programa de pós-graduação em genética e … 20 anos após a descoberta da cultura de anteras...

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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

USO DE HAPLÓIDES NO MELHORAMENTO DE PLANTAS

Aluno: Pedro Radi BelicuasOrientador: Prof. Dr. Cláudio Lopes de Souza Júnior

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Fase diplóide Fase haplóide

MEIOSE

MITOSE

FERTILIZAÇÃO

Gametas 1n

Planta 2n

2n

O que é uma planta haplóide ?

+ Haplóide (esporófito)

duplicação dos cromossomos_________________________

Duplo haplóide

Ciclo de vida das plantas superiores:

Gametófito e Esporófito

Haplóides são plantas esporofíticas com o número gametofítico de cromossomos

1n

1n

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Um pouco da história dos haplóides

1922 – ocorrência natural em Datura stramonium. Seguido por Nicotiana tabacum (1924) e Triticum compactum(1926)

1964 / 66 – Primeiros protocolos para produção de plantas haplóides em laboratório – cultura de anteras.

70s – Conversão de haplóides estéreis (H) em duplo haplóides (DH).

* Lançamento do primeiro cultivar utilizando DH –Maris haplona de canola- Kasha e Kao – Produção de haplóide em cevada via

hibridação com bulbosum.1980 – Cultivar Mingo em cevada

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1974 – Primeiro simpósio internacional : Haplóides em plantas superiores, Guelph, Canadá.

“Eu acredito ser bastante provável que as pesquisas com haplóides possam contribuir para o desenvolvimento de cultivares em várias espécies no futuro. Contudo, o entusiasmo sobre os haplóides deve ser tratado com cuidado”

Sir Ralph Riley

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FORSTER et al. The resurgence of haploids in higher plants. Trends in Plant Science, Jul 2007.

Euphytica volume 158 numero 3 / dezembro de 2007“Gametic Cells and Molecular Breeding for Crop Improvement”

Células gaméticas e técnicas moleculares para o melhoramento de plantas

Haplóides têm sido reportado em mais de 200 espécies de plantas usando vários métodos, in vitro e in vivo.

O Ressurgimento dos haplóides em plantas superiores

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Métodos de Indução de Haploidia

Hibridação interespecífica com posterior eliminação cromossômica.

Haplóides gimnogenéticos

Cultura de anteras

Cultura de micrósporos

Linhagens indutoras

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Hibridação interespecífica e eliminação cromossômica

Processo melhor documentado em cereais

Mecanismo envolvido é pouco conhecido: Ocorre a dupla fertilização normal e nas subseqüentes divisões celulares ocorre a eliminação do parental masculino, formando o embrião haplóide.

Endosperma também sofre eliminação de cromossomos e degeneração

Resgate do embrião haplóide para cultura in vitro.

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Método bulbosum – Alta freqüência de cevada haplóideNa natureza, as sementes desse cruzamento se

desenvolvem por aprox. dez dias e depois abortam.

Foi rapidamente adotado

Vantagens: métodos envolvidos (emasculação, polinização e cultura de embriões) são de fácil execução

Não ocorre mortalidade por albinismo

Contudo, necessita sincronia do florescimento dos parentais e posterior duplicação cromossômica

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Técnica utilizada em: Trigo, triticale, centeio e aveia.

– Várias espécies são utilizadas na hibridação: H. bulbosum, teosinte, sorgo, milheto e milho.

Atualmente o Milho é mais eficiente para trigo.

Batata – S. tuberosum (2n=4x) x S. phureja(2n = 2x) – Núcleos espermáticos fundem-se com núcleo central do ovário formando um endosperma funcional que suporta o desenvolvimento do óvulo não fertilizado.

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Segregação imperfeitaMitose-dependente

Mitose-independenteHeterocromatização

e

Desintegração

Não parental, formação do “broto”de núcleo

Separação espacial

dos genomas parentais

Segregação imperfeitaMitose-dependente

Mitose-independenteHeterocromatização

e

Desintegração

Não parental, formação do “broto”de núcleo

Separação espacial

dos genomas parentais

Como ocorre a eliminação cromossômica?

