produÇÃo, purificaÇÃo, clonagem e aplicaÇÃo de enzimas lÍticas

Quim. Nova, Vol. 28, No. 5, 871-879, 2005

Rev

iso

*e-mail: [email protected]

PRODUO, PURIFICAO, CLONAGEM E APLICAO DE ENZIMAS LTICAS

Luciana Francisco Fleuri* e Hlia Harumi SatoDepartamento de Cincia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas,CP 6121, 13083-862 Campinas - SP

Recebido em 7/6/04; aceito em 3/3/05; publicado na web em 11/7/05

PRODUCTION, PURIFICATION, CLONING AND APPLICATION OF LYTIC ENZYMES: Lytic enzymes such as -1,3 glucanases,proteases and chitinases are able to hydrolyse, respectively, -1,3 glucans, mannoproteins and chitin, as well as the cell walls ofmany yeast species. Lytic enzymes are useful in a great variety of applications including the preparation of protoplasts; the extractionof proteins, enzymes, pigments and functional carbohydrates; pre-treatment for the mechanical rupture of cells; degradation ofresidual yeast cell mass for the preparation of animal feed; analysis of the yeast cell wall structure and composition; study of theyeast cell wall synthesis and the control of pathogenic fungi. This review presents the most important aspects with respect to lyticenzymes, especially their production, purification, cloning and application.

Keywords: -1,3 glucanases; lytic proteases; chitinases.

INTRODUO

A parede celular da levedura Saccharomyces cerevisiae for-mada por trs componentes principais: glucana, um polmero de-1,3 e -1,6 glicose (48-60%), mananaprotenas (20-23%) equitina, um polmero de -1,4 N-acetilglicosamina (0,6-2,7%)1-3. Aparede celular possui duas camadas principais: uma externa, compos-ta de mananaprotenas e uma interna, de glucana4,5.

Muitos microrganismos lisam a parede celular de leveduras.As enzimas envolvidas na lise de leveduras so -1,3 glucanases,-1,6 glucanases, mananases, proteases e quitinases. Essas enzimasagem sinergicamente na lise da parede celular, mas somente duasso essenciais para o rompimento da clula: a protease ltica espe-cfica, que degrada a camada externa de mananaprotena e a -1,3glucanase ltica, que degrada a camada interna de glucana6-8.

As enzimas que lisam a parede celular de leveduras tm apli-caes biotecnolgicas na preparao de protoplastos para melho-ramento gentico de leveduras e no aproveitamento de massa celu-lar de levedura para extrao de protenas, enzimas e pigmentos. Alise enzimtica de clulas de microrganismos tambm tem poten-cial de aplicao no tratamento de massa celular de levedura resi-dual de indstrias de fermentao para preparao de rao ani-mal, na obteno de carboidratos funcionais da parede celular(glucana e manana) e no pr-tratamento para ruptura mecnica declulas aumentando a eficincia e reduzindo o requerimento deenergia9.

As enzimas lticas tm sido utilizadas tambm como ferramentapara determinao da composio da parede celular de leveduras eno estudo do mecanismo da sntese da parede celular para controlede leveduras patognicas.

As enzimas lticas so capazes de lisar a parede celular deSaccharomyces cerevisiae, Candida sp. e outros gneros de leve-duras, o que amplia o campo de utilizao dessas enzimas.

Este trabalho tem como objetivo revisar os principais aspectosrelacionados produo, purificao, clonagem e aplicaes dasenzimas lticas.

COMPOSIO DA PAREDE CELULAR DE LEVEDURAS

A parede celular de leveduras tem muitas funes: proteofsica, estabilidade osmtica, suporte de enzimas, adeso clula/clula e barreira de permeabilidade seletiva10. Alm disso, promo-ve rigidez e transporte de nutrientes para o citoplasma, proporcio-nando a integridade, o metabolismo e o crescimento celular. Constituicerca de 15 a 25% da massa seca da clula e no uma estruturaesttica e sim, uma estrutura em constante crescimento e mudana. Oscomponentes da parede celular so sintetizados e unidos entre si; es-truturas especializadas, como os septos so formados em sincroniacom o crescimento e diviso celular11.

A parede celular de leveduras formada por uma camada demananaprotenas que sobrepe a camada de glucana, o que expli-caria a resistncia das clulas vivas de leveduras ao ataque dasmisturas enzimticas elaboradas por alguns microrganismos4,5,12.

A parede celular de Saccharomyces sp. formada por trscomponentes principais: glucana, um polmero de -1,3 e -1,6glicose (48-60%), mananaprotenas (20-23%) e quitina, umpolmero de -1,4 N-acetilglicosamina (0,6-2,7%)1-3. Asmananaprotenas esto localizadas na parte externa da paredecelular e so compostas por polmero de manose com ligaes -1,2, -1,3 e -1,6, que esto covalentemente ligadas a peptdeosformando glicopeptdeos13-15.

Kapteyn et al.15, Pololo e Vai16 e Kapteyn et al.17 relataram queas protenas, -1,6 glucanas, -1,3 glucanas e quitina da paredecelular das leveduras esto interconectadas por ligaes covalentes.

A parede celular uma estrutura dinmica ajustvel durante ociclo celular e em resposta s condies ambientais como nutrien-tes, disponibilidade de O2, temperatura e pH11,18. Perturbaes naparede celular de leveduras desencadeiam mecanismos de reparoque reorganizam toda a estrutura molecular, para preservar a inte-gridade da clula18,19.

Mananaprotenas

A camada de mananaprotenas tem funo de proteger a clulacontra fatores externos e responsvel pela porosidade da paredecelular, enquanto que a camada de glucana responsvel pela es-

872 Quim. NovaFleuri e Sato

trutura da parede celular perante choques mecnicos e desequil-brios osmticos7,11.

Cabib et al.11 sugeriram a existncia de ligaes cruzadas entrepolissacardeos e mananaprotenas e que a -1,3 glucana e quitinaesto conectadas por uma ligao -1,4 entre um grupo redutorfinal de N-acetilglicosamina da quitina e um grupo no redutor daglicose da glucana. Os autores verificaram tambm a presena deum ncleo central de mananaprotena, em que a quitina e a -1,3glucana esto conectadas preferencialmente a cadeias curtas de -1,6 glucanas. H evidncias que as mananaprotenas esto retidasna parede celular por ligaes indiretas com as -1,3 glucanas eestas, ligadas preferencialmente a cadeias curtas de -1,6 glucanase, provavelmente, pores residuais de glicosilfosfatidilinositol.

Segundo Mrsa et al.20,21, a parede celular de Saccharomycescontm mais de 20 tipos de mananaprotenas que desempenhampapis diferentes na construo, preservao, modificao da es-trutura e interao das clulas com suas adjacncias como, por ex.,as interaes intercelulares durante a aglutinao ou floculao.As mananaprotenas podem ser divididas em trs grupos: prote-nas unidas por pontes dissulfeto ou ligaes no covalentes compolissacardeos estruturais da parede (a maioria dessas protenas apre-sentam atividades enzimticas e podem ser extradas por meio de aque-cimento com SDS e mercaptoetanol ou pelo ditiotreitol); protenasligadas covalentemente principalmente s -glucanas e que podemsomente ser extradas pela lise da parede celular com diferentes prepa-raes de glucanases, como zymolyase ou laminarinase (a funo fisio-lgica dessas protenas no conhecida), e, protenas, provavelmente,ligadas de forma covalente parede celular e que podem ser extradascom NaOH 30 mM (quatro protenas pertencentes a esse grupo estosendo estudadas mais detalhadamente).

