PRISCILA AMANDA FRANCISCO

DETECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS E DE SEUS FATORES DE

VIRULÊNCIA NA SALIVA, CÂMARA PULPAR E CANAL

RADICULAR DE DENTES ASSOCIADOS AO INSUCESSO

ENDODÔNTICO

Piracicaba

2017

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA

PRISCILA AMANDA FRANCISCO

DETECÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS E DE SEUS FATORES DE VIRULÊNCIA

NA SALIVA, CÂMARA PULPAR E CANAL RADICULAR DE DENTES

ASSOCIADOS AO INSUCESSO ENDODÔNTICO

Dissertação apresentada à Faculdade de

Odontologia de Piracicaba da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Mestra em

Clínica Odontológica, na Área de Endodontia.

Orientadora: Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação

defendida pela aluna Priscila Amanda Francisco e

orientada pela Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de

Almeida Gomes

Piracicaba

2017

DEDICATÓRIA

À minha família, Katia, César, Patrícia e Bruna, que não mediram esforços para me

apoiar durante toda essa jornada. A possibilidade de dividir cada conquista com vocês é a minha

maior felicidade.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Agradeço à toda minha minha família pelo carinho e pelo esforço que fizeram para

que eu pudesse prosseguir com meus sonhos. Espero sempre poder retribuir na mesma medida

da minha gratidão, todo o amor e cuidado que têm por mim.

À minha orientadora, profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes,

agradeço por me escolher como orientada, por confiar a mim pesquisas tão sérias e desafiadoras

e por todas as oportunidades incríveis que constantemente me proporciona. Fazer parte da

equipe da senhora é um privilégio.

Aos professores, Dr. Carlos Augusto de Morais Souto Pantoja, Dr. Marlos Barbosa

Ribeiro e Dr. Rafael Nóbrega Stipp, pelas correções e contribuições para a melhoria deste

trabalho, durante o exame de qualificação.

Aos professores que compõem a minha banca de defesa do Mestrado, Dra. Brenda

Paula Figueiredo de Almeida Gomes, Dr. Francisco Montagner e Dr. José Flávio Affonso de

Almeida, por terem aceitado prontamente meu convite. As arguições dos senhores com certeza

serão fundamentais para o enriquecimento desse trabalho. Será um prazer e uma honra tê-los

nesse momento tão especial.

Aos meus amigos de Piracicaba, Andréa Cardoso Pereira, Ana Carolina Correia

Laurindo de Cerqueira Neto, Ana Carolina Pimental Corrêa, Aniele Carvalho Lacerda, Augusto

Rodrigues Lima, Bruna Alves Taveira Ueno, Bruna Milaré Angelieri, Daniela Cristina

Miyagaki, Diogo Henrique da Silva, Eloá Cristina Bícego Pereira, Felipe Nogueira Anacleto,

Flávia Medeiros Saavedra de Paula, Jaqueline Mafra Lazarri, Maicon Ricardo Zieberg Passini,

Marlos Barbosa Ribeiro, Rafaela Casadei Chapola, Rodrigo Arruda Vasconcelos. Agradeço à

vocês por dividirem seus conhecimentos, por estarem presentes tanto nos momentos difíceis

como nos de descontração, e por acrescentarem alegria aos meus dias. Considero valiosa a

amizade de cada um e torço pelo sucesso de todos.

Aos amigos Augusto Rodrigues Lima e Diogo Henrique da Silva, por me receberem

de forma tão gentil e atenciosa. Vocês sempre são positivos e estão dispostos a ajudar. Em

apenas dois anos já dividimos muitas histórias e nos tornamos grandes amigos. Espero tê-los

pra sempre em minha vida.

Ao amigo Marlos Barbosa Ribeiro, por me ajudar a evoluir desde o início do

mestrado, tanto na vida acadêmica e profissional, como também na pessoal. Foi muito bom ter

te conhecido e criado essa amizade tão especial. Tenho um carinho grande por você e fico muito

feliz por tudo que tem conquistado.

Às amigas Flávia Medeiros Saavedra de Paula, Jaqueline Mafra Lazarri e Rodrigo

Arruda Vasconcelos pela companhia de todos os dias, pelo carinho e pela amizade sincera.

Sempre quando precisei vocês estavam presentes para me escutar e ajudar. Espero poder sempre

retribuí-los e tê-los como amigos.

Aos amigos Andréa Cardoso Pereira, Ana Carolina Correia Laurindo de Cerqueira

Neto e Aniele Carvalho Lacerda e Felipe Nogueira Anacleto, pelas conversas agradáveis, pela

gentiliza e também pelos “momentos científicos”. Vocês são muito inteligentes e competentes,

com certeza terão isso refletido em suas vidas profissionais.

Ao amigo Maicon Ricardo Zieberg Passini, pela paciência em ensinar as técnicas

do laboratório e principalmente pela amizade. Sem nossas conversas diárias eu não entenderia

metade do que sei hoje, te agradeço de coração.

Ao Prof. Dr. Walter Luiz Siqueira por ter me aceitado para um estágio na University

of Western Ontario, London, Ontário, Canadá.

