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Produção de biossurfactantes em biorreator assistido por processos com membranas

Biosurfactants production in bioreactor assisted with membrane process Producción de biosurfactantes en un biorreactor asistido por procesos de membranas

Frederico de Araujo KronembergerDenise Maria Guimarães FreireCristiano Piacsek Borges

ResumoOs surfactantes sintetizados quimicamente são extensamente usados nas indústrias farmacêutica, alimentícia e de petró-

leo. Entretanto, com as vantagens de biodegradabilidade e de produção em substratos renováveis, as moléculas tensoativas produzidas por micro-organismos, os biossurfactantes, podem eventualmente substituí-los. Até hoje, o uso de biossurfactantes está limitado a algumas aplicações específicas, já que não são economicamente competitivos. Há a necessidade de se aprimo-rar a tecnologia dos processos fermentativos para a ampliação de escala e a redução dos custos de produção. A maior parte dos biossurfactantes estudados é produzida por micro-organismos aeróbios. A principal dificuldade encontrada nessas fermen-tações é a formação excessiva de espuma, decorrente da injeção de ar no vaso. Para contornar este problema, um contactor de membrana pode ser utilizado para a transferência não dispersiva de oxigênio da fase gasosa para a líquida. O principal objetivo deste trabalho foi a produção de biossurfactantes do tipo ramnolipídeo a partir de uma cepa de Pseudomonas aeruginosa (PA1), isolada em poços de petróleo. Essa produção foi realizada com o uso de um contactor de membranas na forma de fibras-ocas para a oxigenação do meio de cultivo. Os resultados descritos no trabalho indicam que é viável economicamente a produção, em larga escala, deste biossurfactante.

palavras-chave: n Biossurfactantes n oxigenação n biorreatores n membranas n contactores

AbstractChemically synthesized surfactants are widely used in the pharmaceutical, food and oil industries. However, they may

eventually be replaced by biosurfactants, which are biodegradable and produced from renewable substrates, the surface- active molecules produced by micro-organisms. Currently biosurfactants use is limited to some specific applications as they are not economically competitive. The fermentation technology needs to be improved to expand the production scale and lower costs. The most studied biosurfactants are produced by aerobic microorganisms. The main difficulty of this fermen-tation process is the excess foam caused by injecting air into the vessel. To overcome this problem, a membrane contactor

Boletim Técnico da Petrobras, Rio de Janeiro, v. 53, n. 1/3, p. 109-122, abr./ago./dez. 2010 n 109

IntroduçãoOs avanços em ciência e tecnologia desde a revolução in-

dustrial vêm aumentando constantemente a possibilidade da exploração dos recursos naturais. Essa exploração tem gera-do distúrbios nos ciclos elementares globais. A introdução de produtos químicos exógenos a determinado local pode sem-pre sobrepujar sua capacidade de autorremediação, resul-tando no acúmulo danoso destes produtos. Contaminações por hidrocarbonetos em derramamentos de petróleo e seus derivados têm causado sérios problemas ambientais e aten-ção adicional está sendo dispensada ao desenvolvimento e implementação de novas tecnologias para a devida limpeza. Diversos métodos de remediação de solos e ambientes im-pactados com petróleo e seus derivados estão sendo desen-volvidos como alternativas ambientalmente corretas.

can be used for the non-dispersive transfer of oxygen from the gas to liquid phase. The main objective of this study was to produce rhamnolipidic type biosurfactants from a strain of Pseudomonas aeruginosa (PA1), isolated from oil wells. This production used a hollow-fiber membrane contactor to oxygenate the culture medium. The study results indicate this biosurfactant is economically viable in large scale production.

keywords: n Biosurfactants n oxygenation n bioreactors n membrane contactors

ResumenLos surfactantes químicamente sintetizados son ampliamente utilizados en las industrias farmacéuticas, alimenticias y

petróleo. Sin embargo, con el tiempo podrán ser sustituidos por biosurfactantes. Los biosurfactantes son biodegradables y producidos a partir de sustratos renovables, que son moléculas activas de superficie, producidas por microorganismos. En la actualidad el uso de biosurfactantes se limita a algunas aplicaciones específicas, ya que no son económicamente competitivos. La tecnología de fermentación debe ser mejorada para ampliar la escala de producción y reducir costos. Los biosurfactantes más estudiados son producidos por microorganismos aerobios. La principal dificultad en este proceso de fermentación es el exceso de espuma causada por la inyección de aire en el vaso. Para superar este problema, contactores de membrana pueden ser utilizados para la transferencia no dispersiva de oxígeno de la fase de gas para la fase líquida. El objetivo principal de este estudio fue producir biosurfactantes del tipo ramnolipidos de una cepa de Pseudomonas aeruginosa (PA1), aislados de los pozos de petróleo. Esta producción utiliza un contactor de membrana de fibra hueca para oxigenar el medio de cultivo. Los resultados del estudio indican que este biosurfactante es económicamente viable en la producción a gran escala.

palabras-clave: n Biosurfactantes n oxigenación n biorreactores n contactores de membrana


A degradação completa de petróleo cru requer a ação simul-tânea de diferentes grupos microbianos, já que uma simples es-pécie não é capaz de degradar todos os seus componentes. O principal fator que dificulta a biodegradação destes poluentes é a sua limitada disponibilidade aos micro-organismos. Hidrocarbo-netos geralmente se agregam aos componentes do solo, sendo de difícil remoção ou degradação. Compostos tensoativos redu-zem as tensões superficial e interfacial através de seu acúmulo na interface de fluidos imiscíveis ou de um fluido e um sólido, au-mentando a área de compostos insolúveis, levando ao aumen-to de sua disponibilidade e subsequente biodegradação. Estes compostos podem ser produzidos por via química ou bioquímica e são denominados surfactantes.