-1,3 glucana

Manners et al.22 descreveram a -1,3 glucana insolvel em l-cali contendo 36% de ramificaes -1,6 como o principal com-ponente estrutural da parede celular de leveduras. Estudos micros-cpicos mostraram a agregao destas microfibras na parte internada parede celular. A glucana solvel em lcali tem estrutura qumi-ca semelhante insolvel, entretanto, apresenta maior nmero deramificaes -1,6. A glucana lcali-solvel representa aproxima-damente 20% da parede celular e a anlise estrutural revelou apresena de 8085% de ligaes -D-1,3; 8 12% de ligaes -D-1,6 e 34% de resduos de ramificaes ligados por C-1, C-3 eC-6.

Kopeck et al.23 estudaram a ultraestrutura da parede celularde isolados de S. cerevisiae durante as fases exponencial e estacio-nria de crescimento, usando -1,3 glucanases. Os autores obtive-ram duas importantes informaes: as regies de brotamento deleveduras so estruturas resistentes ao efeito dessa enzima e oscomponentes fibrilares das leveduras so constitudos de glucanascom ligaes -1,3, uma vez que as microfibrilas desapareceramaps tratamento com -1,3 glucanase. Os autores, ento, relataramque as molculas de glucana permitem a associao das cadeiasmais afastadas de polissacardeos com outras molculas de ramifi-caes superficiais, dando origem a um componente fibrilar cont-nuo.

Estudos da parede celular de leveduras com a utilizao demicroscpio eletrnico permitiram a Kreger e Kopeck24 confir-marem a posio interna da frao de glucana.

Segundo Hinton e Pressey25, as glucanas podem ser encontra-das em microrganismos e plantas superiores como principais cons-tituintes da parede celular, como material citoplasmtico ou de re-serva vacuolar e como substncias extracelulares. As glucanas so

polmeros no cclicos de anidroglicose unidos por ligaes -1,3glicosdicas contendo ramificaes -1,6, as quais pertencem a umadas classes mais abundantes de polissacardeos.

A parede celular de Saccharomyces cerevisiae contm duas fra-es de -1,3 glucana (uma solvel em lcali e outra insolvel) euma frao de -1,6 glucana com poucas ligaes -1,3 (insolvelem lcali e solvel em solues diludas de cido). As -1,3 glucanastm tamanho estimado de 1.500 resduos de glicose, enquanto queas -1,6 glucanas so menores, apresentando de 150 a 200 resdu-os10. Muitos estudos tm mostrado que estes componentes, depoisde serem depositados na parede, so rearranjados para formaremum complexo integrado. Os rearranjos podem ocorrer atravs deglicosiltransferases, as quais introduzem ramificaes nos polis-sacardeos lineares. H evidncias de ligaes entre manana-protenas e quitina. A insolubilidade da glucana em lcali explicadapela presena de ligaes covalentes entre glucana e quitina, umavez que a degradao da quitina por quitinase dissolve completa-mente a glucana em lcali. Foi demonstrado que ocorre a forma-o de ligao -1,6 glicosdica entre glucana e quitina na paredecelular de Candida albicans, mas em Saccharomyces cerevisiae anatureza da ligao desconhecida2.

Quitina

A quitina um polmero de N-acetilglicosamina com ligaes-1,4 encontrada em carapaas de insetos, parede celular de fun-gos e crustceos26. Estudos de difrao de raio-X demonstraramque se refere a uma estrutura cristalina altamente ordenada e inso-lvel em gua27.

Na maioria dos fungos a quitina o maior componente estrutu-ral da parede celular, sendo, portanto, susceptvel a inmeras esp-cies de bactrias, actinomicetos e fungos que podem agir comoantagonistas devido produo de enzimas quitinolticas28. osegundo biopolmero mais abundante depois da celulose e est ge-ralmente ligada a outros polissacardeos e protenas26.

Em leveduras, a quitina encontrada predominantemente emseptos primrios e em volta do crculo de constrio entre a clulame e a jovem. Cerca de 90% da quitina est localizada na cicatrizde brotamento e o restante, na parede celular2.

PRODUO DE ENZIMAS LTICAS

As -1,3 glucanases, proteases e quitinases esto agrupadas naclasse das hidrolases.

A -1,3 glucanase (E.C. 3.2.1.39) (1,3--D-glucana glucano-hidrolase), tambm denominada de glucana-endo-1,3--D-glicosidase, catalisa a reao de hidrlise das ligaes -D-glicosdicas da -1,3 glucana. Atua sobre laminarina, paramylonae pachymana, quando utilizadas como substrato (Figura 1).

A protease (3.4.21.12) tambm denominada de -endopeptidaseltica, catalisa a reao de hidrlise de protenas. Atua preferencialmen-te sobre elastina e em Ala+ e Val+ da parede celular (Figura 3).

A quitinase (3.2.1.14) {Poli[1,4-(N-acetil--D-glicosamina)]glucanoidrolase} catalisa reaes de hidrlise das ligaes -1,4de N-acetil--D-glicosamina da quitina e de quitodextrinas (Figu-ra 2).

Muitos microrganismos, como bactrias, fungos e levedurasso capazes de produzir -1,3 glucanases, proteases e quitinases,que hidrolisam os componentes da parede celular de leveduras ecausam a lise celular. A maioria deles necessita da presena deindutores para sntese de enzimas de interesse (Tabela 1).

As bactrias Cytophaga johnsonii29, Arthrobacter luteus30,Oerskovia sp. CK31,32, Rarobacter faecitabidus33, Rarobacter

873Produo, Purificao, Clonagem e Aplicao de Enzimas LticasVol. 28, No. 5

incanus34, Cellulomonas cellulans 191 (Cellulosimicrobiumcellulans)35,36 produzem enzimas -1,3 glucanases e proteases ca-pazes de lisar clulas de leveduras (Tabela 2).

Estes microrganismos tm sido isolados a partir de lodo ativa-do de sistemas de tratamento de gua de indstrias de alimentos ebebidas alcolicas37.

Bacon et al.29 relataram que o microrganismo Cytophagajohnsonii produziu enzimas capazes de lisar clulas de leveduraspr-tratadas com tiol na presena de clulas autoclavadas ou trata-das com lcali, parede celular e glucana de levedura como indutores.A purificao do sobrenadante da cultura atravs de cromatografiaem coluna mostrou a presena de dois tipos de endo--1,3glucanases e muitas -1,6 glucanases.

