabalhos, entretanto,
têm mostrado que uma considerável incerteza permanece no que diz respeito às relações
entre os morcegos e outras ordens de mamíferos, além de ter gerado recentes
questionamentos sobre a monofilia da subordem Microchiroptera (Jones et al., 2002;
Van Den Bussche e Hoofer, 2004; Gunnel e Simmons, 2005).
A origem filogenética da ordem Chiroptera permanece não resolvida.
Organismos intermediários evolutivos entre os morcegos e seu ancestral não voador são
ainda desconhecidos no registro fóssil. Com base em evidências morfológicas,
Chiroptera tem sido considerada como pertencente à superordem Archonta, juntamente
com Dermoptera, Primata e Scadentia. Contudo, estudos moleculares têm fornecido
suporte para a inclusão de Chiroptera no grupo Laurasiatheria, compartilhado pelas
ordens Cetartiodactyla, Perissodactyla, Carnivora, Pholidota e Eulipothypla (Nikaido et
al. 2000; Lin e Penny 2001; Madsen et al. 2001; Murphy et al. 2001a,b; Van Den
Bussche e Hoofer, 2004). Segundo Van den Bussche e Hoofer (2004), as características
morfológicas que reúnem Archonta como um grupo monofilético são variáveis dentro
das ordens que o compõe, não revelando um forte suporte para sua monofilia. Devido a
essas controvérsias, esta questão permanece ainda em aberto.
Em relação à monofilia das duas subordens, dados morfológicos e moleculares
têm gerado hipóteses contrastantes (Tabela 2). Tradicionais hipóteses filogenéticas
resultantes de análises morfológicas propõem a divisão da ordem Chiroptera em duas
subordens monofiléticas, Mega e Microchiroptera. Além disso, Microchiroptera estaria
subdividida em duas infraordens, Yinochiroptera, composta pelas superfamílias
Rhinolophoidea (Rhinolophidae, Hipposideridae, Nycteridae e Megadermatidae) e
Emballonuroidea (Rhinopomatidae, Craseonycteridae e Emballonuridae) e
Yangochiroptera, formada pelas superfamílias Noctilionoidea (= Phyllostomoidea)
(Mystacinidae, Noctilionidae, Mormoopidae e Phyllostomidae) e Vespertilionoidea
(Vespertilionidae, Natalidae, Furipteridae, Thyropteridae, Myzopodidae e Molossidae)
(Koopman, 1994; Fenton, 1995; Altringham, 1996).
Simmons e Geisler (1998) conduziram novas análises baseadas em dados
morfológicos de espécies existentes e exemplares fósseis e propuseram uma
classificação que reteve boa parte dos agrupamentos prévios. Dessa forma, as duas
subordens permaneceram como grupos monofiléticos sendo mantida a divisão de
Microchiroptera em dois clados. Entretanto, segundo esses autores, Microchiroptera
estaria dividida em sete superfamílias: Emballonuroidea (Emballonuridae),
Rhinopomatoidea (Rhinopomatidae e Craseonycteridae), Rhinolophoidea
(Rhinolophidae, Nycteridae e Megadermatidae, tendo Hipposideridae sido convertida a
uma subfamília de Rhinolophidae), Noctilionoidea (Noctilionidae, Mormoopidae e
Phyllostomidae), Nataloidea (Natalidae, Furipteridae, Thyropteridae, Myzopodidae),
Molossoidea (Molossidae e uma nova família, Antrozoidae) e Vespertilionoidea
(Vespertilionidae). Segundo esta classificação, apenas Rhinopomatoidea e
Rhinolophoidea apareceriam compondo a infraordem Yinochiroptera. As superfamílias
remanescentes seriam parte de Yangochiroptera ou permaneceriam como incertae sedis.
Além disso, Mystacinidae não aparece em uma superfamília definida (Tabela 2). Os dados moleculares, por sua vez, sugerem a monofilia de Rhinopomatoidea e
Rhinolophoidea (a partir da exclusão da família Nycteridae) e a sua união à família
Pteropodidae em um clado denominado Yinpterochiroptera ou Pteropodiformes. Todas
as famílias remanescentes são agrupadas em Yangochiroptera (Tabela 2). Dessa forma,
as subordens deixariam de existir como grupos monofiléticos, cedendo lugar a esta
classificação (Van Den Bussche e Hoofer, 2004; Hoofer e Van Den Bussche, 2004;
Eick et al., 2005; Teeling et al., 2005).
Tabela 2. Algumas das classificações propostas para a ordem Chiroptera.
Classificações de Chiroptera Altringham (1996)
Simmons e Geisler (1998)
Ordem Chiroptera Ordem Chiroptera Subordem Megachiroptera Subordem Megachiroptera
Pteropodidae Pteropodidae Subordem Microchiroptera Subordem Microchiroptera
Infraordem Yinochiroptera Superfamília Emballonuroidea Superfamília Rhinolophoidea Emballonuridae
Rhinolophidae Infraordem Yinochiroptera Hipposideridae Superfamília Rhinopomatoidea Nycteridae Craseonycteridae Megadermatidae Rhinopomatidae
Superfamília Emballonuroidea Superfamília Rhinolophoidea Rhinopomatidae Nycteridae Craseonycteridae Megadermatidae Emballonuridae Rhinolophidae (inclui Hipposiderinae)
Infraordem Yangochiroptera Infraordem Yangochiroptera Superfamília Noctilionoidea Mystacinidae
Mystacinidae Superfamília Noctilionoidea Noctilionidae Phyllostomidae Mormoopidae Mormoopidae Phyllostomidae Noctilionidae
Superfamília Vespertilionoidea Superfamília Nataloidea Vespertilionidae Myzopodidae Natalidae Furipteridae Furipteridae Thyropteridae Thyropteridae Natalidae Myzopodidae Superfamília Molossoidea Molossidae Antrozoidae
Molossidae Superfamília Vespertilionoidea Vespertilionidae Teeling et al. (2005)
Ordem Chiroptera Subordem Yinpterochiroptera
Pteropodidae Superfamília Rhinolophoidea
Rhinolophidae Megadermatidae Craseonycteridae Rhinopomatidae
Subordem Yangochiroptera Superfamília Emballonuroidea
Emballonuridae Nycteridae
Superfamília Noctilionoidea Phyllostomidae Mormoopidae Noctilionidae Furipteridae Thyropteridae Mystacinidae Myzopodidae
Superfamília Vespertilionoidea Vespertilionidae Molossidae Natalidae
Fonte: Altringham (1996); Simmons e Geisler (1998); Teeling et al. (2005).
As conseqüências relativas aos estudos filogenéticos na ordem pelos diferentes
métodos são marcantes. A monofilia da ordem, apoiada por todas as classes de dados,
corrobora a hipótese de que a capacidade de vôo evoluiu apenas uma vez dentro da
classe Mammalia. Por outro lado, os estudos relativos às subordens e famílias implicam
em interpretações diferentes para a origem da ecolocalização laringiana em morcegos.
Se os dados gerados por morfologia estiverem corretos, a ecolocalização evoluiu apenas
uma vez dentro da ordem (apenas em Microchiroptera). Contudo, se os indícios
moleculares forem aceitos, a ecolocalização passa a ser uma característica que apareceu
duas ou mais vezes independentemente durante a evolução do grupo, ou foi perdida em
Pteropodidae. De fato, a ampla variação dessa característica entre as famílias de
Chiroptera têm dificultado consideravelmente a definição de um tipo de ecolocalização
ancestral em morcegos, a maioria delas mostrando sinais de evolução convergente ao
longo de toda a árvore filogenética (Teeling et al., 2002; Jones e Teeling, 2006).
2.2. FAMÍLIA PHYLLOSTOMIDAE
Os morcegos do Novo Mundo, membros da família Phyllostomidae apresentam
como característica mais evidente um apêndice dérmico em formato de folha se
estendendo a partir do aparato nasal. As únicas exceções são os morcegos vampiros e
uma única espécie da subfamília Stenodermatinae (Centurio scenex), nos quais esta
característica aparece de forma modificada e rudimentar, respectivamente (LaVal e
Rodrigues-H, 2002). Os Phyllostomidae variam em tamanho desde diminutos como
Choeroniscus minor, um nectarívoro que pesa cerca de 9 g, até o maior morcego das
Américas, Vampyrum spectrum, cujo peso pode ultrapassar 100 g. O comprimento
corpóreo varia de 40 a aproximadamente 135 mm e do antebraço de 31 a 105 mm. A
cauda, quando presente, apresenta-se bastante reduzida, variando em comprimento
desde quatro até 55 mm (Nowak, 1996).
Das 17 famílias de Microchiroptera, Phyllostomidae constitui a terceira mais
numerosa, sendo endêmica do Novo Mundo, com registros que abrangem desde o
sudoeste dos Estados Unidos da América até o norte da Argentina. Segundo Simmons
(2005), a família compreende 160 espécies distribuídas em 57 gêneros. No Brasil, por
sua vez, são encontradas 90 espécies representantes de 40 gêneros. A diversidade trófica
observada nesse grupo não encontra precedentes dentre as demais famílias de
mamíferos, sendo encontradas as mais variadas adaptações morfológicas a uma série de
nichos ecológicos. Os representantes da família podem ser insetívoros, carnívoros,
frugívoros, nectarívoros, folívoros, granívoros, onívoros ou hematófagos. Esta
heterogeneidade tem motivado inúmeros estudos no que concerne às relações entre os
Phyllostomidae, no intuito de esclarecer a origem evolutiva desses hábitos alimentares
(Freeman, 2000; Reis et al., 2006).
Historicamente, o grupo tem sofrido uma série de alterações no que diz respeito
à sua classificação em subfamílias, sem um consenso entre as diferentes pesquisas.
Registros de árvores filogenéticas obtidas a partir das mais diversas classes de dados
mostram que o número de subfamílias de Phyllostomidae tem variado de um mínimo de
duas a um máximo de 11. Observa-se, na maioria dos casos, que as classificações
obtidas apresentam a tendência de agrupar as espécies com hábitos alimentares
semelhantes, bem como adaptações morfológicas similares associadas a esses hábitos
(Wetterer et al., 2000; Baker et al., 2003).
Diversos trabalhos, entretanto, forneceram importantes contribuições que
gradualmente conferiram relativa estabilidade à classificação da família (Tabela 3)
(Wetterer et al., 2000). Gervais (1854, 1856) (apud Wetterer et al., 2000 ) foi o primeiro
pesquisador que restringiu o uso do termo Phyllostomidae aos morcegos de folha nasal
do Novo Mundo e aplicou nomes às subdivisões propostas. Miller (1907) propôs uma
classificação que permaneceu estável até meados de 1960. As principais modificações
posteriores a este arranjo foram: (1) o reconhecimento dos membros de Sturnirinae
como pertencentes à subfamília Stenodermatinae (Baker, 1967); (2) a inclusão da
família Desmodontidae como subfamília (Desmodontinae) de Phyllostomidae (Forman
et al., 1968) e (3) a exclusão de Chylonycterinae para a família Mormoopidae, grupo
irmão de Phyllostomidae (Smith, 1972).
Baker et al. (1989) propuseram uma classificação baseada em uma análise
cladística de múltiplos dados (morfológicos, bioquímicos e cromossômicos), com o
intuito de eliminar indesejáveis arranjos parafiléticos e polifiléticos. Nesta classificação,
apenas três subfamílias foram reconhecidas: Desmodontinae, Vampyrinae e
Phyllostominae. Koopman (1994), entretanto, apresentou uma classificação de
Phyllostomidae que incluía oito subfamílias e duas tribos dentro de Stenodermatinae.
Estas duas últimas classificações foram as mais utilizadas até recentemente, quando
duas novas propostas emergiram.
Tabela 3. Algumas das classificações propostas para a família Phyllostomidae.
Classificações de Phyllostomidae
Miller (1907) Koopman (1994)
Phyllostomidae Phyllostomidae
Chilonycterinae (=Mormoopidae) Phyllostominae
Phyllostominae Lonchophyllinae
Glossophaginae Brachyphyllinae
Hemiderminae (=Carolliinae) Phyllonycterinae
Sturnirinae Glossophaginae
Stenoderminae (inclui Brachyphylla) Carolliinae
Phyllonycterinae Stenodermatinae
Desmodontidae Sturnirini
Stenodermatini
Baker et al. (1989) Desmodontinae
Phyllostomidae
Macrotus (incertae sedis)
Micronycteris (incertae sedis)
Vampyrinae
Chrotopterus, Trachops,
Vampyrum
Phyllostominae (todas as tribos sedis
mutabilis)
Phyllostomini
[inclui Phyllostomus (mais
Phylloderma), Tonatia, Mimon,
Lonchorhina, Macrophyllum]
Glossophagini
(inclui Lonchophyllinae,
Phyllonycterinae e Brachyphylla)
Stenodermatini
(inclui Carollia e Rhinophylla)
Desmodontinae
Fonte: Wetterer et al. (2000); Baker et al. (2003).
