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Telma Maria Alves
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAISCONTRA Campylobacter fetus subsp. venerealis.
Dissertação apresentada ao programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária Preventiva daEscola de Veterinária da Universidade Federal deMinas Gerais, como requisito parcial para obtençãodo grau de Mestre em Medicina Veterinária.
Área de concentração: Medicina VeterináriaPreventiva
Orientador: Prof. Dr. Andrey Pereira Lage
Co-orientador: Dr. Luiz Guilherme Dias Heneine
Belo HorizonteUFMG - Escola de Veterinária
2006
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A474p Alves, Telma, 1977- Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contraCampylobacter fetus subsp. venerealis / Telma Maria Alves. –2006. 34 p. :il.
Orientador: Andrey Pereira Lage Co-orientador: Luiz Guilherme Dias Heneine Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais,Escola de Veterinária Inclui bibliografia
1. Bovino – Doenças – Teses. 2. Infecções por Campylobacter -Teses. 3. Anticorpos monoclonais – Caracterização – Teses. I. Lage,Andrey Pereira. II. Heneine, Luiz Guilhermee Dias. III. UniversidadeFederal de Minas Gerais. Escola de Veterinária. IV. Título.
CDD – 636.089 693 53
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Aos meus pais e minha irmã, pelo carinho, confiaça, dedicação constantes.
AGRADECIMENTOS
O tempo passou. Não pensei que seria tão rápido. Hoje não sou como ontem, ínicio...Amadurecer é um processo natural e como tudo na vida, aconteceu comigo. Senhor hoje eunão vou pedir nada, absolutamente nada. Aqui estou para agradecer a oportunidade que me foidada;
Aos meus pais, Jair e Neusa, e a minha irmã Regina, que mesmo distantes estavam do meulado, me apoiando, dando amor, amizade e forças para suportar a distância e esse mundonovo. Vocês são a principal razão desta conquista;
Ao Prof. Andrey, pela amizade, dedicação, oportunidade, carinho, confiança e ensinamentosconcedidos. A Elizabeth, mentora de tudo, por acreditar em mim, e me dar essa oportunidadede seguir os meus sonhos;
Aos grandes amigos e amigas do Laboratório de Bacteriologia Aplicada, Ana Cláudia (Patinha),Ana Paula, Paula (Flu), Cristiane (Kika), Karina, Ricardo, Bárbara, Ju, Silvia, Poester, Carol,Carlos, Renata, Adriano, Michelle, Rebeca, Roberta, que me ensinaram a dar os primeirospassos, ou melhor meus primeiros repiques, pela amizade, apoio, conselhos, puxões de orelhae até colo;
Ao Luiz Guilherme e Luciana que abriram as portas dos laboratórios na FUNED pararealizações dos trabalhos. Aos amigos de todas as horas: Patrícia, Márcia, Elaine, Horácio,Rafael, Carolina, Paulo, Flávio, Luciene, Gisele, Ronan. Obrigada pela amizade e pela ajuda,apoio, carinho;
A todos os amigos: Luciana, Eduardo (D2), Simone, Geovana, Creuza, Nádia, Rogério,Eduardo, Jorge, Júnia, Mirli, Fábia, Nilda, Doris, Graziela e Nelson. A todos os funcionários eprofessores do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, em especial aos professoresPaulo Roberto, Nelson, Zélia, José Sergio, Roberto, Rômulo, Jenner e Francisco, pela ajuda ecarinho concedidos;
Aos BAMs Mariana e Stênio, que foram meu apoio em todos os momentos alegres e tristesdesta caminhada. A todos que de alguma forma contribuíram para que esse sonho se tornasserealidade;
MUITO OBRIGADA!!!
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SUMÁRIO
Pág.RESUMO.......................................................................................................... 9
ABSTRACT...................................................................................................... 9
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 10
2 LITERATURA CONSULTADA ........................................................................ 102.1 Gênero Campylobacter e Campilobacteriose Genital Bovina........................ 102.2 Anticorpos monoclonais................................................................................. 12
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 143.1 Animais............................................................................................................. 143.2 Amostras bacterianas de referência e condições de cultivo............................ 143.3 Produçãodos antígenos por sonicação............................................................ 143.4 Imunização dos camundongos......................................................................... 153.4.1 Avaliação dos camundongos imunizados ....................................................... 163.5 Produção de anticorpos monoclonais .............................................................. 163.5.1 Preparo das células do baço............................................................................ 163.5.2 Preparo das células Sp2/0Ag14....................................................................... 173.5.3 Fusão................................................................................................................ 173.5.4 Seleção dos hibridomas ................................................................................... 173.5.5 ELISA Indireto para C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354........................ 183.6 Expansão dos hibridomas................................................................................ 183.6.1 Cultivo primário de macrófagos e baço de camundongo SPF......................... 183.7 Clonagem ......................................................................................................... 193.7.1 Expanção dos clones ....................................................................................... 193.8 Obtenção do sobrenadante de cultura contendo anticorpos monoclonais...... 193.9 Produção de anticorpos monoclonais em líquido ascítico em BALB/c 203.10 Isotipagem........................................................................................................ 203.11 Congelamento dos hibridomas ........................................................................ 203.12 Caracterização dos anticorpos monoclonais quanto a especificidade ............ 213.12.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE................... 213.12.2 “Western blotting”........................................................................................... 21
4 RESULTADO ................................................................................................... 214.1 Imunização dos camundongos......................................................................... 214.1.1 Soro hiperimune ............................................................................................... 224.2 Produção dos anticorpos monoclonais ............................................................ 224.3 Expansão dos hibridomas................................................................................ 244.4 Clonagem ......................................................................................................... 244.5 Expansão dos clones ....................................................................................... 244.6 Produção de líquido ascítico em BALB/c ......................................................... 254.7 Caracterização dos anticorpos quanto ao isotipo ............................................ 254.8 Caracterização dos anticorpos quanto ao especificidade................................ 254.9 Caracterização dos anticorpos por western blot .............................................. 26
5 DISCUSSÃO .................................................................................................... 28
6 CONCLUSÕES ................................................................................................ 30
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 31
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ANEXO I ............................................................................................................. 34
LISTA DE TABELASTabela 1 Amostras de bactérias de referência dos gêneros Arcobacter,
Campylobacter, Escherichia e Helicobacter utilizadas nos diversosexperimentos. .....................................................................................................
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Tabela 2 Especificidade e classes e subclasses dos anticorpos monoclonaisproduzidos contra C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354...............................
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LISTA DE FIGURASFigura 1 “Dot blot” da titulação dos soros dos camundongos inoculados com antígeno
sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354........................................22
Figura 2 “Dot blot” mostrando a especificidade do soro dos animais após aimunização contra C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 produzido emcamundongos. ....................................................................................................
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Figura 3 Hibridomas em fase de crescimento, 48h após da adição de fatores decrescimento (20x). ..............................................................................................
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Figura 4 "Western blotting" para a caracterização dos anticorpos monoclonaisobtidos.................................................................................................................
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RESUMO
Para a produção de anticorpos monoclonais contra Campylobacter fetus subsp. venerealisforam utilizadas as linhagens de células de mieloma Sp2/0-Ag14 e células de baço decamundongos BALB/c imunizados com sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354. Adetecção dos anticorpos monoclonais foi realizada por ELISA indireto utilizando antígenosonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354. A clonagem foi realizada por diluiçãolimitante e os clones foram caracterizados por ELISA indireto utilizando um painel de bactériassonicada escolhidas em função da prevalência e habitats: C. fetus subsp. venerealis NCTC10354, C. fetus subsp fetus ADRI 1812, C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, C. lari NCTC11352 e Arcobacter skirrowii LMG 6621; e no "western blotting" utilizando antígenos sonicadosde C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 e C. sputorum biovar sputorum LMG 6647. Foramobtidos 15 clones produtores de anticorpos anti – C. fetus subsp. venerealis das classes IgM(1) e IgG (14). Quatro clones dentre os 15 clones obtidos foram produtores de anticorposmonoclonais espécie-específicos: dois clones reagiram com maior especificidade contra C.fetus subsp venerealis NCTC 10354 e dois clones reagiram com maior especificidade contra C.fetus subsp fetus ADRI 1812. Nenhum dos clones reagiu contra C. sputorum biovar sputorumLMG 6647, comprovando a especificidade dos anticorpos monoclonais testados. Todos osclones reconheceram uma proteína de massa molecular de aproximadamente 148 kDa nosonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354.
Palavras chave: anticorpos monoclonais, Campylobacter fetus subsp. venerealis, bovinos,campilobacteriose genital bovina.
ABSTRACT
Myeloma cells Sp2/0-Ag14 and spleen cells from BALB/c mouse immunized with sonicatedCampylobacter fetus subsp. venerealis NCTC 10354 were fused with polyethylene glycol (PEG)for the production of monoclonal antibodies (MAb's). Clones were obtained by limiting dilutionand screened for specific MAb's to C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 by indirect ELISAand western blot against a panel of bacteria: C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354, C. fetussubsp fetus ADRI 1812, C. sputorum biovar sputorum LMG 6647, C. lari NCTC 11352, andArcobacter skirrowii LMG 6621 for the ELISA and C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 andC. sputorum biovar sputorum LMG 6647 for the western blotting. Fifteen clones producingMAb's anti – C. fetus subsp. venerealis of the IgM (1) and IgG (14) classes were furtherscreened for species-specificity. Four clones of the 15 obtained were producers of species-specific MAb's, 2 were specific for C. fetus subsp venerealis and 2 specific for C. fetus subspfetus. None of the clones were reactive against C. sputorum biovar sputorum LMG 6647. Allclones recognized a protein with molecular mass of approximately 148 kDa from lised C. fetussubsp. venerealis NCTC 10354.
Keywords: Monoclonal antibodies, C. fetus subsp venerealis, cattle, bovine genitalcampylobacteriosis
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1 - INTRODUÇÃO
A campilobacteriose genital bovina é umadoença sexualmente transmitida cujoagente etiológico é o Campylobacter fetussubsp. venerealis. As perdas econômicasdecorrentes da campilobacteriose genitalbovina são representadas por problemasreprodutivos causados no rebanho comorepetições de cio freqüentes e a intervalosirregulares e aumentados, infertilidadetemporária, morte embrionária, intervalos departo prolongado e aumento da reposiçãode touros.
