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Londrina 2015
GEYCI DE OLIVEIRA DA SILVA COLOGNESI
PRODUÇÃO DE ETANOL EM ESCALA PILOTO A PARTIR DA FERMENTAÇÃO DO SORO DE QUEIJO
DESPROTEINIZADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO LEITE E DERIVADOS
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados. Orientador: Prof. Dr. Hélio Hiroshi Suguimoto
GEYCI DE OLIVEIRA DA SILVA COLOGNESI
PRODUÇÃO DE ETANOL EM ESCALA PILOTO A PARTIR DA FERMENTAÇÃO DO SORO DE QUEIJO
DESPROTEINIZADO
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná
Biblioteca Central Setor de Tratamento da Informação
Colognesi, Geyci de Oliveira da Silva C679p Produção de etanol em escala piloto a partir da fermentação do soro
de queijo desproteinizado / Geyci de Oliveira da Silva Colognesi. Londrina: [s.n], 2016
40f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia do Leite).
Universidade Norte do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Hélio Hiroshi Suguimoto.
1 - Tecnologia do Leite - dissertação de mestrado - UNOPAR 2- Bioetanol 3- Lactose 4- Lactossoro industrial 5-Saccharomyces fragilis I- Suguimoto, Hélio Hiroshi; orient. II- Universidade Norte do Paraná.
CDU 637.1
GEYCI DE OLIVEIRA DA SILVA COLOGNESI
PRODUÇÃO DE ETANOL EM ESCALA PILOTO A PARTIR DA FERMENTAÇÃO DO SORO DE QUEIJO DESPROTEINIZADO
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite
e Derivados, área e concentração em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados
como requisito parcial para a obtenção do título de Mestra conferida pela Banca
Examinadora formada pelos professores:
_________________________________________ Prof. Dr. Hélio Hiroshi Suguimoto
UNOPAR
_________________________________________ Prof. Dr. Raul Jorge Hernan Castro Gómez
UNOPAR
_________________________________________
Profa. Dra. Lyssa Setsuko Sakanaka UTFPR
Londrina, 04 de Dezembro de 2015.
Dedico este trabalho a todos os meus familiares,
especialmente aos meus pais Mario e Gemima, meu
irmão Wilian e esposo Tiago pelo incentivo, amor
incondicional e compreensão da minha ausência na
realização deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter me amparado para a realização deste
trabalho, e por ter me dado entendimento, sabedoria e discernimento na realização
do mesmo.
Aos meus pais Gemima e Mario, pelo incentivo em nunca desistir dos nossos
objetivos e sonhos, pelos conselhos, e amor depositado nos momentos difíceis.
Ao meu esposo Tiago que esteve partilhando de todos os momentos que vivi estes
dois anos, me motivando para a realização deste trabalho, e por compreender a
minha ausência.
Ao Prof. Dr. Hélio Hiroshi Suguimoto pela orientação, apoio, motivação, confiança
depositada e incentivo para prosseguir os estudos realizados.
Ao Prof. Dr. Raul Jorge Hernan Castro Gómez pelos conselhos e orientações.
Aos meus “Queridos Amigos” que conquistei José Renato, Flávia Kawahigashi,
Evelyn Koga, Juliana Suganuma, o meu agradecimento pelos momentos que
vivemos no laboratório, e pela família que nos tornamos.
Á todos os professores que estiveram conosco contribuindo para o nosso sucesso e
crescimento como pessoa. Somos o resultado da confiança e da força de cada um
de vocês.
À todos que contribuíram, direta ou indiretamente para a realização deste trabalho,
os meus sinceros agradecimentos.
“Nenhum obstáculo é grande demais quando confiamos em Deus”
Profundo é o saber de Deus, Criador, Saber sem igual, de grande esplendor; O intento de Deus ninguém pode sondar; Conselhos ninguém foi ao grande Deus ditar.
Ciência perfeita é só a de Deus, Altíssimos são os pensamentos Seus; Por Ele e d´Eele é tudo o que há; É Deus que, aos homens, sustento sempre dá.
A sabedoria com Deus está, O conhecimento não nos negará; Riquezas perpétuas só Ele é que tem; A Ele a glória eternamente. Amém.
CCB
COLOGNESI, Geyci de Oliveira da Silva. Produção de etanol em escala piloto a partir da fermentação do soro de queijo desproteinizado. 2015. 40f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) – Unidade Piza. Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2015.
RESUMO A produção de bioetanol a partir de fontes alternativas, como caldo de cana, milho e beterraba, já são amplamente utilizados em substituição aos combustíveis fosseis, fortalecidos nos cenários econômicos ambientalmente sustentáveis. Assim, o soro de queijo apresenta-se como uma alternativa para a produção de etanol, por ser uma importante fonte para o crescimento de microrganismos, que biocatalisam a lactose diretamente para a produção de etanol e outros produtos, devido ao elevado teor em lactose e demais nutrientes, bem como pelo elevado volume produzido pelos laticínios. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar a influência da adição de nutrientes na fermentação do soro de queijo, verificar a velocidade de produção de etanol a partir de frações de lactose hidrolisada do soro de queijo, e verificar a repetibilidade dos resultados da fermentação em escala laboratorial e piloto a partir da fermentação de soro de queijo concentrado utilizando-se a levedura Saccharomyces fragilis. Nos ensaios avaliando-se a adição de nutrientes, o Sulfato de Amônio e o Extrato de levedura não apresentaram diferenças significativas pelo teste de Tukey 5%, porém, exibiram uma produção positiva de 5,07 e 5,43%, em relação ao tratamento controle, cuja produção foi de 5,52% (m/v). Já o soro de queijo contendo lactose hidrolisada nas concentrações de 10 e 30%, foram as que exibiram uma maior conversão da lactose em etanol, no entanto, a partir de 40% de hidrólise, houve redução significativa na produção de etanol, devido a inibição do metabolismo da levedura por substrato. Em ambas as cinéticas, as produções de etanol foram de 5,6% (v/v), demonstrando que a utilização do soro de queijo desproteinizado para fermentações industriais é possível devida a reprodutibilidade dos resultados desde escala laboratorial à piloto, apresentando-se como uma forma de reduzir o potencial poluidor deste subproduto, e ao mesmo tempo obter produto de valor agregado. PALAVRAS CHAVE: Bioetanol. Lactose. Lactossoro Industrial, Saccharomyces fragilis.
COLOGNESI, Geyci de Oliveira da Silva. Produção de etanol em escala piloto a partir da fermentação do soro de queijo desproteinizado. 2015. 40f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e Derivados) – Unidade Piza. Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2015.