Atualmente, duas outras classificações disponíveis para Phyllostomidae vêm
sendo mais utilizadas (Tabela 4). A primeira, obtida por Wetterer et al. (2000) a partir
do uso de 150 caracteres morfológicos, cromossômicos e de sítios de restrição do
DNAr, é conhecida como a “árvore de total-evidência”. As árvores mais parcimoniosas
provenientes da combinação desses dados indicam que todas as subfamílias
tradicionalmente reconhecidas são monofiléticas e que a maioria dos taxa que
compartilham especializações alimentares formam clados.
Tabela 4. Classificações atualmente adotadas para a família Phyllostomidae.
Modificado a partir de Baker et al. (2003).
Baseados em seus resultados filogenéticos Wetterer et al. (2000) propuseram uma
classificação que melhor reflete as relações hipotetizadas: (1) reconhecimento formal de
Hirsutaglossa e Nulicauda no agrupamento de subfamílias nectarívoras e frugívoras,
respectivamente; (2) redefinição de Glossophaginae e inclusão de duas tribos,
Glossophagini e Lonchophyllini nessa subfamília; (3) reconhecimento de Phyllostomini,
Lonchorrhinini, Vampyrini, Micronycterini como tribos de Phyllostominae, subfamília
que aparece como um agrupamento natural na topologia gerada; (4) reconhecimento
formal de Stenodermatina (Stenodermatines de rostro curto) e Ectophyllina (rostro
alongado); (5) elevação dos subgêneros de Micronycteris ao nível de gênero;(6)
reconhecimento de Mesophylla como sinônimo júnior de Ectophylla;(7)
reconhecimento de Enchisthenes como gênero distinto e (8) retenção de Dermanura e
Koopmania como subgêneros de Artibeus. Além disso, nesta classificação, a subfamília
Desmodontinae aparece como grupo basal e Brachyphyllinae não apresenta
posicionamento definido dentro da árvore. Dessa forma, Phyllostomidae estaria
representada por 53 gêneros em sete subfamílias: Desmodontinae, Brachyphyllinae,
Phyllonycterinae, Phyllostominae, Glossophaginae, Carolliinae e Stenodermatinae (Fig.
1).
Na segunda classificação, resultante de análises de seqüências de DNA
mitocondrial agrupados a informações de estudos prévios com o gene nuclear RAG2
(Baker et al., 2000) mais as filogenias obtidas por Wetterer et al. (2000) e Jones et al.
(2002), Baker et al. (2003) sugerem que Phyllostomidae estaria dividida em 11
subfamílias, englobando 56 gêneros (Fig. 2). A comparação entre as diferentes árvores
analisadas nesse trabalho revela um baixo número de agrupamentos compartilhados,
acarretando em pouca resolução para as relações evolutivas entre os grupos. Em
contraste, as duas árvores geradas a partir de dados moleculares apresentam-se
extremamente semelhantes, compartilhando 21 nós a mais do que se fossem
consideradas as três árvores (em um total de 55 nós). Os dados moleculares, entretanto,
geram resultados contrastantes com a maioria daqueles obtidos através de estudos
prévios baseados em morfologia.
As principais implicações desses resultados são as seguintes: (1) Phyllostominae
(sensu Wetterer et al., 2000) seria um grupo polifilético, composto por membros de
cinco diferentes subfamílias (Macrotinae, Micronycterinae, Lonchorhininae,
Phyllostominae e Glyphonycterinae) e (2) Macrotus e Micronycteris + Lampronycteris
seriam agrupados em duas subfamílias basais na árvore da família, seguidas por
Desmodontinae. O reconhecimento de 11 subfamílias, segundo esses autores, seria
necessário para que se pudessem separar as principais subdivisões morfológicas e
moleculares em grupos monofiléticos. Apesar das discordâncias entre esses trabalhos
com dados morfológicos e moleculares, ambas as classes de dados suportam a monofilia
da família (Wetterer et al., 2000; Jones et al., 2002; Baker et al., 2003).
Fig. 1: Árvore de total-evidência proposta por Wetterer et al. (2000) construída a partir de análise de máxima parcimônia usando 150 caracteres. À direita, classificação proposta por esses autores para a família Phyllostomidae. Decay values e valores de bootstrap correspondem aos números acima e abaixo dos ramos, respectivamente.
Fig. 2: Filograma mostrando as relações de divergência de seqüências entre os gêneros de Phyllostomidae, apresentado por Baker et al. (2003). À direita, classificação proposta por esses autores.
2.3. SUBFAMÍLIA DESMODONTINAE: Aspectos ecológicos e evolutivos
A subfamília Desmodontinae compreende as únicas espécies de morcegos cuja
alimentação é baseada exclusivamente na ingestão de sangue. Nenhum outro mamífero
apresenta essa característica, a qual confere a esses animais o status de verdadeiros
parasitas. Desmodontinae é composta por três gêneros monotípicos, endêmicos da
América Latina: Desmodus, Diaemus e Diphylla (Taddei, 1988; LaVal E Rodríguez-H,
2002). Distinguem-se dos demais Phyllostomidae pela morfologia de seu apêndice
nasal, similar a uma ferradura, cuja função nestes animais parece ser a detecção de áreas
mais vascularizadas na pele de suas presas. São morcegos de médio porte,
extremamente especializados para a hematofagia, apresentando modificações nos
incisivos, bastante afiados e em forma de bisel, saliva com propriedades
anticoagulantes, lábio inferior sulcado e destituído de papilas, língua sulcada que
permite ao sangue fluir por capilaridade para o interior da boca, além de estômago e rins
especializados na absorção e processamento do plasma sanguíneo (Bernard, 2005; Reis
et al., 2007). Como os demais Microchiroptera, os morcegos hematófagos emitem sinais
de ecolocalização para a orientação espacial. Contudo, sua audição parece ser mais
adaptada à captação de baixas freqüências, entre 100 Hz e 10 KHz (Schmidt et al.,
1991).
Desmodus rotundus é a espécie mais comum de Desmodontinae, ocorrendo
desde o norte do México até o norte da Argentina (Koopman, 1988). No Brasil, por sua
vez, foi registrada a sua ocorrência em 25 dos 26 estados. É diferenciado dos outros
morcegos hematófagos por suas orelhas pontiagudas, polegar longo, portando duas
almofadas ou calosidades, membrana interfemural sem pêlos e por sua fórmula dentária
(Nowak, 1994; Reis et al., 2007). Sua alimentação consiste na preferência por sangue de
mamíferos, principalmente de grande porte, ocasionalmente alimentando-se de sangue
de aves e humanos (Altringham, 1996). Este hábito torna-os potenciais transmissores do
vírus rábico, destacando sua importância para a economia e saúde pública (Taddei,
1988).
Diphylla ecaudata é o menor dos morcegos hematófagos e parece ocupar o
segundo lugar em abundância. Apesar disso, sua distribuição é mais restrita do que a
dos outros Desmodontinae, ocorrendo do México até o Brasil. Existe, contudo, registro
de apenas um espécime de D. ecaudata para a região sul dos EUA (Reis et al., 2007).
No Brasil, há registros da espécie para apenas 13 estados (Reis et al., 2006). Este
pequeno hematófago é caracterizado por apresentar grandes olhos, orelhas curtas e
arredondadas e polegares curtos, sem calosidades. Além disso, suas pernas são
extremamente peludas e apresentam calcâneo alongado que funciona como um sexto
dedo, auxiliando sua locomoção por galhos e ramos de árvores (Greenhall e Schutt-Jr,
1996; Schutt-Jr e Altenbach, 1997). A alimentação de D. ecaudata consiste de sangue
fresco, quase que exclusivamente de aves. As diferenças no comportamento alimentar,
relacionadas à seleção de presas arbóreas e terrestres, reduzem significativamente a
competição entre D. ecaudata e D. rotundus. Dessa forma, não é raro encontrar as duas
espécies coexistindo em uma determinada área, muitas vezes compartilhando, inclusive,
o mesmo abrigo (Reis et al., 2007).
Diaemus youngi, por sua vez, assemelha-se a D. rotundus, contudo apresenta
características que o distingue dos outros morcegos hematófagos. Suas asas apresentam
manchas brancas nas pontas e entre as falanges, seu polegar apresenta apenas uma
calosidade, o calcâneo é ausente e apresenta uma conspícua glândula em cada lado da
boca, que exala um forte odor característico (Greenhall e Schutt-Jr, 1996; LaVal e
Rodríguez-H, 2002). Apesar de apresentar uma ampla distribuição geográfica,
ocorrendo desde o nordeste do México ao norte da Argentina, D. youngi é raro ou
incomum ao longo de sua área de ocorrência. Alimenta-se preferencialmente do sangue
de aves, contudo, ataca mamíferos dependendo da disponibilidade de presas na região
(Greenhall e Schutt-Jr, 1996). Registros do vírus rábico em D. youngi, bem como nos
outros dois morcegos vampiros estão presentes na literatura. Entretanto, relatos da raiva
em humanos ou em animais domésticos estão mais relacionados à atividade de D.
rotundus. Dessa forma, são necessários planos de erradicação desta zoonose que
enfoquem exclusivamente o controle desta última espécie, evitando a dizimação
desnecessária das outras duas (Reis et al., 2007).
As extremas modificações estruturais associadas ao hábito alimentar dos
morcegos hematófagos foi, por muito tempo, base para sua classificação em uma
família distinta. Miller (1907) foi um dos primeiros pesquisadores a reconhecer
Desmodontidae como uma família separada e a discutir algumas relações entre seus
membros. Apenas em 1967, Machado-Allison, descrevendo associações parasita-
hospedeiro e interpretando dados de ecolocalização (Novick, 1963), sugeriu que
“Desmodidae” deveria ser considerada uma subfamília de Phyllostomidae. Essa
proposta foi reforçada em 1968, quando Forman et al. chegaram às mesmas conclusões,
baseados em estudos comparativos de imunologia, cariologia e morfologia entre os
morcegos hematófagos e membros de Phyllostomidae (Wetterer et al., 2000).
As relações entre os membros de Desmodontinae, bem como a posição da
subfamília na árvore dos Phyllostomidae permanecem em aberto: a árvore gerada por
Smith (1976) indica que Diaemus e Desmodus são grupos irmãos, formando um clado
separado em relação à Diphylla. Contudo, análises do padrão de bandeamentos C e G
sugerem que dentre os morcegos hematófagos, o cariótipo de Diaemus youngi seria o
menos modificado em relação ao cariótipo proposto como ancestral da família
Phyllostomidae e que Desmodus e Diphylla formam um clado em relação à Diaemus
(Bass, 1978; Baker et al., 1988). Entretanto, essas relações não são apoiadas pelos
dados gerados a partir de técnicas moleculares. Estudos imunológicos e de eletroforese
da albumina indicam uma proximidade maior entre Diaemus e Desmodus, tendo eles
divergido após a ramificação da linhagem que deu origem à Diphylla (Honeycutt et al.,
1981; Baker et al., 1989). Recentes dados morfológicos e baseados em sequências de
DNA nuclear e mitocondrial apresentaram os mesmos resultados (Wetterer et al., 2000;
Baker et al., 2000; 2003).
Desmodontinae foi por muito tempo considerado como o grupo mais basal da
família Phyllostomidae (Wetterer et al., 2000). Contudo, com o avanço das técnicas de
genética molecular esse posicionamento vem sendo questionado. A partir de dados de
seqüências de DNA nuclear e mitocondrial, Baker et al. (2000; 2003) sugerem que dois
novos grupos (Macrotinae e Karyovarians) ocupariam posições mais basais que
Desmodontinae na árvore da família. São necessárias novas investigações a esse
respeito, para que a filogenia da família não seja adotada levando-se em consideração
apenas um número restrito de classe de dados.
2.4. CITOGENÉTICA E EVOLUÇÃO
2.4.1. Importância dos estudos citogenéticos
Os primeiros estudos relativos à similaridade entre as espécies e sua reunião em
grupos taxonômicos foram realizados pela análise de suas características morfológicas e
métricas. Entretanto, com o surgimento de novas abordagens, que fazem uso de técnicas
citogenéticas, bioquímicas e moleculares, hipóteses filogenéticas geradas a partir dessa
classe de dados têm sido reexaminadas e, em alguns casos, reformuladas. Os dados
obtidos através de estudos cariotípicos constituem importantes ferramentas no
esclarecimento de questões genéticas, sistemáticas e evolutivas dos mais variados
grupos de organismos. Alterações nos cromossomos significam modificações no
próprio material genético, as quais são geralmente significativas para o rumo evolutivo
das espécies. Além disso, os cromossomos apresentam-se menos sujeitos à ação de
agentes externos do que qualquer característica morfológica ou fisiológica, tornando-se
importantes indicadores filogenéticos (Varella-Garcia e Taddei, 1989).
Geralmente, diferentes organismos apresentam cariótipos distintos, de forma que
cariótipos de espécies proximamente relacionadas são mais similares entre si do que são
os de espécies filogeneticamente distantes. Alterações no número, tamanho e
morfologia cromossômicas são, portanto, características evidentes do processo
evolutivo (John, 1981). Além disso, modificações do cariótipo primitivo constituem
caracteres em estado derivado, que podem ser utilizados, assim como tem sido feito
com atributos morfológicos, como base para a reunião de grupos naturais nos taxa
examinados. Dessa forma, informações geradas a partir de estudos cariotípicos têm sido
usadas por sistematas na formulação de hipóteses mais rigorosas em relação às
filogenias dos grupos investigados, pela dedução do número e tipos de rearranjos
cromossômicos incorporados durante o curso da evolução, bem como pelo
entendimento das forças participantes na fixação desses rearranjos (Qumsiyeh e Baker,
1988).