O touro é o maior disseminador da doença ecomo a maioria dos rebanhos utilizam amonta natural no manejo reprodutivo, comtouros não testados para a presença de C.fetus, há uma facilitação da transmissão dacampilobacteriose genital bovina em nossomeio. Além disso, em grande parte daspropriedades a monta é distribuída por todoo ano e nas poucas propriedades queutilizam a inseminação artificial geralmentese encontram touros de repasse, que sãofatores de risco para a infecção. Em funçãodisto, a campilobacteriose genital bovinaapresenta-se disseminada em todo o Brasil.
O diagnóstico da campilobacteriose genitalbovina é realizado principalmente emtouros, pelo isolamento e identificação doagente. O isolamento é trabalhoso,necessita de meios de transporte eenriquecimento e condições atmosféricaespeciais, pois C. fetus subsp. venerealistem baixa resistência fora do seu habitat e apresença da microbiota do trato genitaldificulta o isolamento.
Outros testes como a imunofluorescênciadireta (IFD) e a reação em cadeia dapolimerase (PCR) têm sido empregados nadetecção de C. fetus. Testes de ELISAestão sendo avaliados para a detecção dapresença de anticorpos anti-C. fetus nomuco vaginal e para a detecção do agente.
O desenvolvimento de testesimunoenzimáticos para detecção de C. fetussubsp. venerealis em lavado prepucial de
touros infectados utilizando anticorposmonoclonais seria de grande valia nodiagnóstico da campilobacteriose genitalbovina, por poder apresentar grandesensibilidade, especificidade e a praticidadede realizar o diagnóstico de vários animaistornando o diagnóstico mais barato.
Em 1975, Köhler e Milstein descobriram queera possível obter quantidades ilimitadas deanticorpos com especificidadepredeterminada pela fusão de linfócitos Bcom células de mieloma de camundongo.Estes anticorpos, denominados anticorposmonoclonais, são mais homogêneos que osoro hiperimune e possibilitam novasperspectivas de investigação no campo dabiologia e da medicina.
As principais características dos anticorposmonoclonais são a alta afinidade eespecificidade para com o antígeno queinduziu a sua formação, tornando-sepoderosas ferramentas em diversos camposda biologia celular, fisiologia,biosseparação, biologia molecular,imunologia, microbiologia e doençasinfecciosas, dentre outras. Podem serutilizados para a localização de moléculasespecíficas em células ou tecidos,quantificações de antígeno, identificação demolécula em imunoensaios, cromatografia eprecipitação por afinidade.
Os objetivos deste trabalho foram produzir eavaliar a especificidade de anticorposmonoclonais contra C. fetus subsp.venerealis.
2- LITERATURA CONSULTADA
2.1 - Gênero Campylobacter eCampilobacteriose Genital Bovina
O C. fetus é uma bastonete Gram negativo,curvo em forma de asa de gaivota,microaerófilo, termófilo podendo causardoenças nos animais e no homem. Essaespécie pode ser dividida em duassubespécie, C. fetus subsp. fetus que podeser do sorotipo A ou B e C. fetus subsp.venerealis que é do sorotipo A (Brooks et
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al., 2002). Ambos podem causar doença embovinos; entretanto, C. fetus subsp.venerealis é agente etiológico dacampilobacteriose genital bovina, doençasexualmente transmissível de distribuiçãomundial (Thompson e Blaser, 2000).
O habitat do C. fetus subsp. venerealis nomacho é o prepúcio, onde o microrganismoé mantido predominantemente nas criptasdo epitélio, podendo ser encontradotambém nas glândulas do pênis e na uretradistal. O macho infectado é assintomático.Os touros jovens, são relativamenteresistentes à infecção sendo que nos tourosmais velhos a freqüência de infecção por C.fetus subsp. venerealis é maior em funçãodo aumento do tamanho e do número dascriptas no epitélio do prepúcio, o queproporciona uma atmosfera demicroaerofilia, favorecendo o crescimentodo microrganismo (Dekeyser, 1984).
Nas vacas e nas novilhas, o microrganismoinfecta a vagina, a cérvix, o útero e ooviduto em uma infecção ascendente. Ainfecção nas fêmeas resulta primariamenteem infertilidade temporária com repetição decio a intervalos aumentados e irregulares,em geral maiores que 35 dias, devido afalhas no desenvolvimento embrionário,endometrites secundárias e abortos, quesão menos freqüentes, levando a grandesperdas econômicas pelos problemasreprodutivos desencadeados (Dekeyser,1984).
O C. fetus subsp. venerealis é transmitidodo macho à fêmea, e vice-versa, durante ocoito ou por sêmen contaminado utilizadona inseminação artificial. Nos machos, hárelatos de transmissão do C. fetus subsp.venerealis pela atividade homossexual detouros confinados em alta densidade etransmissão indireta por equipamentosusados na coleta de sêmen (Dekeyser,1984).
A campilobacteriose genital bovina é umadoença de apresentação geralmentesubclínica e pouco perceptível no rebanho,principalmente se não há um bom controlezootécnico, pois muitas vezes as repetiçõesde cio não são observadas e quando se
suspeita da doença no rebanho, as perdasjá são grandes (Lage, 2000). Emdecorrência disto, a campilobacteriosegenital bovina é uma doença que diminuisilenciosa e lentamente os lucros daexploração pecuária. Após três a seismeses, o sistema imune da vaca supera ainfecção, mas a colonização vaginal crônicapode persistir por meses ou mesmo anos(Dubreuil et al., 1990; Wang et al., 1993).
Vinte por cento dos touros de propriedadesde pecuária de corte dos estados com maiorpopulação bovina do país (Miranda, 2005)estão infectados por C. fetus, o quedemonstra que a campilobacteriose genitalbovina está bastante disseminada em nossopaís.
A infecção por C. fetus subsp. fetus podelevar à septicemia, mas também podecausar problemas reprodutivos nos bovinose ovinos levando a aborto esporádico embovinos. A transmissão ocorre pela ingestãode alimentos e água contaminados. Emvacas prenhes, o microrganismo que selocaliza no trato gastrointestinal pode causarbacteremia e ser encontrado na placentaresultando em aborto. O C. fetus subsp.fetus pode ser isolado de fezes e bile deanimais infectados. O habitat do C. fetussubsp. fetus é no trato gastroentestinal(Thompson e Blaser, 2000).
Campylobacter sp. possuei proteínas quesão imunogênicas importantes para acolonização do hospedeiro (Thompson eBlaser, 2000). As principais proteínasencontradas em C. fetus, segundo Dunn etal. (1987), são: o flagelo, com pesomolecular de 63 kDa, proteínas demembrana externa, de baixo peso molecularvariando de 43 a 44 kDa, eglicopolissacarídeos com peso molecular de100 kDa. Pode ser encontrada ainda em C.fetus uma camada externa constituídaprincipalmente de proteínas de alto pesomolecular, de aproximadamente 97 a 149kDa, denominadas SAP (surface arrayproteins) (Garcia et al., 1995). Blaser et al.(1994) demonstraram que C. fetus temcapacidade de modificar antigenicamenteessas proteínas de alto peso molecularapós sucessivas passagens em meio
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artificial, diminuindo a virulência emcamundongos inoculados.
Mc Coy et al. (1975) foram os primeiros adescrever a presença de uma microcápsulaem C. fetus. A habilidade de C. fetus emdesenvolver infecções nos animais e nohomem tem atraído a atenção depesquisadores para elucidar a importânciade proteínas de membrana externa dabactéria na patogenia da doença (Tummurue Blaser, 1992; Garcia et al., 1995; Dworkine Blaser, 1997; Grogono-Thomas et al.,2000).
A razão do diagnóstico dacampilobacteriose genital bovina serrealizado principalmente em touros, deve-seao fato desses animais estarem presentesem menor número nos rebanhos, além deserem os grandes responsáveis pela difusãoda doença nos rebanhos. As técnicaslaboratoriais rotineiramente utilizadas para odiagnóstico da infecção por C. fetus subsp.venerealis são, além do isolamento eidentificação do microrganismo, o teste deimunofluorescência direta (IFD), que temsido utilizado para detecção de C. fetus emlavado prepucial e muco vaginal (Clark,1971; Pellegrin, 1999; Figueiredo et al.,2002), e a reação em cadeia da polimerase(PCR) (Hum et al., 1997; Stynen, 2000), queé um teste mais específico e sensível, masmais caro e laborioso.
Os testes sorológicos de aglutinação e deELISA (Hewson et al., 1985, Hum et al.,1994) têm sido usados para detecção deanticorpos contra C. fetus em amostra demuco vaginal. O ELISA direto para detecçãodo C. fetus em lavado prepucial e mucovaginal está sendo testado maisrecentemente por Brooks et al. (2004),utilizando anticorpos monoclonais contra olipopolissacarídio (LPS) de C. fetus. Osresultados alcançados no ELISA descritopor Brooks et al. (2004) não possuem umbom limite de detecção (sensibilidadeanalítica), que é muito baixo sendo de 104 a106 UFC/mL, apesar de estar utilizandoanticorpos monoclonais para tentaraumentar a sensibilidade e especificidade,sendo que a imunofluorescencia diretapossui uma sensibilidade analítica muito
melhor (detecção de 102 UFC/mL)(Figueiredo et al, 2002).
2.2 – Anticorpos Monoclonais
Após o pioneiro trabalho feito por G. Barski,S. Sorieul e B. Cornefert, no início dadécada de 1960, culturas de hibridomasoriginados de fusão de células somáticas dediferentes espécies ou tecidos aumentaramas pesquisa em biologia celular e genética.A fusão destas células era espontânea etinha uma baixa eficiência de célulasfundidas (Harlow e Lane, 1988). Essa fusãoespontânea foi superada dramaticamenteem 1965 pelo tratamento de célulasfundidas com vírus inativado Sendai (Harrise Watkins, 1965). Entretanto o vírus Sendaiinativado tem várias desvantagens comofusógeno incluindo a variabilidade e o custo.