Mitose-dependente:

Assincronismo do ciclo mitótico

Formação de micronúcleo

Mitose-independente

Trigo x Milheto Trigo x Milheto Cevada x H. bulbosum

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Células do gametófito (geralmente óvulo não fertilizado) são estimuladas para formação de um embrião – similar a partenogênese.

Cultura envolve dois processos : Um meio de indução contendo hormônios e um meio de regeneração com pouco ou sem hormônios.

Algumas espécies necessitam de pré-tratamento

Plantas regeneradas requerem duplicação cromossômica.

Limitações: Baixo número de óvulos por flor.

Utilizado em: Cebola e Beterraba

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Gimnogênese induzida por pólen irradiado

Utilizado em algumas espécies arbóreas

Técnica de baixa eficiência mas de importância em espécies que não respondem a outros métodos.

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Micrósporouninucleado

Polén maduroGametófitomasculino

Polén binucleado

maturação

estresse

embriogênese

Embrião, esporófitoMicrósporo embriogênico

Totipotência celular

Cultura de anteras e micrósporos

Princípio da androgênese

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Cultura de anteras

Mesmo sendo de grande aplicação, os processos envolvidos são pouco conhecidos.

Embora várias espécies respondam à técnica, genótipos responsivos ainda é um fator limitante.

Deve-se preferir a embriogênese direta, eliminando a fase de calo (organogênese) que pode promover variação gametaclonal entre os regenerantes

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O método é utilizado em várias espécies como cevada, triticale, arroz, canola, trigo, fumo e pimentão (capsicumannum)

Grande vantagem é a simplicidade.

Baixo rendimento por antera pode ser sobreposto por culturas em larga escala

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20 anos após a descoberta da cultura de anteras

Cultura Cultivar País Ano de Liberação

Reportado por

Aspargo Andreas França 1990 Corriols et al. (1990) Milho Huayu 1 China 1986 Wu (1986) Arroz Hua Yu I e II China 1976 Hu e Zeng (1984) Xin Xiu China 1976 Loo e Xu (1986) Late Keng 959 China 1978 Loo e Xu (1986) Tung Hua 1, 2, 3 China 1978 Loo e Xu (1986) Zhonghua 8 e 9 China 1981 Chen (1986) Hua Han Zao China 1982 Chen (1986) Huajian 7902 China 1983 Chen (1986) Nanhua 5 China 1983 Loo e Xu (1986) Noll China 1983 Loo e Xu (1986) Hua 03 China 1989 Yang e Fu (1989) Guan 18 China 1990 Zhu e Pan (1990) Tabaco Tan Yuh 1, 2, 3 China 1974 Hu e Zeng (1984) NC 744 EUA 1980 Chaplin et al. (1980) KDH 926, 959, 960 EUA 1989 Nielsen (1989) NCBMR 42 e 90 EUA 1990 Rufty et al. (1990) Trigo Jinghua 1 China 1986 Daofen (1986) Florin França 1987 de Buyser et al. (1987) Anther culture 28 China 1990 Zhao et al. (1990)

Cultivares ou germoplasmas de plantas cultivadas desenvolvidos pela aplicação da cultura de anteras

Veilleux 1994, HortScience 29:1238-1241

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Mais demorado e trabalhoso do que a cultura de anteras, contudo apresenta uma série de vantagens:

Culturas de alta densidade podem conter mais que 1000 embriões por mL.

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Os componentes do meio e os tratamentos da cultura têm acesso direto ao micrósporo pois esse não possui influência da parede da antera – efeito de posição.

Utilizado em fumo, canola, pimentão, trigo, cevada e arroz.

Vários genes foram caracterizados como envolvidos na reprogramação de micrósporos da fase gametofítica para esporofítica (Hosp et al. 2006).

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Uso de linhagens indutoras

Linhagens indutoras são utilizadas em milho.Dois sistemas estão envolvidos:

ig, que produz haplóides paternos (Kermicle, 1969)stock 6, que produz haplóides maternos (Coe, 1959)

Ambos utilizam o sistema R-nj de coloração por antocianina para identificação das sementes haplóides e possuem taxa de indução entre 1 a 3%.