Estas substâncias são utilizadas industrialmente com di-versos objetivos, mas por muitos anos vem sendo sintetizadas

110 n Boletim Técnico da Petrobras, Rio de Janeiro, v. 53, n. 1/3, p. 109-122, abr./ago./dez. 2010

a produção de surfactantes por via química, o caráter pron-tamente biodegradável dos biossurfactantes indica que eles podem ser utilizados para remediar solos impactados com hi-drocarbonetos sem a geração de outros problemas ambien-tais – um aspecto que irá apresentar maior importância nos processos industriais, na medida em que forem adotados controles legislativos mais rigorosos (Fiechter, 1992).

Nos últimos anos, vários acidentes com derramamentos de petróleo têm resultado na contaminação de ambientes terrestres e aquáticos. Entre os mais significativos, estão o derramamento de 40.000m3 de petróleo do navio Exxon Val-dez, no Alasca, em 1989 e o vazamento de 300.000m3 de óleo do petroleiro Braer, no Reino Unido, em 1993. No Bra-sil, podem ser citados o derramamento de 1.300m3 de óleo na Baía de Guanabara, no Rio de Janeiro e o vazamento de 4.000m3 de óleo no Estado do Paraná, ambos em 2000 (San-tos, 2003).

A remediação microbiana de solos contaminados com hidrocarbonetos é uma tecnologia emergente envolvendo a aplicação de biossurfactantes. A biodegradação de hidrocar-bonetos pelas populações microbianas nativas é o mecanis-mo primário pelo qual estes compostos são removidos do meio ambiente e a adição de biossurfactantes estimula essa degradação. A habilidade dos biossurfactantes de emulsifi-car misturas de hidrocarbonetos e água aumenta significa-tivamente a sua degradação e assim, é potencialmente útil para o gerenciamento de derramamentos de petróleo em ambientes aquosos. Os biossurfactantes também são úteis na biorremediação de locais contaminados com metais pe-sados tóxicos, como urânio, cádmio e chumbo (Miller, 1995).

Muitos biossurfactantes e seus processos produtivos fo-ram patenteados, mas somente alguns foram comercializa-dos. Atualmente, alguns produtos com base em biossurfac-tantes podem ser encontrados no mercado internacional, como o PD5, produzido pela Pendragon Holdings, vendido como um aditivo para combustíveis baseado em uma mis-tura de biossurfactantes do tipo ramnolipídeo e enzimas; o EC-601, produzido pela EcoChem Organics, comercializado como dispersante de hidrocarbonetos insolúveis em água (ramnolipídeos) e os produtos JBR, da Jeneil Biosurfactant Company, ramnolipídeos em soluções aquosas com diferen-tes graus de pureza ou em uma forma semi-sólida.

Kronemberger et al.

quimicamente. Os compostos biológicos tensoativos, denomi-nados biossurfactantes, que começaram a ser utilizados nas úl-timas décadas, são produzidos por algumas cepas bacterianas que degradam ou transformam os componentes do petróleo (Rahman et al., 2002; Rahman et al., 2003). Estes biossurfactan-tes estão ganhando notoriedade já que podem ser utilizados em várias importantes aplicações industriais, devido às suas vanta-gens de biodegradabilidade, produção a partir de fontes reno-váveis e funcionalidade sob condições extremas (Banat, 1995).

Micro-organismos se mostram capazes de produzir uma grande variedade de produtos com excelentes propriedades tensoativas. Entretanto, seu uso em determinadas aplica-ções depende do custo de produção e purificação para ativi-dades específicas, se comparados aos surfactantes sintéti-cos correspondentes.

Deste modo, os últimos trabalhos estão concentrados na identificação de potenciais surfactantes, na avaliação de suas propriedades e na otimização dos processos fermenta-tivos para sua produção (Parkinson, 1985).

No momento, os biossurfactantes ainda não são capazes de competir economicamente com os compostos sintetizados qui-micamente no mercado, devido aos altos custos de produção. Isso é resultado da metodologia ineficiente do bioprocessamen-to, da baixa produtividade das cepas microbianas e da necessi-dade do uso de substratos caros. Consequentemente, para que os biossurfactantes atinjam uma parcela significativa do merca-do, é necessário que haja um maior conhecimento e habilidade tanto para a manipulação do metabolismo das cepas produto-ras, como para a possibilidade do uso de substratos mais bara-tos, e o aperfeiçoamento tecnológico do processo de produção.

Uma grande variedade de surfactantes é conhecida e, com o aumento da lista dos organismos produtores de bios-surfactantes, o espectro de suas propriedades físicas e quí-micas se ampliará, levando à descoberta de compostos apropriados para aplicações especiais. O aperfeiçoamento da caracterização das cepas pode abrir caminho para a mani-pulação genética dos organismos, possibilitando o seu ajuste para um desempenho ótimo.

Em adição ao custo crescente e incerteza no abasteci-mento de petróleo, que é usado como matéria-prima para


O custo de produção de biossurfactantes é aproximada-mente de 3 a 10 vezes maior do que o de surfactantes quími-cos. Geralmente os biossurfactantes são produzidos durante o crescimento dos micro-organismos em hidrocarbonetos, que normalmente são caros, aumentando o custo total do processo. Contudo, outros substratos mais baratos e so-lúveis em água, como a glicose, o glicerol e o etanol vem sendo utilizados. Na busca por matérias-primas mais eco-nômicas para a produção de biossurfactantes, os efluentes industriais e os resíduos agroindustriais se mostram como uma excelente opção (Desai e Banat, 1997).

Muitas das aplicações potenciais consideradas para os biossurfactantes dependem de sua produção de forma eco-nômica. Assim, muito esforço ainda é necessário para a oti-mização do processo nos campos da biologia e engenharia. Ademais, aspectos legais, como normas mais severas relati-vas à manutenção da saúde da população e em relação à po-luição do meio ambiente por atividades industriais também favorecerão a substituição, pelos biossurfactantes, de seus equivalentes químicos (Fiechter, 1992).