Potter, em 1972, induziu a formação demieloma em camundongos da linhagemBALB/c. Os mielomas podem ser induzidosem algumas linhagens de camundongospela injeção de óleo mineral dentro dacavidade peritoneal. Essas células sãoreferidas pela abreviação MOPC(plasmócitoma formado por óleo mineral).Mielomas derivados de BALB/c vem setornando as células mais comuns para arealização de fusões. As linhagens demielomas de BALB/c mais utilizadas sãoX63Ag8.653 (Kearney et al., 1979) e Sp2/0-Ag14 (Köhler e Milstein, 1976) (Harlow eLane, 1988).
Pontecorvo, em 1974, mostrou queprotoplasmas de plantas poderiam serfundidos rapidamente se tratados compolietilenoglicol (PEG). Em 1975, naInglaterra, Köhler e Milstein descobriramque era possível obter a fusão de linfócitosB de camundongo com capacidade deproduzir anticorpos com células de mielomade camundongo com a utilização depolietilenoglicol e que essas células hibrídascresceriam ilimitadamente, produzindograndes quantidades de anticorposhomogêneos e com alta especificidadepredeterminada para um epítopo (Harlow eLane, 1988). Estes anticorpos foramdenominados anticorpos monoclonais e ascélulas híbridas que os produziam
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hibridomas. Os anticorpos monoclonaisabriram novas perspectivas de investigaçãono campo da biologia e da medicina (Köhlere Milstein, 1975).
As células de baço a ser utilizadas na fusãocom os mielomas podem ser frescas oucongeladas (Marusich, 1988). Ocongelamento evita o desperdício delinfócitos B e pode ser realizado emdimetilsulfóxido (DMSO) e nove partes demeio "high glucose Dulbeccos’s modifiedEagle’s médium" (HGDMEM) em nitrogêniolíqüido por tempo indeterminado (Marusich,1988).
Para a formação dos hibridomas, ofusógeno de escolha é o polietilenoglicol,que faz a fusão das membranas plasmáticasem um primeiro estágio formando umasimples célula com dois ou mais núcleos.Em seguida ocorrerá a fusão dasmembranas nucleares e a formação deheterocário e, durante a mitose, o DNAsofrerá uma segregação para as célulasfilhas. Durante a segregação como onúmero de cromossomos é maior que onormal, nem sempre a divisão é igual paraas células filhas e muitos cromossomospodem ser perdidos. A perda decromossomos pode resultar naincapacidade dos hibridomas em produzirimunoglobulinas ou de fazer rearranjos dafração variável das cadeias leves e pesadas(Harlow e Lane, 1988).
As células de baço de um animal normal, aocontrário das células de mieloma, possuemos genes da imunoglobulina específicadesejada e produzem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT)que atua na produção dos ácidos nucléicos.Em um linfócitos B normal existem duas viaspara síntese de ácidos nucléicosdenominadas via 'de novo' e via desalvamento. Os mielomas têm toda amaquinaria necessária para a secreção deanticorpos que não são específicos masmuitos mielomas, mesmo possuindo essamaquinaria, não secretam anticorpos.Alguns mielomas são mutantes para aprodução da enzima HGPRT. Os mielomassó possuem a via 'de novo' para a síntesedos ácidos nucléicos. Na fusão a via 'de
novo' pode ser bloqueada por várias drogastais como azaserina, metrotrexato eaminopterina. A aminopterina é a drogamais utilizada para selecionar as células demieloma não fusionadas, permanecendovivas as células que possuem a via desalvamento e, conseqüentemente, possuema enzima HGPRT.
Para a formação de hibridomas têm sidoescolhidos mielomas que não secretamanticorpos e que não possuam a enzimaHGPRT.
As células do baço necessárias para serealizar a fusão são isoladas decamundongos imunizados, da mesmalinhagem de origem dos mielomas (Harlow eLane, 1988). Com uma eficiente fusão,aproximadamente 1% das células sãofundidas e apenas aproximadamente 1 em105 formam hibridomas viáveis. Como afusão é aleatória, a possibilidade de fundirmieloma com linfócitos B, linfócitos B comlinfócitos B, mieloma com mieloma, célulasnão fundidas do mieloma e linfócitos B, énecessário utilizar uma droga, que pode sera aminopterina, para selecionar durante ocultivo pós-fusão as células fundidas(Harlow e Lane, 1988).
As células do baço que não fusionarammesmo tendo a via ‘de salvamento’morrerão porque seu tempo de vida é deaproximadamente 7 dias em meio decultura. As células do mieloma, comopossuem apenas a via ‘de novo’ e essa serábloqueada, morrerão. Apenas os hibridomasque são formados por célula de mielomacuja a única via foi bloqueada e por linfócitoB que ainda possui uma via ‘de salvamento’sobreviverão (Harlow e Lane, 1988).
Para o cultivo dessas células híbridasmuitas vezes é necessária a utilização decélulas alimentadoras. Muitos trabalhosrelatam que o uso de células alimentadoras,por exemplo: macrófagos peritoneais(Fazekas e Scheidegger, 1980), células dotimo, células do baço e fibroblastos, podemaumentar a coleta de anticorposmonoclonais e a viabilidade das célulashíbridas (Bazin e Lemieux, 1989).
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Outra forma para melhorar a produção deanticorpos monoclonais é a utilização demeio condicionado, que é o cultivo dascélulas do baço, linfócitos T, macrófagos emuitos outros tipos de células, que contêmfatores de crescimento solúveis para ohibridoma - HGF (“Hybridoma GrowthFactor”), que é similar a IL-6 que é um fatorde crescimento, proporcionando aproliferação celular. Esse meiocomplementar pode ser produzido pelalinhagem de células P388D1 - monócito decamundongo (Bazin e Lemieux, 1989).
Ainda para obter-se uma maior produção deanticorpos monoclonais, os hibridomaspodem ser inoculados na cavidadeperitoneal de camundongo da mesmalinhagem, causando ascíte no animal. Amultiplicação dos hibridomas é auxiliadapelo fluxo de macrófagos e o processoinflamatório resulta em aceleração de ascíterica em anticorpos monoclonais. Aconcentração dos anticorpos no líqüidoascítico fica entre 1 a 10mg/mL. Quando ocultivo dos hibridomas é realizado emgarrafas, essa concentração é 1000 vezesmenor que no líquido ascítico (Harlow eLane, 1988).
O desenvolvimento de testesimunoenzimáticos para detecção de C. fetussubsp. venerealis em lavado prepucial detouros infectados utilizando anticorposmonoclonais, seria de grande valia nodiagnóstico da campilobacteriose genitalbovina, por poder apresentar grandesensibilidade, especificidade e a praticidadede realizar o diagnóstico de vários animais,tornando o diagnóstico mais barato e rápido.
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Animais
Foram utilizadas fêmeas de camundongosda linhagem BALB/c, com idade entre 4 a 6semanas, para a imunização e a coleta dolíquido ascítico. Os animais foramadquiridos do Centro de Bioterismo doInstituto de Ciências Biológicas (ICB) daUniversidade Federal de Minas Gerais(UFMG). Os camundongos da linhagem
BALB/c foram mantidos em grupos emgaiola no biotério da Escola de Veterináriada UFMG.
Para a coleta de macrófagos peritoneais(Harlow e Lane, 1988) foram utilizadoscamundongos suíços livres de patógenosespecíficos (SPF), adquiridos do Centro deBioterismo da Fundação Ezequiel Dias -Funed. Os camundongos SPF forammantidos em grupos em gaiola no biotérioda Funed. Todos os camundongos foramtratados com ração e água à vontade.
Este projeto foi aprovado pelo Comissão deÉtica em Experimentação Animal(CETEA/UFMG) com o protocolo no 124/04.Todos os procedimentos envolvendoanimais foram realizados de formahumanitária (REPORT..., 2001).
3.2 - Amostras bacterianas de referênciae condições de cultivo
Amostras de referência dos gênerosArcobacter, Campylobacter e Helicobacter(Tabela 1), estocadas a –80ºC, foramcultivadas em ágar infusão de cérebro ecoração (Brain Heart Infusion - BHI, Difco,EUA), acrescido de 10% de sanguedesfibrinado de cavalo, em condições demicroaerofilia (5% O2, 5% H2, 10% CO2 e80% N2) a 37°C por 48 h (Vandamme,2000). Escherichia coli foi cultivada em agarMueller-Hinton (Difco, EUA ) a 37°C por 12h. A pureza das amostras foi avaliada pelacoloração com fucsina.
3.3 - Produção dos antígenos porsonicação
Foram feitas suspensões, em solução salinafosfatada tamponada pH 7,4 (PBS), naescala 10 de McFarland, das amostras dereferência constantes da Tabela 1. Estasamostras foram sonicadas em gelo por 6ciclos de 30 seg, com intervalos de 1 min derepouso, a uma freqüência de 50 kHz. Asonicação foi avaliada por microscopia óticapor coloração com fucsina, estabelecendo-se um padrão de 60% de lise das bactérias.
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As amostras sonicadas foram distribuídasem alíquotas de 1 mL e estocadas a -80°C.A concentração de proteínas dos antígenos
sonicados foi determinada pelo método deLowry et al. (1951), utilizando-se comopadrão a soroalbumina bovina (BSA -INLAB, Brasil).
Tabela 1 - Amostras de bactérias de referência dos gêneros Arcobacter, Campylobacter,Escherichia e Helicobacter utilizadas nos diversos experimentos.