ABSTRACT The production of bio-ethanol from alternative sources such as sugar cane juice, corn and beet, are already widely used as an alternative to fossil fuel, strengthened in environmentally sustainable economic scenarios. Thus, the whey is presented as an alternative for the production of ethanol, it is an important source for the growth of microorganisms, which biocatalisam lactose directly to ethanol and other products due to the high lactose content and other nutrients, as well as the high level produced by the dairy. Thus, the aim of this study was to analyze the influence of the addition of nutrients in the fermentation of cheese whey, check ethanol production speed from lactose fractions hydrolyzed whey cheese, and check the repeatability of the results of fermentation laboratory and pilot scale fermentation of cheese whey concentrate using the yeast Saccharomyces fragilis. In assays evaluating the nutrient addition, ammonium sulphate and yeast extract showed no significant difference at 5% Tukey test, however, showed positive production of 5.07 and 5.43%, in relation to the treatment control, whose production was 5.52% (v/v). Since the cheese whey containing hydrolysed lactose at concentrations of 10 and 30% were those that exhibited a higher conversion of lactose to ethanol, however, from 40% hydrolysis, a significant reduction in ethanol production due to inhibition the substrate for yeast metabolism. In both kinetic the ethanol yields were 5.6% (v/v), demonstrating that the use of deproteinized cheese whey for industrial fermentations is possible due to reproducibility of the results from laboratory to pilot scale, presenting as a way to reduce the pollution potential of this by-product, while obtaining value-added product. KEY-WORDS: Bioethanol. Lactose. Whey Industrial. Saccharomyces fragilis.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 9
1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...................................................................... 10
1.1 Soro de queijo ............................................................................................. 10
1.2 Lactose ....................................................................................................... 10
1.3 Fermentação alcoólica ................................................................................ 11
2 OBJETIVOS .................................................................................................... 18
2.1 Objetivo geral .............................................................................................. 18
2.2 Objetivos específicos .................................................................................. 18
3 ARTIGO CIENTÍFICO ..................................................................................... 19
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INTRODUÇÃO
O soro de queijo é um subproduto da indústria láctea, obtido a partir da
coagulação da caseína do leite e dessora do queijo (GUIMARÃES; TEIXEIRA;
DOMINGUES, 2010). Representa 90% do volume total do leite com elevada carga
poluente e um expressivo problema ambiental e econômico, cujo tratamento
representa 5,59% dos custos operacionais em um laticínio (CARVALHO;
PRAZERES; RIVAS, 2013; WISSMANN et al., 2012).
A composição do soro em pó varia de acordo com o tipo de leite e do queijo
produzido, com cerca de 7% de sólidos, 10-12% de proteínas, 74% de lactose, 8%
de minerais e 3% de gorduras (FOX; McSWEENEY, 2009). Isso proporciona a
aplicação em alguns produtos alimentares, pois contém cerca de 55% dos nutrientes
totais do leite (DRAGONE et al., 2009).
Entretanto, representa um problema para os consumidores, principalmente os
intolerantes à lactose, estimado em quase 70% da população mundial (MICINSKI et
al., 2013). Adicionalmente, há outros problemas que envolvem a lactose, como a
cristalização, baixa doçura quando comparada a glicose e sacarose, capacidade de
reagir com aminas e formar glicosaminas, compostos característicos da reação de
Maillard, e que conferem aos alimentos odores e aromas anômalos, bem como a
perda de solubilidade (FOX; McSWEENEY, 2009).
A elevada disponibilidade de nutrientes faz do soro de queijo uma importante
fonte para o crescimento de microrganismos (DRAGONE et al., 2009), como a
Saccharomyces fragilis ou Kluyveromyces marxianus e Candida pseudotropicalis
(GUIMARÃES; TEIXEIRA; DOMINGUES, 2010), com a finalidade de obtenção de
etanol e outros importantes bioprodutos.
O Brasil, embora com uma produção anual de aproximadamente 1 milhão de
toneladas de queijo e 9 bilhões de litros de soro de queijo, ainda não possui planta
industrial para produção de etanol a partir de soro de queijo, como nos Estados
Unidos, Irlanda e Nova Zelândia que já empregam 50% do soro para este fim,
minimizando os problemas ambientais associados ao seu tratamento e disposição
(SADIK; HALEMA, 2014). Isso se deve ao menor custo para produção de etanol a
partir do caldo de cana ou melaço, tornando o soro pouco atrativo para este fim. O
país, mesmo sendo o segundo maior produtor mundial de etanol (VALDES, 2011)
ainda não possui tecnologia industrial para fermentar o soro de queijo e convertê-lo
em etanol.
10
1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
1.1 Soro de queijo
O Brasil apresenta uma ampla diversidade de matéria-prima na área de
alimentos, como o setor lácteo, com produção leiteira de 35 bilhões de litros em
2013 e uma estimativa de crescimento de 5% para 2014 (CIÊNCIA DO LEITE,
2014).
Neste setor a produção de queijos em 2013 foi de um milhão de toneladas
(FIGUEIREDO, 2014), que representa nove bilhões de litros de soro de queijo
produzido, isto é, 80 a 90% do volume total de leite utilizado (BARBOSA et al., 2010;
KIENDL, 2005; WISSMANN et al., 2012).
O soro de leite ou soro de queijo é a porção aquosa obtida durante a fabricação
de queijo (OLIVEIRA; SERRA; MAGALHÃES, 2012) por coagulação ácida ou
enzimática das caseínas do leite. É composto por 55% dos nutrientes do leite
(MICINSKI et al., 2013), com aproximadamente 7% de sólidos, 10-12% de proteínas,
74% de lactose, 8% de minerais e 3% de gorduras na formulação em pó (FOX;
McSWEENEY, 2009).
Há várias formas de tratamento e aproveitamento do soro de queijo, que pode
ser comercializado como subproduto ou utilizado como matéria prima em outros
produtos lácteos (WISSMANN et al., 2012).
No entanto, quando não aproveitado o soro de queijo é eliminado em lagoas de
tratamento (WISSMANN et al., 2012), devido a elevada capacidade poluente.
Comparativamente o volume de 50.000 litros de soro de queijo pode ser comparado
a um esgoto de uma cidade de 25.000 habitantes. Assim, este resíduo precisa ser
tratado para atender a legislação ambiental brasileira, que define as indústrias como
responsáveis pelo tratamento dos seus efluentes, estabelecendo padrões de
qualidade dos corpos receptores para cada topo de efluente gerado (CONAMA,
2011).
O tratamento representa 5,59% dos custos operacionais (WISSMANN et al.,
2012), ou 0,5 dólar/kg soro de queijo (OZMIHCI; KARGI, 2007), o que tem
estimulado as indústrias a buscarem alternativas para o aproveitamento do soro.
1.2 Lactose
Dois importantes constituintes do soro de queijo podem ser aproveitados: as
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proteínas que, embora em menor quantidade podem ser aplicadas em indústrias
alimentícias, pois são ricas em aminoácidos essenciais (FLORENCIO et al., 2013) e
a lactose, maior porção sólida do soro, que fermentada produz derivados de
elevador valor agregado. A lactose pode ainda ser desidratada e usada como
ingrediente em formulações de outros produtos.