Ao Prof. Dr. Mario Zuolo e à Profa. Me. Maria Cristina Coelho Carvalho, pelo

convite ao brilhante curso “Intensivo em Microscopia” ministrado.

À Profa. Dr. Magda Feres e à técnica Izilvânia Barreto, por me receberem em seu

laboratório para a realização de uma metodologia do meu projeto de Mestrado.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela

concessão da bolsa de mestrado no país, processo nº 2015/19215-2 e pela bolsa de estágio

no exterior, processo 2016/19743-1.

À direção da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade Estadual de

Campinas, na pessoa do seu diretor, o prof Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.

À profa Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora do Programa de

Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e à profa Dra. Karina Gonzales Silvério Ruiz, coordenadora

do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.

À Ana Paula Carone, Claudinéia Prata Pradela, Érica A. Pinho Sinhoreti, Lucas de

Almeida Cruz e Raquel Q. Marcondes Cesar, profissionais da secretaria da Pós-Graduação da

Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas.

Aos professores da área de Endodontia, profa. Dra. Adriana de Jesus Soares, prof.

Dr. Alexandre Augusto Zaia, profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, prof.

Dr. Caio Cezar Randi Ferraz e prof. Dr. José Flávio Affonso de Almeida.

Aos funcionários Adriano Luis Martins, Ana Cristina Godoy, Elisângela Barbosa

Vendemiatti, Janaina de Oliveira Leite, Maria Helídia Neves Pereira e Maicon Ricardo Zieberg

Passini.

Aos colegas de mestrado Augusto Rodrigues Lima, Bruna Alves Taveira Ueno,

Bruna Milaré Angelieri, Diogo Henrique da Silva, Eloá Cristina Bicego Pereira, Flávia

Medeiros Saavedra de Paula, Jaqueline Mafra Lazarri, e Rafaela Casadei Chapola.

Aos colegas de doutorado Aline Cristina Gomes, Ana Carolina Correia Laurindo

de Cerqueira Neto, Ana Carolina Pimental Corrêa, Andréa Cardoso Pereira, Aniele Carvalho

Lacerda, Ariane Cássia Salustiano Marinho, Cimara Barroso Braga Brum, Claudia Leal

Sampaio Suzuki, Elilton Cavalcante Pinheiro Júnior, Érika Manuela Asteria Clavijo, Fabrício

Rutz da Silva, Felipe Nogueira Anacleto, Julio Vargas Neto, Marcelle Louise Sposito Bourreau,

Maria Cristina Coelho de Carvalho, Mário Luis Zuolo, Thaís Mageste Duque e Tiago Pereira

da Rosa.

Aos colegas de pós-doutorado: Daniel Rodrigo Herreira Morante e Maria Rachel

Figueiredo Penalva Monteiro.

A todos os pacientes que participaram da minha pesquisa.

A todos que participaram de forma direta e indireta, contribuindo para a realização

deste trabalho.

Muito obrigada!

RESUMO

Na microbiota de infecções secundárias/persistentes predominam micro-

organismos resistentes aos procedimentos endodônticos, destacando-se entre eles Enterococcus

faecalis. A microinfiltração coronária é um agente etiológico do insucesso do tratamento

endodôntico, promovendo uma fonte constante de contaminação da saliva para os canais

radiculares. Os objetivos do presente estudo foram: a) estudar a composição da microbiota da

saliva (S), câmara pulpar (CP) e canal radicular (CR) de dentes com insucesso endodôntico, por

meio da técnica de checkerboard, de maneira a verificar a simultaneidade entre as espécies

bacterianas presentes nestes três sítios; b) quantificar a carga bacteriana total, de Enterococcus

faecalis e de Streptococcus spp. na saliva, câmara pulpar e canais radiculares, por meio de real-

time PCR; c) quantificar os níveis de lipopolissacarídeos (LPS) e ácido lipoteicóico (LTA)

presentes na S, CP e CR investigados; d) correlacionar as bactérias encontradas entre os sítios,

dentro dos sítios e com o LPS/LTA; e) correlacionar os micro-organismos e o LPS/LTA com

os aspectos clínicos dos pacientes. Foram selecionados 20 dentes com presença de lesão

periapical e necessidade de retratamento endodôntico. Amostras foram coletadas da saliva,

câmara pulpar e canal radicular. O DNA destas foi extraído e submetido ao método do

checkerboard utilizando sondas para 40 espécies diferentes. Para a quantificação, por real-time

PCR, de bactérias totais, E. faecalis e Streptococcus spp. foram utilizados primers universais e

específicos. As amostras de LPS e LTA foram quantificadas pelos métodos Limulus

Amoebocyte Lysate (LAL) e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA),

respectivamente. Pelo checkerboard, bactérias foram detectadas em todas as amostras, tanto

Gram-positivas quando Gram-negativas, anaeróbias facultativas e estritas, com média do

número de espécies de 35, 20, e 29, para S, CP e CR, respectivamente. As bactérias mais

prevalentes, encontradas simultanemanete nos 3 sítios estudados foram: E. faecium, P. micra,