A variedade de alterações cromossômicas durante o processo evolutivo, bem
como marcantes diferenças na quantidade de alterações entre espécies próximas,
indicam que não existem alterações específicas requeridas para a especiação. Entretanto,
alguns tipos de alterações cromossômicas parecem ser mais importantes para o processo
de especiação e, conseqüentemente, para a análise da história evolutiva dos organismos.
Neste caso, evidências sugerem que rearranjos cromossômicos que tenham um alto
nível de associação ao isolamento reprodutivo entre populações serão de extrema
importância para a especiação (King, 1993). Além disso, tem sido observado que
existem certos tipos de alterações mais relevantes para a evolução cariotípica de
determinados grupos (Sumner, 2003).
Coghlan et al. (2005) afirmam que rearranjos cromossômicos, incluindo fissões,
fusões, translocações e expansão diferencial de seqüências repetitivas, constituíram as
forças primárias para as modificações cromossômicas entre os vertebrados. Como
exemplo para morcegos, os resultados obtidos no trabalho de Baker e Bickham (1980)
mostraram que apesar de 23% das 78 espécies analisadas terem conservado o cariótipo
primitivo, proposto para cada família (ou subfamília, no caso de Phyllostomidae), a
maioria apresenta vários rearranjos cromossômicos, sendo destacado o papel das fusões
Robertsonianas e inversões pericêntricas.
2.4.2. Técnicas citogenéticas empregadas no estudo de Chiroptera
2.4.2.1. Técnicas clássicas: uma abordagem histórica
Apesar dos caracteres morfológicos terem sido amplamente utilizados em
estudos de genética, sistemática e evolução, o cariótipo como uma complementação a
esses estudos se desenvolveu apenas após o aperfeiçoamento das técnicas de preparação
e coloração citológicas. Para mamíferos, técnicas adequadas não tinham sido descritas
até 1956, quando Ford e Hamerton descreveram a técnica de preparação citológica a
partir de medula óssea, com o uso de colchicina e de uma solução salina hipotônica de
citrato de sódio a qual permitia o aumento celular e melhor espalhamento cromossômico
(choque hipotônico).
A partir do final da década de 60, surgiram as primeiras publicações
descrevendo cariótipos de morcegos com o uso dessa metodologia. Estas preparações
garantiam melhores resultados em comparação aos dados obtidos através de material
testicular, anteriormente empregado, fornecendo informações sobre o número, tamanho
e morfologia dos cromossomos, bem como sobre os mecanismos de determinação
cromossômica do sexo para as espécies analisadas. Dessa forma, até 1970, números
diplóides de 126 espécies de morcegos haviam sido descritos (Yonenaga et al., 1969;
Baker, 1970b; Varella-Garcia e Taddei, 1989).
No início dos anos 70, foram desenvolvidas técnicas de coloração citológica que
permitiam a coloração diferencial de regiões cromossômicas. A análise por meio dessas
colorações revelou que a eucromatina é heterogênea, apresentando-se dividida
longitudinalmente em grandes domínios ou “bandas”, as quais podem apresentar
significados funcionais e/ou estruturais distintos, de forma que determinadas bandas
parecem corresponder a domínios cromossômicos com propriedades bioquímicas
relacionadas (Bickmore e Sumner, 1989).
Seabright (1971) descreveu a técnica de bandeamento G (GTG) que, juntamente
com outras técnicas de bandeamento (Q e R), permitiu o aprimoramento de estudos
cariotípicos em mamíferos. A primeira aplicação do bandeamento G foi no pareamento
cromossômico. Além disso, este tipo de bandeamento é de extrema importância na
detecção de variações estruturais como deleções, duplicações e inversões. Essa técnica
possibilitou uma melhor compreensão das alterações cromossômicas ocorridas ao longo
do processo evolutivo, que se estabeleceram em cariótipos de diversos organismos
(Sumner, 2003). Dessa forma, pela comparação do padrão de bandeamento
cromossômico específico, vários trabalhos têm procurado estabelecer relações
cariotípicas entre espécies de morcegos pertencentes a um mesmo gênero, à mesma
família, ou mesmo a famílias diferentes (Baker e Bickham, 1980; Baker et al., 1982).
Em 1972, Sumner descreveu uma técnica distinta de coloração, a qual permite a
detecção de regiões de heterocromatina constitutiva (HC) em cromossomos: o
bandeamento C (CBG). A heterocromatina constitutiva representa uma classe de
cromatina que se caracteriza por permanecer condensada durante todo o ciclo celular,
bem como por sua forma e localização cromossômica. Apresenta-se geralmente
concentrada em blocos distribuídos preferencialmente nas regiões proximais e/ou
terminais dos cromossomos, ocorrendo menos frequentemente em regiões intersticiais
em algumas espécies. Além disso, é caracterizada pela sua composição, apresentando
poucos genes estruturais, sendo formada principalmente por DNA repetitivo. Por outro
lado, sabe-se atualmente que a formação de regiões de heterocromatina não depende
exclusivamente de sua composição de DNA, mas também de várias proteínas que
desempenham um papel essencial na sua estruturação e manutenção (Wallrath, 1998;
Sumner, 2003; Grewal e Jia, 2007). Segundo Sumner, (2003), a identificação dos sítios
de HC, seu tamanho e composição de DNA são aspectos essenciais na caracterização
cariotípica de diversos organismos, uma vez que blocos de heterocromatina podem
variar entre as espécies, ou mesmo entre indivíduos da mesma espécie.
As regiões organizadoras de nucléolo (RONs), caracterizadas por conter os
principais genes para RNAr (18S, 5,8S e 28S), tiveram seu estudo aprimorado após a
descrição da marcação com nitrato de prata (Ag-RON) por Goodpasture e Bloom (1975)
e Howell e Black (1980). Segundo Trerè (2000), as RONs são compostas por proteínas
ácidas não-histônicas, as quais se ligam aos íons de prata, podendo ser visualizadas
seletivamente por essa técnica. A visualização das regiões marcadas pelo nitrato de
prata aparecem como pontos pretos bem definidos, os quais em núcleos interfásicos
estão exatamente localizados no interior do nucléolo.
Apesar de ser uma ferramenta útil no estudo da organização estrutural e
funcional dos cromossomos, a técnica de Ag-RON apenas detecta as RONs que se
encontravam transcricionalmente ativas na intérfase anterior à fase da divisão celular na
qual a célula se encontra. Dessa forma, um dos principais enfoques desta técnica é o
estudo da expressão de genes ribossomais (Pendás et al., 1993). Atualmente, entretanto,
a confirmação do número e localização das seqüências de DNAr, bem como de vários
outro tipos de seqüências, tem sido realizada por técnicas de citogenética molecular,
destacando-se a importância da hibridização in situ (Sumner, 2003; Guerra, 2004).
De acordo com Hsu et al. (1975), a distribuição de genes ribossômicos em
genomas de mamíferos pode ser classificada em diferentes padrões: (1) um único sítio
principal em que geralmente a própria RON se mostra como uma proeminente
constrição secundária, localizada em um par de cromossomos; (2) dois sítios principais;
(3) múltiplos sítios em áreas de heterocromatina centromérica; (4) múltiplos sítios em
braços curtos heterocromáticos e (5) múltiplos sítios nas regiões teloméricas. A
ocorrência de RONs em um único sítio tem sido considerada como o padrão ancestral
em termos de distribuição de DNAr.
Em morcegos, as primeiras informações citogenéticas obtidas pelas técnicas de
bandeamento G e C foram divulgadas por Pathak et al. (1973), enquanto Sites et al.
(1981) apresentaram os primeiros resultados com a técnica de Ag-RON. Até o presente,
foram publicados os cariótipos bandeados de um número considerável de espécies,
representantes das 18 famílias, principalmente de Phyllostomidae e Vespertilionidae
(Baker e Bickham, 1980; Hood e Baker, 1986; Morielle e Varella-Garcia, 1988; Reis et
al., 2007).
2.4.2.2. Hibridização in situ
A técnica de hibridização in situ (HIS), descrita em 1970 por Pardue e Gall,
consiste basicamente no pareamento de determinado segmento de DNA ou RNA
(sonda) com uma seqüência de nucleotídeos complementar (seqüência-alvo) no sítio
exato onde aquela seqüência ocorre naturalmente. A prévia marcação da sonda permite
a determinação precisa da localização do híbrido (sonda/seqüência-alvo) no interior das
células ou nos cromossomos.
O princípio no qual se baseia a técnica remete à complementaridade de bases na
dupla fita de DNA, ou seja, ao anelamento específico das moléculas complementares
dos ácidos nucléicos pela formação de pontes de hidrogênio entre suas bases
nitrogenadas. As fitas complementares do DNA cromossômico podem ser separadas, no
processo denominado desnaturação, sendo posteriormente renaturadas ao estado de fita
dupla. Se durante a renaturação do DNA cromossômico houver sonda disponível nas
proximidades da região de interesse, as cópias da sonda competirão com a seqüência
cromossômica idêntica, podendo ser hibridizadas in situ (Wilkinson, 1999; Guerra,
2004).
As primeiras hibridizações in situ foram realizadas com a utilização de sondas
marcadas com radioisótopos. Entretanto, certas desvantagens desse tipo de marcação,
como a instabilidade das moléculas radioativas, limitada resolução, longos períodos de
exposição requeridos para a obtenção das radiografias e os riscos associados à
radioatividade, impulsionaram o desenvolvimento de técnicas mais seguras e vantajosas
(Levsky e Singer, 2003). Atualmente, as marcações não-isotópicas, nas quais um
fluorocromo, um hapteno ou outro “grupo químico” é acoplado aos nucleotídeos, têm
sido mais amplamente utilizados no processo de HIS (Schwarzarcher e Heslop-
Harrison, 2000).
A FISH (fluorescence in situ hybridization) corresponde à hibridização in situ
com o uso de fluorocromos. Dependendo da forma como ocorre a marcação da sonda,
duas metodologias têm sido utilizadas: na marcação direta, nucleotídeos da sonda são
ligados diretamente a fluorocromos, enquanto na indireta, os nucleotídeos são acoplados
a uma molécula marcadora (mais comumente a biotina e a digoxigenina), a qual é
posteriormente detectada por outra molécula (anticorpo contra a molécula marcadora)
conjugada a um fluorocromo (Guerra, 2004).
As análises cromossômicas, utilizando a técnica de FISH, têm levado a um
marcante progresso na pesquisa citogenética. Comparada a outros métodos, a detecção
fluorescente dos sinais de hibridização apresenta vantagens de resolução, contraste,
rapidez, estabilidade e segurança, bem como a possibilidade de localização de diferentes
sondas simultaneamente. Essa técnica tem possibilitado estudos sobre a organização
física de seqüências repetidas, genes, seqüências clonadas e segmentos cromossômicos
ou cromossomos inteiros em diversos organismos, pelo emprego de sondas
correspondentes, sendo comum o uso de sondas para seqüências ribossômicas (45S e
5S), teloméricas (TTAGGG), centroméricas (DNA satélite), cromossômicas (pintura
cromossômica), DNA genômico total, entre outras. Além disso, avanços na tecnologia
empregada para este tipo de análise têm possibilitado estudos refinados nas mais
diversas áreas de pesquisa básica e aplicada, atribuindo à FISH um papel de extrema
relevância para a citogenética atual (Trask, 1991; Schwarzarcher e Heslop-Harrison,
2000; Levsky e Singer, 2003; Guerra, 2004).
2.4.2.3. Pintura cromossômica (Chromosome painting)
Os estudos citogenéticos se caracterizam como uma importante ferramenta na
reconstrução da história evolutiva de diversos grupos. Através deles se torna possível o
estabelecimento de homeologias, pela comparação interespecífica do padrão de bandas
cromossômicas. Entretanto, os dados gerados a partir de bandeamentos podem não
fornecer em alguns casos a verdadeira história evolutiva de segmentos cromossômicos,
principalmente em famílias com rápida evolução cariotípica, ou em estudos entre
espécies distantemente relacionadas, devido a dificuldades de se estabelecer verdadeiras
homeologias entre braços similares e de se realizar a distinção de caracteres primitivos e
derivados (O´Brien et al., 1999; Wetterer et al., 2000; Ao et al., 2007).
Recentemente, com o desenvolvimento das técnicas de FISH, a identificação de
segmentos homeólogos entre taxa distantemente relacionados tornou-se possível,
independentemente da conservação do padrão de bandeamento cromossômico. Durante
os últimos anos, uma das técnicas que tem contribuído significativamente na
identificação de regiões cromossômicas conservadas entre diferentes espécies é a
pintura cromossômica, a qual consiste basicamente na utilização de sondas específicas
para cromossomos inteiros ou segmentos cromossômicos para fornecer um mapa
citogenético de homeologias entre espécies diferentes (Wienberg e Stanyon, 1997;
Chowdhary et al., 1998; O´Brien et al.,1999).