No entanto, quando empregada em alimentos a lactose representa um
problema para os consumidores que são intolerantes a este açúcar, já que quase
70% da população mundial apresenta este distúrbio (MICINSKI et al., 2013). Há
também problemas como cristalização, baixa doçura quando comparada a glicose e
sacarose, reage com aminas para formar glicosaminas, compostos característicos
da reação de Mailhard, que conferem aos alimentos odores e aromas anômalos, e
perda de solubilidade (FOX; McSWEENEY, 2009).
Assim, é mais interessante o uso da lactose, um dissacarídeo redutor,
composto de glicose e galactose unidos por ligação β1→4, em processos
fermentativos, como substrato para a produção de uma variedade de produtos . Isso
reduz o custo das indústrias por gerar um resíduo de menor carga orgânica, tendo
como produtos o etanol, ácido lático, acético e propiônico (FOX; McSWEENEY,
2009; SANSONETTI et al., 2010).
1.3 Fermentação alcoólica
A produção de etanol através da fermentação de matérias-primas como o
melaço ou caldo de cana (cana-de-açúcar), milho e glicose (beterraba) já são
amplamente usados em substituição aos combustíveis fósseis, fortalecidos nos
cenários econômicos ambientalmente sustentáveis (SOUZA et al., 2014; IGLECIAS;
SESMERO, 2015). Isso tem proporcionado um estímulo ao avanço na produção de
bioetanol a partir de outras fontes alternativas (ZAFAR; OWAIS, 2006).
Assim, devido ao elevado teor em lactose e demais nutrientes, bem como pelo
elevado volume produzido pelos laticínios, o soro de queijo, apresenta-se como uma
alternativa para a produção de etanol, por ser uma importante fonte para o
crescimento de microrganismos (DRAGONE et al., 2009), que biocatalisam a lactose
diretamente para a produção de etanol e outros produtos (GUIMARÃES; TEIXEIRA;
DOMINGUES, 2010; JEON; CHOI, 2010).
Entretanto Silveira et al., (2005) destaca que o processo catalítico de
conversão da lactose em etanol pode ser influenciado pela concentração de lactose
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do meio de fermentação, e do etanol produzido, quando em elevadas concentrações
torna-se tóxico à levedura alterando o seu metabolismo.
A levedura mais utilizada para a produção industrial de etanol é a
Saccharomyces cerevisae (CHRISTENSEN et al., 2011), pela boa capacidade
fermentativa, tolerância ao etanol produzido até 20% (v/v), capacidade de crescer
em condições anaeróbicas e servir como ingrediente de ração animal (GUIMARÃES;
TEIXEIRA; DOMINGUES, 2010).
No entanto, é incapaz de metabolizar diretamente a lactose por não apresentar
o gene LAC12, que permeia a lactose para o interior da célula, e o gene LAC4, que
hidrolisa este dissacarídeo (ZOU et al., 2013). Assim, espécies que utilizam a lactose
diretamente como Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus ou
Saccharomyces fragilis estão sendo utilizadas na fermentação deste açúcar (BACH
et al., 2014).
Enquanto a Saccharomyces cerevisae necessita de glicose como principal
fonte de carbono (RUBIO-TEIXEIRA, 2005), a Kluyveromyces spp. apresenta a
capacidade de biocatalisar a lactose presente no soro de queijo (DRAGONE et al.,
2009), além de elevada tolerância ao etanol de 10% (v/v), e pressão osmótica de
22% (m/v) (LÓPEZ-ALVAREZ et al., 2012). Destaca-se por sua diversidade
metabólica e seu substancial grau de polimorfismo, traços que são refletidas pelos
diversos ambientes a partir da qual foi isolada (Lane et al., 2011).
Assim, a levedura Kluyveromyces marxianus está ganhando considerável
atenção devido às suas propriedades desejáveis na fermentação industrial, incluindo
uma ampla absorção de carboidratos para fermentação, crescimento rápido,
termotolerância ao meio fermentescível e produção da enzima β-galactosidase,
tornando-se uma levedura atraente para a produção de etanol industrial a partir de
substratos de baixo custo, como o soro de queijo (LANE; MORRISSEY, 2010).
O uso de Kluyveromyces marxianus na conversão do soro de queijo em etanol
é também promissor, pela ótima adaptação da levedura a uma ampla faixa de
temperatura, pH e concentração de lactose (DINIZ et al., 2014).
Entretanto o ótimo desempenho do processo fermentativo conduzido pelas
leveduras é afetado por diversas variáveis, como a temperatura, agitação, pH,
concentração inicial de inóculo e substrato, sendo estes fatores importantes para a
obtenção de produtos com alta qualidade (DRAGONE et al., 2011).
Hadiyanto, Aini, Pinundi (2014) concluiram que a temperatura ideal para a
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produção de etanol a partir do soro de queijo, em sistema de batelada com a
Kluyveromyces marxianus, foi de 30ºC, com uma produção de 0,796% (v/v) de
etanol e uma taxa de crescimento de 0,186/h.
Guo, Zhou e Xiao (2010), nos ensaios com soro de queijo com mistura de
culturas de Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae produziram,
4,6% (v/v) de etanol após 72 horas de fermentação. Koushki, Jafari e Azizi (2012)
também fermentaram o soro de queijo com 4,9 e 9,8% de lactose e Kluyveromyces
marxianus, e obtiveram 2,8% (v/v) e 5,8% (v/v) de etanol, respectivamente, após 60
horas de fermentação.
Já Guimarães, Teixeira e Domingues (2010), Christensen et al., (2011),
Koushki, Jafari e Azizi, (2011), Sansonetti et al., (2010) destacam a vantagem da
utilização da K. marxianus pela rapidez na multiplicação celular.
Além disso, Belém e Lee (1998) citam que o interesse pelo gênero
Kluyveromyces spp. tem ganhado destaque por apresentar leveduras como
Kluyveromyces marxianus e Kluyveromyces lactis, que fermentam a lactose em
temperaturas ideais de hidrólise enzimática (BABIKER et al., 2010), produzindo
etanol, aromas, oligossacarídeos e biomassa.
Assim, os estudos para a utilização do soro de queijo como meio para
fermentação são realizados há bastante tempo, entretanto, a sua aplicação industrial
ainda não é viável economicamente pelo baixo rendimento na conversão da lactose
a etanol. Desta forma, o presente trabalho tem como principal objetivo estudar a
fermentação do soro de queijo desproteinizado, em escala piloto (50 litros),
utilizando a levedura Saccharomyces fragilis, a fim de reproduzir a produção de
etanol da escala laboratorial em escala piloto, e viabilizar o seu emprego em
alimentos, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos e indústrias.
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REFERÊNCIAS
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18
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a produção de etanol em escala piloto a partir de soro de queijo
concentrado utilizando-se a levedura Saccharomyces fragilis.
2.2 Objetivos específicos
• Analisar a influência da adição de nutrientes na fermentação do soro de queijo
concentrado pela Saccharomyces fragilis para produção de etanol.
