Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

ISSN 2179-8184

Novembro, 2011149

Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

Heliofábia Virgínia de Vasconcelos FacundoDeborah dos Santos GarrutiVictor Costa Castro AlvesBeatriz Rosana CordenunsiFranco Maria Lajolo

Documentos 149

ISSN 2179-8184Novembro, 2011

Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaEmbrapa Agroindústria TropicalMinistério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

Embrapa Agroindústria TropicalFortaleza, CE2011

© Embrapa 2011

Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na:

Embrapa Agroindústria TropicalRua Dra. Sara Mesquita 2270, PiciCEP 60511-110 Fortaleza, CEFone: (85) 3391-7100Fax: (85) 3391-7109Home page: www.cnpat.embrapa.brE-mail: vendas@cnpat.embrapa.br

Comitê de Publicações da Embrapa Agroindústria TropicalPresidente: Antonio Teixeira Cavalcanti JúniorSecretário-Executivo: Marcos Antonio NakayamaMembros: Diva Correia, Marlon Vagner Valentim Martins, Arthur

Cláudio Rodrigues de Souza, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho, Adriano Lincoln Albuquerque Mattos e Carlos Farley Herbster Moura

Revisão de texto: Marcos Antônio NakayamaNormalização bibliográfica: Rita de Cassia Costa CidEditoração eletrônica: Arilo Nobre de OliveiraFoto da capa: Cláudio de Norões Rocha

1a edição (2011): on-line

Todos os direitos reservadosA reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte,

constitui violação dos direitos autorais (Lei no 9.610).

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)Embrapa Agroindústria Tropical

Procedimento para análise de compostos voláteis de banana pela técnica de microextração em fase sólida. / Heliofábia Virgínia de Vasconcelos Facundo... [et al.] – Fortaleza : Embrapa Agroin-dústria Tropical, 2011.

19 p. 21 cm. – (Documentos / Embrapa Agroindústria Tropical, ISSN 2179-8184, 149).

1. Banana. 2. Compostos voláteis - Microextração. 3. Análise prática. I. Facundo, Heliofábia Virgínia de Vasconcelos. II. Garruti, Deborah dos Santos. III. Alves, Victor Costa Castro. IV. Cordenunsi, Beatriz Rosana. V. Lajolo, Franco Maria. VI. Série.

CDD 641.4772

Autores

Heliofábia Virgínia de Vasconcelos FacundoEngenheira de Alimentos, Doutoranda em Ciências dos Alimentos, Universidade de São Paulo (USP),05508-000, São Paulo, SP, hellyvirginia@gmail.com

Deborah dos Santos GarrutiEngenheira de Alimentos, D. Sc. em Ciência de Alimentos, pesquisadora da Embrapa Agroindústria Tropical, Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici, 60511-110, Fortaleza, CE, deborah@cnpat.embrapa.br

Victor Costa Castro AlvesFarmacêutico pela Universidade Federal do Ceará,Bolsista DTI/CNPq/Embrapa Agroindústria Tropical,vccalves@gmail.com

Beatriz Rosana CordenunsiQuímica, D. Sc. em Ciências dos Alimentos,professora associada da Universidade de São Paulo (USP), 05508-000, São Paulo, SP, hojak@usp.br

Franco Maria LajoloFarmacêutico e Bioquímico, D. Sc. em Ciências dos Alimentos, professor livre-docente da Universidade de São Paulo (USP), 05508-000, São Paulo, SP,fmlajolo@usp.br

Apresentação

O sabor é um fator decisivo na escolha e aceitação dos alimentos e bebidas, em especial das frutas tropicais. Produtos processados que não mais apresentam o aroma e sabor originais da fruta serão rejeitados pelo consumidor. Por sua vez, o sabor característico do alimento é conferido pela combinação de dezenas de substâncias voláteis, de várias classes químicas, presentes em quantidades extremamente diminutas. Assim, a pesquisa do sabor é bastante complexa.

A análise de compostos voláteis é de extrema importância para a caracterização de novos materiais genéticos, bem como para a compreensão de como o sabor é formado ou modificado durante o amadurecimento, processamento e estocagem de frutas e seus produtos derivados.