As primeiras pinturas cromossomo-específicas foram humanas, utilizadas no
estudo de doenças genéticas. Wienberg et al. (1990) foram os primeiros a utilizar
sondas produzidas a partir de cromossomos totais de humanos em metáfases de outros
mamíferos, no caso, primatas, visando à identificação de homeologias cromossômicas.
A partir desse trabalho, vários estudos citogenéticos comparativos foram realizados,
utilizando sondas de todos os cromossomos humanos em preparações cromossômicas
de primatas e, após o aperfeiçoamento da técnica por Scherthan et al. (1994), em outras
ordens de mamíferos, a partir da qual a técnica foi denominada Zoo-FISH. Sondas
produzidas a partir de cromossomos “não-humanos”, por sua vez, apresentam marcante
utilidade na análise de grupos próximos de mamíferos ou de outros vertebrados porque
a eficiência de hibridização e da resolução é consideravelmente mais alta do que ao usar
sondas de ordens diferentes (Wienberg e Stanyon, 1997; Guerra, 2004).
Tem sido observado que quando uma sonda cromossômica de uma espécie é
hibridizada in situ nos cromossomos de outra, grandes regiões de homeologias contendo
genes são detectadas entre as duas espécies. Ocasionalmente, a sonda hibridiza em
apenas um cromossomo, indicando que todo o cromossomo é conservado. Em outros
casos, vários cromossomos ou partes de cromossomos são marcadas, indicando que
rearranjos intercromossômicos ocorreram durante a divergência dessas espécies. Em
geral, espécies mais proximamente relacionadas apresentam menos rearranjos entre si
do que as mais distantemente relacionadas (Ferguson-Smith et al., 1998).
Estudos comparativos confirmam que a pintura cromossômica é bem mais eficaz
do que estudos convencionais de bandeamento com Giemsa na determinação das
homeologias cromossômicas entre as espécies. Varias conclusões equivocadas de
antigos estudos com bandeamento foram refutadas pela Zoo-FISH (Ferguson-Smith et
al., 1998). Contudo, cromossomos pintados com sondas cromossômicas totais não
apresentam padrão de bandas, sendo geralmente difícil sua identificação precisa apenas
por morfologia após a hibridização. Dessa forma, o bandeamento cromossômico é
frequentemente requerido em conjunto à técnica de pintura cromossômica, garantindo a
identificação dos rearranjos internos ocorridos entre os cromossomos analisados (Trask,
1991; Chaves et al., 2002). A partir da homeologia definida pela pintura e o padrão de
bandas gerado pelo bandeamento G, a análise citogenética torna-se uma poderosa
ferramenta na elucidação da evolução cariotípica e das relações filogenéticas entre os
organismos, principalmente entre mamíferos (Wienberg e Stanyon, 1997; �Ao et al.,
2007).
O papel da Zoo-FISH em estudos de evolução cromossômica em mamíferos está
bem documentado na literatura. Atualmente uma ou algumas espécies pertencentes a
quase todas as ordens de mamíferos placentários foram estudadas com essa técnica
(Frönicke e Scherthan, 1997; �Müller et al., 1999; Richard et al., 2000; Yang et al.,
2006; Kellog et al., 2007).
Os primeiros estudos com pintura cromossômica em morcegos foram realizados
por Volleth et al. (1999; 2002) a partir de sondas cromossômicas de humanos. Nesses
estudos, dez espécies representantes de seis famílias foram investigadas: Glossophaga
soricina (Phyllostomidae), Myotis myotis, M. dasycneme e Pipistrellus blancpygmaeus
(Vespertilionidae), Rhinolophus mehelyi (Rhinolophidae), Hipposideros larvatus
(Hipposideridae), Mormopterus planiceps, M. jugularis e Mops mops (Molossidae) e
Eonycteris spelaea (Pteropodidae). Como resultado, seis sinapomorfias foram
encontradas, reunindo todas as famílias, gerando suporte para a monofilia da ordem.
Além disso, foi possível obter a divisão das famílias estudadas em três linhagens
evolutivas: Megachiroptera, Rhinopholoidea e Yangochiroptera. Contudo, as relações
entre essas três linhagens foram consideradas não-resolvidas, por conta da necessidade
de se investigar os taxa remanescentes.
A partir de 2005 foram produzidas as primeiras sondas cromossômicas derivadas
de espécies de morcegos. Pieczarka et al. (2005) realizaram a pintura cromossômica
recíproca em duas espécies da família Phyllostomidae: Phyllostomus hastatus
(Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae). A partir da análise dos dados
gerados, foi sugerido que diversos rearranjos cromossômicos ocorreram durante o
processo de diferenciação dos dois gêneros, com subseqüente estabilidade
cromossômica intragenérica. Além disso, foi proposto que os dois únicos pares
cromossômicos totalmente conservados entre estas espécies estão presentes no cariótipo
ancestral da família Phyllostomidae.
Com o uso de sondas cromossômicas totais da espécie Myotis myotis
(Vespertilionidae), Ao et al. (2006) estabeleceram relações entre sete espécies de
Vespertilionidae e concluíram que os rearranjos Robertsonianos constituíram o principal
mecanismo de evolução cromossômica da família e que adições de material
heterocromático desempenharam um importante papel na evolução cariotípica dos
gêneros Tylonycteris e Nyctalus. Além disso, esses autores puderam realizar a
comparação de seus dados com o cariótipo humano, fornecendo uma nova abordagem
para os estudos de evolução de Vespertilionidae.
Com a utilização das mesmas sondas, hibridizadas em cariótipos de três
membros de Pteropodidae, Rhinolophidae e Hipposideridae, Ao et al. (2007) integraram
seus dados aos resultados de Volleth et al. (2002) e traçaram relações entre as seis
famílias investigadas através da Zoo-FISH. Da mesma forma, foi possível a obtenção de
informações adicionais acerca de rearranjos ocorridos na evolução cariotípica no gênero
Rhinolophus, entre gêneros de Pteropodidae e Hipposideridae bem como entre
diferentes famílias da ordem Chiroptera. Segundo Ao et al. (2007), um rearranjo
cromossômico sinapomórfico apoiaria a reunião do clado Yinpterochiroptera
(Pteropodidae + Rhinolophoidea), proposto por análises moleculares, constituindo a
primeira assinatura cromossômica que apóia a reunião dessas famílias como um
agrupamento natural.
O trabalho mais recente referente à pintura cromossômica em morcegos, foi
realizado por Mao et al. (2007). Seis espécies da família Rhinolophidae juntamente com
quatro espécies, representantes das famílias Pteropodidae e Hipposideridae foram
analisadas por pintura cromossômica com sondas de Aselliscus stoliczkanus
(Hipposideridae). Adicionalmente, sondas cromossômicas de humano foram mapeadas
no cariótipo de A. stoliczkanus para a integração dos resultados aos previamente
publicados. Com a utilização dos rearranjos como caracteres na construção de uma
árvore filogenética e com a espécie Myotis altarium como grupo externo, foi refutada a
hipótese de que o cariótipo ancestral de Rhinolophus seria 2n=62 e proposto um
cariótipo similar ao de R. ferrumequinum, com 2n=58, como o ancestral para o gênero.
A ocorrência de translocações parece ter desempenhado um importante papel na
evolução cariotípica do grupo, contudo foi reconhecida a necessidade de análises com
um maior número de espécies para o esclarecimento dos rearranjos que ocorreram entre
espécies de Rhinolophus.
2.4.3. Evolução cariotípica na família Phyllostomidae
Os primeiros estudos citogenéticos na família Phyllostomidae, realizados a partir
de 1960, baseavam-se exclusivamente na análise cariotípica convencional. No entanto,
contribuíram consideravelmente para o entendimento inicial da evolução cariotípica do
grupo. O emprego da coloração convencional permitiu que fossem analisados os
números diplóides (2n) e fundamentais (número de braços autossômicos = NF), a
morfologia cromossômica e o sistema de determinação sexual em várias espécies.
(Baker, 1967; Yonenaga et al., 1969; Baker, 1970a;b). Adicionalmente, estudos usando
técnicas que permitem a marcação diferencial dos cromossomos contribuíram de forma
significativa para o entendimento dos mecanismos envolvidos na evolução cariotípica
da família (Patton e Baker, 1978; Baker e Bickham, 1980).
Os dados gerados até o presente mostram que Phyllostomidae apresenta números
diplóides que variam de 2n=14 em Vampyressa melissa a 2n=46 em Macrotus
waterhousii, com números fundamentais se estendendo de 20 a 70. Os valores mais
comumente encontrados são 2n=32 e NF=56, apresentados por representantes de várias
subfamílias (Baker, 1970b; Gardner, 1977; Reis et al., 2007).
Em relação ao sistema de determinação sexual, apesar do sistema simples
(XX;XY) ser o mais comum em Chiroptera, a família Phyllostomidae apresenta
adicionalmente dois sistemas distintos, ambos originados a partir de eventos de
translocação entre alossomos e autossomos (Baker, 1970b; Tucker, 1986). No sistema
múltiplo do tipo XY1Y2, um cromossomo do complemento autossômico foi translocado
ao cromossomo X. Dessa forma, seu homólogo permanece livre, correspondendo a um
segundo Y em machos. Este sistema tem sido descrito nas subfamílias Carolliinae,
Glossophaginae e Stenodermatinae, com esta última apresentando o maior número de
espécies. O sistema de determinação sexual Neo-XY, por sua vez, é considerado como
derivado do sistema múltiplo, sendo representado em Phyllostomidae por espécies da
subfamília Stenodermatinae. Após o rearranjo que originara o sistema múltiplo, uma
segunda translocação (Y1-Y2) resulta na formação de cromossomos X e Y compostos
(Tucker, 1986; Tucker e Bickham, 1986).
Patton e Baker (1978) realizaram um dos primeiros trabalhos onde se tentou
estabelecer, por bandeamento cromossômico, as relações entre Phyllostomidae e
morcegos de outras famílias. Bandeamentos G e C foram utilizados na determinação de
homeologias cromossômicas entre representantes das famílias Mormoopidae,
Noctilionidae e Phyllostomidae. Como resultado da análise do padrão de bandas G, foi
proposto que Mormoopidae e Noctilionidae, compartilhando cinco fusões
Robertsonianas sinapomórficas, estariam mais proximamente relacionadas entre si do
que a Phyllostomidae. Além disso, um cariótipo com 2n=46, NF=60 foi considerado
como ancestral para a família Phyllostomidae, bem como para a superfamília
Phyllostomoidea (= Noctilionoidea). Um cariótipo similar, composto por 16
meta/submetacêntricos, 28 acrocêntricos mais cromossomos sexuais, está presente na
espécie Macrotus waterhousii e por isso tem sido utilizado por alguns grupos de
pesquisa como referência para o sistema de numeração cromossômica em
Phyllostomidae (Baker, 2006).
A provável tendência evolutiva em Phyllostomidae parece levar à redução do
número diplóide por eventos de fusão cêntrica, com a retenção dos grupos de ligação.
Dessa forma, a homeologia de muitos segmentos cromossômicos tem sido constatada
em espécies representantes das diferentes subfamílias, como por exemplo,
Desmodontinae (Varella-Garcia et al., 1989; Santos et al., 2001), Phyllostominae
(Rodrigues et al., 2000; Pieczarka et al., 2005), Glossophaginae (Haiduk e Baker,
1982), Carolliinae (Pieczarka et al., 2005) e Stenodermatinae (Souza e Araújo, 1990;
Silva et al., 2005).
Segundo Baker e Bickham (1980), a evolução cromossômica em várias espécies
de morcegos, inclusive da família Phyllostomidae, não ocorre de maneira uniforme,
com algumas linhagens apresentando mudanças rápidas e consideráveis, enquanto
outras, uma taxa lenta de evolução cromossômica. Dessa forma, os padrões de evolução
cariotípica em morcegos podem ser enquadrados em três categorias: conservacionismo
cromossômico, ortoseleção cariotípica e megaevolução cariotípica.
No conservacionismo cromossômico, a taxa de evolução cariotípica é baixa,
com espécies proximamente relacionadas diferindo por poucos ou nenhum rearranjo. O
gênero Artibeus (Stenodermatinae) exemplifica esse tipo de padrão, uma vez que a
maioria das espécies apresenta o mesmo número diplóide (2n=30/31) com praticamente
nenhuma variação no padrão de bandeamento G (Souza e Araújo, 1990).
A ortoseleção cariotípica, descrita por White (1975), ocorre quando cariótipos de
espécies proximamente relacionadas diferem por poucos ou numerosos rearranjos,
contudo sem grandes variações nos tipos de rearranjos apresentados, havendo
conseqüentemente a conservação dos grupos de ligação. O gênero Uroderma é citado
como exemplo para a família Phyllostomidae (Baker e Bickham, 1980).
Nos taxa que apresentam megaevolução cariotípica, os cariótipos de espécies
estreitamente relacionadas podem ser tão rearranjados que homeologias não podem ser
determinadas através de bandeamento G. Numerosos e diferentes tipos de rearranjos
participam na reorganização desses cariótipos, de forma que o estabelecimento dos
passos envolvidos na formação dos mesmos é extremamente dificultado. Exemplos de
megaevolução cariotípica em morcegos da família Phyllostomidae são encontrados nos
gêneros Tonatia, Micronycteris e Vampyressa (Baker e Bickham, 1980).