Kitamura e Yamamoto38 relataram que o microrganismoArthrobacter luteus, isolado de resduos de cervejarias, cresceu emmeio contendo clulas de levedura ou -1,3 glucana e produziuenzimas com atividade de lise de leveduras. O conjunto destasenzimas foi denominado zymolyase e requeria polmeros linearesde glicose com ligaes -1,3 como substrato especfico. Os auto-res verificaram que o polissacardeo termo-tratado pachymana e aglucana de levedura foram hidrolisados por zymolyase a unidadesde laminaripentaose.

Kobayashi et al.46 estabeleceram um mtodo para produo epreparao de um complexo enzimtico que degrada parede celu-lar de leveduras produzido por espcies de Rhizoctonia, em escalacomercial. A produo da enzima bruta em p, em batelada de 80kg, mostrou-se vivel. Esta preparao enzimtica foi avaliada parauso industrial.

Yamamoto et al.47 isolaram microrganismos que lisam levedu-ras a partir do lodo ativado de tanques de sistemas de tratamentode gua de indstrias de alimentos e de bebidas alcolicas. Dezlinhagens que puderam crescer em meio nutriente normal perten-ciam aos gneros Streptomyces sp., Oerskovia sp. e Bacillus sp.

Yamamoto et al.48 isolaram trinta e seis linhagens de bactriasque lisam leveduras de lodo ativado de resduos de tratamento degua. Estes microrganismos aderiram, aglutinaram e lisaram s clu-las viveis de todas as espcies de Saccharomyces e Hansenulla e al-gumas espcies de Candida. Esses microrganismos no aderiram oulisaram clulas viveis de Rhodotorula, Cryptococcus e Trichosporon.

Andrews e Asenjo4 verificaram que as enzimas -1,3 glucanase eprotease do sistema ltico da bactria Oerskovia xanthineolytica LL-G109 so capazes de lisar e romper totalmente as clulas de leveduras.Esta bactria apresentou taxa de glucanase-protease maior que a de ou-tras cepas. Quando cultivada em sistema contnuo, a bactria Oerskoviaxanthineolytica apresentou produtividade e concentrao de enzimasmaiores que quando cultivada em batelada. O sistema de enzimas lticasest sujeito represso catablica pela glicose e mostrou-se induzvelpela glucana da levedura. Na fermentao da linhagem Oerskovia sp.em cultura contnua, a glicose pode ser utilizada como meio de cresci-mento com concentrao relativamente baixa do indutor.

Yamamoto et al.34 isolaram no Brasil, linhagens de bactrias quelisam leveduras a partir de solo, flores, frutos e outras fontes. Destaslinhagens, 46 foram identificadas como Rarobacter. Essas linhagensde Rarobacter apresentaram a capacidade de se aglutinarem com c-lulas viveis de S. cerevisiae e exigiam composto heme para cresci-mento aerbico. Outras quatro bactrias gram positivas no exigiamgrupo heme para crescimento aerbico; duas delas foram identificadascomo Oerskovia, uma como Arthrobacter e a quarta no foiidentificada.

Santos35 estudou a produo de -1,3 glucanase e protease pormicrorganismos que lisam a parede celular de levedura. As linha-gens FXX e Cellulosimicrobium cellulans 191 apresentaram maiorproduo de -1,3 glucanase, enquanto que a linhagem Oerskovia sp.

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OH

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H

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CH2OH

H

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n

OLigao -1,3

Glicose

Glicose

-1,3 glucanase(

H2O

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H

Glicose

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H

Glicose

-1,3 glucana

+

Figura 1. Hidrlise da -1,3 glucana pela -1,3 glucanase

OH

H

OH

NHH

OH

CH2OH

H

N-acetilglicosamina

Quitinase

(H2O

C

CH3

O

O

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CH2OH

H

C

CH3

O

N-acetilglicosamina

Ligao -1,4

n

Quitina

OH

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CH2OH

H

C

CH3

O

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CH2OH

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C

CH3

O

+

N-acetilglicosamina

N-acetilglicosamina

Figura 2. Hidrlise da quitina pela quitinase

OH

OH

H

OH

HH

CH2OH

H

Protease

Ltic

a( H2O

OLigao -1,2

OH

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H

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O Ligao -1,3

OH

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CH2

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H

Ligao -glicosdica

NH

CH

C

CH2

O

Ligao -1,6Manose

Manose

Manose

Ser

Val

Ala

Trp

Tyr

Mananaprotena

Ligao

peptdica

Mananaprotena de baixo peso molecular + Trp

Ala

Val

Trp

+

Aminocidos

Peptdeos

n

Trp

Ligao

peptdica

Ligao

peptdica

Val

Ala

Trp

Ligao

peptdica

Ligaopeptdica

Figura 3. Hidrlise da mananaprotena pela protease ltica


Tabela 1. Microrganismos produtores de enzimas lticas e indutores utilizados para produo das enzimas lticas

Microrganismo ltico Fonte de carbono (indutor) Enzima(s) produzida(s)Cythophaga johnsonii29 Parede celular de levedura de panificao -1,3 glucanase e -1,6 glucanaseRhizopus chinensis R-6914 Clulas de leveduras de panificao ou farelo Endo e exo -1,3 glucanaseOerskovia xanthineolytica6 Glucana insolvel em meio alcalino, levedura -1,3 glucanase e protease alcalina

autoclavada e glicose

Streptomyces rutgersensis H-4639,40 Glicose e extrato de soja Enzimas bacteriolticasOerskovia sp.8 Glucana e parede celular de leveduras -1,3 glucanaseVrias espcies de Acremonium e Glicose e laminarina ou pustulana -1,3 glucanaseCephalosporium41,42

Trichoderma harzianum43 Parede celular purificada 3 isoformas de -1,3 glucanaseQuitina, quitosana, N-acetilglicosamina e laminarina 1 isoforma de -1,3 glucanase

Trichoderma asperellum44 Parede celular de Rhizoctonia solani -1,3 glucanasesPaecilomyces lilacinus45 Gema de ovo Proteases

Quitina Quitinases

Tabela 2. Sistemas enzimticos lticos de microrganismos

Microrganismos lticos Enzimas pH timo Temperatura Microrganismos lisadostima (o C)

Arthrobacter luteus, -1,3 glucanase 5,0-6,5 45-60 Saccharomyces sp., Candida sp.,Oerskovia xanthineolytica Protease 9,0-10,0 35 Hansenula sp., Pichia sp. e outras leveduras(zymolyase)6,49,50 Atividade na clula 7,5 30-35

de levedura integral

Arthrobacter sp. G151 Saccharomyces fragilis NCYC 587,Torulopsis colliculosa NCYC 141,Candida utilis NCYC 707

Cellumonas cartae 19135 -1,3 glucanase 4,5 55 Kluyveromyces marxianus NCYC587,Protease 8,0 50 Pachysolen tannophilus NRRL 2460,

Atividade na clula 7,07,5 30-35 Saccharomyces capensis NCYC 761, de levedura integral S.cerevisiae KL 88, Candida glabrata

NCYC 388, Debaryomyces vanrij NCYC 577Cytophaga NCIB 94974 Atividade na clula 9,0 45-55 Saccharomyces cerevisiae, Bacillus sp.,

de levedura integral Corynebacteria, E. coli

Oerskovia CK31,32 -1,3 glucanase 35-40 Saccharomyces cerevisiaeProtease 60

Atividade na clula 9,0 35-40de levedura integral

Rhizoctonia sp.46 -1,3 glucanase 5,5 55-60 Candida sp., Saccharomyces sp.,Protease 6,5 40 Hansenula sp.