Espécie Amostra
Arcobacter skirrowii
A. butzleri
Campylobacter coli
C. fetus subsp. fetus sorotipo A
C. fetus subsp. fetus sorotipo B
C. fetus subsp. fetus sorotipo B
C. fetus subsp. fetus sorotipo BC. fetus subsp. venerealis
C. fetus subsp. venerealis
C. fetus subsp. venerealis
C. fetus subsp. venerealis
C. fetus subsp. venerealis
C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis
C. hyointestinalis subsp. lawsoni
C. jejuni subsp. doylei
C. jejuni subsp. jejuni
C. lari
C. sputorum biovar fecalisC. sputorum biovar paraureolyticus
C. sputorum biovar paraureolyticus
C. sputorum biovar sputorum
Escherichia coli
Helicobacter fenneliae
LMG 6621LMG 15919
NCTC 11366 T
ADRI 1812
ADRI 553
ADRI 1810
ATCC 27374 T
NCTC 10354
ADRI 510
ADRI 528
ADRI 534
ADRI 1832LCDC 17398 (=LMG 12686)
LMG 14432 T
LMG 8843 T
NCTC 11351 T
NCTC 11352 T
NCTC 11415LCDC 6577
LCDC 6939
LMG 6447
ATCC 25922
LMG 13306T – Amostra tipoLMG – Laboratorium voor Microbiologic – Rijksuniversiteit Gent – BélgicaNCTC – National Type Culture Collection – InglaterraADRI – Animal Diseases Research Institute – CanadáATCC – American Type Culture Collection – Estados Unidos da AméricaLCDC – Laboratory Center for Disease Control – Canadá
3.4 - Imunização dos camundongos
Foram imunizadas fêmeas de camundongoda linhagem BALB/c, utilizando-se antígenosonicado da amostra C. fetus subsp.venerealis NCTC 10354 com adjuvantecompleto (primeira inoculação) e incompleto
(segunda e terceira inoculações) de Freund(Sigma, EUA), na proporção de 1:2. Asinoculações, em um volume de 500 µLcontendo 50 µg de antígeno, foramrealizadas por via intraperitoneal nos dias 0,15 e 30. Uma quarta inoculação foirealizada por via endovenosa ou
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subcutânea, com 50 µg de antígenosonicado em 100 µL de PBS sem adjuvante,quatro dias antes da fusão, para asincronização das células B (Harlow e Lane,1988). Antes de cada imunização foicoletado sangue para a titulação dosanticorpos e para servir de controle positivoe negativo nos testes a serem realizados.
3.4.1 – Avaliação dos camundongosimunizados
Foi avaliado o título de anticorpos séricosanti – C. fetus subsp. venerealis NCTC10354 pela técnica de “dot blot” segundoHarlow e Lane (1988), com modificações.
Foram utilizadas membranas denitrocelulose (Pharmacia, Suécia) comporos de 0,45µm e área de 9775 mm2,sendo hidratada de forma homogênea comtampão Tris salina (TBS pH 7,5), durante 15min. Em seguida as membranas foramtransferidas para o aparelho de “dot blot”(Bio - DotTM Apparatus, BioRad, EUA) elavadas com 200 µL por poço de TBS, sobvácuo.
As membranas foram sensibilizadas comantígeno sonicado da amostra C. fetussubsp. venerealis NCTC 10354, com 100µL/poço na concentração de 1 ng/µL. Oantígeno foi transferido para a membranapor vácuo e em seguida as membranasforam bloqueadas com solução de BSA a1%, sendo drenadas pela gravidade. Asmembranas foram lavadas duas vezes com200 µL de tampão tris salina com 0,05% deTween 20 (Sigma, EUA) (TTBS), utilizando-se vácuo.
Os soros a serem testados foramadicionados no volume de 100 µL/poço,diluídos em base 2 de 1:1.000 a 1:50.000,sendo drenados por gravidade. Asmembranas foram novamente lavadas duasvezes com tampão tris salina Tween 200,05% drenado por gravidade e foram entãoaplicados 100 µL/poço na diluição 1:6.000do anticorpo secundário (anti - IgG decamundongo conjugado com peroxidase,Sigma, EUA), com a drenagem sendo feitapor gravidade. As membranas foram
finalmente lavadas duas vezes com TTBS0,05% drenado por vácuo, retiradas doaparelho e reveladas com 3,3`-diaminobenzidina (DAB) (Kit DAB SK-4100,Vector Laboratories, EUA), segundo asrecomendações do fabricante.
3.5 - Produção de anticorposmonoclonais
Para a produção e preparo dos anticorposmonoclonais foram utilizados osprocedimentos preconizados por Harlow eLane (1988) e Coligan et al. (1996), commodificações.
3.5.1 - Preparo das células do baço
Os camundongos que atigiram a melhortitulação Dot Blot, foram sacrificados pordeslocamento cervical, quatro dias após aúltima imunização (Report..., 2001). Foi feitaassepsia no abdômen dos camundongoscom álcool 70º com o auxílio de uma gazeestéril e em seguida com álcool iodado a3%. Após a abertura da cavidade abdominalcom material cirúrgico estéril, o baço foiretirado de forma asséptica em fluxolaminar, lavado três vezes com meio RPMI1640 (Invitrogen, EUA) suplementado com10 mg/mL de tetraciclina (Sigma, EUA), 1mg/mL de anfotericina B (Bristol-MyersSquibb, Brasil) e 40 mg/mL de gentamicina(Sigma, EUA).
O baço foi colocado em uma placa de Petriestéril contendo 10 mL de meio RPMI 1640suplementado com antibiótico, maceradocom auxilio de pinça estéril e transferidopara um tubo de centrífuga de fundo cônicocom o auxílio de uma pipeta. O volume foicompletado para 15 mL com meio RPMI1640 sem SFB centrifugado uma vez por 5min, a 200 X g, a 25°C, para remoção dashemácias e retirada de proteínas solúveis eplasmáticas.
O sobrenadante foi descartado e foiacrescentado ao sedimento 5 mL do tampãode lise (cloreto de amônio 0,16 M, tris 0,17M) seguido de 5 min de repouso, pois a lisedas hemácias aumenta as chances decolisão entre os linfócitos B e as células de
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mieloma (Hurrell, 1982). O material foi entãocentrifugado uma vez por 5 min, a 200 X g,a 25°C. O sobrenadante foi descartado e aosedimento foram adicionados 15 mL demeio RPMI 1640 suplementado comantibiótico, sendo o tubo centrifugado umavez por 5 min, a 200 X g, a 25°C.
Após descarte do sobrenadante, osedimento foi ressuspenso em 10 mL demeio RPMI 1640 acrescido de antibióticos e15% de SFB (GibcoTM, EUA). As célulasforam então contadas em câmara deNeubauer após diluição em azul de tripan(GibcoTM, EUA)a 0,3%.
3.5.2 - Preparo das células Sp2/0-Ag14
As células de mieloma da linhagem Sp2/0-Ag14 (ATCC CRL 1581 – Köhler e Milstein,1976) foram adquiridas do Banco de Célulasdo Laboratório de Biologia Celular eMolecular da Fundação Ezequiel Dias paraa produção dos hibridomas.
As células foram previamentedescongeladas, cultivadas em meio de pré-fusão (100 mL de RPMI 1640 acrescido de10% de SFB e 20 µg/mL 8-azaguanina[Sigma, EUA]) em estufa a 37°C em 5% deCO2 por uma semana, sendo o meio trocadoa cada 48 h. A 8-azaguanina ajuda aselecionar as células que são realmentehipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasenegativas - HGPRT (Coligan et al., 1996).Em seguida, as células foram cultivadas pormais uma semana em meio base (RPMI1640 acrescido de 10% de SFB e sem 8-azaguanina). As células foram contadas emcâmara de Neubauer após diluição em azulde tripan a 0,3%.
3.5.3 – Fusão
A fusão foi realizada utilizando-se células demieloma da linhagem Sp2/0-Ag14 (ATCCCRL 1581) e células do baço de animalimunizado com sonicado de C. fetus subsp.venerealis NCTC 10354. Para realizar afusão foi utilizada uma proporção de 1célula Sp2/O-Ag14 para 10 células de baçode animal imunizado (Sharon, 1979; Coliganet al., 1996). As células do baço e as células
Sp2/O-Ag14 foram transferidas apóscontagem para um tubo de centrífuga defundo cônico de 50 mL.
As células foram centrifugadas por 5 min, avelocidade de 200 X g, a 25ºC. Osobrenadante foi descartado. As células dosedimento foram aquecidas a 37°C e emseguida foram adicionados lentamente 0,8mL de polietilenoglicol (1300-1600, Sigma,EUA), previamente aquecido a 37ºC embanho-maria, por 1 min. As células foramhomogeinizadas lentamente e foi tomadocuidado com o tempo de exposição aopolietilenoglicol, pois este é tóxico para ascélulas, podendo diminuir o número decélulas fundidas, sendo 1 min o tempoessencial para realizar uma boa fusão.
Em seguida, foram adicionados 5 mL demeio RPMI 1640, sem SFB, e o tuboincubado a 37oC durante 1 min, paradiminuir a ação do polietilenoglicol. Foramacrescentados 10 mL de meio RPMI 1640sem SFB, sendo o tubo mantido a 37oC por5 min. Então, as células foram centrifugadaspor 5 min, a 200 X g, a 25°C. Osobrenadante foi descartado.
Uma pequena alíquota de células Sp2/O-Ag14 foi reservada a fim de servir decontrole do meio do RPMI 1640suplementado com HAT 100X (RPMI 1640acrescido com HAT- hipoxantina,aminopterina, timidina, [Sigma, EUA]).
3.5.4 – Seleção dos hibridomas
As células híbridas foram selecionadas pelomeio de cultura suplementado com HAT(200 mL de RPMI 1640, 15% de SFB,insulina bovina (GibcoTM, EUA) (16,1 g/mL),10 mg/mL de tetraciclina, 1 mg/mL deanfotericina B e 40 mg/mL de gentamicina,2,4 mL HAT.100X). Este suplemento HATfoi utilizado pela ação da aminopterina, queinibe a via 'de novo'. As células foramressuspensas em meio de culturasuplementado com HAT, em um volume de20 mL e distribuídas em placas de 96 poços(200 µL/poço) de fundo chato depoliestireno (Sarstedt, Alemanha).
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As células Sp2/0-Ag14 reservadas antes dafusão foram ressuspendidas em meio decultura suplementado com HAT etransferidas para o poço A1 das placas decultivo celular, pois estas foram usadascomo controle do meio de culturasuplementado com HAT. As placas forammantidas em estufa com 5% de CO2 a 37°C.As células do poço A1 Sp2/0-Ag14 foramavaliadas diariamente, para controlar amorte destas pelo meio de culturasuplementado com HAT.