De acordo com Gruber et al. (1993), os pré-requisitos para a produção competitiva de biossurfactantes são os se-guintes: a obtenção de produtos com grande atividade, pro-duzidos a partir de substratos baratos através de processos economicamente viáveis e com alto rendimento. Um aspec-to favorável economicamente para a produção de biossur-factantes no Brasil, a partir de substratos de baixo custo, foi a sanção da Lei 11.097 de 13 de janeiro de 2005, que auto-riza a introdução do biodiesel na matriz energética brasileira. Assim, alguns projetos privados já estão em andamento para a produção do novo combustível, com capacidade instalada total acima de 100 milhões de litros por ano. Como o prin-cipal subproduto da produção de biodiesel é o glicerol, este pode ser utilizado a um baixíssimo custo para a produção de biossurfactantes (Ma e Hanna, 1999; Ministério de Minas e Energia, 2005). O maior desafio então recai no desenvolvi-mento tecnológico de um processo produtivo eficiente, de alto rendimento, e na redução das etapas posteriores de re-cuperação e purificação do produto.

A maioria dos micro-organismos produtores de biossur-factantes conhecidos necessita de condições aeróbicas para a produção dos mesmos, de modo eficiente. Entretanto, o

uso da aeração submersa convencional pode levar à forma-ção de espumas muito estáveis, causando sérios problemas operacionais. E isso é particularmente válido para a produção de biossurfactantes do tipo ramnolipídeo. A alta produção de espumas ainda é aumentada pela presença de proteínas ex-tracelulares e pelas próprias células microbianas, resultan-do em grandes gastos para o controle das mesmas e, mui-tas vezes, inviabilizando o processo produtivo. Quebradores de espuma mecânicos não são muito eficientes e agentes antiespumantes químicos podem alterar a qualidade do pro-duto e o potencial poluente do efluente final do fermenta-dor (Gruber et al., 1993). Para superar essa dificuldade, um contactor de membranas pode ser utilizado para promover a transferência de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida sem a dispersão dessas fases. Este processo já foi descrito por Gruber et al. (1993).

Desta forma, o principal objetivo deste trabalho é investigar a produção destes biossurfactantes em fermentadores acopla-dos a contactores de oxigenação através de membranas.

Revisão BibliográficaBiossurfactantes: definição e classificação

Os surfactantes são moléculas anfipáticas com porções tanto hidrofílicas quanto hidrofóbicas (geralmente hidrocar-bonetos) que se repartem preferencialmente na interface en-tre fases fluidas, através de diferentes graus de polaridade e ligações de hidrogênio, como as interfaces entre óleo e água ou água e ar. Essas propriedades conferem aos surfactantes a capacidade de reduzir tensões superficiais e interfaciais e de promover a formação de microemulsões, onde água pode solubilizar hidrocarbonetos. Estas características conferem excelentes propriedades detergentes, emulsificantes, espu-mantes e dispersantes, que fazem dos surfactantes alguns dos mais versáteis produtos químicos.

Um biossurfactante é definido como uma molécula ten-soativa produzida por células vivas, na maioria dos casos, por micro-organismos. A principal função fisiológica dos biossur-factantes é permitir o crescimento dos micro-organismos em substratos imiscíveis em água, através da redução da ten-



são interfacial entre as fases, tornando o substrato disponí-vel para a sua assimilação e metabolização.

Uma grande variedade de biossurfactantes é conheci-

da e seu tipo, quantidade e qualidade são influenciadas pelo micro-organismo produtor, pela natureza do substrato dispo-nível, pela concentração de íons de nitrogênio, fósforo, mag-nésio, ferro e manganês no meio e pelas demais condições de cultura, como pH, temperatura, agitação, oxigenação e taxa de diluição (Banat, 1995).

A atividade de um biossurfactante pode ser avaliada atra-vés do acompanhamento de mudanças nas medidas de ten-sões superficiais e interfaciais, na estabilização ou desesta-bilização de emulsões e no balanço hidrofílico-lipofílico. A tensão superficial pode ser facilmente medida com o uso de um tensiômetro. A tensão superficial de água destilada é de 72mN/m, mas a adição de surfactantes pode reduzir este va-lor para até 30mN/m (Desai e Banat, 1997).

Embora haja um grande número de relatos sobre a síntese de biossurfactantes por micro-organismos que degradam hi-drocarbonetos, alguns biossurfactantes podem ser obtidos em compostos solúveis em água, como glicose, sacarose, glicerol e etanol. Os micro-organismos produtores de biossurfactan-tes estão distribuídos em uma grande variedade de gêneros.

Os biossurfactantes mais conhecidos são os glicolipí- deos, que consistem de carboidratos combinados com áci-

dos alifáticos ou hidroxialifáticos de cadeia longa. Entre os glicolipídeos, os mais investigados são os ramnolipídeos, os trealolipídeos e os soforolipídeos (Desai e Banat, 1997).

Ramnolipídeos

Os ramnolipídeos são os glicolipídeos mais estudados. São formados por uma ou duas moléculas de ramnose liga-das a uma ou duas moléculas de ácido β-hidroxidecanóico. A produção de glicolipídeos contendo ramnose por Pseudo-monas aeruginosa foi primeiramente relatada por Jarvis e Johnson (1949). Os principais glicolipídeos produzidos por P. aeruginosa são os ramnolipídeos dos tipos 1 e 2, L-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato e L-ramnosil-L-ramnosil-β hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato, respectivamente. Suas estruturas podem ser vistas na figura1. A formação de ra-mnolipídeos dos tipos 3 e 4, contendo uma molécula de áci-do β-hidroxidecanóico e uma ou duas unidades de ramnose, respectivamente, metil-ésteres derivados dos ramnolipíde-os 1 e 2 e ramnolipídeos com outras cadeias de ácidos gra-xos, também já foram previamente reportadas (Desai e Ba-nat, 1997).

A composição da mistura de tipos de ramnolipídeos pode influenciar bastante suas propriedades físico-químicas. Uma mistura de ramnolipídeos dos tipos 1 (C28H48O9, 504g/gmol) e 2 (C32H58O13, 650g/gmol) pode reduzir a tensão superficial da água para 29mN/m, quando em concentração superior à concentração micelar crítica. Essa concentração foi determi-

Kronemberger et al.