Atividade na clula 6,0 40de levedura integral

Streptomyces sp. 122852 -1,3 glucanase 5,5-6,0 50-55 Candida utilis, Saccharomycescarlsbengensis, Schizosaccharomyces pombe

4 apresentou maior produo de protease. A maior produo de -1,3 glucanase foi verificada em meio de cultivo contendo paredecelular de levedura extrada mecanicamente como indutor, enquantoque a maior produo de protease ocorreu com levedura autoclavada,lavada e liofilizada.

Gacto et al.53 estudaram o crescimento do actinomicetoMicromonospora chalcea, em meio contendo laminarina como fontede carbono para induzir a produo de um sistema de enzimas

extracelulares capazes de lisar clulas de vrias espcies de leve-dura.

Fleuri54 estudou a produo de -1,3 glucanases, proteases lticase quitinases pelas linhagens B1, B22, B26, FXX, Oerskovia sp. 4 eCellulosimicrobium cellulans 191, em meios de cultura contendodiferentes indutores e aplicao na lise de leveduras. A maior pro-duo de protease ltica foi obtida com as linhagens bacterianas B26 e191, em meio de cultivo contendo 8% de levedura seca. As linhagens


B1 e 191 apresentaram maior produo de -1,3 glucanase entre aslinhagens testadas, em meio de cultivo contendo 1% de parede celularde levedura; enquanto que a linhagem 191 apresentou maior pro-duo de quitinase entre as linhagens testadas, em meio de cultivocontendo 1,5% de quitina neutralizada. As preparaes de -1,3glucanase das linhagens B1 e C. cellulans 191 obtidas dosobrenadante do meio de cultura, por meio de fracionamento comsulfato de amnio, apresentaram atividade de lise das levedurasSaccharomyces cerevisiae KL-88, Kluyveromyces marxianus NCYC587, Hansenula mrakii NCYC 500 e Candida glabrata NCYC 388,sendo que Kluyveromyces marxianus e Hansenula mrakii apresen-taram-se mais susceptveis s -1,3 glucanases que a linhagem deSaccharomyces cerevisiae. Entre as linhagens testadas, a leveduraCandida glabrata mostrou-se mais resistente atividade de lisedas -1,3 glucanases.

O extrato bruto de quitinase, obtido a partir do cultivo deTrichoderma harzanium TUBF 781 em fermentao semi-slidaem meio otimizado, mostrou atividade antifngica contra uma s-rie de linhagens de fungos selvagens, como Aspergillus sp., Rhizopussp. e Mucor sp., mostrando maior eficcia contra Aspergillus niger55.

Kenji et al.56 estudaram a produo de trs endoquitinases porBacillus stearothermophilus CH-4 em meio de cultivo contendoquitina e verificaram que as enzimas responsveis pela degradaoda quitina so quitinase A (endo-ao), quitinase B (exo-ao) eN-acetilglicosaminidases.

A lise dos componentes da parede celular de leveduras pelasenzimas produzidas por microrganismos pode variar dependendodos estgios de crescimento celular57 e conforme o gnero e a es-pcie da levedura58. A lise enzimtica das clulas de levedura acon-tece em passos progressivos e depende do sinergismo entre proteasee -1,3 glucanase. A protease ataca a camada externa de manana-protena, permitindo o acesso da -1,3 glucanase camada de -glucana, implicando no rompimento celular por diferena de pres-so osmtica6,9,51,59,60.

Os microrganismos do gnero Arthrobacter produzem dois tiposde -1,3 glucanases. A glucanase I causa lise em clulas jovens napresena de -mercaptoetanol e 0,6 M de KCl como estabilizadorosmtico. A glucanase II similar encontrada em fluido de culturade Bacillus circulans. Na dissoluo da parede celular de leveduraspor glucanase I, a enzima ataca a glucana liberando fragmentos devrios tamanhos que servem como substratos para a glucanase II. As-glucanases so estveis em ampla faixa de pH, mas perdem rapida-mente a atividade em temperaturas acima de 60 C; apresentam pHtimo de atividade na faixa de 5,5 a 6,530.

Obata et al.32 relataram que a linhagem Oerskovia sp. CK produztrs tipos de enzimas designadas F-L, F-0 e F-2 que esto envolvidas nalise da parede celular de leveduras. A enzima F-L mostrou alta atividadeltica em clulas viveis de levedura, mas fraca atividade sobre a glucanade levedura. As enzimas F-0 e F-2 mostraram baixa ou nenhuma ativi-dade ltica, mas alta atividade de -1,3 glucanase. Os resultados eviden-ciaram que as enzimas F-0 e F-2 no so eficientes na lise de leveduras,devido inacessibilidade espacial camada de glucana. No entanto, otratamento com a enzima F-L com soluo alcalina ou com reagentesredutores modificaram a clula, permitindo o acesso de F-0 e F-2 ca-mada de glucana e possibilitando a lise da clula; foi observado efeitosinrgico entre as enzimas F-L e F-0 ou F-L e F-2. A protease F-L pro-duzida por Oerskovia sp. CK possui alto efeito sinrgico com a enzima-1,3 glucanase na lise de leveduras.

Rowley e Bull51 estudaram uma linhagem de Arthrobacter comalta capacidade para lisar clulas vivas de Saccharomyces fragilis.O complexo enzimtico extracelular produzido pelo microrganismocontinha -1,3 glucanase, mananase, manose hidrolase e atividadeproteoltica.

A zymolyase, preparao comercial para lise da parede celularde leveduras, obtida a partir Arthrobacter luteus. Esse microrganis-mo foi reclassificado como Oerskovia xanthineolytica61. A zymolyase uma preparao enzimtica composta de duas fraes: azymolyase A, que uma -1,3 glucanase e a zymolyase B, que uma protease alcalina e provavelmente tambm uma serina protease.A -1,3 glucanase (zymolyase A) no diminui a turbidez nem onmero de clulas de uma suspenso de leveduras. A protease(zymolyase B) diminui a turbidez, mas no altera o nmero declulas da suspenso. No entanto, a ao cooperada de zymolyaseA e B tem como efeito alta atividade ltica, lisando completamenteas clulas de leveduras62.

A bactria Rhizoctonia solani produz enzimas lticas capazes delisar a parede celular de leveduras. As enzimas foram separadas emquatro fraes: L-1, L-2, L-3 e L-4. Trs delas foram consideradas -1,3 glucanases lticas. A frao L-3 mostrou alta atividade de protease.A protease purificada L-3 sozinha, assim como as outras -1,3glucanases lticas foram capazes de lisar clulas intactas e parede celu-lar isolada de S. cerevisiae. A separao completa da protease ltica deRhizoctonia solani no foi importante apenas para esclarecer a aohidroltica da parede celular de levedura, mas tambm para elucidar aestrutura da parede63.