As células Sp2/0-Ag14 e as células fundidasforam monitoradas diariamente, trocando-seo meio de cultura quando necessário ou acada 48 h, utilizando-se meio de culturasuplementado com HAT, até se certificarque todas as células do poço A1 estavammortas. Decorridos 14 dias da fusão, foiiniciada a triagem dos hibridomas quecresceram, utilizando-se o ELISA indireto, afim de determinar os poços com híbridospositivos para anticorpos anti – C. fetussubsp. venerealis (Harlow e Lane, 1988;Coligan et al., 1996).
3.5.5 – ELISA Indireto para C. fetussubsp. venerealis NCTC 10354
Placas de poliestireno de fundo chato(PoliSorp™ Surface, Nunc, Dinamarca),foram sensibilizadas com 100 µL/poço dosonicado de C. fetus subsp. venerealisNCTC 10354 na concentração de 3 ng/µL,diluído em tampão carbonato/bicarbonato(Sigma, EUA) 0,05 M pH 9,6 a 4°C durantea noite.
A placa foi bloqueada com 100 µL/poço dasolução de bloqueio (soroalbumina bovina-BSA 3% diluida em PBS 0,1 M com 0,05%Tween 20 pH 7,4), a 37°C por 1 h. Após asetapas de sensibilização e bloqueio, asplacas foram lavadas duas vezes comsolução de lavagem (salina- NaCl- com0,5% de Tween 20) e nas demais etapas aplaca foi lavada seis vezes com solução delavagem e o excesso foi retirado batendo aplaca em folhas de papel toalha.
Foram adicionados nas placas ossobrenadantes das culturas em um volume
de 100µL/poço e as placas foram incubadasa 37ºC por 1 h e 30 min. Cem microlitros doconjugado (IgG anti–camundongoconjugado com peroxidase, Sigma, USA)diluído a 1:20.000 em PBS acrescido comTween 20 0,1% foram adicionados a cadapoço e incubado por 1 h a 37°C.
Foram adicionados 100 µL/poço deortofenilenediamina (OPD-Sigma, EUA) naconcentração de 40 mg/100 mL, diluído emtampão citrato 0,15 M pH 5,0, e as placasforam incubadas por 1 h a 37°C. A reaçãofoi interrompida com 50 µL/poço da soluçãode ácido sulfúrico 0,37 mM (Vetec, Brasil)diluído em água. A placa foi lida em leitor deELISA (Labsystems Multiskan MS 352,Finland) em um comprimento de onda de492 nm. O ponto de corte foi calculado pelamédia de 10 controles negativos utilizadosem cada reação acrescidos de três vezes odesvio padrão desta média, utilizando-se oprograma Sigma Plot 4.0 (Jandel,Alemanha).
3.6 - Expansão dos hibridomas
Após a seleção por ELISA de hibridomasprodutores de anticorpos contra C. fetussubsp. venerealis, estes foram expandidoscom a finalidade de se ampliar o númerodestas células.
O meio de cultura suplementado com HATfoi substituído gradativamente pelo meio decultura suplementado com HT (Sigma, EUA)(200 mL de RPMI 1640, 15% de SFB, 16,1g/mL insulina bovina, 10 mg/mL detetraciclina, 1 mg/mL de anfotericina B e 40mg/mL de gentamicina, 2,4 mL de HT.100X- hipoxantina e timidina diluida em 10 mL demeio RPMI 1640) e em seguida pelo meioRPMI 1640 contendo 10% de SFB e insulinabovina. Estes hibridomas foram transferidospara placas de poliestireno de 24 e 6 poços(Sarstedt, Alemanha), sucessivamente, paraa expansão.
3.6.1 - Cultivo primário de macrófagos ecélulas do baço de camundongos SPF
Os macrófagos peritoneais, tambémchamados de células alimentadoras, foram
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utilizados como fonte de fatores decrescimento para se realizar co-cultura comos hibridomas durante a clonagem (Bazin eLemieux, 1989).
Para a coleta dos macrófagos peritoneais oscamundongos foram sacrificados pordeslocamento cervical (Report, 2001). Apóso sacrifício, foi realizada assepsia comálcool 70º com o auxilio de uma gaze estérile o camundongo foi fixado na prancha dedissecação pelas patas com o auxilio deagulhas, sendo o abdômen limpo com álcooliodado a 3%.
Foi feita uma abertura na linha alba, commuito cuidado para não perfurar amusculatura. A pele foi rebatida e fixada naprancha. Foi feito um pique na musculaturaabdominal e, com o auxílio de uma pipetaPasteur, a cavidade foi lavada três vezescom meio utlizado para cultura doshibridomas, previamente aquecido. O lavadofoi distribuído em placas de 96 poços, ondeforam colocados os hibridomas.
O baço foi retirado e processado com omesmo protocolo utilizado anteriormente(3.5.1). As células do baço foram cultivadasem garrafas plásticas para cultivo celular de25 cm2 em estufa com 5% de CO2 a 37°Cpor três dias. Em seguida as células dobaço foram centrifugadas a 200 X g, por 5min, a 25°C. O sobrenadante foi utilizadocomo meio suplementar em uma proporçãode uma parte de meio suplementar e umaparte de meio RPMI 1640 completo. O meiosuplemtentar foi congelado a -20°C paraposterior uso.
3.7 - Clonagem
A clonagem dos hibridomas foi realizada pordiluição limitante. O meio utilizado foi o meiode cultura suplementado com HT e asplacas foram incubadas em estufa com 5%de CO2, a 37°C por 14 dias. Foi realizada acontagem dos hibridomas em câmara deNeubauer e em seguida foi feita a diluiçãolimitante nas concentrações de 10 células euma célula por poço em um volume de 100µL/poço.
As placas foram observadas todos os diaspor 14 dias para se verificar em primeriolugar a presença de uma célula por poço e,nos dias seguintes, crescimento e troca demeio. Os clones em expressão foramavaliados quanto a produção de anticorposmonoclonais anti C. fetus subsp. venerealispor ELISA indireto (3.5.5).
3.7.1 - Expansão dos clones
As células dos poços positivos para aprodução de anticorpos foram transferidaspara placas de 24 poços e 12 poços paraexpansão e obtenção de sobrenadantesuficientes para a realização da isotipagem,especificidade e caracterização dosanticorpos monoclonais. Neste estágio oshibridomas diminuiram o crescimento e paratentar melhorar o crescimento da cultura osoro fetal bovino foi inativado 30 min a 56ºC.Foram introduzidos no meio de culturafatores de crescimento, como: o fator decrescimento de células endoteliais (EGF –Sigma, EUA) 10 µL/100 mL de meio(1g/100), transferrina bovina (Sigma, EUA)40 mg/mL de meio, selenito de sódio(Sigma, EUA) 5 µg/mL de meio, 50 µg/mLconcanavalina A (Sigma, EUA) e meiosuplementar (1:2), meio de cultura CDHybridoma AGT (Gibco™) para fazer aexpansão clonal. As células foram apenasobservadas por microscopia e não foramcontadas e a cada sete dias foi adicionadoum fator.
3.8 - Obtenção do sobrenadante decultura contendo anticorposmonoclonais
Nas trocas do meio de cultura das placascontendo anticorpos monoclonais, ossobrenadantes das culturas foram coletadosem condições assépticas, com auxilio deuma pipeta automática, distribuídos emalíquotas em criotubos devidamenteidentificados e estocados a -20°C.
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3.9 - Produção de anticorposmonoclonais em líquido ascítico emBALB/c
Para a produção de anticorpos monoclonaisem líquido ascítico foi seguida ametodologia descrita por Harlow e Lane(1988), com modificações.
Fêmeas adultas de camundongos dalinhagem BALB/c, com 6 semanas de idade,foram inoculadas por via intraperitoneal com0,5 mL de Pristane (2,6,10,14-ácidotetrametildecanóico [Sigma, EUA]) (Potter1972) e, após 7 dias, os hibridomas foraminoculados intraperitoneal em umaconcentração de 5x105 a 5x106 hibridomaspor animal. Os hibridomas antes de sereminoculados foram centrifugados e as célulasforam ressuspensas em PBS em um volumefinal de 0,5 mL.
A colheita do líqüido ascítico foi feita 14 a 34dias após a inoculação dos hibridomas como auxilio de uma agulha 40 X 1,2 (Injex -Brasil). Após a coleta, o líquido ascítico foicolocado em estufa a 37°C por 1 h e emseguida colocado a 4°C durante a noite econgelado a -20°C.
3.10 – Isotipagem
As classes e subclasses dos anticorposmonoclonias produzidos foramdeterminadas por ELISA de acordo comHarlow e Lane (1988).
Para realizar a isotipagem foramsensibilizadas placas de poliestireno defundo chato (Immuno™ Plate PoliSorp™Surface, Nunc, Dinamarca) com antígenosonicado de C. fetus subsp. venerealis
NCTC 10354 na concentração de 3 ng/µL,diluído em tampão carbonato/bicarbonato0,05 M pH 9,6. Foram adicionados 50µL/poço e a placa foi incubada a 4°Cdurante a noite.
A placa foi bloqueada com 50 µL/poço dasolução de bloqueio (BSA 3% diluída emPBS 0,1 M com 0,05% Tween 20), atemperatura ambiente por 2 h. Após asetapas de sensibilização e bloqueio, as
placas foram lavadas duas vezes comsolução de lavagem [salina (NaCl) com0,5% de Tween 20] e nas demais etapas asplacas foram lavadas três vezes comsolução de lavagem e o excesso foi retiradobatendo a placa em folhas de papel toalha.
Cem microlitros de sobrenadante dos clonesprodutores de anticorpos foram adicionadosem placas de 96 poços, sendo um total de 6poços para cada clone a ser testado, ouseja, um poço para cada classe ousubclasse a ser testada. A placa foiincubada a temperatura ambiente por 1 h.Como controle negativo foi usado100µL/poço de PBST 0,1% e como controlepositivo foi utilizado soro hiperimune decamundongo imunizado com sonicado de C.fetus subsp. venerealis NCTC 10354, diluído1:500.