Esse tipo de pesquisa compreende quatro etapas fundamentais: o isolamento dos compostos voláteis, a separação por cromatografia gasosa, a identificação por espectrometria de massas e a análise sensorial. O isolamento é uma etapa crítica, pois, em geral, os voláteis são sensíveis e termolábeis. Qualquer aumento de temperatura ou oxidação poderá acarretar reações químicas ou volatilização, modificando a composição original da amostra. O procedimento para a separação dos voláteis do alimento vai depender também do tipo de alimento, pois a composição de carboidratos, gorduras, proteínas e sais minerais vai influenciar na

volatilidade das moléculas e, consequentemente, na facilidade do seu desprendimento da matriz alimentar.

Nesta publicação, é apresentada uma metodologia científica para a captura de compostos voláteis de amostras de banana in natura, por meio de uma das técnicas mais modernas da atualidade, a microextração em fase sólida (SPME). O procedimento foi desenvolvido, em parceria com a Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (USP), otimizando-se as condições de extração para essa fruta tropical, de delicado aroma e sabor.

Vitor Hugo de OliveiraChefe-Geral da Embrapa Agroindústria Tropical

Sumário

Introdução.................................................................................9

Procedimento experimental ....................................................12Preparação da fibra de SPME ...............................................................12

Preparação da amostra para análise ....................................................12

Preparo da amostra para análise imediata ...........................................12

Preparo da polpa de banana congelada com sal ..................................13

Preparo da amostra para análise a partir da polpa congelada .............13

Extração dos compostos voláteis ..........................................................14

Análise cromatográfica ..........................................................................14

Identificação dos compostos .................................................................16

Referências ............................................................................18

Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase SólidaHeliofábia Virgínia de Vasconcelos FacundoDeborah dos Santos GarrutiVictor Costa Castro AlvesBeatriz Rosana CordenunsiFranco Maria Lajolo

Introdução

A banana é um fruto rico em nutrientes que apresenta sabor agradável, sendo amplamente consumido em todo o mundo (JORDÁN et al., 2001). Segundo a Organização para Alimentação e Agricultura das Nações Unidas (FAO), a banana é a principal fruta no comércio internacional e uma das mais populares no mundo. A indústria do fruto é uma importante fonte de renda, emprego e receitas de exportação para países em desenvolvimento da América Latina e do Caribe, assim como Ásia e África, sendo responsável também pela criação de muitos postos de trabalho, tanto em zonas agrícolas como urbanas (FIORAVANÇO, 2003).

No Brasil, a área de cultivo de banana em 2010 foi de aproximadamente 500.000 hectares, com produção de cerca de 7.000.000 toneladas. As regiões Norte e Nordeste representam mais de 70% do total cultivado, porém São Paulo é o estado que detém a maior parcela da produção nacional, com mais de 1.200.000 toneladas (IBGE, 2011).

O aroma e o sabor característicos dos frutos são fatores determinantes no seu consumo. Quimicamente, ambos são dados pela presença de compostos voláteis que impressionam os receptores olfativos, primeiramente pelas narinas (aroma) e, depois que o alimento é colocado na boca, pela cavidade retronasal (sabor). No que diz respeito à banana,

10 Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

seu agradável e peculiar aroma tem sido alvo de diversos estudos ao longo dos últimos 40 anos. Como resultados dessas pesquisas, mais de 150 compostos voláteis de diversas classes químicas já foram identificados, principalmente ésteres, cetonas, aldeídos e terpenos. Ésteres de isoamila, isobutila e a 2-pentanona são comumente descritos como os compostos detectados em maior quantidade em amostras de banana (JORDÁN et al., 2001).

Metodologias de extração como a hidrodestilação, arraste a vapor e extração por fluido supercrítico já foram largamente utilizadas para obtenção de compostos voláteis de frutos. Em 1990, foi introduzida a técnica de Microextração em Fase Sólida ou Solid Phase Microextraction (SPME), em inglês, utilizada não somente na análise de alimentos, mas também para análises clínicas e forenses (AUGUSTO; VALENTE, 2002). A técnica SPME foi desenvolvida principalmente para atender à necessidade de preparação de amostras em um pequeno intervalo de tempo (LORD; PAWLISZYN, 2000), mas verificou-se, ao longo de estudos (PROSEN; ZUPANČIČ-KRALJ, 1999; KATAOKA et al, 2000; MILLS; WALKER, 2000), que essa técnica apresenta outras vantagens, tais como:

a) Simplicidade e praticidade.

b) Possibilidade de trabalho com pequenas quantidades de amostra.

c) Ausência de solventes.

d) Emprego de baixas temperaturas.

e) Elevada sensibilidade e reprodutibilidade.

f) Baixo custo.

g) Compatibilidade com análises de separação e identificação, como a cromatografia gasosa-espectrometria de massas (CG-EM).