Figura 1 – Modelos de esferas rígidas para as estrutu-ras dos ramnolipídeos tipos 1 e 2 em suas posições de energia mínima: carbono - verde; oxigênio - vermelho; hidrogênio - cinza (Helvaci et al., 2004).

Figure 1 – Figure 1: Models of rigid spheres of rhamnolipidic type 1 and 2 structures in their positions of minimum energy: carbon - green, oxygen - red, hydrogen - gray (Helvaci et al., 2004).

Figura 1 – Modelos de esferas rígidas de estructuras de los ramnolípidos del tipo 1 y 2 en sus posiciones de energía mínima: carbono - verde, oxígeno - rojo, hidrógeno gris (Helvaci et al., 2004).


nada por Santa Anna et al. (2002), apresentando um valor de apenas 19mg/L. Esse biossurfactante pode ser conside-rado não volátil, estável à temperatura ambiente e a 121ºC por pelo menos 1 hora. Entretanto, essa mistura é instável sob valores extremos de pH, devido à hidrólise da ligação gli-cosídica entre o açúcar e o lipídeo. Ela é rapidamente bio-degradável e apresenta graduação mínima na classificação HMIS (Hazardous Materials Identification System) em todos os quesitos: saúde, inflamabilidade e reatividade (Jeneil Bio-surfactant Company, 2005).

Os biossurfactantes são produzidos por uma variedade de micro-organismos, secretados extracelularmente ou ane-xados a partes da célula, predominantemente durante cres-cimento em substratos imiscíveis com a água. Mutantes de Pseudomonas aeruginosa que não produziam biossurfactan-tes apresentaram pequeno crescimento em n-parafina e he-xadecano e a adição de ramnolipídeos ao meio restaurou o crescimento destas bactérias. Do ponto de vista fisiológico, a produção de grande quantidade de uma substância polimé-rica seria um desperdício, se não apresentasse nenhuma fun-ção. O sistema genético também perde a expressão do gene depois de algum tempo, por mutação e seleção, se o produto deste gene não representa alguma vantagem específica para a sobrevivência (Desai e Banat, 1997).

Entre os parâmetros que influenciam o tipo e a quanti-dade de biossurfactante produzido, estão a natureza da fon-te de carbono, possíveis limitações nutricionais e outros pa-râmetros físicos e químicos, como oxigenação, temperatura e pH. Além disso, um fator primordial é a identidade do mi-croorganismo ou cepa usada no processo produtivo. Em mui-tos casos, as sínteses das porções hidrofílica e hidrofóbica do surfactante fazem parte do metabolismo primário, mas estão relacionadas a duas diferentes rotas de degradação de carboidratos e hidrocarbonetos. Na maioria dos casos, o crescimento em hidrocarbonetos induz a síntese de biossur-factantes, mas isso não é um pré-requisito para todos os or-ganismos. A mudança no substrato frequentemente altera a estrutura do produto, alterando assim as propriedades do surfactante. A escolha da fonte de carbono é, então, deter-minada pela aplicação específica pretendida. A fonte e a con-centração de nitrogênio, assim como a relação carbono/ni-trogênio, também influenciam a síntese de biossurfactantes (Guerra-Santos et al., 1984).

Uma contribuição adicional para se alcançar excelente produtividade e rendimento pode ser fornecida pela enge-nharia genética com as cepas produtoras. Através do maior conhecimento das rotas metabólicas de produção, os genes que codificam as enzimas envolvidas podem ser expressos em hospedeiros para permitir o uso de substratos mais ba-ratos e facilitar a recuperação do produto, além de substituir produtores patogênicos, como as bactérias da espécie Pseu-domonas aeruginosa.

Grande parte dos estudos está direcionada para o au-mento da eficiência e da viabilidade econômica dos biopro-cessos para permitir a competição dos biossurfactantes com os compostos tensoativos quimicamente sintetizados. Até o momento, poucos sistemas de produção economicamente viáveis para biossurfactantes foram reportados. O esperado desenvolvimento das aplicações dos biossurfactantes é di-ficultado pelos altos custos de produção, pela falta de acei-tação de algumas cepas produtoras e pelos altos graus de pureza requeridos para o uso nas indústrias farmacêutica, ali-mentícia e de cosméticos (Fiechter, 1992).

A máxima produção de ramnolipídeos é normalmente ve-rificada no fim da fase exponencial de crescimento, sendo uma produção não associada ao crescimento (Venkata Ra-mana et al., 1990).

Contactores gás/líquido

O objetivo primário das operações de transferência de mas-sa é colocar duas fases em contato para a eficiente transferên-cia de uma ou mais espécies entre elas. As áreas de contato estabelecidas entre as fases e os coeficientes de transferên-cia de massa das espécies, em cada fase, influenciam direta-mente suas taxas de transferência (Bhattacharyya e Butter-field, 2003). Operações de contato gás/líquido e líquido/líquido são tradicionalmente realizadas em algum recipiente funcio-nando como uma coluna de simples estágio ou multiestágios com as fases circulando em contracorrente (Winston Ho e Sirkar, 1992). Normalmente, o maior desafio em relação ao projeto e operação dos equipamentos para este fim é maximi-zar a transferência de massa através do aumento da área de contato entre as fases. Em colunas empacotadas, por exem-plo, isso implica em uma criteriosa seleção do material utiliza-do como recheio e na distribuição uniforme dos fluidos. Em ou-



Figura 2 – Esquema de um contactor gás/líquido.

Figure 2 – Sketch of a gas/liquid contactor.

Figura 2 – Bosquejo de un contactor de gas/líquido.

tros equipamentos, o desafio recai em minimizar o tamanho e maximizar o número de bolhas/gotas da fase dispersa.

O fato das fases estarem diretamente em contato ocasiona alguns problemas, como a formação de emulsões e espumas. Uma tecnologia alternativa que evita estes problemas e ainda oferece substancialmente mais área interfacial é o contato das fases através de uma membrana (Gabelman e Hwang, 1999).