F. nucleatum sp. nucleatum, E. faecalis, E. saburreum e C. ochracea. Pelo real-time PCR,

foram encontrada médias de bactérias totais de 1,45 x 106; 6,78 x 105 e; 2,02 x 104, na S, CP e

CR. A proporção média de E. faecalis e Streptococcus spp. nesses mesmos sítios foram de 0,6%

e 10,7% (S); 17,4% e 9% (CP); 9,17% e 1% (CR). O LPS e o LTA estiveram presentes em 95%

e 100% das amostras do CR, com média de 3,26 EU/mL e 578,67 pg/mL. Associações

altamente significativas positivas e negativas (p<0,01) foram encontradas entre espécies dentro

de cada sítio, sendo 2 positivas na S; 66 positivas e 44 negativas na CP; e 7 positivas e 11

negativas no CR, todas com valores de ODDS > 2 ou < 0,5. Uma associação estatística positiva

(p<0,05) entre os sítios dos dentes que apresentavam sinais de microinfiltração (11/20) foi

encontrada entre S. oralis da S e S. oralis do CR (p=0,015 e ODDS=7). Nos dentes que não

apresentavam sinais de microinfiltração (9/20) uma associação negativa foi encontrada, entre

C. showae da CP e C. showae do CR (p=0,048 e ODDS=0,250). Entre a concentração de

bactérias Gram-negativas e o LPS, houve quatro associações positivas (V. parvula-CP/LPS-S;

C. showae-CP/LPS-S; N. mucosa-CP/LPS-S e C. ochracea-CP/LPS-CR); e duas negativas (F.

nucleatum sp. nucleatum-CP/LPS-CP; e D. pneumosintes-CR/LPS-CR) (p<0,01). Entre a

concentração de bactérias Gram-positivas e o LTA, houve uma associação positiva (E. hirae-

CR/LTA-CP) e três negativas (todas na CP, entre o LTA e E. nodatum, S. mitis e E. nodatum)

(p<0,01). Com relação as correlações com aspectos clínicos, três associações negativas

significantes (p<0,05) foram encontradas entre dor à percussão e D. pneumosintes, F.

periodonticum e E. corrodens. O LPS da S apresentou uma correlação moderada positiva com

a presença de fístula (p=0,02). A dor à percussão e o LTA da CP apresentaram uma correlação

regular positiva (p=0,035). Concluiu-se que a microbiota do canal radicular associado à

infecção secundária/persistente é heterogênea, existindo uma similaridade entre as microbiotas

das 3 regiões estudadas, com maior detecção de LTA do que LPS. Associações entre micro-

organismos presentes na saliva, câmara pulpar e canal radicular sugerem possível comunicação

entre os sítios.

Palavras–chave: Periodontite apical, micro-organismos, fatores de virulência, endotoxinas,

clorexidina.

ABSTRACT

In the microbiota of secondary/persistent infections, microorganisms resistant to

endodontic procedures predominate, especially Enterococcus faecalis. Coronary microleakage

is an etiologic agent of endodontic treatment failure, promoting a constant source of saliva

contamination to the root canals. The aims of the present study were: a) to study the microbiota

composition of saliva (S), pulp chamber (PC) and root canals (RC) of teeth with endodontic

failure, by means of the checkerboard technique, in order to investigate the simultaneity among

the bacterial species present in these three sites; b) to quantify the total bacterial load,

Enterococcus faecalis and Streptococcus spp. in saliva, pulp chamber and root canal, by real-

time PCR; c) to quantify the levels of lipopolysaccharides (LPS) and lipoteichoic acid (LTA)

existing in the S, PC and RC investigated; d) to correlate the bacteria found between the sites,

within the sites and with the LPS/LTA; e) to correlate the microorganisms and the LPS/LTA

with the patient clinical aspects. Twenty teeth with presence of periapical lesion and need for

endodontic retreatment, were selected. Samples were collected from saliva, pulp chamber and

root canal. The extracted DNA was subjected to the checkerboard method using probes for 40

different species. For the quantification, by real-time PCR, of total bacteria, E. faecalis and

Streptococcus spp., universal and specific primers were used. The LPS and LTA samples were

quantified by the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) and Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay (ELISA) methods, respectively. By checkerboard, bacteria were detected in all samples,

both Gram-positive and Gram-negative, facultative and strict anaerobes, with an average

number of species of 35, 20, and 29, for S, PC and RC, respectively. Simultaneous bacteria

most found, at the 3 studied sites, were: E. faecium, P. micra, F. nucleatum sp. nucleatum, E.

faecalis, E. saburreum and C. ochracea. By real-time PCR, the mean of total bacteria was 1.45

x 106; 6.78 x 105 e; 2.02 x 104, in S, PC and RC. The mean proportion of E. faecalis and

Streptococcus spp. at these same sites was 0.6% and 10.7% (S); 17.4% and 9% (PC); 9.17%

and 1% (RC). LPS and LTA were found in 95% and 100% of the RC, with a mean of 3.26