Os processos não são bem entendidos.

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Marcador morfológico de coloração

Linhagem indutora igW23

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Megasporócit oMegasporócit o

MeioseMeiose

MegásporosMegásporos

MegásporoMegásporo

sobreviventesobrevivente

MitoseMitose

Núcleo PolarNúcleo Polar

OosferaOosfera

Gametóf ito FemininoGametóf ito Feminino

EndospermaEndosperma

SementeSemente

MaduraMadura

Fert ilizaçãoFert ilização

EmbriãoEmbrião

MicrosporócitoMicrosporócito

MeioseMeiose

MicrósporoMicrósporo

MitoseMitose

Núcleo Vegetat ivoNúcleo Vegetat ivo

Núcleo Reprodut ivoNúcleo Reprodutivo

Gametóf ito MasculinoGametóf ito Masculino

Grão de pólen GerminadoGrão de pólen Germinado

Esporóf ito MaduroEsporóf ito Maduro

Megasporócit oMegasporócit o

MeioseMeiose

MegásporosMegásporos

MegásporoMegásporo

sobreviventesobrevivente

MitoseMitose

Núcleo PolarNúcleo Polar

OosferaOosfera

Gametóf ito FemininoGametóf ito Feminino

EndospermaEndosperma

SementeSemente

MaduraMadura

Fert ilizaçãoFert ilização

EmbriãoEmbrião

MicrosporócitoMicrosporócito

MeioseMeiose

MicrósporoMicrósporo

MitoseMitose

Núcleo Vegetat ivoNúcleo Vegetat ivo

Núcleo Reprodut ivoNúcleo Reprodutivo

Gametóf ito MasculinoGametóf ito Masculino

Grão de pólen GerminadoGrão de pólen Germinado

Esporóf ito MaduroEsporóf ito Maduro


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Foram desenvolvidas várias linhagens indutoras provenientes das linhagens W23 e stock6:

ZMS e KMS foram derivadas da stock6 e o cruzamento delas deu origem a linhagem MHI que induz em média 6,5% de haplóides (Chalyk, 1999).

Do cruzamento entre W23 x stock6 foi gerada a linhagem indutora WS14 (Lashermes e Beckert, 1988) que foi cruzada com outra linhagem indutora KEMS (Shatskayaet al. 1994) e deu origem a RWS (Röber et al. 2005).

A RWS induz em média 8% de haplóides

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Fonte: Dr. Wolfgang Schipprack – University of Hohenheim, Stuttgart

Lígula presente

(Cruzamento)Sem Lígula

Planta haplóide

Lígula presente

(Cruzamento)Sem Lígula

Planta haplóide

Coloração de antocianina no colmoColoração de antocianina no colmo

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FALSO POSITIVO

Plantio da geração D0 – duplo haplóide

Geração D2


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Duplicação cromossômica

Colchicum autumnale

Colchicina

Alcalóide que interfere na organização das fibras do fuso, impedindo a sua formação e a conseqüente disjunção dos cromossomos-filhos

Prófase Metáfase Anáfase Telófase Citocinese

Fibras do fusoFibras do fuso

Prófase Metáfase Anáfase Telófase Citocinese

Fibras do fusoFibras do fuso

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Processo operacional

Germinação das sementes

Corte do coleóptilo

Tratamento das plântulas com colchicina

Plantio em bandejas

Transplante das D0 com três folhas para o campo

Duplicação cromossômica


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Dois dia de tratamento de plântulas com seis folhas em câmara com Oxido Nitroso, a câmara tem capacidade para 15 plântulas.

A. Kato 2002, Plant Breeding, 121:370-377.

Eder & Chalyk 2002 TAG 104:703-708.

Rendimento da duplicação com colchicina:

Em milho cerca de 30% das plantas haplóides submetidas ao tratamento conseguem ser autofecundadas e produzem sementes.