Ryan e Ward64 verificaram que a enzima -1,3 glucanase deBasideomycete aphyllophoroles possui alta atividade ltica em le-veduras. Quando usada em combinao com papana na lise deleveduras, 90 a 95% da massa seca das leveduras foram solubili-zadas. Em comparao com estudos envolvendo trs -1,3glucanases, a atividade de laminarinase no foi bem correlacionadacom a atividade ltica em leveduras. O mecanismo da -1,3 gluca-nase do B. aphyllophoroles em glucana isolada de levedura foi ca-racterizado pela alta taxa de produo de laminaribiose.

PURIFICAO DE ENZIMAS LTICAS

As preparaes enzimticas comerciais como a lyticase deArthrobacter luteus e lyticase recombinante expressa em Escherichiacoli para lise de leveduras e para obteno de protoplastos so en-contradas nas formas bruta e parcialmente purificada (Tabela 3).

CLONAGEM

A clonagem ultimamente tem sido uma ferramenta muito im-portante e til para enzimologistas e outros pesquisadores. Em re-lao s enzimas lticas, a disponibilidade de seqncias nucleo-tdicas e, conseqentemente, de famlias de genes, possibilita ummaior entendimento do papel e do modo de ao dessas enzimasna degradao da parede celular de leveduras, alm de possibilitara comparao com enzimas de outros organismos. Estudos maisapurados sobre as relaes estruturais e funcionais dessas enzimaspermitem obter enzimas lticas apropriadas para permeabilizaocelular e recuperao seletiva de protenas das clulas de levedu-ras, no somente de S. cerevisiae, mas tambm de leveduras cadavez mais importantes no ramo biotecnolgico, como Hansenulapolimorpha, Pichia pastoris, entre outras74. Devido importnciadas -1,3 glucanases, muitos genes que codificam a produo des-ta enzima tm sido identificados, clonados e transferidos em ummicrorganismo competente. Tcnicas de clonagem de DNA com-plementares (DNAc) combinadas com mecanismos de regulaoda transcrio, utilizao de vetores plasmidiais especialmenteprojetados e transformao em E. coli, tambm tm sido muito utili-zadas para super produo de enzimas de interesse (Tabela 4).

APLICAES


Uma grande quantidade de produtos podem ser isolados e purifi-cados da clula microbiana com auxlio da lise enzimtica como, porex. peptdeos, polissacardeos, protenas recombinantes, cidosnuclicos, pigmentos, enzimas, lipdeos, entre outros. Alm do po-tencial de aplicao na preparao de protoplastos, fuso celular etransformao de leveduras, pode-se ressaltar sua aplicao na pro-duo de enzimas intracelulares, preparao do polissacardeoglucana, extrao alcalina de protenas de leveduras, pr-tratamentopara lise mecnica de clulas em Dyno-Mill, produo de extratode levedura, extrao de pigmentos de leveduras vermelhas e lisede microrganismos que provocam a crie dentria8. A lise de clu-

las de leveduras com enzimas permite seletividade na liberao deprodutos, independe da escala e pode ser realizada em condiesde pH e temperatura que no implicam na desnaturao de produ-tos celulares de interesse.

As enzimas lticas podem ser utilizadas para lise da parede celularde leveduras para diferentes finalidades, como preparao de ex-trato de levedura80; aumento da eficincia de desintegrador mec-nico para extrao de compostos intracelulares e ligados clula46;aumento da digestibilidade de rao animal46,81; extrao do pig-mento vermelho astaxantina de Phaffia rhodozyma82; preservaode alimentos4,5; obteno de fonte de protena unicelular para ani-mais e humanos83; aumento do valor alimentcio de cereais quando

Tabela 3. Purificao e caracterizao de enzimas lticas

Propriedades bioqumicas daenzimaa- pH timo: substrato

Microrganismo Enzima purificada Mtodos de purificao e Massa b- temperatura timaeletroforese molecular c- estabilidade

(KDa) d- pIe- K

m: substrato

f- Vm: substrato

Oerskovia xanthineolytica -1,3 glucanase SDS-PAGE 27,19 b- 65 oCLL-G10965 c- 55 o C/ 30 min

Oerskovia xanthineolytica -1,3 glucanase Colunas DEAE-Sephacel, 40 a- 7,5: laminarinaTK-166 DEAE-Toyopearl 650M e a- 5,5: glucana de levedura

Bio-Gel P-2 d- 6,5

Trichoderma harzanium67 Endo--1,3 Coluna Sephacryl 300R e 17 d- 5,0glucanase focalizao isoeltrica

Trichoderma harzanium68 -1,3 glucanase Colunas Sephacryl S-200, 29 a- 4,4Fenil-Sepharose e CM-Sepharose, b- 50 oCSDS-PAGE e- 1,72 mg/mL: laminarina

f- 3,10 U/mL: laminarina

Cellulomonas cellulans -1,3 glucanase Ultrafiltrao e coluna de 17,1 a- 5,5 - 6,519136 CM-Sepharose CL-6B, b-55 oC

SDS-PAGE c- pH 5,5 6,5

Cellulomonas cellulans -1,3 glucanase Ultrafiltrao e coluna de 57 -19169 DEAE-Sepharose, SDS-PAGE

Bacillus clausii70 -1,3 glucanase Colunas DEAE-Sepharose FF 71 c- pH 5,3 11,5e Sephacryl S-200HR,SDS-PAGE

Cellulomonas flavigena quitinase Colunas Q cartridge e Superdex a- 10,0NTOU71 75HR

Filtrao em gel 34,2 b- 50 oCSDS-PAGE 32,5 c- pH 6,0 10,0 at 45 oC

Metarhizium anisopliae72 quitinase Precipitao com sulfato de 30 a- 4,5 5,0amnio e coluna b- 40 - 45 oCDEAE-Sephacel e- 0,537 mmol:p-nitrofenol-

-diacetilquitobiosef- 4,86 nmL/mL/min: p- nitrofenol--diacetil- quitobiose

Trichoderma harzanium quitinase Precipitao com sulfato de a- 3,5T19873 amnio, cromatografia de b- 50 oC

afinidade com quitina d- 7,4Filtrao em gel 28SDS-PAGE 27,5


se utilizam altas propores de polissacardeos sem amido84; ob-teno de mananas de diferentes fontes que apresentam atividadeantioxidante e antimutagnica85; melhoramento da clarificao efiltrao de vinhos86; sntese de novos substratos para -1,3 e -1,4glucanases por meio de reaes de transglicosilao catalisadaspor -1,3 glucanases85; reduo da viscosidade do produto final noprocesso de fabricao de cerveja81; elucidao da estrutura, com-posio e mecanismo da sntese da parede celular de levedu-ras15,16,18,20,21,88-91.

As enzimas quitinolticas apresentam inmeras aplicaesbiotecnolgicas no ramo da indstria e agricultura. As quitinasespodem ser utilizadas no controle de fungos patgenos de plantas einsetos. H tambm, um crescente interesse na produo dequitinooligossacardeos biologicamente ativos atravs da utiliza-o das quitinases. Essas enzimas podem ainda ser aplicadas naproduo de fonte de protena unicelular, preparao de enzimasmicolticas e na formao de protoplastos fngicos92.