EU/mL and 578.67 pg/mL. Highly significant positive and negative associations (p <0.01) were

found between species for each site, being 2 positives in S; 66 positive and 44 negatives in PC;

and 7 positive and 11 negative in RC, all with ODDS values> 2 or <0.5. A positive statistical

association (p <0.05) between the sites of the teeth showing signs of microleakage (11/20) was

found between S. oralis from S and S. oralis from RC (p = 0.015 and ODDS = 7). In the teeth

that did not show signs of microleakage (9/20) a negative association was found between C.

showae of PC and C. showae from RC (p = 0.048 and ODDS = 0.250). There were four positive

associations between the Gram-negative bacteria concentration and the LPS (V. parvula-

PC/LPS-S, C. showae-PC/LPS-S and C. ochracea-PC/LPS-RC), and two negatives (F.

nucleatum sp. nucleatum-PC/LPS-PC and D. pneumosintes-RC/LPS-RC) (p <0.01). Between

the Gram-positive bacteria concentration and the LTA, there were one positive association (E.

hirae-RC/LTA-PC) and three negatives (all at PC between LTA and E. nodatum, S. mitis and

E. nodatum) (p <0.01). With regard to correlations with the clinical aspects of patients, three

significant negative associations (p <0.05) were found between pain to percussion and D.

pneumosintes, F. periodonticum and E. corrodens. LPS of S presented a moderate positive

correlation with the fistula presence (p = 0.02). The pain to percussion and LTA of the PC had

a positive positive correlation (p = 0.035). It was concluded that the microbiota of root canal

associated with secondary/persistent infection is heterogeneous, with a similarity among the

microbiotas in the 3 sites, with greater detection of LTA than LPS. Associations between the

microorganisms present in the saliva, pulp chamber and root canal suggest a possible

communication among the sites.

Keywords: Periapical periodontitis, microorganisms, virulence factors, endotoxins,

chlorhexidine.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 =

105, 3 = 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) na saliva de pacientes

com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por meio da técnica de

checkerboard. 60

Figura 2. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 =

105, 3 = 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) na câmara pulpar do

dente de pacientes com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por

meio da técnica de checkerboard. 61

Figura 3. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 =

105, 3 = 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) no canal radicular do

dente de pacientes com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por

meio da técnica de checkerboard. 62

Figura 4. Número de espécies por caso de insucesso coletado nos 3 sítios

estudados (saliva, câmara pulpar e canal radicular), investigado pelo checkerboard. 64

Figura 5. Média e desvio-padrão da concentração de LPS em EU/mL das amostras

de saliva, câmara pulpar e canal radicular. 67

Figura 6. Média e desvio-padrão da concentração de LTA em pg/mL das amostras

de saliva, câmara pulpar e canal radicular. 68

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Relação das cepas empregadas para o desenvolvimento das sondas de

DNA bacteriano. 48

Tabela 2. Pares de primers reportado na literatura, que foram utilizados na reação

de real-time PCR 50

Tabela 3. Diluição da solução de endotoxina de E. coli para a determinação da

curva padrão 52

Tabela 4. Características clínicas dos pacientes com insucesso do tratamento

endodôntico e presença de lesão periapical. 57

Tabela 5. Quantificação e prevalência de bactérias totais, E. faecalis e

Streptococcus spp., na saliva, câmara pulpar e canais radiculares de dentes com

insucesso do tratamento endodôntico e presença de lesão periapical. 66

Tabela 6. Associações positivas significantes (p<0,05) entre as espécies bacterianas

Gram-negativas e o LPS. 70

Tabela 7. Associações negativas significantes (p<0,05) entre as espécies

bacterianas Gram-negativas e o LPS. 70

Tabela 8. Associações positivas significantes (p<0,05) entre as espécies bacterianas

Gram-positivas e o LTA. 71

Tabela 9. Associações negativas significantes (p<0,05) entre as espécies bacterianas

Gram-positivas e o LTA. 71

Tabela 10. Associações negativas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas

investigadas e os sinais e sintomas clínicos observados. 71

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 19

2 REVISÃO DA LITERATURA 22

2.1 Insucesso endodôntico 22

2.2 Papel da microinfiltração coronária 24

2.3 Microbiota do insucesso endodôntico 27

2.3.1 Enterococcus faecalis 29

2.4 Métodos moleculares de identificação bacteriana 31

2.4.1 Checkerboard DNA-DNA hybridization 32

2.4.2 Real-time PCR 34

2.5 Fatores de virulência 35

2.5.1 Lipopolissacarídeo (LPS) 36

2.5.2 Ácido lipoteicóico (LTA) 38

3 PROPOSIÇÃO 40

4 MATERIAL E MÉTODOS 41

4.1 Autorização para realização da pesquisa 41

4.2 Local da pesquisa 41

4.3 Seleção dos sujeitos da pesquisa 41

4.4 Exame clínico, aspectos clínicos e radiográficos 42

4.5 Procedimentos clínicos 43

4.5.1 Coleta das amostras da saliva 43

4.5.2 Coleta das amostras da câmara pulpar 43

4.5.3 Coleta das amostras do canal radicular 44

4.5.4 Armazenamento das amostras 45

4.5.5 Retratamento endodôntico 45

4.6 Procedimentos laboratoriais 46

4.6.1 Checkerboard DNA-DNA hibridization 46

4.6.1.1 Extração do DNA microbiano 46

4.6.1.2 Aplicação das amostras na membrana de nylon 46

4.6.1.3 Hibridização da membrana com as sondas de DNA 47

4.6.1.4 Detecção das espécies 49

4.6.2 Quantificação por meio do real-time PCR 50

4.6.2.1 Primers utilizados 50

4.6.2.2 Extração do DNA 51

4.6.2.3 Reação de real-time PCR 51

4.6.3 Endotoxinas (LPS) - Pyrogent-5000 Kinetic Turbidimetric Teste

Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Lonza, Walkersville, MD, EUA) 51

4.6.3.1 Materiais apirogênicos 51

4.6.3.2 LAL Pyrogent-5000 (Lonza, Walkersville, MD, EUA) 52

4.6.3.3 Procedimentos para execução do teste 53

4.6.3.4 Cálculo da concentração de endotoxinas 53

4.6.4 Ácido Lipoteicóico (LTA) - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 54

4.7 Análise estatística 54

5 RESULTADOS 56

5.1 Perfil dos casos coletados 56

5.2 Composição da microbiota 58

5.2.1 Micro-organismos identificados pelo checkerboard 58

5.2.2 Distribuição da microbiota 63

5.2.3 Quantificação dos micro-organismos pelo real-time PCR 65

5.3 Lipopolissacarídeos e ácido lipoteicóico 67

5.4 Associações da microbiota, LTA, LPS e aspectos clínicos e radiográfico 68

5.4.1 Associações entre a microbiota identificada nos 3 sítos 68

5.4.2 Associações dentro da microbiota identificada em cada sítio 69

5.4.3 Associações entre bactérias Gram-negativas e LPS 69

5.4.4 Associações entre bactérias Gram-positivas e LTA 70

5.4.5 Associações entre os micro-organismos e aspectos clínicos e radiográficos 71

5.4.6 Associações entre o LPS e aspectos clínicos e radiográficos 72

5.4.7 Associações entre o LTA e aspectos clínicos e radiográficos 72

6 DISCUSSÃO 73

6.1 Composição da microbiota da saliva, câmara pulpar e canal radicular 73

6.2 Níveis de lipopolissacarídeos e ácido lipoteicóico 80

6.3 Associações da microbiota, LTA, LPS e aspectos clínicos e radiográficos 81

7 CONCLUSÃO 85

REFERÊNCIAS 87

APÊNDICES 103

Apêndice 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 103

Apêndice 2 – Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na saliva. 106

Apêndice 3 – Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na câmara pulpar. 107

Apêndice 4 – Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na câmara pulpar. 110

Apêndice 5 – Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas no canal radicular. 112

Apêndice 6 – Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas no canal radicular. 113

Apêndice 7 – Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado,

nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal radicular),

investigadas pelo checkerboard 114

ANEXO 1 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP 124

19

1 INTRODUÇÃO

É reconhecido que os micro-organismos encontrados nos canais radiculares podem

ser oriundos da cavidade oral (Gomes et al., 2004; Sedgley et al., 2006). A existência desses

micro-organismos e seus produtos no interior dos canais são fatores cruciais no

desenvolvimento e manutenção das doenças endodônticas (Kakehashi et al., 1965). Assim, o

objetivo de uma terapia endodôntica bem sucedida consiste em alcançar a drástica redução do

conteúdo bacteriano intracanal. Todavia, alguns casos podem evidenciar o ressurgimento ou

persistência de lesões perirradiculares, o que revela a falha do tratamento anterior (Subramanian

e Mickel, 2009).

Embora estudos, como o de Nair (1999), mostrem que fatores não microbianos,

como as reações de corpo estranho à substâncias endógenas (cristais de colesterol) e exogênas

(extrusão do material obturador), possam estar envolvidos na patologia periapical, inúmeros

trabalhos na literatura reportam que a principal causa do insucesso do tratamento endodôntico

é a persistência da comunidade bacteriana (Sundqvist et al., 1998; Molander et al., 1998;

Pinheiro et al., 2003a; Gomes et al., 2004; Rôças et at., 2004; Gomes et al., 2006; Endo et al.,

2013; Barbosa-Ribeiro et al., 2016; Delboni et al., 2017).

Os fatores etiológicos mais comuns que podem levar a infecção endodôntica

associada ao insucesso são: controle asséptico inadequado, acesso coronário mal executado,

canais radiculares não encontrados, anatomia radicular complexa, instrumentação imprópria, e

infiltração da obturação ou da restauração coronária (Ray e Trope 1995; Sundqvist et al., 1998).

A microinfiltração por falta do selamento coronário satisfatório promove uma fonte constante

de agentes infecciosos da saliva, que podem iniciar e manter a infecção periapical, levando ao

insucesso do tratamento endodôntico (Dos Santos et al., 2014; Delboni et al., 2017).