Anticorpos monoclonais específicos anti-IgA, anti-IgM, anti-IgG1, anti-IgG2a, anti-IgG2b
e anti-IgG3 de camundongo (BD BiosciencesPharmingen, EUA), na concentração de 2µL/mL, foram adicionados à placa em umvolume total de 50 µl/poço. A placa foiincubada por 1 h a temperatura ambiente.
Cinqüenta microlitros do conjugado (IgG anti- rato conjugado com peroxidase [Sigma,USA]), diluído em PBST 0,1% na razão de1:10.000, foram adicionados a cada poço.As placas foram incubadas por 1 h àtemperatura ambiente.
Foram adicionados 50 µL/poço de OPD naconcentração de 40 mg/100mL, diluído emtampão citrato 0,15 M pH 5,0 em cada poçoe as placas foram incubadas por 30 min àtemperatura ambiente. A reação foiinterrompida com 50 µL/poço de ácidosulfúrico a 0,37mM diluído 1:20 em água e aleitura foi feita em leitor de ELISA(Labsystems Multiskan MS 352, Finlândia)em um comprimento de onda de 492 nm.
3.11 - Congelamento dos hibridomas
As células foram congeladas seguindo ametodologia descrita por Campbell et al.(1986), com modificações. O meio utilizadopara congelar os hibridomas foi meio
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suplementado com HAT acrescido com 6%de DMSO (Sigma, USA) e 10% de SFB. Oshibridomas foram distribuídos em alíquotasem criotubos devidamente identificados. Oscriotubos foram envolvidos em papel eacondicionados em uma caixa de isoporlacrada e colocados a 4ºC por 1 h. Emseguida a caixa contendo os criotubos foicolocada a –20ºC por 24 h e em seguidacolocada a -80ºC.
3.12 - Caracterização dos anticorposmonoclonais quanto a especificidade
Para caracterização dos anticorposmonoclonais quanto à especificidade foiutilizado o ELISA (3.5.5) com antígenossonicados preparados a partir das bactérias:Arcobacter skirrowii LMG 6621, C. fetussubsp. venerealis NCTC 10354, C. lariNCTC11351, C. sputorum biovar sputorumLMG 6647, C. fetus subsp. fetus sorotipo AADRI 1812. Os anticorpos monoclonaisreagentes contra essas bactérias foramtestados por “western blotting”.
3.12.1 - Eletroforese em gel depoliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE)
Para a eletroforese em gel de poliacrilamidadesnaturante foi empregada a técnicadescrita por Laemmli (1970). Aconcentração dos géis utilizados foram 4%para o gel de concentração e de 12% para ode separação e como marcador molecularfoi utilizado “Prestained Molecular WeightStandard Mixture” (Sigma, EUA). Foiutilizado como antígeno a C. fetus subsp.venerealis NCTC 10354 e C. sputorumbiovar sputorum LMG 6647.
3.12.2 - “Western blotting”
Após a eletroforese (SDS-PAGE), o gel foicuidadosamente retirado do aparelho eequilibrado com solução tampão tris - glicinapH 8,3 (tampão de transferência). Emseguida, o gel foi montado no Mini Trans-Blot Eletrophoretic Transfer Cell (BioRad,EUA) e a transferência realizada a 100 V,por 1 h.
Após a transferência, as membranas foramlavadas três vezes com tampão de lavagemTBS com 0,05% de Tween 20, por 5 min atemperatura ambiente. Então, asmembranas foram bloqueadas em TBS pH7,5, contendo 1% de Tween 20 por 1 h àtemperatura ambiente, sob agitação de 100rpm. Em seguida, a membrana denitrocelulose foi acondicionada no MiniProtean II Multi Screen (BioRad, EUA)para realização do “western blotting”.
Foram adicionados 600 µL do sobrenadantede cada hibridoma a ser testado em cadacanaleta. A membrana de nitrocelulose foiincubada à temperatura ambiente por 3 h.Em uma canaleta foi colocado o soropoliclonal de camundongo BALB/c, pré-testado em "dot blot" contra C. fetus subsp.venerealis NCTC 10354, como controlepositivo.
Após a incubação, as canaletas foramlavadas com tampão de lavagem TTBS eforam adicionados 600 µL do conjugado(anti – mouse IgG peroxidase), na diluiçãode 1:5.000 em solução de TBST 0,1% e amembrana de nitrocelulose foi incubadaspor 1 h à temperatura ambiente. Após alavagem, a membrana foi retirada doaparelho e revelada com o substrato 3,3`-diaminobenzidina (Kit DAB SK-4100, VectorLaboratories, EUA) utilizado segundorecomendações do fabricante.
4 – RESULTADOS
4.1 - Imunização dos camundongos
O esquema de imunização resultou em umaexcelente resposta humoral contra C. fetussubsp. venerealis em camundongosBALB/c. Títulos de 50.000 foramdeterminados por “dot blot” (Fig. 1). Doiscasos de morte de camundongos ocorreramquando o reforço foi realizado por viaendovenosa. Sendo assim, a via deinoculação do reforço foi substituida pela viasubcutânea.
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Figura 1 – “Dot blot” da titulação dos soros dos camundongos inoculados com antígenosonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 – Membrana de nitrocelulose foisensibilizada com antígeno sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 naconcentração de 1 ng/�/��2V�VRURV�IRUDP�WHVWDGRV�HP�GXSOLFDWD�QDV�OLQKDV�$�H�%��1DV�FROXQDVde 1 a 3 soro hiperimune de camundongo BALB/c, 45 dias após a 3º imunização. Nas colunasde 4 a 6: controle negativo – soros dos camundongos BALB/c coletado antes da imunização.
4.1.1 - Soro Hiperimune
O soro hiperimune de camundongo reagiucom algumas bactérias da Tabela 1, excetocom E. coli ATCC 25922, C. lari NCTC11352, C. hyointestinalis subsp.hyointestinalis LCDC 17398 e C. sputorumbiovar sputorum LMG 6647 (Fig. 2).
4.2 - Produção dos anticorposmonoclonais
Foram realizadas 8 fusões, sendo 4 fusõesutilizando células de baço congelado,segundo Marusich (1988) com modificações
e 4 fusões utilizando células de baço fresco.Não foi obtido sucesso na produção deanticorpos monoclonais, a partir de célulascongeladas. Com as células de baço apósdescongelamento, a fusão foi realizada,mas não foi obtido crescimento,permanecendo no meio apenas as célulasde mieloma fundidas, que morriam dentrode poucos dias. Sendo assim não foipossível produzir células híbridas produtorasde anticorpos partir de células de baçocongeladas.
1 2 3 4 5 6
A
B
1:50.000 1:25.000 1:10.000 1:50.000 1:25.000 1:10.000
1 2 3 4 5 6
A
B
1:50.000 1:25.000 1:10.000 1:50.000 1:25.000 1:10.000
23
Figura 2 – Dot blot mostrando a especificidade do soro de camundongo BALB/c após a 3ºimunização contra C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354– Membranas de nitrocelulose foramsensibilizadas com antígenos sonicados das amostras bacterianas constantes da Tabela 1 nasconcentrações de 1 ng/�/��2V�VRUR�GR�PHVPR�DQLPDO� IRL� WHVWDGR�HP�GXSOLFDWD�QDV� OLQKDV��)RUDPtestadas as diluições de 1:1.000 (colunas 1, 6 e 7 ), 1:5.000 (colunas 2 e 8), 1:10.000 (colunas 3 e9), 1:25.000 (colunas 4 e 10) e 1:50.000 (colunas 5 e 11). Nas colunas de 1 a 5 e de 7 a 11, nasmembranas A e C, e de 2 a 6 e de 8 a 12, na membrana B, foram testados soro de camundongoBALB/c após a 3º imunização. Como controle negativo (N) foi empregado soro do camundongoantes da imunização nas colunas 6 e 12 das membranas A e C e nas colunas 1 e 7 da membrana B.Na membrana A, as colunas de 1 a 6 foram sensibilizada com C. sputorum biovar sputorum LMG6447 (linhas A e B), C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis LCDC 17398 (linhas C e D), C. lariNCTC 11352 (linhas E e F) e C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 (linhas G e H); as colunas de7 a 12 foram sensibilizadas com C. hyointestinalis subsp. lawsoni LMG 14432 (linhas A e B), C.jejuni subsp. jejuni NCTC 11351 (linhas C e D) e E. coli ATCC 25922 (linhas E e F), nada digno denota (linha G e H). Na membrana B, as colunas de 1 a 6 foram sensibilizadas com C. fetus subsp.fetus ATCC 27374 (linhas A e B), C. fetus subsp. fetus sototipo A ADRI 1812 (linhas C e D), C. fetussubsp. fetus sototipo B ADRI553 (linhas E e F) e C. jejuni subsp. doylei LMG 8843 (linhas G e H); ascolunas de 7 a 12 foram sensibilizadas com C. fetus subsp. fetus sototipo B ADRI 1810 (linhas A eB), C. fetus subsp. venerealis ADRI 1832 (linhas C e D), C sputorum biovar paraureolyticus LCDC6939 (linhas E e F) e C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 (linhas G e H). Na membrana C, ascolunas de 1 a 6 foram sensibilizadas com Arcobacter skirrowii LMG 6621 (linhas A e B), C. fetussubsp. venerealis ADRI 510 (linhas C e D) e C. sputorum biovar paraureolyticus LCDC 6577 (linhasE e F), C. fetus subsp. venerealis ADRI 534 (linhas G e H); as colunas de 7 a 12 foramsensibilizadas com C. fetus subsp. venerealis ADRI 528 (linhas A e B), A.butzleri LMG 15919 (linhasC e D), C. sputorum biovar fecalis NCTC 11415 (linhas E e F) e C. coli NCTC 11366 (linhas G e H).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12C
NN
A
B
C
D
E
F
G
H
P
N N
B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C
E
F
G
H
A
B
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A
NN
B
C
D
E
F
G
H
A
NCTC 11352 ATCC 25922
LMG 6647
LCDC 17398
P
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Foram realizadas quatro fusões utilizandocélulas de baço fresco, mas apenas umafusão seguiu o curso normal, pois ocorreramalguns problemas técnicos econtaminações, quando as culturas decélulas híbridas foram perdidas. No preparodas células de baço foi utilizado tampão delise para retirar as hemácias e foram obtidosbons resultados. Após a fusão foi utilizadoapenas meio RPMI 1640, acrescido de 15%de SFB, gentamicina, tetraciclina, insulinabovina e HAT. As células tinham um bomcrescimento e podia se observar célulascom mais de um núcleo (heterocário).