Alguns trabalhos relatam as aplicaes de quitinases e -1,3glucanases no setor agrotecnolgico. Wiwat et al.93 produziramquitinase a partir de Bacillus circulans 41 para uso como suple-mento de bioinseticida de B. thuringiensis para controle de larvasde lepidpteras. Zhang e Yuen94 utilizaram um sistema ltico com-posto por quitinase, protease, -1,3 glucanase e lipase para contro-le de manchas nas folhas de centeio, causadas por Biopolarissorokiniana.

-1,3 glucanases e quitinases produzidas por plantas em res-posta s infeces causadas por microrganismos patognicos tmsido purificadas e utilizadas para testes de atividade antifngica.Sela-Buurlage et al.95 verificaram a atividade antifngica de dife-rentes isoformas de quitinases e -1,3 glucanases do tabaco contraesporos de Fusarium solani. Ji e Kc96 observaram a atividadefungicida de -1,3 glucanase e quitinase de pepino (Cucumis sativusL.) sobre Colleotrichum lagenarium. Beffa et al.97 verificaram que-1,3 glucanases de plantas com atividade antifngica apresentamfuno na patognese viral, atuando sobre o vrus do tabaco deHavana 425 e sobre Nicotiniana sylvestris (vrus que causa necroseno tabaco). Kim e Hwang98 utilizaram uma -1,3 glucanase purifi-

Tabela 4. Clonagem e expresso de genes que codificam a produo de -1,3 glucanases de diversos organismosOrganismo Enzima (s) Gene (s) ComentriosBacillus circulans -1,3 glucanases GlcB O gene foi clonado em E. coli e a seqncia nucleotdicaWL-1275 B e C determinada

Oerskovia xanthineolytica Endo--1,3 Beta III Elucidao da seqncia primria de aminocidos eLLG10974 glucanase subseqente expresso em Bacillus subtilis

Streptomyces matensis -1,3 glucanase- lph O gene foi clonado, a seqncia de aminocidos da regioDIC-10876 laminarinapentaose N-terminal e a seqncia total do gene foram determinadas.

Cellulomonas cellulans -1,3 glucanase - A regio N-terminal do gene foi seqenciada e os resduos19169 obtidos desta tcnica foram idnticos aos obtidos da -1,3

glucanase da preparao comercial zymolyase

Oerskovia xanthineolytica77 -1,3 glucanase - Obteno de uma E. coli recombinante para a super produoda enzima

Lysobacter enzymogenes Trs -1,3 GluA, gluB Identificao e determinao da seqncia interna deN4-781 glucanases e gluC aminocidos dos trs genes. Atribui-se s -1,3 glucanases a

atividade de biocontrole

Pyricularia oryzae78 Endo--1,3 DNAc O DNAc foi clonado, caracterizado e expresso em E. coli.glucanase (OsGLN1) A protena recombinante obtida foi capaz de hidrolisar a

parede celular do fungo patgeno do arroz (Pyriculariaoryzae) e laminarina

Camada de Mananaprotena

Camada de -glucanaMembrana Plasmtica

Depsito de Quitina

Hidrlise da mananaprotena

Protease

Hidrlise da -1,3 glucana

-1,3 glucanase

Em condio osmtica controlada

Protoplasto

Em condio hipotnica do meio

Clula lisada

Figura 4. Lise enzimtica da clula de levedura e formao de protoplasto

cada de raiz de pimenta para inibir o crescimento das hifas do fun-go Phytophthora capsici. O efeito sinrgico da -1,3 glucanase ede uma quitinase tambm produzida pela pimenta ocasionou inibi-o do crescimento das hifas de F. oxysporum var. cucumerinum eP. capsici. O mecanismo de resposta de plantas infectadas induz aproduo de -1,3 glucanases e quitinases. Essas enzimas esto rela-


Tabela 5. Enzimas lticas envolvidas no biocontrole de fitopatgenos

Microrganismos de controle biolgico Enzimas envolvidas Fitopatgeno

Pichia membranifaciens FY-101101 -1,3 glucanases Botrytis cinereaThichoderma harzianum CECT 2413102 Quitinase, -1,3 e -1,6 glucanase Rhizoctonia solani e

Botrytis cinerea

Glomus mosseae e Glomus intraradices103 Quitinase, quitosanase, -1,3 glucanase e Phytophthora parasiticasuperxido-dismutase

Rhodotorula glutinis e Cryptococcus laurentii104 -1,3 glucanase, polifenoloxidase, fenilalanina Penicillium expansum ee amnia-liase Alternaria alternata

Bacillus mycoides105 e Bacillus pumilus106 Quitinase, -1,3 glucanase e peroxidase Cercospora beticolaTilletiopsis pallescens Gokhale107 Exo e endo -1,3 glucanase e quitinase Podosphaera xanthii

cionadas patognese e so indicadoras do sistema de resistnciada planta. Em geral, so encontradas em compartimentos onde hleses causadas por fungos e vrus infectantes99,100.

As enzimas lticas, principalmente -1,3 glucanases e quitinases,tambm so produzidas por microrganismos que exercem funo an-tagnica aos fitopatgenos. essas enzimas atribuiu-se o efeito defungitoxicidade sobre o patgeno e a eficcia do biocontrole deorganismos antagonistas (Tabela 5).

CONCLUSES

As clulas microbianas podem ser rompidas por mtodos mec-nicos, qumicos ou enzimticos. Em condies extremas de presso etemperatura requeridas na lise mecnica, as protenas e outros produ-tos podem ser desnaturados e, desta forma, a lise enzimtica da paredecelular de leveduras, realizada a 35-37 oC em pH 7,0-7,5, tem-se tor-nado bastante atrativa. As preparaes comerciais lticas apresentamcusto elevado, o qual, provavelmente, est associado a procedimentosultrapassados e onerosos. O investimento em pesquisas de produodas enzimas com indutores baratos e facilmente disponveis e proce-dimentos melhorados de purificao podem ser de grande contribui-o para diminuio dos custos. As enzimas lticas b-1,3 glucanases,proteases e quitinases apresentam variadas aplicaes industriais e sorequeridas em muitas reas da pesquisa, o que amplia o campo deutilizao dessas enzimas.

AGRADECIMENTOS

FAPESP pelo apoio financeiro.

REFERNCIAS

1. Fleet, G. H.; Curr. Top. Med. Mycol. 1985, 1, 24.2. Hartland, R. P.; Vermeulen, C. A.; Klis, F. M.; Sietsma, J. H., Wessels, J.

G. H.; Yeast. 1994, 10, 1591.3. Klis, F. M.; Yeast. 1994, 10, 851.4. Andrews, B. A.; Asenjo, J. A.; Biotechnol. Bioeng. 1987, 30, 628.5. Andrews, B. A.; Asenjo, J. A.; Tibtech. 1987, 5, 273.6. Scott, J. H.; Schekman, R.; J. Bacteriol. 1980, 142, 414.7. Zlotnik, H.; Fernandez, M. P.; Bowers, B.; Cabib, E.; J. Bacteriol. 1984,

159, 1018.8. Asenjo, J. A.; Andrews, B. A.; Hunter, J. B.; Lecorre, S.; Process Biochem.