A penetração dos micro-organismos no interior dos canais radiculares devido à

microinfiltração coronária poderá trazer como consequência o desenvolvimento ou perpetuação

da periodontite apical crônica, sem quaisquer sintomas, ou com sintomas persistentes e

exsudação (Siqueira, 1997). Além disso, certos componentes da estrutura bacteriana,

conhecidos como fatores de virulência, poderão agir estimulando as respostas inflamatórias e

imunológicas (Amersfoort et al., 2003).

A composição da microbiota associada com infecção secundária/persistente é

diferente em número e em diversidade de espécies quando comparada à infecção primária.

20

Bactérias anaeróbias facultativas Gram-positivas são predominantes nesse meio ambiente

(Molander et al., 1998; Pinheiro et al, 2003a; Gomes et al., 2005), dentre elas, Enterococcus

spp tem sido a mais frequentemente detectada (Hancock et al., 2001; Gomes et al., 2006b;

Ozbek et al., 2009a; Wang et al., 2012), assim como Streptococcus spp. (Rôças et al.,2008 e

Antunes et al, 2015). Essas espécies possuem maior capacidade de sobreviver ao preparo

químico-mecânico, à medicação intracanal e à obturação dos canais radiculares, ou seja, a um

meio nutricional restrito, no qual as inter-relações são mínimas (Sundqvist et al., 1998).

Para um melhor entendimento da microbiota presente nos canais radiculares e de

seu papel nas infecções periapicais, métodos moleculares de identificação microbiana têm sido

amplamente utilizados em pesquisas na área de microbiologia aplicada à odontologia (Munson

et al., 2002; Sedgley et al., 2005; Siqueira e Rôças, 2005ab; Gomes et al., 2006ab; Sakamoto et

al., 2006; Vianna et al., 2008; Subramanian e Mickel, 2009; Endo et al., 2013). A biologia

molecular cultura-independente, apresenta vantagens em relação aos procedimentos de

identificação bacteriana baseados em características fenotípicas, em aspectos como: maior

sensibilidade e especificidade, e a capacidade de identificar bactérias incultiváveis (Munson et

al., 2002; Siqueira e Rôças, 2005ab), gerando resultados relevantes em relação ao conteúdo

microbiano.

O checkerboard DNA-DNA hybridization é um tipo de método independente de

cultura, proposto por Socransky et al. (1994) que trabalha com a identificação de múltiplas

espécies em amostras clínicas a partir do DNA total, levando a maior compreensão do perfil da

microbiota associada a infecções endodônticas, de forma rápida e com sensibilidade adequada

(Sakamoto et al., 2006). O método é capaz de revelar o número e composição microbiana, fator

importante para o entendimento do desenvolvimento e manutenção da doença (Vianna et al.,

2008). Outro método molecular é o real-time PCR, uma variação da reação da cadeia de

polimerase (PCR). A maior parte dos ensaios de PCR são qualitativos ou semi-quantitativos,

com exceção do real-time PCR, que é capaz de identificar microrganismos específicos

(Shelburne et al., 2000; Antunes et al., 2015). Tal método envolve a análise dos padrões de

amplificação ao longo de um número de ciclos de PCR, utilizando sondas fluorogênicas

espectralmente distintas para detectar e quantificar os genes de interesse. Durante os repetitivos

ciclos de amplificação, ocorre o aumento da fluorescência que é monitorado e medido pelo

aparelho de real-time, sendo proporcional a quantidade do DNA amplificado (Sedgley et al.,

2005).

21

Em relação aos fatores de virulência, o ácido lipoteicóico (LTA) é um componente

importante da parede e membrana de bactérias Gram-positivas, grupo mais prevalente dentro

da infecção secundária/persistente. O LTA pode ativar e permanecer dentro dos macrófagos por

longo tempo, induzir a liberação de citocinas pró-inflamatórias como IL-1, IL-6, e TNF-α

(Amersfoort et al., 2003), ativar o sistema complemento (Ginsburg, 2002), e estar envolvido na

formação do biofilme e adesão ao dente devido sua ação adsortiva a hidroxiapatita (Fabretti et

al., 2006). Todas essas atividades do LTA poderão afetar indiretamente na indução da lesão

periapical. Outro fator de virulência intimamente ligado a doença periapical são as endotoxinas

(lipopolissacarideos, LPS) presentes na parede celular das bactérias Gram-negativas. Embora a

literatura relate a predominância de bactérias Gram-positivas nos insucessos, Gomes et al.

(2008) demonstraram que bactérias Gram-negativas também estão presentes na infecção

persistente. O LPS tem-se mostrado presente em todos os canais radiculares com infecção

endodôntica (Martinho et al., 2014; Marinho et al., 2015). Mesmo em pequena concentração

(1 à 50 µg/ml), este pode agir na estimulação da resposta imunológica, com a liberação de

citocinas pró-inflamatórias por neutrófilos e monócitos/macrófagos, podendo gerar dor e

sintomatologia clínica (Hanazawa et al., 1985; Wilson et al., 1996; Martinho et al., 2010;

Gomes et al., 2012).