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Determinarão do nível de ploidia

Contagem cromossômica

Contagem do número de cloroplasto

Contagem de estômatos

Citometria de fluxo

Marcadores moleculares

25 pbDNA ladder

500 pb

125 pb

HaplóidesHaplóides

W23 BRS 801 216 494 660 664 804-A1010

W23 BRS 801 216 494 660 664 804-A1010

mmc 0022 mmc 0081

25 pbDNA ladder

500 pb

125 pb


25 pbDNA ladder

500 pb

125 pb

25 pbDNA ladder

500 pb

125 pb



W23 BRS 801 216 494 660 664 804-A1010

W23 BRS 801 216 494 660 664 804-A1010

mmc 0022 mmc 0081

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Por que obter plantas haplóides?- Rápida produção de linhagens totalmente

homozigóticas.- Eliminação de genes letais e deletérios- Permite imediata identificação de genes

mutantes.- Segregação diferenciada permitindo um menor

número de indivíduos para obter combinações desejáveis.

- Purificação de linhagens.- Aumenta a eficiência da seleção.

Duplo-haplóides no melhoramento de plantas

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AAbb aaBB

Ab Bb

Parentais

Gametas

AaBb Híbrido intervarietal

X

aabbaaBbAabbAaBbab

aaBbaaBBAaBbAaBBaB

AabbAaBbAAbbAABbAb

AaBbAaBBAABbAABBAB

abaBAbAB

aabbaaBBAAbbAABB

abaBAbABPlantas haplóides

Duplicação cromossomica

Indução de haploidia ⊗

aBAB Ab ab

Gametas F1

F2 alelos recessivos = (1/4)n

DH alelos recessivos = (1/2)n

Segregação diferenciada dos DH

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α n 0,90 0,95 0,99 1 5 6 8 2 13 16 21 3 33 38 51 4 79 90 115 5 181 203 255

Tamanho mínimo de população no caso de seleção de todos os possíveis genótipo homozigoto para locos não ligado

Fase Associação Repulsão r 0,1 0,4 0,1 0,4 N 6 9 59 14

Tamanho mínimo de população no caso de seleção de um genótipo homozigoto específico para dois locos ligados

AAbb x aaBB F1 – AaBb

Mínimo de 11 DH para obter aabb

Mínimo de 16 DH para obter AABB, aabb, AAbb e aaBB com α = 0,95.

Para genes ligados em repulsão Ab/aB com r = 0,10, são necessário o mínimo de 59 DH ou 36 SSD na 11ª geração para obter um genótipo aa/bb ou AA/BB.

Para 5 locos não ligados: 95 DH para obter um genótipo específico contra 1024 linhagens obtidas pelo método do pedigree.

Jansen 1992, Heredity 69:92-95

α n 0,90 0,95 0,99 1 4 5 7 2 9 11 17 3 18 23 35 4 36 47 72 5 73 95 146

Tamanho mínimo de população no caso de seleção de um genótipo homozigoto específico para locos não ligado

Segregação diferenciada dos DH

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Toojinda et al. 1998 TAG 96:123-131

Steptoe = susceptível a ferrugem

BSR41 = resistente a ferrugem

Marcadores RFLP flanqueando dois QTLs para resistência

Cevada

32 a 39% do parental doador estavam presentes nas 4 linhagens selecionadas como possíveis cultivares

DH e retrocruzamento assistido

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Alternativa: aumentar o tamanho da pop de RC e/ou obter haplóides a partir do RC2

Recorrente Doador

F1

RC1

Duplo haplóide&

MASLinhagemResistente

RC2

RC3

RCn

LinhagemResistente

Autofecundação

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A variabilidade genética é afetada pelo processo de DH?

Foram obtidas três populações provenientes do mesmo cruzamento em trigo

- DH por cultura de anteras (DHCA),

- DH por androgênese in vivo (polinização com milho e eliminação cromossômica) – DHPM

- SSD

33 linhagens de cada cruzamento avaliadas em seis ambientes

Desempenho médio das linhagens SSD foram superiores a DHCA no entanto não diferiram para as linhagens DHPM.