Um contactor de membrana é um artefato que propicia a transferência de massa entre duas fases fluidas sem a disper-são de uma fase em outra. Essa transferência é obtida através do escoamento dos fluidos em lados opostos de uma mem-brana microporosa ou densa, e ocorre pela difusão através da interface, como em um equipamento tradicional. Em um con-tactor de membrana, a separação por membranas está com-pletamente integrada com outras tecnologias de separação, como a extração ou a absorção. Membranas oferecem a pos-sibilidade de se ter um equipamento com grande eficiência energética, além de ser modular, facilitando seu escalonamen-to. Já a extração ou a absorção oferecem alta seletividade e altas forças motrizes para o transporte, mesmo quando opera-das em condições de baixas concentrações.

Os contactores de membrana ainda apresentam valores bem maiores para os coeficientes volumétricos de transferên-cia de massa, se comparados aos equipamentos tradicionais, e também uma faixa mais ampla para os valores possíveis de fluxo, sem os inconvenientes de transbordamento ou esvazia-mento. Um esquema simplificado de um contactor gás/líquido é apresentado na figura 2.

Materiais e Métodos

Manutenção de microorganismo e preparo do pré-inóculo

A cepa de Pseudomonas aeruginosa PA1 previamente se-lecionada de ambientes de petróleo como melhor produtora de biossurfactantes (Santa Anna, 2000) foi preservada em glicerol a 10% em ultrafreezer -80ºC. O pré-inóculo foi crescido em placa com YPDA (extrato de levedura 0,3%, peptona 1,5%, dextrose 0,1%, Agar-agar 1,2%) a 30ºC por 48h e transferido para frascos de 1.000mL com 300mL de meio com a seguinte composição (g/L): NaNO3 1,0; KH2PO4 3,0; K2HPO4 7,0; MgSO4.7H2O 0,2 ; ex-trato de levedura 5,0; peptona 5,0 e glicerol 30,0. Após 24h de cultivo o meio de fermentação contendo as células foi estoca-do em criotubos na relação glicerol/meio fermentado de 1:3 para servir como pré-inóculo padrão em todas as fermentações.

Preparo do inóculo

O conteúdo de 1,0mL do criotubo foi inoculado em 300mL de meio de fermentação com a seguinte composição (g/L): gli-cerol 30,0; NaNO3 1,0; K2HPO4 7,0; KH2PO4 3,0; MgSO4.7H2O 0,2; extrato de levedura 5,0 e peptona 5,0. Os frascos foram então incubados em agitadores rotatórios a 30ºC e 170rpm por 40h. Ao final desse período, as células de cada frasco fo-ram recuperadas por centrifugação (10.000g por 20 minutos) e utilizadas como inóculo (entre 0,6 e 1,1g/L) nos biorreatores.

EsterilizaçãoO fermentador, já com o meio de cultura a ser utilizado,

era esterilizado em autoclave a 121ºC por 15m antes de cada produção. O sistema de oxigenação era esterilizado com a circulação de uma solução de hipoclorito de sódio a 1% por 1h. Depois deste procedimento, era circulada água destilada estéril pelo sistema para a eliminação de vestígios de cloro. Só então era realizada a inoculação dos micro-organismos.

Produção de ramnolipídeos por Pseudomonas aeruginosa

As fermentações foram realizadas em um biorreator Bio-Flo IIc (Batch/Continuous Fermentos; New Brunswick Scien-

Kronemberger et al.


tific; USA) com capacidade nominal de 5,0L de volume, in-serido em uma capela com exaustão. O volume utilizado nas fermentações foi de 3,0L, a temperatura foi mantida em 30ºC e a agitação mantida em 100rpm. A oxigenação foi con-duzida de forma não dispersiva através de um contactor gás/líquido. O sistema utilizado pode ser visto na figura 3.

O meio de cultura utilizado nas fermentações apresen-tava a seguinte composição (g/L): glicerol 30,0; NaNO3 1,4; K2HPO4 7,0; KH2PO4 3,0 e MgSO4.7H2O 0,2.

A oxigenação foi realizada com ar comprimido ou com o auxílio de um cilindro de oxigênio puro. As condições de oxigenação foram inicialmente definidas de acordo com os resultados dos testes de oxigenação do módulo utilizado. A vazão de líquido foi definida como 25L/h e a pressão da corrente gasosa, ar, mantida em 1,0bar, com vazão de pur-ga de 1,0L/h. Essas condições resultariam em um coefi-ciente volumétrico de transferência de massa superior a 2,0h-1, equivalente, nessas condições, à transferência de mais de 80mg/h de oxigênio para o meio de fermentação – considerando a concentração de oxigênio dissolvido no meio igual a 50% da concentração de saturação. Com o uso de oxigênio puro nas mesmas condições, esse valor é su-perior a 500mg/h.

Determinação da concentração de células

A concentração celular das suspensões de Pseudomonas aeruginosa PA1 foi determinada através da absorbância de luz a 600nm (Espectrofotômetro MultiSpec – 1501; Shima-dzu Corporation, Japan). O valor de absorbância foi conver-tido no valor de concentração (g/L) através de uma curva de calibração. Esta curva foi construída por amostragem ao final da fermentação. As amostras foram filtradas em membranas de 0,2µm para a retirada das células e estas foram levadas em estufa a 70ºC até que fosse atingida massa constante. A curva de calibração da absorbância em função da massa seca foi construída a partir de uma série de diluições realiza-das com amostras idênticas de meio de cultivo contendo cé-lulas. Para cada diluição os valores de absorbância e massa seca foram determinados e construiu-se assim uma curva de calibração. O fator de conversão de absorbância em concen-tração, calculado através da equação Abs = 2,5437 * X, foi de 0,39g/L (= 1 / 2,54).