O presente trabalho visa apresentar um procedimento para a extração de compostos voláteis do headspace de amostras de bananas por meio da técnica de microextração em fase sólida, bem como as condições cromatográficas necessárias para a separação e identificação desses compostos. Esse procedimento foi desenvolvido na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, em parceria com a Embrapa Agroindústria Tropical,

11Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

como parte da tese de doutorado da primeira autora, e tem sido utilizada com sucesso na determinação do perfil de voláteis de diferentes cultivares de banana (PINTO et al., 2011; PENHA et al., 2011a; PENHA et al., 2011b).

Materiaisa) Bananas.

b) Faca de aço inoxidável.

c) 2 béqueres plásticos de 250 mL.

d) Cloreto de sódio (NaCl) P.A.

e) Água destilada.

f) Frascos de plástico com tampa para congelamento.

g) Espátula.

h) Bastão de vidro.

i) Frasco de vidro (30 mL a 50 mL) com tampa rosqueável e septo.

j) Barra magnética.

k) Termômetro.

l) Suporte metálico com garra.

m) Amostrador de SPME (Supelco®).

n) Fibra 50/30 µm DVB/CAR/PDMS (divinilbenzeno/carboxen/polidimetilsiloxano).

o) Coluna cromatográfica DB-Wax.

p) Seringa de 10 µL, para cromatografia.

q) Padrões de alcanos saturados (C7 – C24).

Equipamentosa) Balança semianalítica.

b) Homogeneizador tipo Turrax.

c) Deionizador de água ou filtro Mili-Q.

d) Agitador magnético com aquecimento.

e) Cromatógrafo a gás (CG) acoplado a um detector de massas (EM).

12 Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

Procedimento experimental

Preparação da fibra de SPMEPara a extração de compostos voláteis de banana, foi escolhida a fibra 50/30 µm DVB/CAR/PDMS, por ter apresentado maior número de picos e maior área total no cromatograma, indicando que esse material extraiu um maior número de compostos e com maior eficiência.

A fibra deve ser acoplada ao amostrador de SPME e condicionada no próprio injetor do CG a 270 °C por 60 min (recomendação do fabricante) antes de seu primeiro uso.

Preparação da amostra para análiseA amostra de banana pode ser preparada a partir da banana in natura, para análise imediata ou a partir da polpa congelada com sal, quando é necessário guardar o material para análises futuras.

Preparo da amostra para análise imediata Fatias de banana in natura e cloreto de sódio devem ser homogeneizados com água destilada deionizada ou filtrada em Mili-Q em um béquer plástico de 250 mL, com um processador do tipo Turrax, para fazer um “suco” de banana contendo 30% p/p da fruta e 20% p/p NaCl. A função do cloreto de sódio é promover uma saturação da amostra, reduzindo a solubilidade dos compostos orgânicos na fase aquosa, favorecendo a extração dos analitos (efeito chamado salting-out), além de inibir reações enzimáticas. Uma quantidade de NaCl suficiente para realizar todo o experimento deve ser previamente seca em mufla a 550 oC por 15 min para eliminar todos os voláteis adsorvidos.

Uma alíquota de 15,0 g a 25,0 g do “suco” deve ser transferida para um frasco de vidro de 30 mL a 50 mL, com tampa rosqueável e septo (de tal maneira que o volume de amostra esteja na metade da altura do frasco).

Como exemplo, vamos preparar uma alíquota de 20,0 g do “suco” de banana: Pese 6,0 g da polpa em um béquer de 250 mL, utilizando balança semianalítica, e, em seguida, adicione 4,0 g de cloreto de sódio (NaCl).

13Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

Homogeneíze a mistura (Turrax) e transfira quantitativamente para o frasco com ajuda de aproximadamente 10 mL de água até obter 20,0 g de solução (Figura 1). Homogeneíze a solução lentamente com um bastão de vidro, adicione uma barra magnética ao frasco e tampe.