Dessa forma, este estudo clínico foi conduzido para elucidar a composição da

microbiota e os níveis de endotoxinas e ácido lipoteicóico presentes na saliva, câmara pulpar e

canal radicular de dentes com infecção secundária/persistente. O trabalho também

correlacionou nos três sítios estudados: a comunidade microbiana; o LPS; o LTA; além dos

aspectos clínicos e radiográficos, propondo rotas de associação entre a microbiota da cavidade

bucal e aquela associada ao insucesso do tratamento endodôntico.

22

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 INSUCESSO ENDODÔNTICO

O objetivo do tratamento endodôntico é prevenir ou tratar a periodontite apical para

que o dente possa continuar em função na cavidade oral. A periodontite apical é caracterizada

como uma resposta inflamatória à infecção intra ou extra-radicular, representando uma tentativa

de defesa do hospedeiro contra a disseminação de bactérias e seus sub-produtos para o osso

alveolar e outras partes do organismo (Sundqvist, 1994; Stashenko et al. 1998; Nair, 2004;

Siqueira et al., 2014).

A presença de micro-organismos dentro dos canais radiculares foi demonstrada pela

primeira vez por Miller em 1890. Kakehashi (1965), em seu afamado trabalho, demonstrou

que a periodontite apical apenas desenvolve-se na presença de bactérias.

Desta forma, a eliminação ou redução de bactérias no interior dos canais radiculares

é mandatória, visto que a principal causa da lesão periapical pós-tratamento, ou seja, do

insucesso do tratamento endodôntico, é a permanência de micro-organismos ou a

recontaminação do sistema de canais radiculares. (Siqueira e Rôças, 2008; Endo et al., 2013;

Siqueira et al., 2014).

Espera-se que o insucesso seja resultado de uma terapia anterior mal conduzida.

Problemas comuns que podem levar ao insucesso endodôntico incluem: controle asséptico

inadequado, abertura coronária mal delineada, canais não encontrados, anatomia radicular

complexa, instrumentação inadequada, e infiltração das restaurações temporárias e permanentes

(Sundqvist e Figdor, 1998). Contudo, Siqueira e colaboradores (2014) em uma revisão da

literatura que teve como um de seus objetivos estudar as causas do insucesso, verificou que a

periodontite pós-tratamento também pode ser observada em alguns casos de dentes

aparentemente bem tratados, isto devido a questões da complexa anatomia radicular, ocorrendo

em 5-15% dos casos com lesão periapical pré-operatória. Ainda, Sundqvist e Figdor (1998)

afirmam que dois fatores possuem influência negativa no prognóstico do tratamento

endodôntico: a presença de infecção no interior dos canais no momento da obturação e o

tamanho da lesão periapical.

23

O insucesso endodôntico pode ser caracterizado como emergente (se desenvolvido após

o tratamento), persistente (se persistiu apesar do tratamento) e secundária (se desenvolvido após

a cura da patologia inicial). Quanto a sua localização, a infecção usualmente se encontra dentro

dos canais radiculares (Möller, 1966; Sundqvist et al., 1998; Molander et al., 1998; Hancock et

al., 2001), mas em alguns casos essa pode estender-se externamente aos tecidos radiculares

(Tronstad et al., 1990; Siqueira et al., 2014). Fatores não microbianos também foram sugeridos

como potencial causa da patologia pós-tratamento, mas as evidências científicas desses casos

são pouco relatadas na literatura (Nair et al., 1990; Nair, 1999).

A infecção persistente é composta por bactérias provenientes do primeiro

tratamento que não foram eliminadas ou suficientemente controladas. Essas bactérias estão

normalmente localizadas em regiões das paredes dos canais radiculares não tocadas pela

instrumentação e pelas substâncias químicas auxiliares, ou em áreas de difícil acesso como

canais laterais, ramificações apicais, túbulos dentinários e istmos (Fukushima et al. 1990, Ida e

Gutmann 1995; Sjögren et al. 1997; Nair et al., 2005; Ricucci et al., 2009; Vera et al., 2012).

A infecção secundária é causada por bactérias que não estavam presentes no canal

antes do primeiro tratamento, mas foram introduzidas durante o mesmo devido a falta de

atenção às condições assépticas durante os procedimentos (Siren et al.1997), ou devido à falha

no selamento coronário após a conclusão do tratamento (Torabinejad et al., 1990; Magura et

al., 1991; Ray e Trope, 1995; Cheung 1996; Vieira et al., 2012).

Ainda, para Nair (2004), existem 5 fatores biológicos que contribuem para a

persistência da radioluscência periapical após o tratamento dos canais radiculares: 1) a infecção

intra-radicular na porção apical do sistema de canais radiculares; 2) infecção extra-radicular, na

forma de actinomicose periapical; 3) cistos; 4) reações de corpo estranho à substâncias

cristalinas de origem endógena (cristais de colesterol), extrusão do material obturador ou

qualquer outro material exógeno; e 5) tecido de cicatrização da lesão. Entretanto, enfatiza que

de todos esses fatores, a infecção persistente na porção apical radicular é a principal causa do

insucesso endodôntico prevista na literatura (Nair et al., 1990a; Sjögren, 1996; Figdor, 2002).