Quantificação de glicerol

O teor de glicerol nas amostras livres de células – as células foram removidas das amostras por centrifugação a 5.000g por 15min – foi avaliado pelo método enzimático/co-lorimétrico para determinação de triglicerídeos (Triglicérides Enzimático – Bioclin; Quibasa Química Básica Ltda.). O méto-do consiste na fosforilação de glicerol a glicerol-3-fosfato em presença de glicerol quinase e ATP. O glicerol-3-fosfato é en-tão oxidado pela glicerol-3-fosfato oxidase, liberando peróxi-do de hidrogênio que, na presença de aminoantipirina, p-clo-rofenol e peroxidase, dá origem a um composto quinônico de cor cereja. A intensidade dessa coloração pode ser determi-nada pela medida de absorbância no comprimento de onda correspondente – 490nm – e é proporcional à concentração de glicerol, podendo assim ser comparada a um padrão.

Quantificação de ramnolipídeos

A quantificação dos ramnolipídeos foi realizada de modo indireto, utilizando-se a ramnose como referência – a ram-nose é um subproduto da hidrólise ácida dos ramnolipídeos. Foi utilizado um método adaptado do descrito por Pham et

Figura 3 – Fotografia do fermentador inserido na capela de exaustão acoplado ao sistema de oxigenação utilizando o contactor de membranas.

Figure 3 – Photograph of fermentor inserted in the hood attached to the exhaust system using the oxygenation membrane contactor.

Figura 3 – Fotografía del fermentador inser-tado en la campana conectada al sistema de escape con el con-tactor de membrana de oxigenación.



al. (2004), onde a etapa de extração dos ramnolipídeos foi suprimida, sendo o ensaio realizado diretamente a partir do meio fermentado livre de células, já que o biossurfactante é um produto extracelular. Para a determinação da concentra-ção de ramnose presente na amostra, o valor de absorbân-cia obtido era comparado com o valor obtido na dosagem de uma solução padrão de ramnose.

A solução de biossurfactantes produzida pela cepa PA1 de Pseudomonas aeruginosa foi caracterizada por HPLC e comparada a cromatogramas obtidos na literatura (Santa Anna, 2000). A composição de ramnolipídeos desta solução está apresentada na tabela 1.

Tomando como base 100,0g de ramnolipídeos, temos um total de 0,2737gmol de ramnose. Sabendo-se que a massa molar da ramnose (C6H12O5) é igual a 164,0g/gmol, calcula-mos um total de 44,89g de ramnose. Com isso, é determi-nado o fator de 2,23 (100,0g de ramnolipídeos/44,89g de ra-mnose) para a conversão de concentração de ramnose em concentração total de ramnolipídeos.

Resultados e DiscussãoA primeira e mais clara observação na produção de ra-

mnolipídeos com o uso da oxigenação não dispersiva por

membranas é a ausência de espuma no vaso contendo o meio fermentado durante o processo fermentativo. A com-paração entre a produção realizada com contactores e uma produção com aeração convencional pode ser observada na figura 4.

Nota-se a ausência de espuma na figura 4(a), correspon-dente à fermentação com oxigenação por membranas. Para descartar a possibilidade da ausência de espuma estar rela-cionada à inexistência de biossurfactante nesse meio de fer-mentação, neste foi injetado ar comprimido diretamente por um dispersor, com baixa vazão, simulando a oxigenação con-vencional. Em poucos segundos, foi obtida a condição vista na figura 4(b). Isto mais uma vez comprova a ineficiência da condução deste processo fermentativo de produção de ram-nolipídeos por Pseudomonas aeruginosa pelos meios de oxi-genação por borbulhamento tradicionais.

Para o acompanhamento das fermentações conduzidas, foram realizadas análises periódicas na concentração de bio-massa no meio e nas concentrações da fonte de carbono (glicerol) e de produto. Como a maior alteração no proces-so produtivo consistia na oxigenação do meio, atenção es-pecial foi dispensada à concentração de oxigênio dissolvido, com seus valores registrados continuamente com o uso de um computador acoplado ao fermentador.

Tipo FórmulaMassa molar

(g/gmol)Concentração mássica (%)

R1 (MonoC10C10) C26H36O9 492 35,3

R2 (Di C10C10) C32H46O13 638 51,0

DiC10C12 C34H50O13 666 9,8

DiC10C8 C30H42O13 610 3,9

Tabela 1 – Composição de uma solução de ramnolipídeos produzidos por Pseudomonas aeruginosa PA1 a partir de glicerol.

Table 1 – Composition of a rhamnolipids solution produced by Pseudomonas aeruginosa PA1 from glycerol.

Cuadro 1 – Composición de una solución de ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa PA1 de glicerol.

Kronemberger et al.

Figura 4 – Comparação entre a produção de ramnolipídeos utilizando a oxigenação con-vencional e a oxigenação por contactores com membranas, proposta no presente trabalho. (a) Oxigenação não dispersiva. (b) Oxigenação dispersiva convencional.

Figure 4 – Comparison between the production of rhamnolipids using conventional oxygenation and oxygenation by membrane contactors proposed in this study. (a) Non dispersive oxygenation. (b) Conventional dispersive oxygenation.

Figura 4 – Comparación entre la producción de ramnolípidos con oxigenación conven-cional y la oxigenación de contactores de membrana que se propone en este estudio. (a) oxigenación no dispersiva. (b) oxigenación de dispersión convencional.

a b


Na maior parte das fermentações no biorreator com a oxigenação com membranas fez-se necessário o uso de oxigênio puro para a manutenção de uma concentração de oxigênio dissolvido acima de zero. Foi investigado o uso de contactores com dois tipos de membranas na forma de fibra-oca, uma microporosa composta coberta com uma fina camada superficial densa e outra densa integral. No caso do uso da membrana composta, a corrente líquida foi circulada pelo interior das fibras. Quando usadas as fibras densas, o escoamento dessa corrente se deu pela carcaça do contac-tor, externamente às fibras.