• Verificar o crescimento microbiano e a produção de etanol pela Saccharomyces
fragilis a partir de diferentes concentrações de lactose hidrolisada do soro de
queijo concentrado;
• Verificar a repetibilidade dos resultados da fermentação em escala laboratorial
e piloto a partir da fermentação de 50 litros de soro de queijo.
19
3 ARTIGO CIENTÍFICO
FERMENTAÇÃO DO SORO DE QUEIJO DESPROTEINIZADO POR
Saccharomyces fragilis EM ESCALA PILOTO
COLOGNESI, G. O. S.1; SUGUIMOTO, H. H.1.
1 Universidade Norte do Paraná – UNOPAR – Mestrado em Ciência e Tecnologia de
Leite e Derivados, Rua Marselha, 591, Jardim Piza, 86041-140, Londrina, PR, Brasil.
• Autor para correspondência:
Hélio Hiroshi Suguimoto
E-mail: [email protected]
Rua Marselha, 591, Jardim Piza, 86041-140, Londrina, PR, Brasil
Tel: +55 43 3371-7834
20
RESUMO
A produção de bioetanol a partir de fontes alternativas, como caldo de cana, milho e beterraba, já são amplamente utilizados em substituição aos combustíveis fosseis, fortalecidos nos cenários econômicos ambientalmente sustentáveis. Assim, o soro de queijo apresenta-se como uma alternativa para a produção de etanol, por ser uma importante fonte para o crescimento de microrganismos, que biocatalisam a lactose diretamente para a produção de etanol e outros produtos, devido ao elevado teor em lactose e demais nutrientes, bem como pelo elevado volume produzido pelos laticínios. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar a influência da adição de nutrientes na fermentação do soro de queijo, verificar a velocidade de produção de etanol a partir de frações de lactose hidrolisada do soro de queijo, e verificar a repetibilidade dos resultados da fermentação em escala laboratorial e piloto a partir da fermentação de soro de queijo concentrado utilizando-se a levedura Saccharomyces fragilis. Nos ensaios avaliando-se a adição de nutrientes, o Sulfato de Amônio e o Extrato de levedura não apresentaram diferenças significativas pelo teste de Tukey 5%, porém, exibiram uma produção positiva de 5,07 e 5,43%, em relação ao tratamento controle, cuja produção foi de 5,52% (m/v). Já o soro de queijo contendo lactose hidrolisada nas concentrações de 10 e 30%, foram as que exibiram uma maior conversão da lactose em etanol, no entanto, a partir de 40% de hidrólise, houve redução significativa na produção de etanol, devido a inibição do metabolismo da levedura por substrato. Em ambas as cinéticas, as produções de etanol foram de 5,6% (v/v), demonstrando que a utilização do soro de queijo desproteinizado para fermentações industriais é possível devida a reprodutibilidade dos resultados desde escala laboratorial à piloto, apresentando-se como uma forma de reduzir o potencial poluidor deste subproduto, e ao mesmo tempo obter produto de valor agregado.
Palavras-chave: Fermentação. Hidrólise. Lactossoro Industrial, Nutrientes.
Saccharomyces fragilis.
21
INTRODUÇÃO
A produção de derivados lácteos, em especial os queijos cresce em
média 11,4% ao ano no Brasil (WISSMANN et al., 2012). Gera, consequentemente,
elevado volume de efluentes, como o soro de queijo, que representa 90 a 95% do
volume de leite utilizado para a produção de queijos (SERPA; PRIAMO;
REGINATTO, 2009; SPALATELU, 2012).
São produzidos por ano cerca de 160 milhões de toneladas de soro de queijo
no mundo, com uma previsão de aumento de 1 a 2% anualmente (GUIMARÃES;
TEIXEIRA; DOMINGUES, 2010). A maior parte é subutilizado ou descartado,
elevando custos de tratamento (GONZÁLEZ-SISO, 1996; SPALATELU, 2012).
O soro de queijo pode ser amplamente requisitado como precursor de
ingredientes, ou como ingrediente na indústria de alimentos (GERNIGON, et al.,
2010), devido à sua composição nutricional, pois retém 55% dos nutrientes do leite
(SPALATELO, 2012). Pode ser classificado de acordo com o teor de proteínas, e ser
aplicado em diversas áreas, agregando valor a produtos e seus derivados, desde
ingrediente alimentício à produção de medicamentos (ALVES, et al., 2014).
Dentre as utilizações industriais, destacam-se a obtenção do isolado proteico
do soro o qual pode ser usado como agente indutor da gelificação (ZHANG et al.,
2014). Ainda no âmbito industrial, o soro pode servir de base para a extração de
lactose, que é o substrato para a síntese de galacto-oligossacarideos. Este
composto possui reconhecida ação prebiótica, com grande benefício para a flora
colônica (MALINOVSKA et al., 2012).
No entanto, a sua utilização na indústria alimentícia requer tratamentos prévios,
como a concentração e desidratação, devido ao elevado conteúdo de água. Isso
eleva os custos e pode tornar o seu uso economicamente inviável. Em estado líquido
é perecível e arriscado o seu armazenamento prolongado (SERPA; PRIAMO;
REGINATTO, 2009).
A lactose quando empregado em alimentos apresenta alguns problemas, como
cristalização, baixa doçura, e, por ser um açúcar redutor, reage com aminas
formando glicosaminas, compostos característicos da reação de Maillard, que
conferem aos alimentos odores e aromas anômalos, bem como perda de
solubilidade (FOX; McSWEENEY, 2009).
Um outro aspecto negativo da lactose é a sua baixa digestibilidade para os
consumidores intolerantes a este açúcar, representado por 70% da população
22
mundial (MICINSKI et al., 2013).
Perante as restrições que o soro de queijo apresenta em alimentos, a sua
utilização pode ser direcionada para a produção de biogás, etanol e proteínas
concentradas (SERPA; PRIAMO; REGINATTO, 2009), evidenciando a ampla
aplicação que este importante produto apresenta (SPALATELU, 2012).
A fermentação da lactose do soro de queijo para produção de etanol e outros
produtos utilizando-se leveduras, é mencionada na literatura desde a década de 40
(GUIMARÃES; TEIXEIRA; DOMINGUES, 2010).
Países como Estados Unidos, Irlanda e Nova Zelândia já empregam 50% do
soro de queijo para este fim, minimizando os problemas ambientais associados ao
seu tratamento e disposição (SADIK; HALEMA, 2014), demonstrando-se como um
sistema eficaz, limpo e seguro para a produção de biocombustíveis e outros
produtos a partir de fontes sustentáveis (BECERRA; CERDÁN; GONZÁLEZ-SISO,
2015).
A primeira planta de produção de etanol a partir da lactose do soro de queijo
com operação comercial foi implantada em 1978 na Irlanda por Carbery Produtos
Lácteos Ltd., iniciando, também, a partir de 1985, a produção de etanol combustível
(LING, 2008). O processo desenvolvido pela empresa denominado “Processo
Carbery”, foi adotado por indústrias nos Estados Unidos e na Nova Zelândia em
Agosto de 2007, onde permanece implantada a Anchor Ltd., maior companhia que
utiliza esta técnica, produzindo cerca de 20 milhões de litros de etanol por ano
(LING, 2008).
