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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

BIOTECNOLOGIA FLORESTAL – APLICAÇÕES E PERSPECTIVAS

Pós-graduanda: Juliana Erika de Carvalho TeixeiraOrientador: Prof. Dr. Luís Eduardo Aranha Camargo

SUMÁRIO

1. Introdução

2. Propagação in vitro

- Micropropagação

- Biorreatores e Propagação Fotoautotrófica in vitro

3. Marcadores Moleculares

- Aplicações Operacionais

- SAM

4. Transgenia

5. Genômica

INTRODUÇÃO

Importância do Setor Florestal

Fonte: www.sbs.org.br – FAO, 2007

OS DEZ PAÍSES COM MAIS PLANTAÇÕES FLORESTAIS

INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal

www.sbs.org.br

PLANTAÇÕES DE EUCALIPTO – PRINCIPAIS PAÍSES

MAIORES EXPORTADORES DE PRODUTOS FLORESTAIS (2000)

Fonte: www.sbs.org.br



SP:700 mil ha

MG:1,6 milhões ha

www.sbs.org.br


CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE FLORESTAL BRASILEIRA

DADOS SÓCIO-ECONÔMICOS 2006 – “eucaliptocultura apresenta uma significativa e crescente participação no desenvolvimento socio-econômico nacional”

• PIB Florestal = US$ 21 bilhões (4% do PIB Nacional)

– Celulose e papel: US$ 7,5 bilhões (BR 7° maior produtor e 11° fabricantes papel)

– Siderurgia a carvão vegetal: US$ 4,2 bilhões

– Madeira e móveis: US$ 9,3 bilhões

• Exportações = US$ 5,4 bilhões (10% do total)

• Impostos Recolhidos = US$ 2 bilhões

• Consumo de madeira (Nativas + Plantadas) = 300 milhões m3/ano

• Empregos Diretos + Indiretos = 2 milhões (total)


Nossa indústria de base florestal é muito competitiva !

• Florestas altamente eficientes, produtivas e competitivas, plantadas com base em um

adequado nível de sustentabilidade;

•Madeira de baixo custo;

• Qualidade e homogeneidade da madeira;

• Fábricas de tecnologia estado-da-arte e de classe mundial;

• Recursos humanos qualificados;

• Excelente gestão da qualidade de produto, meio ambiente e da responsabilidade social corporativa

(ISO 9000, ISO 14000, OHSAS 18000, SA, etc..)

• Sustentabilidade ambiental e certificação florestal do manejo e da cadeia de custódia;

• Intenso desenvolvimento científico e tecnológico através de muitas pesquisas;

• Contínuo crescimento do setor industrial, com novas adições de capacidade e modernizações das

fábricas existentes;

• Gestão eficaz, eficiente e competitiva;

• Competição a nível mundial nos mais exigentes mercados.

Fonte: Foelkel, 2007.


www.sbs.org.br

Plantio Clonal: um dos responsáveis pelo sucesso!

Apagão florestal:

BR - Déficit de madeira: 225 milhões de m3/ano

INTRODUÇÃO – Biotecnologia Florestal

Biotecnologia tecnologia que ajudará a superar este desafio!

... compreensão dos processos moleculares fundamentais nas árvores, enquanto organismos individuais, bem como sua domesticação e utilização comercial ...

Biotecnologia FlorestalGenética Molecular

Genética Populações

Genética Quantitativa

Propagação Clonal

Melhoramento

Silvicultura

INTRODUÇÃO – Biotecnologia Florestal

Biotecnologia Florestal:

� Propagação in vitro

� Marcadores Moleculares

� Transgenia

� Genômica

PROPAGAÇÃO IN VITRO

Primeiros trabalhos de micropropagação no BR – Déc. 50 e laboratórios: 1970 - 1980

Micropropagação e enxertia in vitro: maior interesse científico e econômico

Na área florestal: micropropagação é a técnica mais difundida e com aplicações comprovadas

Aplicações da Propagação in vitro na área florestal:

• conservação de germoplasma in vitro

• multiplicação de clones superiores – aceleração do programa de melhoramento

• limpeza clonal

• base para outras técnicas biotecnológicas – transformação genética

PROPAGAÇÃO IN VITRO - Aplicações

Fases Micropropagação:

• Seleção do explante e obtenção de culturas livres de contaminantes - Inoculação

• Multiplicação e Alongamento dos propágulos vegetativos

• Enraizamento (in vitro ou ex vitro)

• Aclimatização na condição ex vitro das plantas obtidas in vitro

PROPAGAÇÃO IN VITRO – AplicaçõesProliferação de Gemas Axilares

Seleção dos Explantes

Enraizamento e Aclimatização

Via Organogênese

Via Embriogenêse Somática Fonte: Xavier, et al., 2007 Fonte: Xavier, et al., 2007

Fonte: Xavier, et al., 2007

PROPAGAÇÃO IN VITRO - Aplicações

Eucalipto:

• Micropropagação por proliferação de gemas axilares

• Enraizamento ex vitro

• Produção de mudas para formação de mini-jardins clonais

Micropropagação Enraizamento Mini-jardim clonal

PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas

Micropropagação tradicional: meio semi-sólido, grande número de pequenos recipientes e muita mão-de-obra, várias câmaras de fluxo laminar, grandes

autoclaves e espaço de cultivo

Propagação em larga escala mediante propagação in vitro, em quantidade e qualidade

Inovações têm sido propostas:

• Uso de recipientes de cultivo alternativo

• Equipamentos para produção de mudas em larga escala – Biorreatores

• Automação das operações dos sistemas de cultura de tecidos

• Manipulação do ambiente in vitro com a propagação fotoautotrófica


BIORREATORES:

• Tecnologia mais proeminente na redução de custos de mão-de-obra,

permitindo multiplicação de plantas em larga escala

• Por usar meio líquido, permite maior produtividade e eficiência da

propagação

• Primeiro relato: 1981 em Begonia

• 2005: surgiram os primeiros biorreatores para micropropagação

comercial em espécies arbóreas


Fonte: Penchel, et al., 2007

Tipos de Biorreatores, classificados pelo tipo de agitação e pela construção do frasco


RITA

TRI

3R

Princípio de funcionamento:

- Compartimento superior: suporte e flutuação do material vegetal

- Compartimento inferior: estocagem de meio de cultura

- Conjunto de válvulas: controla a transferência do meio de cultura


Impacto da utilização de Biorreatores



Micropropagação em Condições Fotoautotróficas

Propagação in vitro convencional: heterotrófica

• Perda da competência fotossintética e desordens fisiológicas

• Etapa de aclimatização a condição ex vitro

O que pode melhorar a competência FS e permitir rustificação in vitro?

• Reduzir ou eliminar Sacarose

• Uso de luz alternativa, luz natural

• [ CO2]

• ↓ [ O2]


Micropropagação em Condições Fotoautotróficas

Uso de frascos maiores

Menor risco de contaminação

Automação!!

MARCADORES MOLECULARES

� Aplicações Operacionais

Análise de DNA para fins de identificação individual e estudos de parentesco

• MM vem sendo utilizados em florestas desde os anos 80 – primeiros mapas

• Tipos: RFLP

RAPD

AFLP

SSR

SNPs

TRAP

DArT

• herança co-dominante

• multi-alélicos

• análise simples e econômica

• transferíveis dentro e entre espécies

MARCADORES MOLECULARES - Aplicações

Grattapaglia, 2007

Evolução dos MM...


• Controle de Qualidade do Processo de Multiplicação: Certificação Genética

� Evitar mistura principalmente em jardim clonal

� Garantir que o clone selecionado pelo programa de melhoramento seja corretamente multiplicado e plantado

Principais aplicações:

1. Identificação e Discriminação de Clones-elite


Método Padrão para identificação de clones:

• SSR em sistemas multiplex com 6 a 12 locos

analisados em seqüenciador automático

Parcerias com universidades ou

empresas de genotipagem

• Gel de agarose 3% com locos polimórficos Dados Tese Juliana Teixeira


Exemplo:

Análise de identidade de 4 clones com 12 locos

Grattapaglia, 2007


2. Determinação da paternidade em cruzamentos controlados

• Identificação de contaminantes na progênie (auto-fecundação e filhos ilegítimos)

Por que certificar os descendentes de um cruzamento?