O perfil de oxigênio dissolvido no fermentador ao longo do tempo em uma fermentação pode ser visto na figura 5. No-ta-se que, com o sistema de controle manual, não é possível o estabelecimento de uma concentração fixa de oxigênio du-rante uma fermentação, por isso essa variável não pôde ser estudada profundamente. Assim, o consumo de oxigênio ao longo das diferentes fases do metabolismo dos micro-orga-nismos não pode ser corretamente avaliado.

Este comportamento do sistema de oxigenação pode in-terferir na produtividade de ramnolipídeos pelas bactérias. Para isso e para aprofundar o conhecimento sobre a necessi-dade microbiana por oxigênio, deve-se implementar um sis-tema de controle automatizado da concentração de oxigê-nio dissolvido.

O crescimento celular, o consumo de glicerol e a produ-ção dos ramnolipídeos no fermentador com oxigenação por membranas foram avaliados através da comparação com fermentações similares realizadas em frascos agitados, com a duração de 200 a 300h. Os dados obtidos nas fermenta-ções apresentaram grande oscilação, fato que é inerente a diversos processos biotecnológicos. Mas pode-se concluir que a produtividade média de ramnolipídeos no fermenta-dor foi igual a 22,6mg/L.h, enquanto que nos frascos agita-dos esse valor chegou a 35,5mg/L.h de biossurfactante. Não foi possível notar diferença entre as fermentações conduzi-das com diferentes módulos de oxigenação. Também foi ob-servado que a concentração de biomassa se comportava de modo similar nos dois tipos de fermentações realizados: em frascos e no biorreator. Um aspecto interessante é o estudo do consumo do glicerol. Essa fonte de carbono é consumida totalmente entre 250 e 300h de fermentação, tanto no fer-mentador quanto nos frascos agitados. Isso indica que du-rante as fermentações no biorreator as bactérias utilizam o glicerol para a produção de algum outro produto, que não o biossurfactante, indicando algum desvio em seu metabolis-mo. As figuras 6 e 7 apresentam os perfis de concentrações de biomassa, ramnolipídeos e glicerol para fermentações re-alizadas em biorreator e em frasco agitado, respectivamente.

A maior parte das fermentações foi conduzida no siste-ma de batelada simples. Outra possibilidade é a condução da


Figura 5 – Perfil do percentual de saturação de oxigênio dissol-vido (O.D.) ao longo do tempo em uma fermentação para a produção de ramnolipídeos em biorreator com oxigenação não dispersiva.

Figure 5 – Profile of the dissolved oxygen (D.O.) saturation percen- tage during fermentation to produce rhamnolipids in a non dispersive oxygen bioreactor.

Figura 5 – Perfil del porcentaje de saturación del oxígeno disuelto (O.D.), durante la fermentación para producir los ramnolípidos en un biorreactor de oxígeno no dispersivo.


Figura 6 – Perfil de concentrações de biomassa, ramnolipí-deos e glicerol para fermentações realiza-das em biorreator.

Figure 6 – Concentra- tion profile of biomass, rhamnolipids and glycerol for biore-actor fermentations.

Figura 6 – Perfil de concentración de la biomasa, ramnolípidos y glicerol para las fermentaciones en el biorreactor.

Figura 7 – Perfil de concentrações de bio-massa, ramnolipídeos e glicerol para fermen-tações realizadas em frascos agitados.

Figure 7 – Concentra- tion profile of biomass, rhamnolipids and glycerol for shaken flask fermentations.

Figura 7 – Perfil de concentración de la biomasa, ramnolípidos y glicerol para fermen-taciones en frascos agitados.

fermentação em batelada alimentada. Baseado em resulta-dos anteriores, foi conduzida uma fermentação com a alimen-tação suplementar da fonte de nitrogênio com 24 e 48h de fermentação, de modo a restabelecer a concentração inicial. Essa concentração deve ser mantida baixa para não prejudi-car a produção do ramnolipídeo, que só acontece com a extin-ção da fonte de nitrogênio. Em frascos agitados, essa alimen-tação suplementar de nitrogênio elevou a produtividade média do biossurfactante para 54,2mg/L.h, com o aumento do con-sumo de glicerol. Um exemplo de uma produção com alimen-

tação suplementar de nitrato pode ser visualizada na figura 8. Na fermentação em biorreator com a oxigenação através de membranas também foi observado o aumento do consumo de glicerol, mas que não foi refletido em maior produção de bios-surfactante. A produtividade se manteve praticamente inalte-rada, com 21,5mg/L.h de ramnolipídeos. Os resultados desta fermentação estão apresentados na figura 9.

Kronemberger et al.

Figura 8 – Perfil de concentrações de bio-massa, ramnolipídeos e glicerol para fermen-tações realizadas em frascos agitados com adição suplementar de nitrato (batelada alimentada).

Figure 8 – Concentra- tion profile of biomass, rhamnolipids and glycerol in shaken flask fermentations with the supplemen-tary addition of nitrate (fed batch).

Figura .8 – Perfil de concentración de la biomasa, ramnolí-pidos y glicerol en fermentaciones de frascos agitados con la adición suplementar de nitrato (alimentado por lotes).

Figura 9 – Perfil de concentrações de biomassa, ramnolipí-deos e glicerol para a fermentação realizada em fermentador com adição suplementar de nitrato (batelada alimentada).

Figure 9 – Concentra- tion profile of biomass, rhamnolipids and glycerol for fermentation in a fermentor with the addition of supple-mentary nitrate (fed batch).

Figura 9 – Perfil de concentración de la biomasa, ramnolípidos y glicerol para la fermentación en un fermentador con la adición suplementar de nitrato (alimentado por lotes).


Essa menor produtividade de biossurfactante no fermen-tador pode se explicada pelo fato das bactérias receberem uma grande quantidade de oxigênio quando passam pelo contactor. Essa quantidade de oxigênio pode ser prejudicial às células, que desviam sua rota metabólica para a produção de algum fator de virulência como a piocianina, que apresen-ta coloração esverdeada como a encontrada no meio dessa fermentação, em defesa à situação de estresse.