Os resultados obtidos pelo emprego da técnica de bandeamento C na família
Phyllostomidae demonstram que a heterocromatina constitutiva (HC) pode restringir-se
às regiões centroméricas ou ocorrer também em regiões teloméricas e intersticiais,
apresentando variações em relação ao tamanho do bloco heterocromático (Varella-
Garcia e Taddei, 1989; Souza e Araújo, 1990; Santos e Souza, 1998a,b; Santos et al.,
2001).
Nas espécies do gênero Phyllostomus (Phyllostominae), P. discolor, P.
elongatus e P. hastatus, a HC têm sido descrita como localizada exclusivamente na
região pericentromérica de todos os cromossomos (Varella-Garcia et al., 1989; Santos e
Souza, 1998b; Rodrigues et al., 2000). Blocos de HC intersticiais e teloméricos foram
encontrados em várias espécies: Carollia perspicillata, Choeroniscus minor, Artibeus
lituratus, A. planirostris, A. jamaicencis, A. cinereus, A. obscurus, Diaemus youngi,
Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata, Anoura caudifer e Platyrrhinus lineatus. Esta
técnica representa uma importante ferramenta na distinção de espécies que são
morfologicamente idênticas, e tem sido de extrema utilidade na caracterização das
diversas espécies do gênero Artibeus (Stenodermatinae) (Souza e Araújo, 1990; Santos
e Souza, 1998a; Neves et al., 2001; Santos et al., 2001; Lemos-Pinto, 2007).
Estudos das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) em diversos
representantes de Phyllostomidae têm sido realizados a partir do emprego da coloração
com nitrato de prata. Nesses morcegos, podem ocorrer de um a quatro pares de RONs
em regiões cromossômicas teloméricas ou intersticiais, sendo freqüentemente
encontradas nos autossomos (Morielle e Varella-Garcia, 1988; Souza e Araújo, 1990;
Silva et al., 2005). Contudo, em duas espécies da subfamília Carolliinae foi descrita a
presença de RONs em cromossomos sexuais. Em Carollia perspicillata e C. castanea,
foram detectadas marcações no cromossomo X e nos cromossomos X e Y,
respectivamente (Goodpasture e Bloom, 1975; Hsu et al., 1975; Santos e Souza,
1998a).
Nos casos em que as RONs se apresentam em apenas um par de cromossomos,
ocorre geralmente sua marcação em todas as células. Entretanto, nas espécies em que há
mais de um par, tem sido observada ampla variabilidade intraespecífica no número de
RONs ativas devido à afinidade da prata apenas às regiões de transcrição dos genes de
RNAr (Morielle e Varella-Garcia, 1988).
Adicionalmente, as RONs de diversas espécies de morcegos têm sido detectadas
através da FISH com sondas ribossomais. Representantes das subfamílias
Desmodontinae (Santos et al., 2001), Carolliinae (Hsu et al., 1975), Phyllostominae,
Stenodermatinae e Glossophaginae (Santos et al., 2002) foram analisados por essa
técnica. No trabalho de Baker et al. (1992), foram analisadas 50 espécies pertencentes a
sete famílias, sendo 30 de Phyllostomidae e os resultados foram comparados aos obtidos
para 40 espécies de roedores. Constatou-se que o número médio de sítios ribossomais
em morcegos é significativamente mais baixo do que o observado em roedores. Esses
autores justificam a variação encontrada como decorrente de uma provável tendência de
contenção do tamanho do genoma em morcegos, por redução na quantidade de
seqüências repetitivas. Como em todos os mamíferos parecem existir mecanismos de
amplificação e redução de seqüências repetitivas (Wu e Hammer, 1991), foi sugerido
que em morcegos, os mecanismos de redução dos sítios ribossomais são mais fortes do
que estes mesmos mecanismos em roedores e outros mamíferos.
Como a FISH não depende da presença de proteínas ácidas marcadas pela prata
no processo de transcrição do DNAr, essa técnica tem sido utilizada não apenas na
detecção de RONs ativas, mas também para a detecção de seqüências de DNAr inativas
no genoma (Porter, 1994). Um exemplo desta aplicação no estudo de morcegos da
família Phyllostomidae foi observado por Santos et al. (2002). A comparação entre os
resultados obtidos por FISH e pela marcação com nitrato de prata mostrou a ocorrência
de um par cromossômico portando RONs silenciosas em Artibeus cinereus
(Stenodermatinae).
Estudos com hibridização in situ na ordem Chiroptera ainda são escassos.
Segundo Baker (2006), menos de 1% das espécies de morcegos foi estudada por
técnicas modernas de citogenética molecular. Apesar disso, existem registros pontuais
do emprego dessas técnicas em algumas espécies de Phyllostomidae. Além dos estudos
de FISH com sondas ribossomais, outros tipos de sondas têm sido empregados no
estudo de representantes do grupo.
Parish et al. (2002) utilizaram sondas da seqüência repetitiva LINE-1 no
cariótipo de Carollia brevicauda e detectaram um maior acúmulo dessas seqüências na
porção original do cromossomo X em relação à porção deste cromossomo representada
pelo autossomo translocado. A interpretação dos resultados obtidos atribuiu a estas
seqüências um possível papel na inativação do cromossomo X nessa espécie.
O uso de sondas teloméricas com a seqüência TTAGGG tem demonstrado certa
diversidade de padrões entre diferentes espécies analisadas. Um padrão exclusivamente
telomérico foi observado em Macrotus waterhousii e M. californicus. Em Artibeus
lituratus e A. jamaicencis foram observados um e quatro pares de cromossomos com
sítios centroméricos dessa seqüência, respectivamente, enquanto em uma espécie de
Chiroderma grandes sítios centroméricos estão presentes na maior parte dos
cromossomos (Meyne et al., 1990; Multani et al., 2001). Em Platyrrhinus lineatus,
alguns sinais intersticiais e terminais foram observados, estando em associação com
regiões de heterocromatina e RONs (Faria e Morielle-Versute, 2002). Os resultados
mais controversos foram observados em Carollia perspicillata. Nos três trabalhos em
que se realizaram experimentos com sondas teloméricas, as extremidades da maioria
dos cromossomos apresentaram marcações fracas ou ausentes. Apesar disso, foi
observada uma forte marcação nas regiões centroméricas na maioria dos pares
autossômicos (Meyne et al., 1990; Multani et al., 2001; Faria e Morielle-Versute,
2002).
Três espécies da família Phyllostomidae foram estudadas pela técnica de pintura
cromossômica: Glossophaga soricina, Phyllostomus hastatus e Carollia brevicauda
(Volleth et al., 1999; Pieczarka et al., 2005). Esta técnica tem exemplificado a proposta
de Patton e Baker (1978) de retenção dos grupos de ligação entre espécies de morcegos,
uma vez que têm sido observados grandes blocos e/ou alguns cromossomos
inteiramente marcados quando se hibridizam sondas de cromossomos totais nos
cariótipos dessas espécies.
2.4.3.1 Subfamília Desmodontinae
A subfamília Desmodontinae tem sido investigada por praticamente todas as
técnicas citológicas mencionadas anteriormente. Cadena e Baker (1976) analisaram
convencionalmente os cariótipos das três espécies dessa subfamília (Desmodus
rotundus, Diaemus youngi e Diphylla ecaudata) e observaram que existe certa variação
entre elas. Desmodus rotundus apresenta um número diplóide de 2n=28 e NF=52
enquanto as outras duas espécies apresentam 2n=32 e NF=60. Todas apresentam
autossomos com dois braços e sistema simples de determinação do sexo, de forma que
os cromossomos sexuais aparecem bastante semelhantes em tamanho e morfologia entre
as três espécies. Apesar dos mesmos valores para número diplóide e fundamental, foi
constatado que os cariótipos de D. ecaudata e D. youngi não eram idênticos, devido a
diferenças na morfologia de alguns cromossomos.
Análises mais detalhadas da variação cromossômica entre os morcegos
hematófagos foram obtidas através das técnicas de bandeamento C e G. Dessa forma,
foi observado que nas três espécies, blocos de HC ocorrem na região pericentromérica
de todos os cromossomos, enquanto em D. youngi blocos teloméricos adicionais são
evidenciados pela técnica de bandeamento C (Baker et al., 1988 ;Varella-Garcia et al.,
1989; Santos et al., 2001). Em relação à presença de blocos de HC intersticiais, existe
certa discordância entre diferentes trabalhos. Segundo Baker et al. (1988), nenhum dos
três hematófagos apresenta blocos intersticiais C-positivos em seus cariótipos. Varella-
Garcia et al. (1989), entretanto, encontraram bandas intersticiais em alguns
cromossomos de D. ecaudata. Por outro lado, Santos et al. (2001) observaram que
blocos intersticiais estão presentes apenas em cromossomos de D. rotundus e concluem
que essa diferença pode ser atribuída a polimorfismos cromossômicos entre distintas
populações.
A técnica de bandeamento G tem mostrado um padrão no qual boa parte dos
cromossomos é compartilhada entre as três espécies. A comparação dos cariótipos
bandeados obtidos por Varella-Garcia et al. (1989) mostra que D. rotundus e D. youngi
apresentam homeologias entre os pares cromossômicos 1, 2, 3, 4, e 5. Além disso, foi
possível detectar inversões entre as duas espécies, como a presente no par 6. Os dados
obtidos por Santos et al. (2001) permitiram a identificação de homeologias
cromossômicas entre D. rotundus e D. ecaudata, de forma que os padrões de
bandeamento se apresentam extremamente conservados entre vários cromossomos
dessas espécies.
Resultados das análises realizadas por Baker et al. (1988) sugerem que as três
espécies de hematófagos compartilham considerável homeologia cromossômica e que
vários braços cromossômicos podem ser relacionados entre seus cariótipos e de outros
Phyllostomidae, Mormoopidae e Noctilionidae. Foi proposto que o cariótipo de D.
youngi apresenta-se menos modificado em relação ao cariótipo ancestral da família, de
forma que cinco dos oito cromossomos com dois braços presentes no cariótipo ancestral
estão presentes e inalterados nesta espécie. Dos três cromossomos restantes, dois
parecem ter sofrido inversão dando origem a cromossomos acrocêntricos, seguida de
translocação, gerando os cromossomos de dois braços apresentados atualmente pela
espécie. O último par cromossômico ancestral de dois braços parece ter sofrido fissão
cêntrica, com posterior inversão. No cariótipo primitivo existem 14 cromossomos
acrocêntricos que parecem ter sofrido inversões ou fusões Robertsonianas para a
formação do cariótipo atual de D. youngi.
A detecção das RONs em morcegos hematófagos tem sido realizada tanto pela
técnica de coloração com nitrato de prata como pela FISH. Foi demonstrado que as três
espécies apresentam um único sítio, contudo os cromossomos portadores da RON são
distintos entre as três espécies. Em D. rotundus a RON localiza-se intersticialmente no
braço longo de um par cromossômico numerado como 10 por Varella-Garcia et al.
(1989) e 8 por Santos et al. (2001), enquanto em D. ecaudata e D. youngi a marcação
aparece no braço curto do par 13 e proximalmente no par 15, respectivamente (Morielle
e Varella-Garcia, 1988; Varella-Garcia et al. (1989); Baker et al., 1992; Santos et al.,
2001).
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Manuscrito a ser enviado à revista:
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Elucidação das homeologias cromossômicas entre os morcegos
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4 Molecular Cytogenetics Laboratory, Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, UK.
Running title: Zoo-FISH em morcegos hematófagos.
Corresponding Author:
Neide Santos
Departamento de Genética, CCB/UFPE,
Av. Moares Rego, S/N, Cidade Universitária
50. 732-970 Recife, Pernambuco, Brasil.
Phone: (81)2126-8520, Fax: (81)2126-8569
E-mail: [email protected]
RESUMO
Phyllostomidae caracteriza-se como o grupo mais diverso morfologicamente
dentre os mamíferos, o que gera considerável discordância no estabelecimento de suas
relações sistemáticas e evolutivas. Citogeneticamente caracteriza-se por cariótipos
conservados entre espécies proximamente relacionadas, contudo por intensa
variabilidade intergenérica, o que dificulta o estabelecimento de suas relações por
bandeamentos clássicos. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo identificar
homeologias cromossômicas e possíveis rearranjos ocorridos na diferenciação
cariotípica de Desmodus rotundus, Diphylla ecaudata e Diaemus youngi
(Desmodontinae), através da Zoo-FISH com sondas cromossômicas totais de
Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae). As 16
sondas de P. hastatus detectaram 23, 22 e 21 segmentos conservados nos cariótipos de
D. rotundus, D. ecaudata e D. youngi, respectivamente, enquanto 28, 27 e 27 segmentos
conservados foram respectivamente detectados com 11 sondas de C. brevicauda. Os
dados obtidos evidenciaram certa conservação cariotípica entre os membros de
Desmodontinae, com D. rotundus apresentando o cariótipo mais rearranjado dentre as
três espécies. Com base nas relações evolutivas estabelecidas previamente por dados
moleculares, morfológicos e citogenéticos são propostas, neste trabalho, as possíveis
seqüências de eventos que ocorreram durante a evolução cromossômica do grupo. O
estudo comparativo entre as cinco espécies permitiu concluir que Desmodontinae
apresenta-se mais proximamente relacionada à Phyllostominae que à Carolliinae.