Decorridos 14 dias da fusão, foramdetectados por ELISA indireto poços ondehavia produção de anticorpos anti – C. fetussubsp. venerealis. Foram consideradospositivos os sobrenadantes com leitura a492 nm superior ao ponto de corte. Cadafusão resultou em duas placas de 96 poçosde fundo chato. Dessas duas placas, 77poços foram positivos para a produção deanticorpos contra C. fetus.
4.3 - Expansão dos hibridomas
Após a seleção dos hibridomas produtoresde anticorpo contra C. fetus subsp.venerealis, os mesmos foram transferidospara uma placa de 24 poços. O crescimentopermaneceu excelente, com o meio decultura RPMI 1640 suplementado com SFBe insulina bovina. Então, alíquotas decélulas híbridas foram congeladas eestocadas a -80ºC. Outras alíquotas decélulas híbridas foi mantida em placa de 24poços para a realização da clonagem.
4.4 – Clonagem
A clonagem foi realizada por diluiçãolimitante, de acordo com Harlow e Lane(1988). Os poços produtores de anticopo demaior absorbância no ELISA foram clonadose os outros poços de baixa absorbânciaforam congelados para estudos posteriores.Foram feitas trocas de meio a cada 48 h ouquando necessário e observações emmicroscopia de contraste de fase em umaumento de 40X e 100X para se verificar ospoços que continham apenas uma célula e
o crescimento das colônias. Após 14 dias declonagem, foi realizado um ELISA com osobrenadante das culturas. Foram obtidos96 (16,66%) poços positivos para aprodução de anticorpos anti- C. fetus subsp.venerealis, oriundos de seis placas de 96poços.
4.5 – Expansão dos clones
As células hibridas eram acompanhadasdiariamente por microscopia de contraste defase em um aumento de 20X, 40X e 100X.
Com a combinação de meio RPMI 1640 ecélulas alimentadoras foi obtida umamelhora temporária dos hibridomas. Foioptado pela a utilização de fatores decrescimento EGF que foi adicionado aomeio RPMI 1640 e células alimentadorasonde foi obtido uma nova melhora nocrescimento por um tempo limitado, tendouma paralisação no desenvolviento celularcom uma semana após o uso do meio como fator de crescimento. Para tentar manter ocrescimento celular, foi empregado meioRPMI 1640 com EGF, células alimentadorase elemento traço - transferrina bovina. Ascélulas mantiveram o crescimento por umtempo maior. Então foi introduzida aassociação de meio RPMI 1640, EGF,células alimentadoras, transferrina bovina,selenito de sódio e concanavalina A. Amelhora das células foi rápida tendo umcrecimento significante, porém resultou emum crescimento ainda temporário doshibridomas. Em seguida foi introduzido omeio de cultura CD Hybridoma AGT, ascélulas se mantiveram mas o crescimentocontinuou lento (Figura 3 – A, B, C, D, E).
Mesmo com a adição do EGF e elementostraços, os hibridomas diminuiram ocrescimento , diminuindo o número decélulas drasticamente. Não foi possível aexpansão dos clones, permanecendo estesem concentrações baixas e com baixosníveis de produção de anticorpos.
25
4.6 - Produção de líquido ascítico emBALB/c
Com a finalidade de se recuperar oshibridomas e produzir uma maiorconcentração de anticorpos foi tentada aprodução de líqüido ascítico com alguns
clones. Em nenhum dos camundongosBALB/c inoculados houve produção deascite, apenas uma pequena reação aopristane, sem produção de líquido ascíticocom presença de imunoglobulinasespecíficas.
A B C
D E
Figura 3 - Hibridomas em fase de crescimento, 48h após da adição de fatores de crescimento(20x). A - Hibridomas sem fator de crescimento com células alimentadoras no dia zero. B -Hibridomas após meio RPMI 1640, células alimentadoras e EGF. C - Hibridomas após meioRPMI 1640, células alimentadoras, EGF e transferrina bovina. D - Hibridomas após meio RPMI1640, células alimentadoras, EGF e transferrina bovina, selenito de sódio. E - Hibridomas apósmeio RPMI 1640, células alimentadoras, EGF e transferrina bovina, selenito de sódio,concanavalina, meio complemento (1:2).
4.7 – Caracterização dos anticorposmonoclonais quanto ao isotipo
Foram observados clones produtores deanticorpos anti – C. fetus subsp. venerealisdas classes IgM (1) e IgG (14), com assubclasses IgG1 (13) e IgG2b (1) (Tab. 2).Foram considerados positivos todos ospoços com leitura acima do ponto de corteem leitor de ELISA a 492 nm. Os clonescom leitura abaixo do ponto de corte paratodas as classes e subclasses foramdescartados e os que reagiram com mais deuma classe e subclasses, foram congeladospara estudos posteriores e subclonagem.
4.8 - Caracterização dos anticorposmonoclonais quanto a especificidade
Para a caracterização da especificidade dosanticorpos monoclonais produzidos foramrealizados por ELISA (3.5.5) teste comantígenos escolhidos das bactériasArcobacter skirrowii LMG 6621, C. fetussubsp. fetus sorotipo A ADRI 1812, C. fetussubsp. venerealis, C. hyointestinalis subsp.hyointestinalis LCDC 17398, C. fetus subsp.venerealis NCTC 10354, C. lari NCTC11351 e C. sputorum biovar sputorum LMG6647. Os resultados da especificidade dosanticorpos monoclonais produzidos estão na
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Tabela 2. Dos 15 clones produtores deanticorpos monoclonais, quatro foramespecíficos para C. fetus, sendo dois
específicos para C. fetus subsp. venerealis(M28 e M 93) e dois para C. fetus subsp.fetus (M7 e M94).
Tabela 2 – Especificidade e classes e subclasses dos anticorpos monoclonais produzidoscontra C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354.
Amostras bacterianasClonesLMG 6647 NCTC 10354 ADRI 1812 NCTC 11352 LMG 6621
Isotipo
M2 - X X X - IgG1
M7 - - X - - IgMM21 - X X X - IgG1
M22 - X X X - IgG1
M28 - X - - - IgG1
M37 - X X X - IgG1
M39 - X X X - IgG1
M41 - X X X - IgG1
M42 - X X X - IgG1
M44 - X - X X IgG1
M45 - X X X X IgG2b
M60 - X X X - IgG1
M76 - X X X - IgG1
M93 - X - - - IgG1
M94 - - X - - IgG1
Arcobacter skirrowii LMG 6621C. fetus subsp. fetus sorotipo A ADRI 1812C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis LCDC 17398C. lari NCTC11351C. sputorum biovar sputorum LMG 6647M - Clones produtores de anticorpos monoclonaisX – produtores de anticorpos monoclonais- não produtores de anticorpos monoclonais
4.9 - Caracterização dos anticorposmonoclonais por “western blotting”
Os hibridomas isotipados e caracterizadosquanto a especificidade foram avaliados por“western blotting”, para se determinar contraquais proteínas das amostras C. fetussubsp. venerealis NCTC 10354 e C.sputorum biovar sputorum LMG 6647reagiriam. O resultado obtido pelo "western
blotting" realizado com o antígeno de C.fetus subsp. venerealis NCTC 10354 foi oreconhecimento de uma banda com umpeso molecular de aproximadamente 148kDa, por todos os clones (Fig. 4). Nenhumabanda foi identificada pelos clonesproduzidos quando se utilizou antígeno deC. sputorum biovar sputorum LMG 6647 no"western blotting.
M2 M7 M28 M93 M94
180.000
116.000
84.000
58.000
45.000
36.000
26.000
27
148.000 :
M2 M7 M28 M93 M94
Figura 4 – "Western blotting" para a caracterização dos anticorpos monoclonais obtidos. A –"Western blotting" utilizando antígeno sonicado de C. fetus subsp. venerealis NCTC 10354 (357µg por canaleta) e 2000 µL de sobrenadante de cultura dos clones M2 (canaleta 1), M7(canaleta 2), M28 (canaleta 3), M93 (canaleta 4) e M94 (canaleta 5). B - "Western blotting"utilizando antígeno sonicado de C. sputorum biovar. sputorum LMG 6647 (357 µg por canaleta)e 600 µL de sobrenadante de cultura dos clones M2 (canaleta 1), M7 (canaleta 2), M28(canaleta 3), M93 (canaleta 4) e M94 (canaleta 5). As reações foram reveladas pelo kit DAB(Vector Laboratories, EUA).
180.000
116.00084.000
58.000
45.000
36.000
26.000
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5 – DISCUSSÃO
O desenvolvimento de técnicas de produçãode anticorpos monoclonais em cultura decélulas tem aumentado rapidamente aprodução de anticorpos específicos ehomogêneos contra um epítopo específicode escolha. No entanto, o sistema deprodução de anticorpos monoclonais e ocultivo de células híbridas são complexos eestes necessitam de fatores para ocrescimento, proteínas transportadoras eelementos traços, tais como transferrina eselenito de sódio, dentre outros.
Anticorpos monoclonais podem serferramentas importantes no estudos daepidemiologia das infecções causadas porC. fetus subsp. venerealis, podendo originartestes diagnósticos mais específicos esensíveis, tais como imunoensaios,imunofluorescência direta eimunoistoquímica, servir de marcadores desuperfície celular para estudo da relaçãoparasita–hospedeiro e triagem de amostras.