Figura 1. Amostra de banana homogeneizada com NaCl e adicionada de água até 20,0 g

Preparo da polpa de banana congelada com salPara análises posteriores, deve-se congelar a polpa da banana com o sal, para evitar o escurecimento enzimático. Homogeneíze somente as fatias de banana in natura com o cloreto de sódio, nas mesmas proporções que seriam usadas para a análise imediata, mas sem a adição da água. Calcule a quantidade necessária para realizar as análises em triplicata. Após transferir a mistura para um frasco plástico, armazene a -20 °C.

Preparo da amostra para análise a partir da polpa congeladaNo momento da análise, descongele a polpa de banana à temperatura ambiente (25 °C) e faça a diluição. Seguindo o exemplo para uma alíquota de 20,0 g de “suco” de banana, pese 10,0 g da polpa descongelada e

14 Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

transfira a amostra quantitativamente para o frasco com água destilada deionizada (aproximadamente 10 mL) até obter 20,0 g de “suco”. Homogeneíze lentamente com um bastão de vidro e adicione uma barra magnética ao frasco.

O descongelamento correto da amostra é um passo muito importante para garantir uma extração eficiente, pois a presença de umidade na fibra pode acarretar em cromatogramas pobres ou com picos de baixa resolução.

Extração dos compostos voláteisPara montar o sistema de extração, coloque um béquer de 250 mL contendo 100 mL água destilada sobre a placa aquecedora do agitador magnético. Com o auxílio de um termômetro mantenha a temperatura da água a 25 °C. Após a estabilização dessa temperatura, mergulhe o frasco de vidro contendo a amostra, tampado com tampa rosqueável e septo.

Acione o agitador e mantenha-o por 15 min. Esse tempo em que a amostra fica sob agitação na temperatura determinada, sem estar exposta à fibra de SPME, é denominado “tempo de equilíbrio”. Após esse tempo, introduza o amostrador de SPME no frasco pelo septo da tampa. Em seguida, exponha a fibra de modo que sua ponta fique situada na metade da altura entre a superfície da amostra e a tampa do frasco (Figura 2). Após o ajuste da posição, o amostrador deve ser fixado a um suporte metálico com garra (Figura 3). A fibra deverá ficar assim exposta por 60 min, sob agitação e temperatura (25 °C) constantes. Ao final desse período, a fibra deve ser recolhida antes de o amostrador ser retirado do frasco.

Análise cromatográficaConstrua o método cromatográfico no CG-EM (Figura 4) de acordo com os parâmetros descritos na Tabela 1. Após acionar o método e receber o aviso de que o CG está pronto para análise, insira o amostrador no injetor do cromatógrafo e imediatamente faça a exposição da fibra dentro do injetor. A fibra deve ficar exposta nos primeiros 15 min de análise para garantir que todos os voláteis tenham sido dessorvidos.

15Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

Figura 2. Procedimento para realizar a inserção do amostrador de SPME e expor a fibra.

Figura 3. Captura dos voláteis de uma amostra de banana por SPME.

Figura 4. Aparelho de cromatografia gasosa/espectrometria de massa (CG-EM).

16 Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

Identificação dos compostosApesar de a técnica CG-EM ser uma poderosa ferramenta para análise qualitativa, permitindo a identificação da maioria dos compostos mediante comparação com o espectro de padrões, é importante verificar o índice de retenção linear (IR) dos compostos no cromatograma, a fim de evitar uma identificação equivocada (VIEGAS; BASSOLI, 2007).

Para calcular o IR, é necessário que seja injetado no CG-EM uma solução-padrão de uma série homóloga de alcanos saturados (C7 – C24, por exemplo), geralmente em hexano. Injete 0,5 µL da solução-padrão utilizando seringa para cromatografia gasosa, utilizando as mesmas condições da Tabela 1. Se o CG já estiver preparado com um liner para SPME no injetor, certifique-se que ele seja compatível com uso de seringa. Isso varia para diferentes marcas, mas a informação pode ser encontrada no manual do fabricante.

Após injeção da solução padrão de alcanos saturados, é possível calcular o IR, que é obtido por interpolação, relacionando o tempo de retenção do componente em estudo com o tempo de retenção dos hidrocarbonetos que eluíram imediatamente antes e após o pico do composto de interesse, conforme equação 1.