Palavras-chave: Desmodus, Diaemus, Diphylla, Phyllostomidae, pintura
cromossômica.
INTRODUÇÃO
A família Phyllostomidae apresenta uma ampla diversidade dentre os Chiroptera
Neotropicais, incluindo 57 gêneros e cerca de 160 espécies (Simmons 2005). Seus
representantes exibem mais variações morfológicas do que qualquer outro grupo de
mamíferos, com adaptações a uma grande diversidade de nichos ecológicos. Essa
heterogeneidade tem gerado discordâncias no que diz respeito às suas relações
sistemáticas e evolutivas. Registros de árvores filogenéticas, obtidas a partir das mais
diversas classes de dados, têm mostrado que o número de subfamílias de
Phyllostomidae tem variado de um mínimo de duas a um máximo de 11, com
considerável reorganização de membros incluídos nestas subfamílias (Wetterer et al.
2000, Baker et al. 2000, 2003).
A subfamília Desmodontinae é composta por apenas três gêneros monotípicos,
representados por Desmodus rotundus, Diaemus youngi e Diphylla ecaudata, as quais
são as únicas espécies de morcegos hematófagos existentes (Simmons 2005, Reis et al.
2007). Apesar das evidencias indicarem a monofilia do grupo, as relações entre os
membros de Desmodontinae, bem como a posição da subfamília na árvore dos
Phyllostomidae são ainda motivo de controvérsias. Dados imunológicos, morfológicos e
de seqüências de DNA nuclear e mitocondrial indicam que Diaemus e Desmodus são
grupos irmãos, tendo divergido após a ramificação da linhagem que deu origem à
Diphylla (Honeycutt et al. 1981, Wetterer et al. 2000, Baker et al. 2000, 2003).
Contudo, estudos citogenéticos têm mostrado diferentes resultados, nos quais análises
do padrão de bandeamento G sugerem que dentre os morcegos hematófagos, o cariótipo
de D. youngi representa o menos modificado em relação ao cariótipo ancestral da
família Phyllostomidae e que Desmodus e Diphylla formam um clado à parte, em
relação à Diaemus. Apesar de várias homeologias identificadas, esse tipo de
bandeamento não permitiu o entendimento das mudanças cromossômicas que ocorreram
durante a evolução cariotípica do grupo (Bass, 1978, Baker et al. 1988, Varella-Garcia
et al. 1989, Santos et al. 2001).
Diversos trabalhos têm procurado estabelecer as relações entre os morcegos
hematófagos comparativamente aos representantes de outras subfamílias. Dados
gerados por análises morfológicas sugerem o posicionamento basal de Desmodontinae
na árvore de Phyllostomidae. Entretanto, recentes análises moleculares têm proposto
que outras linhagens divergiram mais cedo que Desmodontinae na irradiação da família.
Apesar das controvérsias, considera-se que os morcegos vampiros representam um
clado que divergiu relativamente cedo na evolução de Phyllostomidae (Wetterer et al.
2000, Jones et al. 2002, Baker et al. 2000, 2003).
Dados citogenéticos comparativos entre morcegos hematófagos e outros
Phyllostomidae são escassos na literatura. Cadena e Baker (1976) observaram através de
coloração convencional, que os três gêneros de Desmodontinae apresentam grande
similaridade cariotípica com alguns membros das subfamílias Phyllostominae e
Glossophaginae, divergindo dos membros de Carolliinae e Stenodermatinae. Baseados
em comparações dos padrões de bandeamento G, Baker et al. (1989) sugeriram, assim
como proposto por dados moleculares, que os vampiros compartilham uma
acenstralidade comum com Phyllostominae após a divergência dos gêneros
Micronycteris e Macrotus.
Análises comparativas de cariótipos G-bandeados têm contribuído
significativamente para o estabelecimento das relações evolutivas entre várias espécies
de morcegos. Entretanto, em alguns casos, este tipo de análise não esclarece a
verdadeira história evolutiva de segmentos cromossômicos por conta de similaridades
entre bandas não homólogas (Baker e Bickham 1980, Wetterer et al. 2000). Nestes
casos, uma das técnicas que tem se mostrado significativamente eficiente na
identificação de regiões cromossômicas conservadas entre diferentes espécies é a
pintura cromossômica comparativa (Zoo-FISH). Quando combinada com o
bandeamento G, esta técnica tem desempenhado um importante papel na determinação
dos rearranjos cromossômicos que ocorreram durante a evolução cariotípica de
determinado grupo, bem como para a elucidação de suas relações filogenéticas (Volleth
et al. 1999, 2002, Pieczarka et al. 2005, Ao et al. 2006, 2007, Mao et al. 2007).
As primeiras sondas cromossômicas derivadas de espécies de morcegos foram
produzidas no trabalho de Pieczarka et al. (2005), onde se realizou a pintura
cromossômica recíproca em duas espécies da família Phyllostomidae: Phyllostomus
hastatus (Phyllostominae) e Carollia brevicauda (Carolliinae). A partir da análise dos
dados gerados, foi sugerido que diversos rearranjos cromossômicos ocorreram durante o
processo de diferenciação dos dois gêneros, com subseqüente estabilidade
cromossômica intragenérica. Neste trabalho foi destacada a importância do uso dessas
sondas no estudo das relações evolutivas entre representantes da família
Phyllostomidae.
Dessa forma, no presente trabalho foi realizada a Zoo-FISH com sondas
cromossômicas totais de Carollia brevicauda (2n=21,XY1Y2) e Phyllostomus hastatus
(2n=32,XX) nos cariótipos de Diphylla ecaudata, Diaemus youngi e Desmodus
rotundus, na tentativa de elucidar suas verdadeiras homeologias cariotípicas, para a
reconstrução dos eventos que levaram aos cariótipos apresentados atualmente por essas
espécies. Além disso, pela comparação entre os cariótipos dessas cinco espécies, tentou-
se estabelecer quais cromossomos estariam presentes no cariótipo ancestral da família
Phyllostomidae.
MATERIAIS E MÉTODOS
Espécies analisadas
Espécimes de D. ecaudata, D. youngi e D. rotundus foram coletados em
populações naturais no estado de Pernambuco, região Nordeste do Brasil. A Tabela 1
apresenta o número de indivíduos, sexo e local de captura. Os exemplares coletados
encontram-se depositados na Coleção de Mamíferos do Departamento de Sistemática e
Ecologia da Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e na Coleção de mamíferos da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
Preparações citológicas e marcação com AgNO3
As metáfases das espécies analisadas neste trabalho foram obtidas a partir de
preparações diretas de medula óssea. Foi realizada a coloração convencional com
Giemsa para a verificação do número diplóide, morfologia cromossômica e mecanismo
de determinação sexual das espécies, para a comparação com os dados previamente
publicados. A marcação com nitrato de prata foi realizada segundo Howell e Black
(1980) para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) e comparação
com dados previamente descritos na literatura.
Hibridização in situ
As sondas cromossomo-específicas foram produzidas no trabalho de Pieczarka
et al. (2005) no Molecular Cytogenetics Laboratory, Department of Veterinary
Medicine, University of Cambridge, UK a partir de linhagens primárias de fibroblasto
de Phyllostomus hastatus (2n=32,XX) e Carollia brevicauda (2n=21,XY1Y2)
estabelecidas no Laboratório de Citogenética, Departamento de Genética/CCB,
Universidade Federal do Pará. Cromossomos separados através de citometria de fluxo
foram amplificados pela técnica de DOP-PCR e marcados com biotina-16-dUTP, FITC-
12-dUTP ou Cy3-dUTP (Amersham) para a obtenção das sondas espécíficas para cada
autossomo e o X de cada espécie, totalizando 16 e 11 sondas de P. hastatus e C.
brevicauda, respectivamente. Neste trabalho não foram utilizadas sondas para
cromossomos Y, exceto pelo Y2 de C. brevicauda.
A hibridização in situ foi realizada segundo Yang et al. (1995) e Pieckzarka et
al. (2005) com algumas modificações. As lâminas foram desnaturadas em solução de
formamida 70% a 62°C por 1 minuto. Posteriormente, 2 µL de sonda foram adicionados
a 13 µL de solução de hibridização (formamida a 50%, 1XSSC, sulfato de dextran a
10%, 5 µg de DNA de esperma de salmão e 2 µg de mouse Cot-1 DNA) e desnaturados
a 70°C durante 15 minutos. A solução de hibridização foi aplicada nas lâminas
desnaturadas e cobertas com lamínulas de 24X32 mm. A hibridização ocorreu em
câmara úmida a 37°C por um período de 72 horas. Nos banhos pós-hibridização, as
lâminas foram incubadas duas vezes em solução de formamida 50% em 2XSSC por
cinco minutos cada, seguidas de duas lavagens em 2XSSC por cinco minutos e uma
lavagem em 4-Tween (4T) por quatro minutos a 42°C. Para a detecção da marcação
com biotina, utilizou-se avidina conjugada ao fluorocromo Cy3. Finalmente, foram
realizadas três lavagens à temperatura ambiente em 4T por quatro minutos cada, seguida
de coloração com DAPI.
Captura e processamento das imagens
As imagens em campo claro foram obtidas através de um microscópio Leitz
Orthoplan, acoplado a uma câmera fotográfica. Fotomicrografias das hibridizações
foram obtidas através de um microscópio Zeiss-Axiophot 2 conectado a um sistema de
fluorescência e acoplados a uma câmera CCD (Photometrics C250/A). A sobreposição e
ajustes de brilho/contraste das fotografias obtidas foram realizados com auxílio do
software Adobe Photoshop 7.0.
Análise dos dados
Para a análise dos dados, foram utilizados os bandeamentos cromossômicos
publicados previamente por Santos et al. (2001) para D. ecaudata e por Varella-Garcia
et al. (1989) para D. youngi e D. rotundus. A reprodução das imagens referentes ao
bandeamento G foi efetuada com a autorização dos respectivos autores. Os sinais de
hibridização foram atribuídos a um cromossomo ou região cromossômica específica a
partir da comparação do padrão de coloração por DAPI invertido, em preto e branco,
similar ao obtido por bandeamento G. As abreviações PHA, CBR, DEC, DYO, e DRO
seguidas do número do par cromossômico foram utilizadas para referir-se a determinado
cromossomo de P. hastatus, C. brevicauda, D. ecaudata, D. youngi e D. rotundus,
respectivamente.
RESULTADOS
Dados cariotípicos das espécies analisadas
As espécies Diphylla ecaudata e Diaemus youngi apresentaram número diplóide
2n=32 e número fundamental (NF) igual a 60, enquanto um cariótipo com 2n=28 e
NF=52 foi observado para Desmodus rotundus. As três espécies mostraram um sistema
simples de determinação sexual do tipo XX nas fêmeas e XY nos machos. Os cariótipos
revelaram morfologia meta/submetacêntrica para todos os cromossomos, exceto para o
Y (dados não mostrados), que aparece como um cromossomo puntiforme nas três
espécies analisadas e para um par subtelocêntrico de tamanho médio (par 13), em D.
ecaudata (Fig. 1 e 2). Um único par de RON foi observado em cada espécie, variando
em sua localização: intersticial no braço curto do par 13 em D. ecaudata e proximal no
braço longo do par 10 de D. rotundus e no braço longo do par 15 de D. youngi (Fig. 1 e
2).
Hibridização de sondas de Phyllostomus hastatus nos cariótipos de Diphylla ecaudata,
Diaemus youngi e Desmodus rotundus.
O cariótipo de Diphylla ecaudata apresentou 22 segmentos conservados a partir
da hibridização com sondas cromossômicas totais de P. hastatus (Fig. 1a,b). Apenas
cromossomos marcados com uma ou duas sondas foram observados: os pares DEC2
(PHA3), DEC5 (PHA6), DEC6 (PHA7), DEC8 (PHA8), DEC9 (PHA4), DEC10 (PHA
10), DEC11 (PHA11), DEC12 (PHA9), DEC14 (PHA14) e DECX (PHAX)
apresentaram marcações por apenas uma sonda de Phyllostomus. Os demais pares,
foram hibridizados por duas sondas simultaneamente: DEC1 (PHA2 e 4), DEC3 (PHA2
e 5), DEC4 (PHA5 e 1), DEC7 (PHA1 e 12), DEC13 (PHA15 e 13) e DEC15 (PHA15 e
12). Todas as sondas de P. hastatus hibridizaram em apenas um par cromossômico de
D. ecaudata, exceto PHA1, 2, 4, 5, 12 e 15 as quais apresentaram marcação em dois
cromossomos distintos, cada.