As melhores 5 linhagens de cada método para produção de grãos e % proteína tiveram desempenho similar, exceto para % proteína que foi maior em DHPM.

Ma et al. 1999, TAG 99:432-436

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Outros estudos tem mostrado perfomance inferior das linhagens geradas por cultura de anteras em relação a SSD ou cruzamento interespecífico:

Trigo (Baenzinger et al. 1983, 1989 e Mitchell et al. 1992)

Cevada (Rossnangel et al. 1986 e Bjornstad et al. 1993)

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Médias similares entre pop indica ausência de seleção direcional na formação de SSD e DH.

Resultados concordam com Chase (1974) usando DH espontâneo e Seitz (2005) usando método in situ.

Bordes, et al. 2007, Euphytica 154:41-51

Comparação de testecross para DH, SSD e S1 em milho

Característica População Média Mín Máx Intervalo Produção de grãos S1 103,6 92.0 123.8 31.8

DH 103,9 82.9 121.7 38.8 SSD 104,4 85.8 120.0 34.2

Altura de planta S1 203,0 176.5 233.5 57.0 DH 204,3 172.0 234.5 62.5 SSD 203,3 176.0 229.5 53.5

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Comparação das variâncias genéticas entre testecross em DH, em S1 e em SSD

Variância genética de linhagens DH foi aproximadamente duas vezes maior do quelinhagens S1, como esperado.

Maior consistências das variâncias entre DH x S1 comparada com SSD x S1 indica que a produção de linhagens via DH é menos sujeita ao viés de seleção.

Resultados indicam que técnica DH fornece resultados similares às linhagens geradas por autofecundação.

Bordes, et al. 2007, Euphytica 154:41-51

DH/SSD DH/S1 SSD/ S1 Var Gen Esp DH ou SSD

Desvio (obs-esp) DH

Desvio (obs-esp) SSD

Produção de grãos 1.3 1.9 1.5 49.8 -2.6 -12.6

Altura de planta 1.4 1.8 1.1 173.2 -40.1 -81.3

Razão entre variâncias genéticas e teste de desvios entre as variâncias genéticas observadas e esperados para DH e linhagens SSD.

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Distorção de segregação em DH

Milho: No cruzamento entre duas linhagens responsivas á cultura de anteras a distorção de segregação afetou menos que 20% (p<0,05) dos locos (com mais de 100 marcadores RFLP).

No entanto, no cruzamento envolvendo uma linhagem não responsiva e outra responsiva foi observado mais que o dobro de distorção de segregação com excesso de alelos da linhagem responsiva.

A fração de recombinação observada após cinco meioses (SSD) foi em média duas vezes maior do que após uma meiose (DH)

Murigneux et al. 1993 TAG 87:278-287

Outros estudos tem mostrado distorção de segregação em linhagens geradas por métodos androgenéticos:

Brócolis (Orton e Browers, 1985) e Arroz (Guiderdoni, 1991)

Cevada – distorção mais freqüente em androgêneses do que método bulbosum(Schön et al. 1990)

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Seleção recorrente utilizando plantas haplóides

Cada ciclo de seleção consiste em dois passos:- Obtenção dos haplóides da população- Crescer os haplóides no campo, polinizá-los

com mistura de pólen da pop e selecionar.Sementes colhidas da plantas haplóides

selecionadas são utilizadas no próximo ciclo.

Eder e Chalyk 2002 TAG 104:703-708 – seleção para comprimento de espiga em pop sintética de milho.

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Eder e Chalyk 2002, TAG 104:703-708

Pop Sintética

Características Ciclo de Seleção Ganho, %

C0 C1 C2 C3 Por ano Por cicloSP Produção, g/planta 134.7 144.5 148.7 - 2.6 5.2 Tamanho espiga, cm 15.8 16.3 16.9 - 1.6 3.3 Altura planta, cm 244.3 260.5 266.3 - 2.25 4.50 SA Produção, g/planta 106.4 129.6 122.8 118.5 1.9 3.8 Tamanho espiga, cm 15.7 16.4 16.5 16.4 0.7 1.4 Altura planta, cm 23.3 236.5 244.4 257.3 2.54 5.07

Médias observadas para características de produção em cada ciclo de seleção e a resposta à seleção em populações sintéticas SP e SA.

