programa de pós-graduação em genética/ufmg estudos de domínios reguladores de transcrição de...
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Programa de Pós-Graduação em Genética/UFMG
Estudos de domínios reguladores de transcrição de proteínas Tead com novas tecnologias genéticas
Erica Maria de Queiroz
Orientador: José Miguel Ortega
Laboratório de Biodados, Biologia Celular e Desenvolvimento
Introdução
As proteínas Tead
domínio TEA (90% conservado)
estrutura 3D
homologia: camundongos (Tead1, 2, 3, 4)
galináceos (TEF-1A, B, C e D)
Drosophila (SD)
Aspergilus nidulans (Aba A)
leveduras (TEC-1)
Introdução
4 parálogos (camundongos):
expressão
estágios embrionários: pré-implantação/ final
adulto
Proteínas mTead: Função no desenvolvimento:
mTead1 (, e ) coração/ músculomTead2 neurônios/ rinsmTead3 placenta/ músculo/ coração / pulmões/ rins/ intestinomTead4 (4a e 4b) pulmões/músculo esquelético
Introdução
especificidade de ativação e repressão de diferentes genes
interações com outras proteínas
Proteínas: Função:Referências:
YAP65 co-ativador transcricional DePamphilis et al., 2001
Max fosfoproteína nuclear Gupta et al., 1997
TBP proteína de ligação a TATA box Jiang et al., 1996
TONDU/hVgl-1, hVgl-2 e hVgl-3 co-ativadores transcricionais Vaudin et al., 1999
MEF2 fator de transcrição de soro Stewart et al., 2002
SRF fator de transcrição de miócito Gupta et al., 2001
PARP modificador de histonas Ordahl et al., 1999
P160 (SRC1,TIF2 e RAC3) co-ativadores nucleares Parker et al., 2000
Introdução
A proteína mTead1 99% de homologia a Tead1 humana
domínios caracterizados
PROMOTOR PROMOTOR
52
NAD
- - -
TEA
+++
PR STY ZF
134 236 342 426
PROMOTOR Rodrigues, 2001
Objetivo Geral
Desenvolver e aplicar tecnologias genéticas para o estudo de domínios reguladores da
transcrição gênica utilizando proteínas Tead como modelo
Objetivos Específicos
Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead
Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA
Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido
Triagem de uma biblioteca de cDNA de embrião de camundongo de 7 dias utilizando PR e ZF como “isca”
Aplicar nova tecnologia de análise de alteração da proliferação celular para verificar a atuação de mTead4 na regulação do ciclo celular
Objetivos Específicos
Verificar a existência de homologia funcional entre os domínios das proteínas mTead
Isolar mutantes de mTead1: N-terminal N-terminal + TEA
Desenvolver metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio líquido
Metodologia de seleção com o Sistema de Duplo-Híbrido em meio
líquido
Sistema de Duplo-Híbrido
mRNA
Gene Repórter HIS3UASGal
Proteína 1
DL
Proteína 2
DA
Interações detectadas com o sistema de Duplo-Híbrido
Proteínas: Referências:
SNF1 / SNF4 Fields et al., 1989
Proteínas cinases de SNF1 Yang et al., 1992
SRF / SAP1 Dalton et al., 1992
RAP1 / RIF 1 Hardy, 1992
C-jun / c-fos Katoet al., 1992
Maize B / maize C1 Goff et al., 1992
HIV gag / ciclofilina A e B Luban et al., 1993
Max / Mxi 1 Zervos et al., 1993
Rb / proteína fosfatase tipo 1 Durfee et al., 1993
Ras / Raf van Aelst et al., 1993
p53 / antígeno-T Li & Fields, 1993
Grb2 / Sos1 Chardin et al., 1993
várias proteínas hélice-alça-hélice Standinger et al., 1993
DBF4 / CDC7 Jackson, 1993
Seleção em Meio Líquido
Modelo Deepwell
Modelo Erlenmayer
A Proposta
Transformação em Leveduras
Seleção
0,5.107células/mlInóculo
108células/mlTransformação
com LiActrp leu
Seleção em meio líquido
não transformantes
transformantes
duplo-híbrido positivo -trp –leu -his 3AT -trp -leu
n X
104 transformantes<1 “duplo-híbrido”
Seleção em meio sólido
Seleção em Meio Líquido: Elaborando o Protocolo
Metodologia
Elaborando o protocolo
p53
GBD
Gal4DL-p53 (1 g)
GAD
+ Gal4DA (1 g)
•
• Adição de Gal4DA-largeT– 0 ng – 0,1 ng – 1 ng – 10 ng– 100 ng
largeT
GAD
•
• Adição de Gal4DA-largeT– 0 ng – 0,1 ng – 1 ng – 10 ng– 100 ng
Metodologia
Os 4 experimentos
-trp –leu