1985, 159.9. Hunter, J., B.; Asenjo, J. A.; Biotechnol. Bioeng. 1988, 31, 929.

10. Stratford, M.; Yeast. 1994, 10, 1741.11. Cabib, E.; Drgon, T.; Drgonovaa, J.; Ford, R. A.; Kollar, R.; Biochem. Soc.

Trans. 1997, 25, 200.12. Bacon, J. S. D.; Farmer, V. C.; Jones, D.; Taylor, I. F.; Biochem. J. 1969,

114, 557.13. Lampen, J. O.; A. Van. Leeuw. 1968, 34, 1.

14. Yamamoto, S.; Nagasaki, S.; Agr. Biol. Chem. 1975, 39, 1981.15. Kapteyn, J. C.; van Egmond, P.; Sievi, E.; van Den Ende, H.; Makarow,

M.; Klis, F. M.; Mol. Microbiol. 1999, 31, 1835.16. Popolo, L.; Vai, M.; BBA-Gen. Subjects 1999, 1426, 385.17. Kapteyn, J. C.; Mol. Microbiol. 2000, 35, 601.18. Kapteyn, J. C.; van Den Ende, H.; Klis, F. M.; BBA-Gen. Subjects 1999,

1426, 373.19. Lagorce, A.; Hauser, N. C.; Labourdette, D.; Rodriguez, C.; Martin-Yken,

H.; Arroyo, J.; Hoheisel, J. D.; Franois, J.; J. Biol. Chem. 2003, 278,20345.

20. Mrsa, V.; Ecker, M.; Cappellaro, C.; Teparic, R.; Tanner, W.; Food Technol.Biotech. 1999, 37, 21.

21. Mrsa, V.; Tanner, W.; Yeast. 1999, 15, 813.22. Manners, D. J.; Masson, A. J.; Patterson, J. C.; Biochem. J. 1973, 135, 19.23. Kopeck, M.; Phaff, H. J.; Fleet, G. H.; J. Cell Biol. 1974, 62, 66.24. Kreger, D. R.; Kopeck, M.; J. Gen. Microbiol. 1976, 92, 207.25. Hinton, D. M.; Pressey, R.; J. Am. Soc. Hort. Sci. 1980, 105, 499.26. Majeti, N.; Kumar, R.; React. Funct. Polym. 2000, 46, 1.27. Roberts, G. Em Physical structures; Roberts, G. A. F., ed.; Macmilian:

London, 1992, p. 20.28. Sahai, A. S.; Manocha, M. S.; Microbiol. Rev. 1993, 11, 317.29. Bacon, J. S. D.; Gordon, A. H.; Jones, D.; Taylor, I. F.; Webley, D. M.;

Biochem. J. 1970, 120, 67.30. Doi, K.; Doi, A.; Fukui, T.; Agr. Biol. Chem. 1973, 37, 1619.31. Obata, T.; Iwata, H.; Namba, Y.; Agr. Biol. Chem. 1977, 41, 2387.32. Obata, T.; Fujioka, K.; Hara, S.; Namba, Y.; Agr. Biol. Chem. 1977, 41,

671.33. Yamamoto, N.; Sato, S.; Saito, K.; Hasuo, T.; Tadenuma, M.; Suzuki, K.;

Tamaoka, J.; Komagata, K.; Int. J. Syst. Bacteriol. 1988, 38, 7.34. Yamamoto, N.; Sato, S.; Miki, H.; Park, Y.; Tadenuma, M.; J. Gen. Appl.

Microbiol. 1993, 39, 261.35. Santos, L. F.; Dissertao de Mestrado, Universidade Estadual de

Campinas, Brasil, 2000.36. Ferro, L. A.; Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas,

Brasil, 2002.37. Hasuo, T.; Yamamoto, N.; Saito, K.; Tadenuma, M.; J. Brew. Soc. Jpn. 1984,

79, 510.38. Kitamura, K.; Yamamoto, Y.; Arch. Biochem. Biophys. 1972, 153, 403.39. Hayashi, K.; Seino, A.; Kasumi, T.; Kubo, N.; Tsumura, N.; J. Ferment.

Technol. 1981, 59, 319.40. Hayashi, K.; Seino, A.; Kasumi, T.; Kubo, N.; Tsumura, N.; Agr. Biol.

Chem. 1981, 45, 2289.41. Pitson, S. M.; Seviour, R. J.; Macdougal, B. M.; Mycol. Res. 1997, 101,

153.42. Pitson, S. M.; Seviour, R. J.; Macdougal, B. M.; Enzyme Microb. Technol.

1997, 21, 182.43. Noronha, E. F.; Ulhoa, C. J.; Microbiol. Lett. 2000, 183, 119.44. Bara, M. T. F.; Lima, A. L.; Ulhoa, C. J.; FEMS Microbiol. Lett. 2003,

219, 81.45. Khan, A.; Williams, K.; Molloy, M. P.; Nevalainen, H.; Protein Expression

Purif. 2003, 32, 210.46. Kobayashi, R.; Miwa, T.; Yamamoto, S.; Nagasaki, S.; Eur. J. Appl.

Microbiol. 1982, 15, 14.47. Yamamoto, N.; Hasuo, T.; Terauchi, T.; Saito, K.; Tadenuma, M.; J. Brew.

Soc. Jpn. 1984, 79, 828.48. Yamamoto, N.; Hasuo, T.; Saito, K.; Tadenuma, M.; Agr. Biol. Chem. 1987,

51, 1541.


49. Vrsansk, M.; Biely, P.; Krtk, Z. Z.; Allg. Mikrobiol. 1977, 17, 465.50. Vrsansk, M.; Krtk, Z. Z.; Biely, P.; Allg. Mikrobiol. 1977, 17, 391.51. Rowley, B. I.; Bull, A. T.; Biotechnol. Bioeng. 1977, 19, 879.52. Bielecki, S.; Wnuk, M.; Szczesna, M.; Bobobwicz-Lassocinska, T.;

Antczak, T.; Galas, E.; Biotechnol. Lett. 1989, 11, 281.53. Gacto, M.; Vicente-Soller, J.; Villa, T. G.; J. Appl. Microbiol. 2000, 88,

961.54. Fleuri, L. F.; Dissertao de Mestrado, Universidade Estadual de Campinas,

Brasil, 2003.55. Nampoothiri, M. K.; Baiju, T. V.; Sandhya, C.; Sabu, A.; Szakacs, G.;

Pandey, A.; Process Biochem. 2003.56. Kenji, S.; Akira, Y.; Hajime, K.; Mamoru, W.; Mitsuaki, M.; Appl. Environ.

Microbiol. 1998, 64, 3397.57. Macwilliam, I. C.; J. Inst. Brew. 1970, 76, 525.58. Kaneko, T.; Kitamura, K.; Yamamoto, Y.; Agr. Biol. Chem. 1973, 37, 2295.59. Funatsu, M.; Oh, H.; Aizono, T.; Shimoda, T.; Agr. Biol. Chem. 1978, 42,

1975.60. Prokopakis, G. J.; Liu, L. C.; Biotechnol. Bioeng. 1997, 53, 290.61. Lechevalier, H. A.; Lechevalier, M. P. Em Bergeys Manual of Sistematic

Bacteriology; Lechevalier, P.; Lechevalier, eds.; Willians e Willians, 1986,p.1489.