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Bouchez e Gallais 2000 Crop Sci. 40:23-29, em estudo teórico comparando a eficiência de seleção entre progênies de testecross em DH, S0, S1 e S2, concluíram que:

Planta anual, sem geração de inverno – SR usando DH émais eficiente, principalmente para caracteres de baixa h2.

Com uso de geração de inverno a vantagem desaparece.

Seleção recorrente utilizando plantas duplo haplóides

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Ganho/ano : DH 4 anos semelhante a S1

Ganho genético observado por ciclo e por ano de seleção recorrente entre famílias S1 de milho e linhagens duplo-haplóides.

Método Ciclo Tamanho do Ciclo (Anos)

Ganho Genético Observado

h2 Obs

Por Ciclo Por Ano

S1 C1 2 2.2 1.1 0.26

C2 2 4.8 2.3 0.60

Total 4 7.0 1.8

DH C1 4 6.6 1.6 0.64

Seleção recorrente utilizando plantas duplo-haplóides

Bordes et al. 2006 TAG 112:1063-1072

Seleção para produtividade i = 20%

DH: 4 anos/ciclo

S1: 2 anos/ciclo

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Bordes, et al 2006 TAG 112:1063-1072

Seleção recorrente utilizando plantas duplo-haplóides

Do ponto de vista de desenvolvimento de cultivares DH tem larga vantagem sobre S1

Testador – material elite... Novo híbrido

DH com ciclo de 4 anos só é mais eficiente que S1 no primeiro ciclo de desenvolvimento de cultivares, tanto no observado como no esperado.

Neste experimento, o custo do DH foi 1,2 vezes maior do que S1.

Do ponto de vista de melhoramento populacional, considerando o número de progênies avaliadas para cada método em 4 anos, o custo total do DH foi ligeiramente maior do que o custo de dois ciclos de S1. Do ponto de vista de desenvolvimento de variedades, levando em conta o avanço de geração dos S1 selecionados, DH tem nítida vantagem.

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Esquema proposto para produção de híbridos em milho utilizando DH

Intercruzamento de linhagens criando variabilidade

in vivo indução de haplóides da geração F1

Avaliação das linhagens D1 per se e simultânea autofecundação

Avaliação em testecrosses em vários ambientes

Formação dos híbridos experimentais.

Röber et al., Maydica 2005 50:275-283

Leva o mesmo tempo que um esquema convencional com testes para capacidade de combinação em S2 e S4.

No entanto, a resposta à seleção das linhagens DH em testecross é maior do que S2.

Purificação de linhagens – proteção de cultivares.

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Uso de DH na piramidação de genes

A vantagem na utilização de DH para piramidação de genes está na pronta identificação das linhagens portadoras dos alelos recessivos.

Werner et al. 2005 Mol. Breeding 16:45-55

Piramidação de três genes causadores do mosaico amarelo em Cevada

Alelos de resistência em linhagens diferentes.

Com apenas duas gerações de cruzamentos e posterior produção de DH obteve-se linhagens com os tres alelos de resistência fixados.

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Quem está utilizando DH?

Tuvesson et al. 2007 Euphytica 158:305-312

Cevada, canola, trigo, centeio e triticale

Cevada e trigo.

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- Milho

2000 – Primeiros haplóides foram induzidos

2001 – mais de 2500 linhagens DH foram produzidas

2002 – mais de 13000 linhagens DH foram produzidas

- Primeiros testes de campo com linhagens DH

2004 – mais de 56000 linhagens DH forma produzidas

2005-06 – Liberação de híbrido duplo haplóide no mercado americano

2006 – Aumentou a produção de DH em mais de 150%

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Considerações Finais

programa de pós-graduação em genética e … 20 anos após a descoberta da cultura de anteras...

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