Para contornar essa dificuldade, será realizada uma eta-pa de microfiltração para a separação das células antes de sua entrada no oxigenador. A corrente contendo as células retornará ao vaso de fermentação enquanto que a corrente do permeado, livre de células, será oxigenada, só então re-tornando ao fermentador. O oxigênio dissolvido presente na corrente de saída do oxigenador será então diluído no vaso, livrando as bactérias do contato com a concentração do gás, em excesso.

ConclusõesOs resultados de produtividade do biossurfactante das

fermentações apresentam certa inferioridade aos testes em frascos agitados (22,6 e 35,5mg/L.h de ramnolipídeos, res-pectivamente). Mesmo assim, deve-se levar em considera-ção que o meio de cultivo utilizado foi otimizado para a uti-lização nos frascos, com grande limitação na oxigenação. Assim, os resultados indicam que o processo proposto é viável e promissor, principalmente levando em consideração que estes são apenas os testes iniciais e que nenhum tipo de otimização foi contemplado.

Este processo é uma boa alternativa para a produção de ramnolipídeos, favorecendo o controle e o aumento de esca-la de produção. Entretanto, diversos ajustes no sistema ope-racional devem ser introduzidos, principalmente com relação

ao controle da concentração de oxigênio dissolvido no meio. Assim, pode ser investigada a melhor estratégia de oxigena-ção. Além disso, a composição do meio fermentado deve ser otimizada para as novas condições de trabalho.

Com o controle da concentração de oxigênio dissolvido no meio, poderá ser realizado um estudo completo do consu-mo deste composto pelas bactérias em diversas condições de cultivo. Além de buscar a otimização da produção de ram-nolipídeos em uma escala de produção nunca realizada pre-viamente, haverá dados suficientes para o estudo da influên-cia do oxigênio nas diversas fases do metabolismo celular, o que também é inédito na literatura, mesmo sendo a Pseudo-monas aeruginosa uma espécie amplamente estudada, prin-cipalmente pela área médica.

Pode-se destacar novamente a possibilidade do aumento de escala de produção, o que tornará o produto competitivo frente aos surfactantes produzidos quimicamente até hoje. Com a aplicação das melhorias apresentadas, como a oxi-genação da corrente líquida livre de células e a implementa-ção do controle automatizado da concentração de oxigênio, a produtividade será aumentada e o processo terá maiores controle e uniformidade.

Por fim, a produção de ramnolipídeos poderá ser conside-rada de baixíssimo custo, considerando a fonte de carbono escolhida como matéria-prima para a produção deste bios-surfactante no Brasil: o glicerol. Este composto é o principal subproduto obtido na produção do biodiesel. Este biocom-bustível é adicionado parcialmente no diesel utilizado no país, sendo produzido em grande quantidade, gerando, como sub-produto, o glicerol que deverá passar da condição de commo-dity para rejeito de baixo custo.

n n n

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Denise Maria Guimarães Freire possui graduação em Enge-nharia Química pela UFRJ, em 1984, mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos pela UFRJ em 1988 e doutorado em Bioquímica em 1996. É professora associada I do Instituto de Química de Bioquímica da UFRJ. Atua como do-cente permanente nos cursos de pós-graduação em Bioquími- ca e Ciências de Alimentos do Instituto de Química e como do- cente colaborador no programa de Engenharia Química do Ins-tituto Alberto Luiz Coimbra de Pós-Graduação e Pesquisa de En- genharia - COPPE/UFRJ. Tem experiência na área de Biotecno-logia Farmacêutica e Ambiental, atuando nos seguintes temas: fermentação em meio sólido, lipases vegetais e microbianas, proteases microbianas, tratamento biológico-enzimático e pro-dução e utilização de biossurfactantes. É pesquisadora e con-sultora Ad Hoc e líder de dois grupos de pesquisa do CNPq e também é revisora de sete revistas internacionais indexadas.

Denise Maria Guimarães Freire

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)Instituto de QuímicaDepartamento de Bioquímicae-mail: [email protected]

Cristiano Piacsek Borges é professor do Programa de Enge-nharia Química do Instituto Alberto Luiz Coimbra de Pós-Gra-duação e Pesquisa de Engenharia - COPPE/UFRJ desde 1995, tendo concluído sua tese de doutorado na mesma institui-ção, em 1993. Orientou cerca de 50 teses e dissertações, tem diversas publicações em periódicos e é co-autor do livro

Cristiano Piacsek Borges

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)COPPEPrograma de Engenharia Químicae-mail: [email protected]

Autores

Frederico de Araujo Kronemberger possui graduação em En-genharia Química pela UFRJ, em 2002. Foi admitido no cur-so de doutorado em Engenharia Química pelo Instituto Alber-to Luiz Coimbra de Pós-Graduação e Pesquisa de Engenharia - COPPE/UFRJ em 2007. Sua tese recebeu o Prêmio Petrobras de Tecnologia, no ano de 2007; uma Menção Honrosa na edi-ção de 2008 do Prêmio Capes de Teses e obteve a 2ª coloca-ção na categoria Doutorado na 8ª Edição do Prêmio Nacional de Pós Graduação Braskem-ABEQ. Tem experiência na área de Engenharia Química, com ênfase em Processos de Separação com Membranas e Biotecnologia, atuando nos seguintes te-mas: membranas, fibras-ocas, oxigenação, biorreatores, bios-surfactantes e Pseudomonas. Trabalha no desenvolvimento da produção em escala piloto de biossurfactantes, em uma unida-de construída em parceria entre o Instituto de Química/UFRJ, o Programa de Engenharia Química/COPPE/UFRJ e o Cenpes.

Frederico de Araujo Kronemberger

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)COPPEPrograma de Engenharia Químicae-mail: [email protected]



“Processos de Separação com Membranas”. Seus interes-ses de pesquisa incluem a síntese de polímeros especiais, o estudo da formação de membranas, separações de misturas líquidas e gasosas, membranas catalíticas, biorreatores e re-atores assistidos por membranas.

produção de biossurfactantes em biorreator assistido por ... · gens de biodegradabilidade,...

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