Atualmente existem duas plantas de produção de etanol a partir da
fermentação do soro de queijo em escala industrial, nos Estados Unidos, Corona,
Califórnia e Melrose. Ambas iniciaram suas operações em 1980, e são atualmente
operados por cooperativas leiteiras. Estas produzindo juntas 8 milhões de galões de
combustível por ano, equivalente a aproximadamente 30 milhões de litros (LING,
2008).
A estimativa de custos operacionais e de serviços para a produção de etanol a
partir do permeado do soro de queijo, com uma taxa de conversão de substrato em
produto de 100%, é de US $1,60 a 1,85 por galão. Valores semelhantes são citados
por fontes nos Estados Unidos de US $ 1,50 a 4,00 por galão (LING, 2008).
Assim, para que uma usina de produção de etanol combustível seja bem
sucedida, é necessário uma adequada seleção de tecnologia, engenharia, design, e
23
apoio de estudos de viabilidade, financiamento adequado, e um pessoal técnico
gerencial especializado em processos bioquímicos (LING, 2008).
Desta forma, considerando a ótima adaptação que as leveduras do gênero
Saccharomyces apresentam em soro de queijo, objetivou-se neste trabalho analisar
a influência da adição de nutrientes na fermentação do soro de queijo, verificar o
crescimento da levedura e a produção de etanol a partir de diferentes concentrações
de lactose hidrolisada, e examinar o comportamento da levedura em escala
laboratorial e piloto, a fim de viabilizar a produção de etanol.
MATERIAL E MÉTODOS
As etapas empregadas no tratamento do soro de queijo e fermentações, foram
realizadas com base nos resultados de experimentos preliminares, a partir de um
planejamento fatorial 33 para otimização da produção de etanol utilizando-se soro de
queijo desproteinizado concentrado, obtido por (COLOGNESI et al., 2015), que
avaliaram a concentração de soro de queijo desproteinizado, pH inicial e inoculo na
produção de etanol por Saccharomyces fragilis.
Pré-tratamento do soro de queijo
O soro de queijo em pó (Confepar) foi solubilizado em água destilada na
concentração de 15% (m/v) em lactose. A solução foi pré-tratada pela adição de
ácido láctico até pH 4,6, e aquecido por 30 minutos a 90ºC. Após a precipitação, a
fração proteica foi removida por filtração, o pH ajustado para 5,0 e o soro empregado
nos experimentos, denominado soro de queijo desproteinizado (SQD) (COLOGNESI
et al., 2015).
Preparo do Inóculo / Pré-Incubação
A levedura utilizada foi a Saccharomyces fragilis IZ 275, mantida em tubos de
ensaio contendo Ágar Batata Dextrose (PDA) inclinado e armazenado a 6ºC. No
preparo do inóculo foi utilizado o soro de queijo desproteinizado (SQD),
esterilizando-o por 15 minutos a 121ºC em autoclave. O frasco foi inoculado com
uma alça de platina em ambiente estéril, transferindo as colônias da levedura ao
frasco com (SQD). Posteriormente, o frasco foi incubado em agitador orbital
(TECNAL®) a 35ºC, 100 rpm, por 24 horas, e empregado nas fermentações.
24
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Efeito da adição de nutrientes no soro de queijo na produção de etanol por
Saccharomyces fragilis
A partir de estudos prévios realizados por Santiago et al., (2004), que avaliaram
a produção de β-galactosidase por fermentação do soro de queijo suplementado
com nutrientes utilizando Kluyveromyecs marxianus, realizou-se este delineamento
experimental com sete tratamentos e duas repetições (Tabela 1), para avaliar o
efeito destes nutrientes sobre a produção de etanol, empregando a levedura
Saccharomyces fragilis. As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyer
de 250 mL com 100 mL de (SQD), inoculados com 5% (v/v) de inóculo, e os frascos
incubados em agitador orbital (TECNAL®) a 100 rpm, 35ºC durante 24 horas.
Determinando ao final da fermentação o teor de etanol produzido.
Tabela 1. Concentração de fontes de nutrientes adicionadas ao soro de queijo
Tratamentos Fontes de Nutrientes (g/100mL)
T1 Controle 0,0
T2 Extrato de Levedura 1,0
T3 Fosfato de Potássio 0,5
T4 Peptona 1,0
T5 Sulfato de Amônio 0,6
T6 Sulfato de Magnésio 0,06
T7 (T2+T3+T4+T5+T6) (1,0+0,5+1,0+0,6+0,06)
Efeito da hidrólise da lactose do soro de queijo no crescimento e produção de
etanol por Saccharomyces fragilis
O experimento foi realizado com o soro de queijo desproteinizado e a hidrólise
da lactose foi realizada com a enzima β-galactosidase de origem microbiana
(MAXILACT LX5000) em pH 6,6 a 37ºC durante 18 horas, seguido da inativação em
banho-maria a 90ºC por 15 minutos. A formulação do meio (Tabela 2) com diferentes
proporções de soro de queijo com lactose hidrolisada foi fermentada por 24 horas
em agitador orbital (TECNAL®) a 100 rpm e 35ºC. Decorrido o tempo de
fermentação foram analisados a porcentagem de etanol, glicose e lactose final e
células de leveduras.
25
Tabela 2. Formulação de meio para fermentação contendo diferentes proporções de
soro de queijo desproteinizado com lactose hidrolisada
Tratamentos Soro de queijo desproteinizado com
lactose hidrolisada (mL)
Soro de queijo desproteinizado não
hidrolisado (mL)
H1 0 100
H2 10 90
H3 20 80
H4 30 70
H5 40 60
H6 50 50
H7 60 40
H8 70 30
H9 80 20
H10 90 10
H11 100 0
Cinética de fermentação do soro de queijo por Saccharomyces fragilis
As cinéticas de fermentação para a produção de etanol com Saccharomyces
fragilis (SF) foram realizadas em escala laboratorial em frascos Erlenmeyer de
250mL com 100mL de soro de queijo desproteinizado em agitador orbital
(TECNAL®).
Para avaliar a reprodutibilidade em escala piloto foi realizada a cinética de
fermentação com as mesmas variáveis da cinética anterior, em fermentador orbital
(SUCK MILK®), com 50 litros de soro de queijo previamente tratado.
Os meios foram pasteurizados a 90ºC por 30 minutos e resfriados a 35ºC. As
fermentações foram realizadas durante 30 horas, utilizando como substrato 15%
(m/v) de soro de queijo desproteinizado, com pH 5,0 e 5% (v/v) de inóculo, a 35ºC e
100 rpm para a escala laboratorial e 70 rpm para a piloto. A cada duas horas
amostras foram retiradas para a determinação de etanol, glicose e lactose residual, e
número total de células de leveduras.