-trp –leu -his
-trp –leu –his
0,1mM 3AT
-trp –leu –his
0,5mM 3AT
Tra
nsf
orm
ação
1:10 1:100 OD (1+1+1)
1:10 1:100 OD(2+1+1)
(3+1+1)1:10 1:100 OD
(2+1+2)1:10 1:100 OD
dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5
Resultados Preliminares
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Tu
rbid
ez
[OD
60
0 n
m]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,3 Transformantes em placas
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Tu
rbid
ez
[OD
60
0 n
m]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Tu
rbid
ez
[OD
60
0 n
m]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3 Transformantes em placas
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Turb
idez
[OD
600
nm
]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3
0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Turb
idez
[OD
600
nm
]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Turb
idez
[OD
600
nm
]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,30 0,5 0,8 44,5 119,3
Resultados Preliminares
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Turb
ide
z [O
D 6
00
nm
]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,3
transformantes em placa
Resultados Preliminares
0 0,5 0,8 44,5 119,3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Turb
ide
z [O
D 6
00
nm
]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
transformantes em placa
Resultados Preliminares
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Turb
ide
z [O
D 6
00
nm
]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,3
transformantes em placa
Resultados Preliminares
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 0,1 1 10 100
pTD1 (Gal4DL-largeT) [ng]
Turb
ide
z [O
D 6
00
nm
]
+h
-h
-h 0.1mM 3AT
-h 0.5mM 3AT
-h, -h 0.1mM 3AT
-h, -h 0.5mM 3AT
0 0,5 0,8 44,5 119,3
transformantes em placa
Sumarizando
O protocolo
OD
=600 nm
5° dia
Diluição 1:100
4° dia
ON 30°C
Diluição 1:10
3° dia
ON 30°C
Transformação
1° dia
Seleção em Meio Líquido: Modificando o Protocolo
Metodologia
Modelo Deepwell
10,9 ml –trp –leu -his
1 ng 0 ng 5 ng 10 ng
Transformações
Gal4DL-p53 Gal4DA
100 ng Gal4DA-largeT
Gal4DL-p53Gal4DA
4,36l 21,8l 43,8l
Gal4DL-p53 Gal4DA
100 ng Gal4DA-largeT436l
Gal4DL-p53Gal4DA
Metodologia
Modelo Deepwell
Modelo Deepwell
Gal4DA-largeT
Gal4DL-p53 (1 g) + Gal4DA (1 g)
0 ng
1 ng
5 ng
10 ng
controle
4 p
laca
s gr
ande
s =
1 d
eepw
ell
0%
20%
40%
0 2,5 5 7,5 10
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 1 5 10
0%
10%
20%
30%
0 1 5
[pTD1] (ng)
Resultados Preliminares
Modelo Deepwell
% poços com crescimento
% 22 setores em placas
pGBT9, pVA3, pVA3* + pTD1- p53 p53mut
PerspectivasModelo Erlenmayer
transformação, diluições com seleção em 3-aminotriazol
1 pVA3 : 3 pVA3* enriquecimento pVA3
Perspectivas
p53p53mut
amplicon
Construção GBD-p53 GBD-p53mut GBD
Proteína p53 p53mut -Interação forte fraca não
Isolamento de mutantes do domínio N-terminal de mTead1
Sistema de Mono-Híbrido Reverso
mRNA
CAN1 / LacZUASGal
ProteínaGBD
MORTE / AZUL
100%
0,2%
[L-can]
domínio ativador? GBD??
plasmídio
compete?Não = GBD
Sim = domínio ativador
Sob
revi
vênc
ia
Starling, 2000
Sistema L-can Domínio ativadorGBD
Ensaio de Competição contra Gal4p inteira
Gal4p mais expressa = cor azulpCL1 (Gal4p)
+Competidor
(contém GBD)
Co-transformação(repórter LacZ) GBD competidor mais expresso =
Leveduras brancas(domínio ativador mutado, GBD não)
Gene Repórter LacZUASGal
ProteínaGBD
GADGBD
XGal4p
0% 20% 40% 60% 80%
62%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
80%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
29%
Relação entre plasmídio competidor X pCL1 (Gal4p) e porcentagem de colônias azuis em ensaio com X-gal
Gonçalves, 2003
Metodologia
Sistema de Mono-Híbrido ReversoGene repórter = transportador de L-arginina/L-canavanina (tóxica)
A seleção
-w -uraTransformação
YJOZcanRON 30°C
colônia individual
N-terminal
mTead1/4GBD
105 células/ml
meio seletivo
L-canavanina
Obrigada!