62. Kitamura, K.; Agr. Biol. Chem. 1982, 46, 2093.63. Usui, T.; Oguchi, M.; Agr. Biol. Chem. 1986, 50, 535.64. Ryan, E.; Ward, O.; Process Biochem. 1988. 12.65. Parrado J.; Escudero, P. R.; Conejero-Lara, F.; Kotik, N.; Ponting, C. P.;

Asenjo, J. A.; Dobson, C. M.; Biochim. Biophys. Acta 1996, 1296, 145.66. Saeki, K.; Iwata, J.; Yamazaki, S.; Watanabe, Y.; Tamai, Y.; J. Ferment.

Bioeng. 1994, 78, 407.67. Thrane, C.; Tronsmo, A; Jensen, D. F.; Eur. Plant Pathol. 1997, 103, 331.68. Noronha, E. F.; Ulhoa, C. J.; Microbiol. Lett. 2000, 183, 119.69. Soares, G. A. M.; Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas,

Brasil, 2002.70. Miyanishi, N.; Hamada, N.; Kobayashi, T.; Imada, C.; Watanabe, E.; J.

Biosci. Bioeng. 2003, 95, 45.71. Chen, C.; Hsu, M.; Jiang, S.; Enzyme Microb. Technol. 1997, 20, 191.72. De Siqueira Pinto, A.; Barreto, C. C.; Schrank, A.; Ulhoa, C. J.; Henning

Vainstein, M.; Can. J. Microbiol. 1997, 43, 322.73. Deane, E. E.; Whipps, J. M.; Lynch, J .M.; Peberdy, J. F.; Biochim. Biophys.

Acta 1998, 1383, 101.74. Ferrer, P.; Hedegaard, L.; Halkier, T.; Diers, I.; Savva, D.; Asenjo, J. A.;

Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996, 782, 555.75. Okada, T.; Aisaka, M.; Ainda, K.; Nikaidou, N.; Tanaka, H.; Watanabe, T.;

J. Ferment. Bioeng. 1995, 80, 229.76. Nakabayashi, M.; Nishijima, T.; Ehara, G.; Nikaidou, N.; Nishihashi, H.,

Watanabe, T.; J. Ferment. Bioeng. 1998, 85, 459.77. Salazar, O.; Molitor, J.; Lienqueo, M. E.; Asenjo, J. A.; Protein Expression

Purif. 2001, 23, 219.78. Palumbo, J. D.; Sullivan, R. F.; Kobayashi, D. Y.; J. Bacterial. 2003, 185,

4362.79. Akiyama, T.; Pillai, M. A.; Plant Sci. 2001, 161, 1089.80. Yamamoto, Y.; Fujino, S.; Kitamura, K.; Kaneko, T.; J. Ferment. Technol.

1974, 52, 828.81. Planas, A.; Biochim. Biophys. Acta 2000, 1543, 361.82. Okagbue, R. N.; Lewis, M. J.; Biotechnol. Lett. 1983, 5, 731.83. Nakajima, T.; Konno, R.; Nishihara, H.; Matsuda, K.; J. Ferment. Technol.

1988, 66, 245.84. Richter, G.; Stolken, B.; Hafner, B.; Okologische Aspekte Extensiver

Landbewirtsshatung 1992, 419.85. Krizkov, L.; Durackov, Z.; Sandula, J.; Sasinkov, V.; Krajcovic, J.;

Mutat. Res. 2001, 497, 213.86. Elvig, S. G.; Pedersen, P. B.; Regul. Toxicol. Pharm. 2003, 37, 11.87. Borris, R.; Krah, M.; Brumer, H.; Kerzhner, M. A.; Ivanen, D. I.;

Eneyskaya, E. V.; Elyakova, L. A.; Shishlyannikov, S. M.; Shabalin, K.A.; Neustroev, K. N.; Carbohydr. Res. 2003, 338, 1455.

88. Kollar, R.; Petrakova, E.; Ashwell, G.; Robbins, P.W.; Cabib, E.; J. Biol.Chem. 1995, 270, 1170.

89. Kollar, R.; Reinhold, B. B.; Petrakova, E.; Yeh, H. J. C.; Aswell, G.;Drgonova, J.; Kapteyn, J. C.; Klis, F. M.; Cabib, E.; J. Biol. Chem. 1997,272, 17762.

90. Southard, S. B.; Specht, C.A.; Mishra, C.; Chen-Weiner, J.; Robbins, P.W.; J. Bacteriol. 1999, 181, 7439.

91. Santos, B.; Snyder, M.; Mol. Biol. Cell. 2000, 11, 435.92. Patil, R. S.; Ghormade, V.; Deshpande, M. V.; Enzyme Microb. Technol.

2000, 26, 473.93. Wiwat, C.; Siwayaprahm, P.; Bhumiratana, A.; Curr. Microbiol. 1999, 39,

134.94. Zhang, Z.; Yuen, G. Y.; Phytopathol. 1999, 89, 817.95. Sela-Buurlage, M. B.; Ponstein, A. S.; Bres-Vloemans, S. A.; Melchers,

L. S.; van Den Elzen, P.; Cornelissen, B.; Plant Physiol. 1993, 101, 857.96. Ji, C.; Kc, J.; Physiol. Mol. Plant P. 1996, 49, 257.97. Beffa, R. S.; Hofer, R. M.; Thomas, M.; Meins Jr., F.; The Plant Cell. 1996,

8, 1001.98. Kim, Y. J.; Hwang, B. K.; Physiol. Mol. Plant P. 1997, 50, 103.99. Kang, Z.; Buchenauer, H.; Physiol. Mol. Plant P. 2002, 60, 141.

100. Burketov, L.; Stillerov, K.; Feltlov, M.; Physiol. Mol. Plant P. 2003,63, 47.

101. Masih, E. I.; Paul, B.; Curr. Microbiol. 2002, 44, 391.102. Rey, M.; Delgado-Jarana, J.; Bentez, T.; Appl. Microbiol. Biot. 2001, 55,

604.103. Pozo, M. J.; Cordier, C.; Dumas-Gaudot, E.; Gianinazzi, S.; Barea, J. M.;

Azcn-Aguilar, C.; J. Exp. Bot. 2002, 53, 525.104. Qin, G. Z.; Tian, S. P.; Xu, Y.; Wan, Y. K.; Physiol. Mol. Plant P. 2003,

62, 147.105. Bargabus, R. L.; Zidack, N. K.; Sherwood, J. E.; Jacobsen, B. J.; Physiol.

Mol. Plant P. 2002, 61, 289.106. Bargabus, R. L.; Zidack, N. K.;Sherwood, J. E.; Jacobsen, B. J.; Biol.

Control. 2003.107. Urquhart, E. J.; Punja, Z. K.; Can. J. Microbiol. 2002, 48, 219.

produÇÃo, purificaÇÃo, clonagem e aplicaÇÃo de enzimas lÍticas

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