As sondas de P. hastatus hibridizaram em um total de 21 segmentos conservados
no cariótipo de D. youngi (Fig. 1a,c), correspondendo a cromossomos marcados por
uma ou duas sondas. As marcações por apenas uma sonda ocorreram nos pares
cromossômicos DYO3 (PHA3), DYO5 (PHA6), DYO6 (PHA7), DYO7 (PHA8),
DYO8 (PHA1), DYO9 (PHA9), DYO10 (PHA11), DYO11 (PHA4), DYO13 (PHA10),
DYO15 (PHA15) e DYOX (PHAX). Os pares DYO1 (PHA4 e 2), 2 (PHA5 e 2), 4
(PHA 5 e 1), 12 (PHA 14 e 12) e 14 (PHA 13 e 12) representam os cromossomos
marcados por duas sondas simultaneamente. Todas as sondas de P. hastatus
hibridizaram apenas em um par cromossômico de D. youngi, exceto por PHA1, 2, 4, 5 e
12, as quais apresentaram sinais em dois pares distintos.
A hibridização com sondas de P. hastatus no genoma de D. rotundus revelou 23
segmentos homeólogos (Fig. 1a,d). Nesta espécie, sete cromossomos apresentaram-se
inteiramente marcados com uma única sonda cromossômica de Phyllostomus: DRO2
(PHA3), DRO5 (PHA6), DRO8 (PHA8), DRO9 (PHA7), DRO12 (PHA4), DRO13
(PHA10) e DROX (PHAX). Cinco cromossomos de Desmodus apresentaram-se
marcados por duas sondas: DRO1 (PHA4 e PHA2), DRO3 (PHA5 e PHA2), DRO4
(PHA5 e PHA1), DRO7 (PHA1 e PHA12) e DRO11 (PHA13 e PHA14).
Adicionalmente, dois cromossomos foram marcados por três sondas cromossômicas
diferentes: DRO6 (PHA11, PHA9 e PHA12) e DRO10 (PHA9, PHA12 e PHA15).
As sondas PHA3, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15 e X marcaram apenas um
cromossomo; PHA1, 2, 4, 5 e 9 hibridizaram em dois cromossomos; enquanto PHA12
apresentou sinais de hibridização em três pares cromossômicos distintos no cariótipo de
D. rotundus. Não foi possível a identificação de marcação por nenhuma sonda em
pequenos segmentos dos cromossomos 6 e 10 de D. rotundus (Fig. 1d).
Hibridização de sondas de Carollia brevicauda nos cariótipos de Desmodus rotundus,
Diphylla ecaudata e Diaemus youngi.
As hibridizações com sondas de Carollia brevicauda revelaram a
correspondência de todas as sondas a um ou mais segmentos cromossômicos nas três
espécies de morcegos hematófagos. Apenas entre as sondas CBRX e Y2 houve
sobreposição das marcações, uma vez que boa parte do braço longo de CBRX é
composto pelo cromossomo Y2. Como resultado, CBRX apresentou-se marcada nas
mesmas regiões que CBRY2, com marcação adicional obtida pelo segmento
correspondente ao X original.
Um total de 27 segmentos homeólogos resultou da hibridização de D. ecaudata
com sondas de C. brevicauda (Fig. 2a,b). A marcação por apenas uma sonda ocorreu
nos pares cromossômicos DEC2 (CBR1), DEC9 (CBR5), DEC10 (CBR7), DEC11
(CBR3), DEC14 (CBR9), DEC15 (CBR6) e DECX (CBR X). Os demais cromossomos,
exceto DEC3 (CBR1, 2 e Y2), foram hibridizados por duas sondas simultaneamente:
DEC1 (CBR2 e Y2), DEC4 (CBR1 e 3), DEC5 (CBR Y2 e 1), DEC6 (CBR1 e 3), DEC7
(CBR4 e 6), DEC8 (CBR4 e 2), DEC12 (CBR2 e 1) e DEC13 (CBR6 e 8).
Os cromossomos de C. brevicauda corresponderam a 27 segmentos homeólogos
no genoma de D. youngi (Fig. 2a,c). Os cromossomos hibridizados exclusivamente por
uma sonda cromossomo-específica foram: DYO3 (CBR1), DYO8 (CBR4), DYO10
(CBR3), DYO11 (CBR5), DYO13 (CBR7), DYO15 (CBR6) e DYOX (CBRX). Duas
sondas foram simultaneamente hibridizadas em um único cromossomo de D. youngi nos
pares DYO1 (CBR2 e Y2), DYO4 (CBR1 e 3), DYO5 (CBR1 e Y2), DYO6 (CBR1 e 3),
DYO7 (CBR4 e 2), DYO9 (CBR2 e 1), DYO12 (CBR9 e 6) e DYO14 (CBR8 e 6). O
único par cromossômico marcado por três sondas simultaneamente foi DYO2 (CBR1, 2
e Y2).
Em D. ecaudata e D. youngi O número de cromossomos ou segmentos
cromossômicos marcados por sonda variou de um a seis. As sondas CBR5, 7, 8, e 9
marcaram apenas um cromossomo, cada, CBR4 apresentou-se hibridizada em dois,
CBR3, 6 e Y2 em três, CBR2 e X em quatro e CBR1 em seis cromossomos distintos de
D. ecaudata.
As sondas cromossômicas de C. brevicauda hibridizadas no cariótipo de D.
rotundus identificaram 28 segmentos conservados entre essas espécies (Fig. 2a,d).
Quatro cromossomos de D. rotundus apresentaram-se inteiramente marcados com uma
única sonda cromossômica de C. brevicauda: DRO2 (CBR1), DRO12 (CBR5), DRO13
(CBR7) e DROX (CBRX). A marcação simultânea por duas sondas ocorreu nos pares
DRO1 (CBR2 e CBRY2), DRO4 (CBR1 e CBR3), DRO5 (CBR1 e CBR Y2), DRO7
(CBR4 e CBR6), DRO8 (CBR4 e CBR2), DRO9 (CBR1 e CBR3), DRO10 (CBR1 e
CBR6) e DRO11 (CBR8 e CBR9). A marcação por três sondas distintas ocorreu nos
pares DRO3 (CBR1, CBR2 e CBR Y2) e DRO6 (CBR2, CBR3 e CBR6).
As sondas CBR 5, 7, 8 e 9 marcaram apenas um par cromossômico; CBR4
hibridizou em dois pares; CBR3, 6 e Y2 apresentaram sinais de hibridização em três
pares, CBR2 e X em quatro e CBR1 hibridizou em seis pares cromossômicos no
cariótipo de D. rotundus. Não foi possível a identificação de marcação por nenhuma
sonda em pequenos segmentos dos cromossomos 6 e 10 de D. rotundus (Fig. 2b).
As figuras 3 e 4 mostram os resultados de algumas hibridizações com sondas de
P. hastatus e C. brevicauda respectivamente, nas três espécies de hematófagos,
exemplificando a variação no número de segmentos marcados por sonda. A tabela 2
mostra resumidamente as correspondências cromossômicas entre as cinco espécies.
DISCUSSÃO
A comparação dos dados cariotípicos gerais das espécies estudadas com os
previamente publicados mostra que não existem polimorfismos quanto ao número
diplóide e morfologia cromossômica, bem como com relação ao número e localização
das RONs entre indivíduos coletados em diferentes regiões (Cadena e Baker 1976,
Morielle e Varella-Garcia 1988, Varella-Garcia et al. 1989, Baker et al. 1992, Santos et
al. 2001). Dessa forma, este estudo com Zoo-FISH constituirá uma referência para o
entendimento da evolução cariotípica da família Phyllostomidae, independente do local
de amostragem dos membros da subfamília Desmodontinae.
A análise comparativa usando dados de pintura cromossômica entre os morcegos
hematófagos mostra um grande número de segmentos cromossômicos compartilhados
entre Diphylla ecaudata, Diaemus youngi e Desmodus rotundus. Homeologias de
cromossomos inteiros foram observadas entre nove autossomos e o X das três espécies.
Adicionalmente, dois pares cromossômicos são inteiramente compartilhados entre D.
ecaudata e D. youngi (DEC12= DYO9 e DEC11= DYO10) e um par entre D. rotundus
e D. ecaudata (DRO7=DEC7).
Baker et al. (1988) sugeriram que apesar de apresentarem o mesmo número
diplóide, D. ecaudata e D. youngi não apresentariam cariótipos idênticos devido a
diferenças marcantes na morfologia de alguns cromossomos. Os dados de Zoo-FISH
corroboram esta hipótese ao evidenciar quatro pares cromossômicos distintos entre as
duas espécies (DEC7, 13, 14 e 15 e DYO8, 12, 14 e 15). Entretanto, apesar das
diferenças, percebe-se que rearranjos intensos não devem ter ocorrido no processo de
diferenciação desses cromossomos, persistindo a macrossintenia em todos os segmentos
envolvidos.
Por outro lado, ao longo da evolução cromossômica de D. rotundus parece ter
ocorrido um número maior de rearranjos na diferenciação de seu cariótipo em relação às
demais espécies de Desmodontinae, possibilitando a redução no número diplóide, bem
como a marcante diferença no padrão de bandas de alguns autossomos, por exemplo,
DRO6.
A partir da análise das hibridizações foi observado que os principais segmentos
cromossômicos responsáveis pelas diferenças entre os cariótipos dessas três espécies
representam os correspondentes a PHA12, 13, 14 e 15. Para D. rotundus estão
envolvidos, adicionalmente, os segmentos correspondentes a PHA9 e 11.
Com base nas duas hipóteses filogenéticas propostas para a subfamília, tentou-se
estabelecer as prováveis seqüências de eventos que atuaram na diferenciação cariotípica
do grupo. Quando consideradas as árvores geradas a partir de dados moleculares e
morfológicos (Honeycutt et al. 1981, Wetterer et al. 2000, Baker et al. 2000, 2003), D.
ecaudata aparece como basal em relação às outras duas espécies. Considerando seu
cariótipo como mais próximo ao cariótipo ancestral para a subfamília, seriam
necessários pelo menos dois eventos para a formação do cariótipo de D. youngi: uma
translocação recíproca envolvendo DEC13 e 15 para a formação de DYO14 e 15 e uma
translocação não recíproca, caracterizada por uma fissão de parte do braço longo de
DEC7, correspondente a PHA12, seguido de fusão deste segmento ao DEC14, na
formação de DYO12 e DYO8.
Uma vez considerada a árvore filogenética gerada a partir de dados
citogenéticos, o cariótipo de D. youngi seria o mais primitivo em relação ao das duas
outras espécies (Baker et al. 1988). Dessa forma, a origem do cariótipo de D. ecaudata
aconteceria de forma reversa ao apresentado anteriormente, com uma translocação
envolvendo DYO14 e 15 para a formação de DEC13 e 15, seguida pela fissão de
DYO12 e fusão do segmento resultante à DYO8 para a formação de DEC7.
Não foi possível estabelecer uma seqüência direta de eventos envolvidos na
origem do cariótipo de D. rotundus a partir daquele apresentado por D. ecaudata ou D.
youngi. Esta dificuldade pode ser justificada pela complexidade dos rearranjos ocorridos
na formação dos cariótipos intermediários, fixados anteriormente ao cariótipo atual da
espécie. Entretanto, foi possível presumir que rearranjos do tipo translocação recíproca,
inversão, fissão e fusão devem ter desempenhado um papel essencial na reorganização
dos segmentos no cariótipo de D. rotundus. Esta espécie foi a única que apresentou
segmentos não marcados pelas sondas de P. hastatus e C. brevicauda, o que pode ser
justificado pela presença de blocos de DNA repetitivo exclusivo da espécie nos
cromossomos 6 e 10 (Li et al. 2004, Mao et al. 2008).
Os resultados obtidos permitiram observar a correspondência entre a marcação
de cada uma das sondas utilizadas de P. hastatus e C. brevicauda nos cariótipos dos
membros de Desmodontinae, estando de acordo com os resultados da hibridização
recíproca entre essas espécies, realizada por Pieczarka et al. (2005). O uso de sondas
cromossômicas de ambas as espécies na comparação dos cariótipos dos morcegos
hematófagos foi de extrema importância na distinção de braços cromossômicos
homeólogos, como é o caso da marcação correspondente a PHA9 e CBR1 e 2 em D.
rotundus.
A comparação entre os cariótipos dos Desmodontinae com C. brevicauda
(Carolliinae) e P. hastatus (Phyllostominae) revelou a existência de um par
cromossômico (CBR7 = PHA10 = DRO13 = DEC10 = DYO13) que permaneceu
inalterado durante a divergência dessas espécies. Por estar presente em espécies
evolutivamente distantes, este cromossomo provavelmente faz parte do cariótipo
ancestral da família Phyllostomidae. Segundo Pieczarka et al. (2005), em adição a este
par conservado, CBR9 (PHA14) também estaria presente no cariótipo ancestral de
Phyllostomidae. Este cromossomo aparece inteiramente conservado em D. ecaudata e
como braços cromossômicos conservados em D. youngi e D. rotundus, o que estaria de
acordo com a hipótese de sua presença no ancestral, principalmente se o cariótipo de
Diphylla for considerado como basal para a subfamília.