DETERMINAÇÕES ANALÍTICAS
O etanol produzido foi destilado em microdestilador de etanol (TECNAL®) e
quantificado pelo do método descrito por Kaye e Haag (1954), modificado por Castro
Gómez (1985). A glicose residual das fermentações foi determinada pelo o método
enzimático-colorimétrico de glicose oxidase (Analisa®). A lactose inicial e residual foi
26
determinado pelo método descrito por Nickerson, Vukicic e Lin (1975). A
determinação do número total de células de levedura foi realizada segundo
metodologia descrita por International Dairy Federation (IDF) n. 94B de 1990, e os
resultados expressos em Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC/mL).
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística pelo software
STATISTICA (versão 8.0) da StatSoft. As diferenças entre as médias dos
tratamentos foram determinadas pelo teste de Tukey, ao nível de significância de 5%
(p< 0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito da adição de nutrientes no soro de queijo na produção de etanol por
Saccharomyces fragilis (SF)
As produções de etanol por SF em soro de queijo desproteinizado com adição
de diferentes nutrientes apresentaram variações entre 2,57 a 5,82% (v/v). A maior
produção de etanol foi obtida nos tratamentos T2 e T5, com adição de extrato de
levedura e sulfato de amônio respetivamente, sem diferenças significativas pelo
teste de Tukey, ao nível de significância de 5% (p< 0,05) (Tabela 3).
Tabela 3. Efeito da adição de nutrientes no soro de queijo na produção de etanol
(média ± desvio padrão).
Nutrientes Etanol (%) ± Desvio Padrão
T1. Controle 5,52c±0,049
T2. Extrato de Levedura 5,80ab
±0,014
T3. Fosfato de Potássio 5,40d±0,049
T4. Peptona 2,57f±0,035
T5. Sulfato de Amônio 5,82a±0,028
T6. Sulfato de Magnésio 4,80e±0,007
T7. Todos os Anteriores 5,67b±0,042
a,b,c,d: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas
(p<0,05) entre os nutrientes adicionados a fermentação.
A menor produção de etanol foi obtida com a adição de peptona no soro de
queijo, tratamento T4, com apenas 2,57% (v/v), demonstrando não ser um
27
suplemento adequado para a produção de etanol. No entanto, Santos et al., (2013),
obtiveram em meios sintéticos de glicose e sacarose suplementados com 1% (m/v)
de peptona, resultados favoráveis para a produção de etanol.
As fermentações T2 e T5 exibiram uma produção de +5,07 e +5,43%, em
relação ao tratamento controle, cuja produção foi de 5,52% (m/v). Isso demonstra
que os nutrientes do soro de queijo são suficientes para a fermentação, e pode ser
utilizado como meio de cultura sem suplementação, na fermentação e produção de
etanol com leveduras do gênero Saccharomyces (SANTIAGO et al., 2004).
Os nutrientes do meio são fundamentais por influenciarem no desenvolvimento
das leveduras (SOUSA e MONTEIRO, 2011), afetando a velocidade de crescimento
e a multiplicação (CAMILI; CABELLO, 2007), porém a concentração correta é
importante, pois pode inibir o crescimento, e influenciar negativamente na eficiência
de transformação do açúcar em etanol, quando presentes em quantidades
insuficientes ou exageradas (CAMILI; CABELLO, 2007; SILVA, 2007).
Efeito da hidrólise da lactose do soro de queijo no crescimento e produção de
etanol por Saccharomyces fragilis
Os diferentes níveis de hidrólise da lactose do soro de queijo desproteinizado,
proporcionaram produções que variaram de 3,70 a 5,13% (v/v) de etanol. As maiores
produções foram obtidas nos tratamentos H2, 4,97% a H4, 5,12% (v/v), sem
diferenças significativas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% (p<0,05). Assim, com
10 a 30% de lactose hidrolisada houve a maior produção de etanol,
independentemente do crescimento celular, cujo maior valor foi observado a partir do
tratamento H5 até H11, sem diferenças significativas pelo teste de Tukey, ao nível
de 5% (p<0,05), exceto o tratamento H6.
O maior crescimento se deve a elevada disponibilidade de monossacarídeos
como a glicose e galactose, que fazem com que a levedura se desenvolva mais
rapidamente ao meio e inicie o processo fermentativo.
A partir do tratamento com 40% de hidrólise (H5) com 4,64% (v/v) de etanol,
houve redução significativa na produção de etanol até T11 com 3,70% (v/v). Esta
relação pode ser explicada pelo excesso de açúcares simples presentes no meio
para fermentação, ocorrendo a inibição do metabolismo da levedura por repressão
do catabolismo por substrato, que ocorre a partir de 16% (m/v) de glicose (EZEJI;
QURESHI; BLASCHEK, 2004; MADDOX, 1989; VASCONCELOS, 1983).
28
Não houve residual de lactose após 24 horas de fermentação, exceto nas
fermentações: controle (H1) e as com menor hidrólise H2 (10%) e H3 (20%) (Tabela
4). Também, no meio controle (H1), sem lactose hidrolisada, obteve-se o menor
crescimento celular, 7x107 UFC/mL, devido a baixa disponibilidade de
monossacarídeos. Nesta situação a levedura precisa inicialmente se adaptar ao
meio para depois iniciar a conversão da lactose em açúcares simples e produção de
etanol e outros compostos.
Tabela 2. Efeito da hidrólise da lactose no crescimento e produção de etanol
(media ± desvio padrão).
Tratamentos Etanol (%) Lactose Final (%) Glicose Final (%) UFC/mL 10^7
H1 4,73cd
±0,042 0,263c±0,001
0,0036
df±0,003
7
e±2,121
H2 5,13a±0,035
0,381
a±0,001
0,0033
f±0,002
12
cde±0,707
H3 4,92b±0,092
0,295
b±0,002
0,0038
df±0,003
11
cde±1,414
H4 4,97ab
±0,049
0,000d±0,000
0,0038
df±0,003
10
de±1,414
H5 4,64de
±0,042
0,000d±0,000
0,0044
bcd±0,003
16
abc±1,414
H6 3,69h±0,021
0,000
d±0,000
0,0053
ab±0,003
13
bcd±0,707
H7 4,12g±0,021
0,000
d±0,000
0,0052
abc±0,003
15
abcd±0,707
H8 4,85bc
±0,014
0,000d±0,000
0,0042
cdf±0,003
17
ab±1,414
H9 4,53e±0,028
0,000
d±0,000
0,0040
df±0,003
19
a±1,414
H10 4,31f±0,028
0,000
d±0,000
0,0041
df±0,003
16
abc±1,414
H11 3,70h±0,028
0,000
d±0,000
0,0062
a±0,002
16
abc±0,707
a,b,c,d: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas
(p<0,05) entre as frações de soro de queijo hidrolisada.