- Estimar corretamente os parâmetros genéticos que são ferramentas utilizadas pelos melhoristas na seleção de genótipos superiores !!

- Correta identificação de marcadores de DNA que possivelmente poderiam ser utilizados na construção de mapas genéticos e no Melhoramento Assistido por Marcadores !!


Mãe

Pai

Autofecundação

Filho ilegítimo

Dados Tese Juliana Teixeira

Filho 1

Filho 2

Filho 3

Filho 4

Filho 5

Filho 6


3. Proteção de Cultivares

Consenso: Material genético é um dos principais componentes do sucesso

empreendimento florestal – ativo essencial para a manutenção e o crescimento

da competitividade de uma indústria de base florestal

Conjunto de 36 marcadores morfológicos – estabilidade e pouca influência ambiental, em dois ciclos


MM: atendem com perfeição aos requerimentos do teste de DHE adotado na proteção intelectual de uma nova variedade

• Muitos clones elites selecionados dentro da mesma família: difícil separá-los usando os descritores morfológicos!!

BR: Lei de Proteção de cultivares n° 9.456, sancionada em 1997

2002 – publicação das instruções para os ensaios de DHE

MM: descritores complementares e facultativos

10 a 15 marcadores


4. Caracterização de Coleções de Germoplasmas e Populações de Melhoramento

• Direcionar rotas de coleta de sementes: maior variabilidade dentro de

famílias – sementes de uma única árvores por ponto de coleta representam

grande parte da variabilidade daquela população – coleta de sementes de uma

ou poucas árvores, porém de um grande número de locais diferentes

• Planejamento de pomar de sementes com genótipos mais divergentes

• Gerenciar variabilidade genética em populações de melhoramento

MARCADORES MOLECULARES - Perspectivas

� Perspectivas – SAM

• Nenhum MM publicado para ser usado na SAM – aplicação operacional da SAM

em árvores ainda é uma promessa!!

• Vários mapas publicados (RAPD, AFLP, SSR), com diversos QTLs mapeados

Resistência a ferrugem

MARCADORES MOLECULARES – Perspectivas

Florescimento precoce


Vários mapas para Qualidade da Madeira

Grattapaglia, et al., 1992

Novaes, 2006


Porque não temos MM para serem usados na SAM?

• Domesticação recente, pouco conhecimento sobre herança dos caracteres

• Impossibilidade ou grande dificuldade em obter linhagens

• Poucas características herança simples

• Poucos pesquisadores

• MM mapeados atualmente são dominantes e/ou aleatórios

Novas perspectivas...

• Mapeamento de genes candidatos

• Mapeamento de Associação

• QTLs de expressão (eQTLs)

MARCADORES MOLECULARES – Perspectivas Mapeamento de Associação

Grattapaglia, 2007

DESAFIOS• Desconhecimento da extensão do desequilíbrio de ligação (espécie e/ou população específica)• Whole genome scan ou genes candidatos??• Quantos e quais SNPs genotipar ? Como genotipar ?• Definição de quais genes candidatos devem ser analisados• Seleção de populações adequadas para análise


QTLs de expressão gênica - Identificação de genes por trás de QTLs usandoabordagem combinada mapeamento genético e expressão em microarranjos

Grattapaglia, 2007

Transgenia – Transgenese Florestal

• Transformação genética: ferramenta indispensável aos estudos de biologia

molecular e pesquisa em genômica funcional

• Além de avaliar a função de genes em plantas, tem permitido a geração de

cultivares com características superiores

Vantagem: redução do tempo necessário para introdução de novas

características de interesse em clones superiores

• Populus, eucalipto e coníferas – agrobactérias é mais eficiente

• Populus: planta modelo para estudos de genética molecular em sps florestais

• Principal obstáculo: regeneração de plantas transformadas

• FOCO: QUALIDADE DA MADEIRA

TRANSGENIA – Aplicações

Classes de genes transformados:

1. Redução ou alteração do ciclo reprodutivo

LFY de arabidopsis em Populus: Flores, frutos e sementes férteis em 7 meses – redução de 8 anos

2. Modificação da arquitetura vegetal

Genes reguladores da síntese de fitohormonios:

TRP (triptofano sintase): maior formação de brotos, número e comprimento

de raízes, número de folhas e área foliar

Ugt (UDP-glicose-transferase): duplicação da taxa de multiplicação de raízes

Ácido-giberélico-20-oxidase: crescimento vertical mais acelerado, folhas e

fibras mais largas e aumento da biomassa

TRANSGENIA – Aplicações 3. Manipulação dos teores de lignina e celulose

• COMT e CCoAOMT: fenótipos indesejáveis, baixa S:G• CAD: redução 45% lignina, aumento 15% celulose, crescimento mais rápido de caules

e raízes

4. Resistência a pragas e doenças

• Inibidores de proteases e proteinases, quitinases, bacteriosinas, bacteriopsinas, glutationa sintase e oxalato oxidase

5. Tolerância a herbicidas e estresses abióticos

• CP4/EPSPS, GOX: tolerância a glifosato• ahas: tolerância a imidazolinonas• bar: glifosato amônio• Glutamina sintase: R déficit hídrico• Fitocromo A: R frio• Glutationa sintase e glutationa redutase: R metais tóxicos e a ozônio

TRANSGENIA – Aplicações Eucalipto:

Literatura: vários trabalhos descrevendo geração de calos, tecidos ou órgãos

geneticamente transformados, porém sem comprovação de que plantas

completas foram regeneradas

Diferentes grupos de pesquisas do setor privado: protocolos bem estabelecidos de transformação e regeneração: SEGREDO INDUSTRIAL

Fonte: Brum, 2007


TRANSGENIA – Perspectivas

� Perspectivas

• Maioria dos trabalhos já realizados: aplicações industriais – aumento produção e qualidade da madeira

• Futuro próximo: agregar valores de relevância ambiental – recuperação de áreas ou ecossistemas degradadas

Criação da Castanheira americana resistente à requeima da castanheira e a outras doenças, para recuperação futura do ecossistema florestal dos Appalaches, destruído em razão desta doença

GENÔMICA – Aplicações

GENÔMICA

• Final do séc. XX: início da era genômica

• Genomas completo de várias espécies tem sido seqüenciados – plataformas e metodologias de sequenciamento em larga escala


Populus – árvore modelo:

• Tamanho relativamente pequeno do genoma (~ 485 Mb)Similar ao tamanho do genoma de arroz40 vezes menor que Pinus taeda

• Crescimento rápido podendo atingir maturidade reprodutiva em 4-6 anos e fenótipos de interesse em 1-3 anos

• Alta diversidade fenotípica e existência de híbridos inter-específicosFacilita o mapeamento genéticoGrande pool gênico

• Facilidade de propagação vegetativa e transformaçãogenética

Fundamental para o estudo da função gênica


Iniciado em 2002 pelo International Populus Genome Consortium e coordenado pelo Dr. Gerald Tuskan (ORNL)• Maior parte do seqüenciamento realizado no JGI (Joint Genome Institute)• Foram geradas 4,2 x 109 bases fornecendo uma cobertura de 7,5 vezes do genoma

Entretanto o genoma não pode ser totalmente finalizado...- Aproximadamente 410 Mb (~ 85%) bases puderam ser montadas em

2.447 regiões contíguas distribuídas pelos 19 grupos de ligação- Alto grau de heterozigose que geraram diversos segmentos

haplotípicos (variantes alélicas)- Grande incidência de segmentos duplicados e abundância de

transposons- Limitações na técnica de seqüenciamento e montagem


O que descobrimos...