Programação do CG-EM

InjetorTipo split/splitless, operado a 200 °C, no modo split (1:30) por 2 min

Coluna Tipo DB-Wax (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm)

Programação da temperatura50 °C a 90 °C a 2 °C/min, até 150 °C a 6 °C/min, manter por 5 min

Gás de arraste Hélio (fluxo de 1,0 mL/min)

DetectorEspectrômetro de massas tipo quadrupolo, operado a 70 eV, 200 °C, 0,5 scan/s na faixa de 40-500 m/z

Tabela 1. Programação do cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (CG-EM) para análise de compostos voláteis do headspace de bananas extraídos por SPME.

17Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

Após a obtenção dos espectros de massas e a determinação de seus respectivos índices de retenção, é possível identificar a maioria dos compostos voláteis mediante a comparação desses dados com as bibliotecas do equipamento (NIST107 e NIST21, por exemplo) e informações obtidas em literatura específica.

−−

++ nn

nc

tt

ttn

loglogloglog

1

IR = 100

Equação para cálculo do IR, em que:

IR = índice de retenção linear.

n = número de carbonos do hidrocarboneto anterior.

tc = tempo de retenção do composto de interesse.

tn = tempo de retenção do hidrocarboneto anterior.

tn+1 = tempo de retenção do hidrocarboneto posterior.

(Eq. 1)

AUGUSTO, F.; VALENTE, A. L.P. Aplications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. Trends in Analytical Chemistry, v. 21, n. 6-7, p. 428-438, 2002.

FIORAVANÇO, J.C. Mercado mundial da banana: produção, comércio e participação brasileira. Informações Econômicas, v. 33, n. 10, p. 15-27, 2003.

IBGE Sistema IBGE de Recuperação Automática – SIDRA. Disponível em: <http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl.asp?c=1613&z=t&o=1&i=P>. Acesso em 10 out. 2011.

JORDÁN, M. J.; TANDOM, K.; SHAW, P. E.; GOODNER, K. L. Aromatic profile of aqueous banana essence and banana fruit by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography-olfactometry (GC-O). Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 49, p. 4813-4817, 2001.

KATAOKA, H.; LORD, H. L.; PAWLISZYN, J. Applications of solid-phase microextraction in food analysis. Journal of Chromatography A, v. 880, p. 35-62, 2000.

LORD, H. L.; PAWLISZYN, J. Evolution of solid-phase microextraction technology. Journal of Chromatography A, v. 885, p. 153-193, 2000.

MILLS, G. A.; WALKER, V. Headspace solide-phase microextraction procedures for gas chromatographic analysis of biological fluids and materials. Journal of Chromatography A, v. 902, p. 267-287, 2000.

PENHA, M. F. A. ; ALVES, V. C. C. ; PINTO, N. O. F. ; PEREIRA, G. S. ; GARRUTI, D. S. Perfil sensorial e de compostos voláteis da cultivar Thap Maeo, resistente a doenças da bananeira. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE PROCESSAMENTO DE FRUTAS E

Referências

19Procedimento para Análise de Compostos Voláteis de Banana pela Técnica de Microextração em Fase Sólida

HORTALIÇAS, 2., Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro: SBPFH: Embrapa: UFRRJ, 2011a.

PENHA, M. F. A. ; SILVA, T. H. S. ; ALVES, V. C. C. ; PINTO, N. O. F. ; MAGALHAES, H. C. R. ; GARRUTI, D. S. Varietal differences in the volatile profile of bananas with resistance to black Sigatoka. In: WEURMAN FLAVOUR RESEARCH SYMPOSIUM, 13., Zaragoza. Anais... Zaragoza: Universidad Zaragoza, 2011b.

PINTO, N. O. F.; ALVES, V. C. C.; PENHA, M. F. A.; GARRUTI, D. S. Compostos voláteis da cultivar de banana FHIA 02, resistente à Sigatoka negra. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE PROCESSAMENTO DE FRUTAS E HORTALIÇAS, 2., Rio de Janeiro. Anais... Rio de Janeiro: SBPFH: Embrapa: UFRRJ, 2011.

PROSEN, H.; ZUPANČIČ-KRALJ, L. Solid-phase microextraction. Trends in Analytical Chemistry, v. 18, p. 272-282, 1999.

VIEGAS, M. C.; BASSOLI, D. G. Utilização do índice de retenção linear para caracterização de compostos voláteis em café solúvel utilizando GC-MS e coluna HP-Innowax. Química Nova, v. 30, n. 8, p. 2031-2034, 2007.