A hidrólise do soro de queijo acrescenta custos adicionais à fermentação, já
que as leveduras do gênero Saccharomyces, em especial a espécie marxianus se
destacam pela sua diversidade metabólica, por ser capaz de metabolizar uma
variedade de carboidratos como pentoses, hexoses e dissacarídeos (LANE;
MORRISSEY, 2010). Além de outros atributos para fermentação em processos
industriais, como termotolerância, elevada taxa de crescimento quando comparada a
Kluyveromyces lactis e capacidade de converter os substratos de baixo custo como
a lactose do soro de queijo em etanol, com elevados rendimentos a baixos níveis de
oxigênio (LANE et al., 2011; SILVEIRA et al., 2005).
Logo, a hidrólise prévia do soro de queijo torna-se economicamente inviável,
29
devido aos custos adicionais ao processo fermentativo, já que cada mL da enzima β-
galactosidase custa R$1,25, sendo suficiente para hidrolisar apenas 1 L de soro.
Cinética de fermentação do soro de queijo por Saccharomyces fragilis
Na cinética de fermentação em escala laboratorial, avaliou-se a produção de
etanol, consumo de lactose, crescimento celular e teor de glicose no meio de cultivo
durante as 30 horas do ciclo fermentativo (Figura 1).
A produção de etanol cresceu linearmente de 8 até 18 horas de fermentação
na velocidade de 0,50%.h-1 de etanol (R2 = 0,994), quando alcançou a maior
concentração, com 5,57% (v/v) de etanol. Neste período toda a lactose foi
consumida, na velocidade de 0,80%.h-1 de lactose (R2 = 0,962) (Figura 1). Isso
indica que, na escala laboratorial, a fermentação pode ser finalizada com 18 horas.
Observou-se ainda que não houve diferenças significativas (Tukey, 5% de
significância: p<0,05) na concentração de etanol entre 14 e 30 horas de fermentação
com 3,48 a 4,12% (v/v), respectivamente (Tabela 5).
A concentração de glicose residual permaneceu constante durante a
fermentação entre 0,02 a 0,09% (v/v), indicando que a levedura hidrolisa a
quantidade de lactose necessária para o seu metabolismo transformá-la em etanol e
dióxido de carbono.
30
Figura 1. Cinética de fermentação do soro de queijo concentrado por Saccharomyces
fragilis em escala laboratorial.
Na multiplicação celular a levedura teve um crescimento logarítmico até 10
horas de fermentação, quando alcançou 1,49.108 UFC/mL. A taxa de crescimento
entre 12 e 24 horas foi menor, mesmo assim alcançou 2,1.108 UFC/mL. A partir das
26 horas de fermentação, a levedura iniciou a fase de declínio alcançando ao final,
após 30 horas de fermentação 9.107 UFC/mL. Provavelmente a morte celular foi
devido à ausência de lactose no meio de fermentação, já que após 18 horas de
fermentação, praticamente toda lactose já havia sido consumida pela levedura.
O mesmo comportamento foi observado por Colognesi et al., (2015) e Murari et
al., (2013), quando relataram que em suas fermentações a produção de etanol
apresenta um declínio à medida que a lactose vai se esgotando, podendo a levedura
tolerar uma concentração de 10,67% (v/v) de etanol. Assim, na maioria das vezes, a
redução da multiplicação celular não está associada apenas à elevada concentração
de etanol, mas à ausência de nutrientes.
Tabela 3. Valores dos parâmetros durante a cinética de fermentação por
Saccharomyces fragilis em escala laboratorial (média ± desvio padrão).
Tempo (h) Etanol (%) Lactose Final (%) Glicose Final (%) UFC/mL 10^7
2 0,07e±0,005 12,9
a±2,496 0,03
abc±0,002 0,9
d±0,000
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25 30
Eta
nol/G
licose/L
acto
se/U
FC
/mL
10
^7
Tempo (h)
Etanol %
Lactose %
Glicose %
UFC/mL 10^7
31
4 0,09e±0,014 9,47
b±0,460 0,02
c±0,001 3,1
d±0,071
6 0,26de
±0,030 9,04ab
±1,104 0,02bc±0,003 7,35
cd±0,354
8 0,57de
±0,013 8,83ab
±0,184 0,03abc
±0,000 10,4bc
±0,849
10 1,81cd
±0,106 7,67b±0,002 0,04
abc±0,001 14,9
bc±1,768
12 2,44bc
±0,088 4,32b±0,505 0,04
abc±0,023 15,1
bc±0,495
14 3,48abc
±0,307 3,71c±0,001 0,03
abc±0,014 16,8
ab±1,697
16 4,69ab
±1,063 1,61cd
±0,323 0,04abc
±0,008 17,4ab
±1,273
18 5,57a±0,684 0,09
d±0,001 0,04
abc±0,003 17,2
bc±4,101
20 4,22a±0,138 0,03
d±0,002 0,04
abc±0,003 18,5
ab±0,884
22 3,77a±0,546 0,09
d±0,002 0,09
a±0,000 18,8
ab±1,061
24 4,65a±0,146 0,02
d±0,003 0,04
abc±0,002 21,4
a±4,101
26 4,19ab
±0,481 0,02d±0,001 0,04
abc±0,002 19,5
ab±2,475
28 3,82a±0,592 0,02
d±0,002 0,04
abc±0,001 18,4
ab±1,556
30 4,12a±0,085 0,05
d±0,034 0,05
ab±0,006 9,15
bc±3,960
a,b,c,d: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas
(p<0,05) durante a cinética de fermentação.
Na cinética de fermentação em escala piloto, com 50 litros de soro de queijo
desproteinizado, a produção de etanol foi crescente e linear, a uma velocidade de
0,20%.h-1 de etanol (R2 = 0,984) até 28 horas, quando alcançou a concentração de
5,66% (v/v), (Figura 2), embora não houve diferenças significativas pelo teste de
Tukey, ao nível de 5% (p<0,05), entre 26, 28 e 30 horas, com 5,19; 5,66 e 5,40%
(v/v) de etanol respectivamente (Tabela 6).
Embora a produção de etanol nas cinéticas laboratorial (5,57% v/v) e piloto
com (5,66% v/v), tenha sido próximas, o tempo de fermentação foi expressivamente
maior na segunda, com 28 horas em comparação às 18 horas da fermentação
laboratorial.
Por outro lado estes valores estão acima ao obtido em outros trabalhos, como
a produção de etanol de 1,87% (v/v) obtidos a partir de 5,76% (m/v) de lactose, após
10 horas de fermentação com Kluyveromyces marxianus 229 (MURARI et al., 2013).
Dahiya e Vij (2012), por sua vez, obtiveram uma produção de apenas 2,0 e 2,5%
(v/v) no estado livre e imobilizado, respectivamente, após 72 horas de fermentação
com a mesma levedura.
32
Figura 2. Cinética de fermentação do soro de queijo concentrado por
Saccharomyces fragilis em escala piloto.