• Apenas uma pequena porcentagem de genes em Populus não possui um homólogo em Arabidopsis (Sterky et al., 2004)

• A maioria das famílias gênicas em Arabidopsis possuem correspondentes emPopulus. Em termos proporcionais algumas famílias possuem mais elementos em Populus do que em Arabidopsis

1. Genes associados com resistência à doenças (família NB-ARC)2. Genes envolvidos no desenvolvimento meristemático3. Transportadores de metabólitos e nutrientes

• A análise do genoma de Populus revelou que diversos segmentos estão duplicadosAproximadamente 8,000 genes foram identificados como tendo duas cópias (genes parálogos)


Iniciativas genômicas em outras espécies florestais

Coníferas:

• Para gimnospermas em geral a principal dificuldade é o tamanho do genoma

15 Gb em média, ~ 5 vezes maior que o genoma humano!

• Muitos elementos repetitivos no genoma

• Com a tecnologia atual de seqüenciamento as perspectivas para a obtenção

do genoma completo de qualquer conífera são remotas

• Apesar disso as ESTs fornecem informações valiosas sobre a expressão

gênica e na busca por marcadores moleculares (SSR e SNP)

• Projetos Dendrome e Arborea – estudos genômicos auxiliando melhoramento


Eucalyptus

• Diferentemente das coníferas, o tamanho do genoma para o gênero Eucalyptus

varia de 370 a 700 Mb

• Possui diversas vantagens como o Populus: Crescimento rápido, várias

possibilidades de híbridos interespecíficos, grande variabilidade genética

• Principal desvantagem : Transformação genética não totalmente dominada, o

que impede a realização de estudos funcionais

• Diversos projetos de seqüenciamento de ESTs foram realizados para

Eucalyptus. A maioria com participação de empresas privadas - Não disponíveis

publicamente

Agrigenesis (Nova Zelândia) - 183.000 ESTs a partir de 20 bibliotecas de cDNA

de E. grandis. Somente 951 depositadas no Genbank


1. Geração de um plataforma de informações e recursos genômicos

2. Estabelecimento de uma rede de populações experimentais para pesquisa genômica

3. Mapeamento, identificação e determinação de função de genes envolvidos na formação da madeira e resistência a doenças

4. Estabelecimento das bases para iniciativas empresariais visando a incorporação de tecnologias genômicas nos programas de melhoramento

O Brasil tem uma posição de destaque no cenário mundial em relação à genômica de Eucalyptus. Existem duas iniciativas distintas:

• Forests: Focado na descoberta de genes. Geração de 123.889 ESTs de E. grandis

• Genolyptus: Principal objetivo é estudar as bases genéticas de características de interesse econômico em Eucalyptus.


Grattapaglia, 2007

Sequenciamento do genoma completo...


Era Pós-Genômica...

• transcrissômica, proteômica, metabolômica

• Foco: Qualidade da Madeira...

• Estudos comparando transcritos e proteínas de diferentes tecidos: folha, casca, xilema, etc..

Complementar dados de expressão com proteômica, metabolômica

Conclusões: Não há alta correlação qualitativa ou quantitativa entre os RNAme as proteínas extraídos de um mesmo tecido.

Presença de RNAm de um determinado gene não é indicativo de atividade da proteína equivalente na célula.


� Principais contribuições e perspectivas:

• Melhor compreensão da função dos genes, permitindo maior entendimento da relação entre um gene e um fenótipo bem como um entendimento mais global das relações complexas entre variação genética e variação fenotípica;

• Fornecimento de genes candidatos para estudos de associação, mapeamento e transgênicos;

• Novas plataformas de genotipagem e sequenciamento: sequenciar toda a população a ser mapeada!!

Conclusões

• Somente com a união de diferentes ferramentas de biotecnologia será possível obter informações sobre o controle dos complexos eventos moleculares...

• Genômica + melhoramento: compreensão das relações complexas entre variabilidade genética e diversidade fenotípica;

• Setor florestal investe em estudos relacionados a biotecnologia e aplica as principais tecnologias desenvolvidas;

Obrigada!

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