No presente trabalho com o protocolo deimunização utilizado (Harlow e Lane, 1988)foi obtida uma excelente resposta humoralutilizando camundongos BALB/capresentando títulos iguais ou superiores a50.000. Apesar da boa resposta obtida,ocorreram casos de morte de camundongosimunizados, quando a última inoculação foirealizada pela via endovenosa. Além doestresse ocasionado pela inoculação, que émais dolorosa por ser caudal,provavelmente ocorreu choque anafiláticoapós as inoculações endovenosas, levandoos camundongos a óbito imediato. Para seevitar a perda de animais, a via deinoculação endovenosa do sonicado de C.fetus subsp. venerealis foi substituída pelavia subcutânea, que foi realizada no dorsodo animal, sendo menos traumática,diminuindo o estresse por ter uma absorçãomais lenta que a endovenosa. Desta formanão houve mais morte de animais e ostítulos de anticorpos após a imunizaçãopermaneceram nos mesmos patamares.
Segundo Marusich (1988), a utilização decélulas de baço congeladas para a fusãoseria uma ótima opção pois seria fácil ocongelamento e descongelamento decélulas de baço imunizadas. Haveriatambém diminuição da utilização,manutenção e estresse dos camundongosem função do esquema de imunizaçãoutilizados - um baço poderia resultar emvárias fusões, que poderiam ser feitas emmomentos diferentes e em intervalos curtos,não sendo preciso esperar 50 dias deimunização. Além da economia de tempo edinheiro, ainda poderia ser montado umbanco de células de baço de camundongoimunizado com o antígeno escolhido. Nopresente trabalho foram realizadas no totaloito fusões, sendo quatro fusões realizadascom a utilização de células do baçocongeladas (Marusich, 1988). Nenhuma dasquatro fusões com baço congelados tevesucesso na geração de hibridomas viáveis,não sendo possível a produção deanticorpos monoclonais.
No congelamento das células de baçorealizado no presente trabalho foi utilizado omeio RPMI 1640, diferente do meioHGDMEM indicado (Marusich, 1988), o quepode ter influenciado no resultado, pois oRPMI 1640 contém menor concentração deglicose e piruvato de sódio, que são fontesde energia imediata para as células após odescongelamento. Marusich (1988) utilizouHGDMEM suplementado com baixaconcentração de ��PHUFDSWRHWDQRO�� TXH� Máprepara a membrana celular facilitando afusão das células, insulina, que atua nometabolismo da glicose para fornecimentode energia para a célula, e sobrenadante decultura de células P388D1 (linhagem decélulas de macrófagos de camundongo) quecontém fator de crescimento paraplasmócito (PCT-GF), que estimulam ocrescimento celular. A não utilização nopresente trabalho de suplementos no meiode congelamento também pode tercontribuído para o inssucesso da utlizaçãode células de baço congeladas na produçãode anticorpos monoclonais. Entretanto,talvez o fator mais agravante tenha sido oarmazenamento das células do baço. No
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presente trabalho as células do baço apósserem processadas foram estocadas a –80ºC por mais de dois anos. Noarmazenamento das células a –80ºC emlugar da conservação a –196ºC emnitrogênio líqüido pode ter ocorrido aformação de cristais, que no momento dodescongelamento podem ter causado danosirreversíveis às células, resultando na falhada produção de células híbridas.
Quatro fusões foram realizadas com autilização do baço fresco. Destas quatrofusões, três fusões foram interrompidas porproblemas técnicos e contaminações. Oprotocolo da fusão utilizado (Harlow e Lane,1988, com modificações) foi bem sucedido,obtendo-se células híbridas produtoras deanticorpos. Nesta etapa não foi necessário autilização de células alimentadoras, pois ascélulas estavam com um excelentecrescimento e foi obtido número de célulassuficiente para se realizar a clonagem. Aclonagem realizada foi eficiente e foramobtidos clones produtores de anticorposmonoclonais específicos. A expansãodestes clones ficou comprometidadiminuindo o seu crescimento e algunsfatores de crescimento, elementos traços eco-cultivo foram testados.
A introdução do fator de crescimento EGF,que é um fator de crescimento para célulasendoteliais e não é específico para culturade hibridomas, teve pouca influência nocrescimento celular obtendo-se umcrescimento temporário, que não semanteve. Elementos traços, como atransferrina bovina, que é uma proteínatransportadora de íons, e o selenito de sódioformam em conjunto com a transferrina einsulina o ITS que é um complexo utilizadopara cultivos de hibridomas e cultivoprimários. Com a utilização desses fatoresde crescimento e elementos traços, foiobtido crescimento temporário doshibridomas. Após alguns dias houveredução da concentração celular, não sendopossível a expansão dos clones comnúmero suficiente de células paracongelamento.
A tentativa de se produzir anticorposmonoclonais em líqüido ascítico de
camundongos BALB/c, que propiciariam umambiente com todos os fatores para ummelhor crescimento dos hibridomas, eportanto, uma maior produção de anticorposmonoclonais, não foi produtiva. A produçãode líqüido ascítico foi provavelmentecomprometida em função do lentocrescimento das células híbridas, quedeveriam estar na fase logarítmica eproduzindo anticorpos in vitro no momentoda inoculação. Ocorreu uma produção deum líquido ascítico em pequena quantidade,que continha imunoglobulinas inespecíficas,que provavelmente foi uma reação aopristane utilizado para preparar oscamundongos para receberem os clonespré- selecionados.
Dentre os clones produtores de anticorposanti-C. fetus obtidos foram encontradosclones produtores de IgM e IgG, nassubclasses IgG1 e IgG2b, sendopredominantes os clones produtores deIgG1, o que já era esperado, em função doesquema de imunização e adjuvantesempregados.
Na caracterização da especificidade dosanticorpos monoclonais foi utilizado umpainel de bactérias escolhidas em função desuas prevalências e habitats. C. sputorumbiovar sputorum é comensal do prepúcio dotouro podendo ser encontrado nos lavadosprepuciais e, em algumas situações, serconfundido com C. fetus subsp. venerealis,ocasionando resultados falso-positivos nodiagnóstico da campilobacteriose genitalbovina (Vandamme, 2000). C. fetus subsp.fetus é habitante do trato gastrointestinal debovinos, mas também pode ser encontradono prepúcio de touros e como agente deaborto em bovinos (Thompson e Blaser,2000). C. fetus subsp. fetus são as bactériasgenética e antigênicamente mais próximasde C. fetus subsp. venerealis; além disto, aamostra utilizada, C. fetus subsp. fetusADRI 1812, é do sorogrupo A, ao qualpertencem todas as amostras de C. fetussubsp. venerealis (Stoessel, 1982;Vandamme, 2000). C. hyointestinalis subsp.hyointestinalis, que também é uma bactériaintestinal, é a espécie mais próximageneticamente de C. fetus (Wesley et al.,1991). Arcobacter skirrowii também pode
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ser encontrado no prepúcio do touros e jáfoi isolada de feto abortado de bovinos epode ser confundido com C. fetus subsp.venerealis (Vandamme, 1992; Vandamme,2000). Por estes motivos, o painel debactérias escolhido no presente estudocertifica que os anticorpos monoclonaisproduzidos não têm reações cruzadas comoutras bactérias da famíliaCampylobacteracae que podem estarpresentes no prepúcio de touros ou emfetos bovinos abortados.
Após a caracterização quanto aespecificidade dos clones por ELISAindireto, foi realizado "western blotting" comsobrenadantes coletados dos clones a fimde caracterizá-los quanto à suaespecificidade em relação aos componentesantigênicos da bactérias C. sputorum biovarsputorum LMG 6647 e C. fetus subsp.venerealis NCTC 10354.
No "western blotting" realizado comsonicado de C. sputorum biovar sputorumnenhum anticorpo monoclonal reagiu,confirmando a especificidade dos clonesselecionados. Os anticorpos monoclonaisproduzidos por todos os clonesreconheceram uma mesma proteína, sendoaltamente específicos para uma proteínacom um alto peso molecular,aproximadamente 148 kDa, no antígenosonicado de C. fetus subsp. venerealisNCTC 10354. Esta proteína reconhecidapode ser uma proteína de membranaexterna que forma um arranjo protéicoconstituído de proteínas de alto pesomolecular, variando de 97 a 149 kDa,denominada "surface array protein" (SAP)(Blaser et al., 1994; Garcia et al., 1995). Aproteína SAP forma uma "cápsula" protéicaque recobre todo o lipopolissacáride de C.fetus e é imunodominante (Thompson eBlaser, 2000). A imunização realizada comantígeno sonicado, que apresentava 40%de células bacterianas inteiras, associada àimunodominância da proteína SAP podemter sido responsáveis pelo obtenção declones que só reconhecem esta proteína.
O resultado obtido condiz com os resultadosde Dworkin e Blaser (1997), que analizandolisado de C. fetus em um gel de
poliacrilamida SDS-PAGE, mostrou apresença de bandas dominantes, sendoproteínas de camada externa. A proteínaSAP de amostra do sorotipo A tem a mesmaporção amino-terminal, composição similarde aminoácidos e ponto isoelétricosemelhantes. A variação na proteína SAPem C. fetus pode ser responsável pelavariação antigênica observada in vitro(Wang et al., 1993).
6 – CONCLUSÕES
Em função dos resultados obtidos pode-seconcluir que:
1. Não foi possível a produção deanticorpos monoclonais a partir decélulas de baço congeladas a -80ºC emmeio RPMI 1640;
2. A utilização da via subcutânea na últimainoculação dos camundongos para aimunização não interferiu na produçãode anticorpos monoclonais;
3. Foram produzidos anticorposmonoclonais específicos contra C. fetussubsp. fetus sorotipo A (M7 e M94), C.fetus subsp. venerealis (M28 e M93) eanticorpos monoclonais quereconhecem antígenos conservados nosgêneros Arcobacter e Campylobacter(M2, M21, M22, M37, M39, M41, M42,M44, M45, M60, M76);
4. anticorpo monoclonal M45, quereconhece antígenos conservados nosgêneros Arcobacter e Campylobacter,poderá ser uma ferramenta paracaracterização de gênero.
5. Os isotipos encontrados nos cloneprodutores de anticorpos monoclonaiscontra C. fetus foram IgG1 e IgM, sendoo mais freqüente IgG1;
6. Todos os anticorpos monoclonaisobtidos, específicos para C. fetus,reagiram com uma proteína de C. fetussubsp. venerealis de aproximadamente148 kDa.
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7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXO I
Certificado de aprovação pela
Comissão de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais(Cetea/UFMG)
Protocolo no 124/04