Quatro pares cromossômicos apresentaram-se inteiramente conservados
exclusivamente entre P. hastatus e os morcegos hematófagos (PHA3, 6, 7 e 8), o que
sugere que os mesmos estariam presentes no ancestral comum das subfamílias
Phyllostominae e Desmodontinae. A única diferença observada em relação a esses pares
é a morfologia submetacêntrica de PHA7 em P. hastatus, que difere da condição
metacêntrica observada para os cromossomos correspondentes nos hematófagos, o que
sugere a ocorrência de uma inversão pericêntrica. Este maior número de cromossomos
compartilhados, se comparado ao número de cromossomos conservados exclusivamente
entre C. brevicauda e os hematófagos, podem indicar uma maior relação de
proximidade de Phyllostomus a Desmodontinae, o que apoia a hipótese de Cadena e
Baker (1976) na qual os morcegos hematófagos seriam mais próximos
citogeneticamente aos Phyllostominae e Glossophaginae do que a Carolliinae e
Stenodermatinae.
Por outro lado, três pares cromossômicos (DRO1, 3 e 4) apresentam a mesma
macrossintenia entre as três espécies de hematófagos, de forma que podem constituir
sinapomorfias, apoiando a reunião da subfamília como um grupo monofilético.
Entretanto, se faz necessária a realização da técnica de Zoo-FISH, com as sondas
empregadas neste estudo, em representantes das outras subfamílias de Phyllostomidae
para que se confirme a exclusividade desses cromossomos em Desmodontinae.
Finalmente, o presente estudo revelou dados importantes em relação à
localização das RONs nas cinco espécies. Em P. hastatus, D. ecaudata e D. youngi, o
DNA ribossomal manteve sua localização em um mesmo segmento cromossômico,
correspondente a PHA15. A correspondência dos sítios das RONs a este segmento
específico não foi observada em D. rotundus e C. brevicauda, que apresentaram esse
marcador ligado a segmentos correspondentes a PHA12 e X, respectivamente.
A variação de localização das RONs nas três primeiras espécies está claramente
relacionada à ocorrência de rearranjos estruturais (translocações e inversões) no
cromossomo original portador da RON. Em D. rotundus, rearranjos estruturais também
parecem ter contribuído para a mudança no posicionamento das seqüências de DNAr.
Neste caso, uma inversão envolvendo um segmento delimitado pela RON e por parte do
centrômero do cromossomo 10 justificaria o posicionamento paracentromérico da RON
em justaposição ao segmento correspondente a PHA12. Por outro lado, a diferença na
localização das RONs em C. brevicauda parece estar relacionada a eventos de
transposição dessas seqüências por elementos genéticos móveis proximamente ligados
aos cístrons de DNAr ou por recombinação envolvendo seqüências repetitivas comuns a
cromossomos não-homólogos.
Eventos relacionados à mobilidade do DNAr têm sido discutidos para algumas
espécies de plantas. Schubert e Wobus (1985) propuseram que as RONs de alguns
cromossomos de Allium são capazes de se mover, pelo menos entre alguns sítios
cromossômicos preferenciais. Esta mobilidade se daria tanto por meio de elementos de
transposição, como pela presença de hotspots de recombinação em blocos
heterocromáticos ao quais que encontrariam seqüências homólogas próximas ou
internamente às RONs. Para o gênero Aegilops foi proposto o papel do transposon
Em/Spm para o deslocamento de seqüências de DNAr 5S e 45S entre cromossomos não
homólogos, bem como para a expansão no numero de copias desta seqüência (Raskina
et al. 2004).
Uma hipótese alternativa para a variabilidade das RONs seria a replicação de
seqüências de DNAr diminutas, não detectáveis pela FISH, com concomitante deleção
dos cístrons dessa seqüência no cromossomo original portador da RON (Schubert e
Wobus 1985, Chung et al. 2008). Estas explicações parecem se adequar à situação de C.
brevicauda, estando de acordo com a proposta de Baker et al. (1992) na qual morcegos
apresentam mecanismos ativos de movimentação de DNA repetitivo entre cromossomos
não-homólogos.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico-CNPq e à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco-FACEPE pelo auxílio financeiro.
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Tabela 1. Espécies analisadas
Nome científico e abreviação
Localidade georeferenciada Número e sexo* Total de indivíduos
Desmodus rotundus, DRO Toritama, 8°00’24’’ S e 36°03’24’’O
5M, 1F
09 Tapacurá 8°04’00’’S e
35°12’00’’ O
2M, 1F
Diphylla ecaudata, DEC Toritama, 8°00’24’’ S e 36°03’24’’O
4M, 1F 05
Diaemus youngi, DYO Ipojuca, 08°24’00’’S e 35°03’45’’O
1M, 2F 03
* M = macho; F = fêmea
Tabela 2. Correspondências cromossômicas entre Phyllostomus hastatus (PHA), Carollia brevicauda (CBR), Diphylla ecaudata (DEC), Diaemus youngi (DYO) e Desmodus rotundus (DRO) obtidas através da pintura cromossômica comparativa com sondas das duas primeiras espécies.
PHA CBR DEC DYO DRO 1 3/4 4/7 4/8 4/7 2 2/X/Y2 1/3 1/2 1/3 3 1 2 3 2 4 2/5 1/9 1/11 1/12 5 1/X/Y2 3/4 2/4 3/4 6 1 5 5 5 7 1/3 6 6 9 8 2/4 8 7 8 9 1/2 12 9 6/10 10 7 10 13 13 11 3 11 10 6 12 6 7/15 12/14 6/7/10 13 5/8 13 14 11 14 9 14 12 11 15 6 13/15 15 10 X X X X X
5. CONCLUSÕES
1. A partir da pintura cromossômica com sondas de Phyllostomus hastatus e Carollia
brevicauda foi possível a detecção com maior precisão das homeologias
cromossômicas compartilhadas entre estas e as três espécies da subfamília
Desmodontinae.
2. As espécies de Desmodontinae apresentam cariótipos mais similares entre si do que
às duas outras espécies utilizadas neste estudo, confirmando sua proximidade
filogenética.
3. O cariótipo de Desmodus rotundus apresenta mais rearranjos do que as demais
espécies de morcegos hematófagos, incluindo fusões que justificam a redução em
seu número diplóide.
4. Apesar das espécies pertencerem a subfamílias distintas, foi possível o
reconhecimento de cromossomos conservados, os quais possivelmente estão
presentes no cariótipo ancestral da família Phyllostomidae.
5. Desmodontinae apresenta-se mais proximamente relacionada a Phyllostominae do
que a Carolliinae.
6. A variação na localização das RONs nas espécies estudadas parece acompanhar os
rearranjos cromossômicos em algumas espécies, contudo podendo ser resultado de
mecanismos de movimentação de seqüências repetitivas entre cromossomos não-
homólogos.
7. Os resultados obtidos no presente estudo mostram que as sondas geradas a partir de
P. hastatus e C. brevicauda são ferramentas úteis no estudo da evolução cariotípica
dos morcegos da família Phyllostomidae.
6. ABSTRACT
The bat family Phyllostomidae is the most diverse of all mammalian groups. Its
wide range of morphological variation has led to several disagreements among
researchers regarding its systematic and evolutionary relationships. This family is
cytogenetically characterized by highly conserved karyotypes among closely related
species, however by great intergeneric variability, which leads to difficulties in
comparative analysis using classical banding methods. Great effort has been made
concerning Phyllostomidae Karyotypic evolution elucidation through comparisons of
G-banding patterns between species. However, in some circumstances these data might
not provide the true evolutionary history of chromosome segments due to similarity of
non-homologous bands. Recent studies have overcome this situation by applying
chromosome painting to reveal syntenic segments between species. Thus, in this study,
comparative chromosome painting was used to identify chromosomal homologies
between five species, belonging to three subfamilies of Phyllostomidae. Emphasis is
given on the probable events that led the differentiation of Desmodus rotundus,
Diphylla ecaudata e Diaemus youngi (Desmodontinae) by the use of probes from
Phyllostomus hastatus (Phyllostominae) and Carollia brevicauda (Carolliinae) on their
karyotypes. Painting probes of P. hastatus have detected 23, 22 and 21 conserved
segments on D. rotundus, D. ecaudata and D. youngi karyotypes, respectively, while C.
brevicauda paints respectively detected 28, 27 and 27. The obtained data show
chromosomal conservation among Desmodontinae members, with D. rotundus
presenting the most rearranged karyotype. Based on the evolutionary relationships
proposed by morphological, molecular and cytogenetic data, we present the probable
sequence of events that has occurred during chromosomal evolution of hematophagous
bats. Additionally, karyotypic comparison between the five species allowed inferring a
closer affinity of Desmodontinae to Phyllostominae than to Carolliinae.
Key words: Chromosomal homeologies, chromosome painting, Desmodus, Diaemus,
Diphylla.
7. ANEXOS
7.1 Anexo1
Instruções para Autores
Revista
Chromosome Research
ISSN: 1573-6849
Springer, Netherlands
Manuscript Submission There are no page charges or charges for the publication of colour illustrations or administration charges for papers published in Chromosome Research. Manuscripts may be sent by e-mail to any of the Associate Editors or to the Editor-in-Chief (Please see addresses below). When submitting an article to one of the Associate Editors a copy of the covering letter, the title page and the abstract must be sent at the same time to the Editor-in-Chief, Professor Herbert Macgregor ([email protected]) The decision with regard to acceptance for publication is made by the Associate Editor/Editor to whom the manuscript is sent. North American authors are encouraged, but under no obligation, to send their manuscripts to one of our Associate Editors in that region. This often helps to speed up editorial processing and can lead to better communication and a faster decision on acceptance for publication. For the same reasons, Japanese authors are encouraged to submit their papers through our Associate Editor in Japan. It is understood that papers submitted for publication have not been published previously and are not simultaneously offered to any other journal. Before submission, the submitting author must ensure that the manuscript has been seen and approved by all other named authors. Editor−in−Chief: Professor Herbert Macgregor School of Biosciences Geoffrey Pope Building University of Exeter Stocker Road Exeter EX4 4QD England, UK Tel.+fax: (+44) (0)1392 879701 Email: [email protected] Associate Editors: Wendy Bickmore MRC Human Genetics Unit Western General Hospital NHS Trust Edinburgh EH4 2XU Scotland, UK Tel: (+44) (0) 131 332 2471 Fax: (+44) (0) 131 343 2620 Email: [email protected] Website: http://www.hgu.mrc.ac.uk/Users/Wendy.Bickmore/ Mary E. Delany 2131D Meyer Hall Department of Animal Science University of California Davis, CA 95616 USA Tel: +1-530-754-9343 office Tel: +1- 530-754-9404 lab Fax: +1-530-752-0175 E-mail:[email protected] http://animalscience.ucdavis.edu/AvianResources/ http://animalscience.ucdavis.edu/faculty/Delany J.S. (Pat) Heslop−Harrison Department of Biology University of Leicester Leicester LE1 7RH UK Tel: (+44) 116 2523381 Fax: + 44 116 2522791 Email: [email protected] Email: [email protected] Website: http://www.le.ac.uk/biology/staff/blphh4.htm Dr Jiming Jiang Department of Horticulture University of Wisconsin-Madison
Madison, WI 53706 USA Fax: (+1) 608 262 4743 Email:[email protected] Professor Dr. Hans J. Lipps Institut für Zellbiologie Universität Witten/Herdecke Stockumer Str. 10 58448 Witten Germany Tel.: (49) 2302 669144 Fax.: (49) 2302 669220 Email: lipps@uni−wh.de Adrian Summer 7 Smileyknowes Court North Berwick East Lothian EH39 4RG Scotland Tel/Fax: (+44) (0) 1620 894 640 Email: [email protected] Nobuo Takagi Hokusei Gakuen University Atsubetsu−ku Sapporo, 004−8631 Japan Email: [email protected] Fengtang Yang The Wellcome Trust Sanger Institute Wellcome Trust Genome Campus Hinxton, Cambridge CB10 1SA UK Tel: (+44) (0)1223 494842 Fax: (+44) (0)1223 494919 Email: [email protected] How to Submit your Manuscript There are no page or administration charges for papers published in Chromosome Research. Manuscripts should be submitted by e-mail as PDF files with the illustrations integrated into the text or as Word files for the text and compressed JPEG files for the illustrations. Do not send very large files as email attachments by e-mail as they may not be accepted by the editors' and reviewers' Web servers or they may take a very long time to download. Receipt of your manuscript by the receiving editor will be acknowledged immediately. Style and Presentation The manuscript should be typed with double spacing throughout, allowing for ample margins. The first page should show the paper title, names and addresses of all authors, a short running title, and fax and telephone numbers and the e−mail address for the corresponding author. The second page should present a summary of less than 200 words, along with 3−5 key words, and should be followed by the text of the paper, arranged in the following sequence: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References. Informative legends should be provided for all illustrations and should be grouped together at the end of the paper, along with all tables. Subheadings may be inserted in the main text, but should not be numbered or lettered. Manuscripts should be written in clear, grammatical, idiomatic English. Spelling
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7.2 Anexo2
Fotografias das espécies analisadas
Fig. 1: Fotografias de espécimes de Desmodus rotundus (a), Diphylla ecaudata (b) e
Diaemus youngi (c).