A curva de lactose foi decrescente na velocidade de 0,27%.h-1 de lactose (R2 =
0,945), entre 0 e 8 horas. No tempo entre 8 e 14 horas o consumo de lactose foi
maior, com velocidade de 1,11%.h-1 de lactose (R2 = 0,969). Este rápido consumo
neste período está relacionado com o maior crescimento celular. Já entre 14 e 30
horas o consumo foi menor, com velocidade de 0,17%.h-1 de lactose (R2 = 0,926).
Após o período de 30 horas de fermentação houve um resíduo de apenas 0,85%
(v/v) de lactose. A concentração de glicose foi constante durante toda fermentação,
variando entre 0,026 a 0,061% (v/v), (Tabela 6), reproduzindo o que foi observado
na cinética laboratorial.
O crescimento celular foi linear a uma velocidade de 1,64UFC/mL.h-1 (R2=
0,983) até 14 horas de fermentação, quando alcançou 2,2.108 UFC/mL. Após 16
horas houve uma redução acentuada na contagem da levedura chegando a 6,3.107
UFC/mL as 20 horas. A partir de 22 horas o declínio foi menor e após 30 horas de
fermentação, a contagem foi de 4,3.107 UFC/mL (Tabela 6).
Tabela 4. Valores dos parâmetros durante a cinética de fermentação por
Saccharomyces fragilis em escala piloto (média ± desvio padrão).
Tempo (h) Etanol (%) Lactose Final (%) Glicose Final (%) UFC/mL 10^7
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Eta
nol/G
licose/L
acto
se/U
FC
/mL1
0^7
Tempo (h)
Etanol %
Lactose %
Glicose %
UFC/mL 10^7
33
2 0,46k±0,008 11,45
a±0,078
0,026
d±0,003 2,9
e±0,636
4 0,65jk±0,010
10,98
b±0,092
0,028
d±0,001
8,3
cde±0,071
6 0,90jk±0,016
10,44
c±0,071
0,032
d±0,004 10,3
bcde±1,414
8 1,29ij±0,177
10,20
d±0,064
0,033
cd±0,001 11,6
bcd±3,960
10 1,90hi±0,027
9,04
e±0,078
0,047
abc±0,004 17,7
ab±2,828
12 2,43gh
±0,010
6,50f±0,028
0,030
d±0,003 20,5
a±2,828
14 2,60g±0,261
3,63
g±0,035
0,061
a±0,004 22,6
a±4,243
16 3,36f±0,035
3,33
h±0,021
0,038
bcd±0,004 15,7
abc±1,414
18 3,81ef±0,088
2,48
i±0,028
0,052
ab±0,003 11,6
bcd±1,273
20 4,32de
±0,097
2,29i±0,049
0,040
bcd±0,005 6,3
de±0,849
22 4,70cd
±0,146
1,52j±0,042
0,030
d±0,004 5,9
de±1,697
24 4,80cde
±0,129
1,45j±0,007
0,031
d±0,003 5,8
de±2,121
26 5,19abc
±0,330
1,37jk±0,127
0,032
d±0,004 5,1
de±1,061
28 5,66a±0,052
1,17
k±0,007
0,032
d±0,005 4,6
de±1,414
30 5,40ab
±0,432
0,85l±0,071
0,032
d±0,006 4,3
e±0,707
a,b,c,d: letras minúsculas diferentes sobrescritas na mesma coluna indicam diferenças significativas
(p<0,05) durante a cinética de fermentação.
O processo fermentativo origina uma série de compostos que podem atuar
como inibidores potenciais. Entre eles está o etanol, um metabólito produzido em
maior quantidade, que pode ser tóxico após uma determinada concentração,
causando redução na viabilidade celular das leveduras, devido ao estresse causado
pela exposição das mesmas ao etanol (SILVA et al., 2008), que provoca alterações
na composição da camada lipídica da membrana, agindo de maneira sinergística
intoxicando a célula da levedura, levando-a a morte, com redução da viabilidade
celular (OLIVA NETO, 2006).
No entanto, a tolerância a diferentes concentrações de etanol ainda não está
totalmente compreendida. Dessa forma, o processo catalítico de conversão da
lactose em etanol pode ser influenciado pela concentração de lactose do meio de
fermentação ou o etanol produzido pode alterar o metabolismo do microrganismo.
Contudo, a levedura Kluyveromyces marxianus vem sendo empregada com sucesso
em pesquisas, demonstrando ser potencialmente viável no processo de conversão
da lactose em etanol (SILVEIRA et al., 2005).
Assim, tensões severas durante a fermentação, como alto teor alcoólico,
elevada pressão osmótica do substrato e forte inibição do etanol durante a fase de
produção, podem causar a perda da viabilidade celular com consequente morte
34
celular, e aumento do período de fermentação (CHRISTENSEN et al., 2011; LI et al.,
2009; STANLEY et al., 2010).
Valores acima de 10% de etanol podem ocasionar uma diminuição da
eficiência da levedura nas fermentações, pela sua desnaturação, cessando a
produção de etanol devido à dissolução da membrana plasmática da célula,
enquanto um teor abaixo de 7% prejudica o rendimento da fermentação (SOUSA;
MONTEIRO, 2011; SILVA et al., 2008; SILVA et al., 2003).
Da mesma forma, a fermentação é afetada por outros fatores além da elevada
concentração de etanol, tais como inibição pelo substrato ou concentração de sais,
sendo reduzida pelo aumento de células mortas, déficit de nutrientes, baixa atividade
de água, acúmulo de polissacarídeos e de outras macromoléculas, ou perdas
indesejáveis de oxigênio no fermentador (EZEJI; QURESHI; BLASCHEK, 2004;
KUMAR; GAYEN, 2011; MADDOX, 1989).
CONCLUSÃO
A suplementação do soro de queijo com extrato de levedura ou sulfato de
amônio na fermentação do soro de queijo com Saccharomyces fragilis
proporcionaram as maiores produções de etanol, com 5,80 e 5,82 respectivamente.
No entanto, devido a elevada disponibilidade de nutrientes que o soro de queijo
apresenta, a suplementação não demonstrou-se vantajosa perante os resultados
obtidos, quando comparado com a fermentação controle.
Da mesma forma, a hidrólise parcial da lactose do soro de queijo apresentou
melhor produção de etanol. Entretanto o pequeno aumento na produção do etanol
proporcionado pela utilização desta tecnologia, em processos industriais, o torna
inviável economicamente pelo elevado custo da enzima β-galactosidase, e pelos
processos adicionais, como utilização adicional de energia e tempo de
processamento.
As cinéticas, laboratorial e piloto, apresentaram semelhanças na produção de
etanol, no entanto, a fermentação em escala piloto necessitou de um tempo maior
de fermentação.
Assim, pode-se observar que as leveduras do gênero Saccharomyces são
capazes de fermentar o soro de queijo desproteinizado em escala piloto, indicando
possibilidades de uso em escala industrial, apresentando-se como uma forma de
reduzir o potencial poluidor deste subproduto, e ao mesmo tempo obter produto de
35
valor agregado.
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