O diagnóstico clínico do insucesso endodôntico é frequentemente caracterizado

pela presença de sinais e/ou sintomas de periodontite apical, que pode ter persistido ou surgido

pós-tratamento (European Society of Endodontology, 2006; Roças et al., 2008). A decisão

sobre o retratamento ou não depende da avaliação da lesão periapical, ou seja, se esta está

curando ou não. Quando imagens radiográficas do tratamento prévio estão disponíveis para

24

comparação, o julgamento pode ser facilitado. Algumas situações em que retratamento é

indicado são: 1) presença de obturação incompleta ou defeituosa associada ao desenvolvimento

de uma lesão periapical; 2) necessidade de uma nova restauração e a qualidade da obturação

anterior não é satisfatória; e 3) dentes que no momento do tratamento anterior não apresentavam

lesão e algum tempo depois a exibem. Para dentes com radioluscência apical pré-operatória, o

tempo de proservação é um fator importante para a cura. Um acompanhamento de 4 anos é

considerado favorável (Sjögren et al., 1998).

Na tentativa de preservar-se o elemento dentário sempre que possível, várias

estratégias são sugeridas, entre elas: o retratamento não cirúrgico com ou sem o uso de

medicação intracanal, cirurgia parendodôntica ou a extração do elemento dental e substituição

por implante. Geralmente o retratamento não cirúrgico é a primeira escolha, visto ser a

abordagem menos invasiva (Sjögren et al., 1997; Siqueira, 2001). Os procedimentos clínicos

dessa técnica incluem a remoção da obturação original, seguida por nova instrumentação,

desinfecção e obturação (Salehrabi e Rotstein, 2010).

2.2 PAPEL DA MICROINFILTRAÇÃO CORONÁRIA

Estudos transversais apontam que os melhores resultados de tratamentos

endodônticos são obtidos em dentes com adequadas obturações associado a adequadas

restaurações coronárias (Tronstad et al., 2000; Siqueira et al., 2005; Moreno et al., 2013). Sendo

assim, o tratamento do dente afetado deve ser considerado como um todo e a adaptação da

restauração coronária permanente deve ser feita o quanto antes após o término do tratamento

dos canais radiculares (Siqueira et al., 2014).

Pinheiro et al. (2003a) notaram em seu trabalho que a infiltração coronária (por

restaurações defeituosas, materiais temporários antigos ou dentes sem selamento) foi detectada

em 45 dos 60 dentes retratados e pode ter influenciado os achados microbiológicos. Gomes et

al., em 2006, analisando que a maior parte dos dentes incluídos em sua pesquisa apresentavam

cáries ou restaurações defeituosas, também relacionaram a infiltração coronária (durante ou

após o tratamento) à presença de determinados micro-organismos dentro do sistema de canais.

Tais resultados corroboram com os de Ray e Trope de 1995, que indicaram que a

obturação dos canais não é uma barreira adequada contra a infiltração, devendo ser então, o

adequado selamento coronário um fator crítico para o sucesso.

25

Ng et al. (2008), da mesma forma, afirmam que dentes com restaurações

satisfatórias tem maior taxa de sucesso e cura significativamente melhor dos tecidos periapicais

(10–18%; OR = 1.82), quando comparados a dentes com restaurações de baixa qualidade. Além

disso, postulam que quatro fatores são identificados como fortes influenciadores do prognóstico

do tratamento endodôntico: a) presença de lesão periapical, b) extensão apical da obturação, c)

qualidade da obturação, e d) estado restaurador pós-tratamento. Com base nesses resultados,

concluíram que a restauração coronária deve ser considerada a parte final do tratamento de

canais radiculares juntamente a obturação, com o intuito de prevenir a reinfecção pós-

operatória.

Em 2000, Tronstad e colaboradores observaram que dentes diagnosticados com boa

endodontia e boa restauração coronária apresentavam taxas de sucesso de 81%. Já em dentes

diagnosticados com boa endodontia e restauração coronária ruim a taxa de sucesso diminuia de

10% à 71%. Essa diferença foi estatisticamente significante e a importância do bom selamento

coronário foi também evidenciada nesse estudo.

Uma revisão de 33 trabalhos anteriores à 1994, realizada por Sanders e Sanders,

relacionando a falha do tratamento endodôntico à microinfiltração, concluiu que a infiltração

deve ser considerada como uma importante causa da falha do tratamento dos canais radiculares.

Por outro lado, em outra revisão da literatura, Siqueira et al. (2014) contrariando o

pressuposto de que a infiltração coronária desempenha um papel importante na falha do

tratamento, encontraram evidências de que a doença pós-tratamento é causada principalmente

por bactérias que persistiram no sistema de canais radiculares após o tratamento inicial. A

afirmativa é baseada nas seguintes constatações:

a) Biópsia de espécimes de dentes com doença pós-tratamento geralmente revelam

uma infecção bacteriana localizada no terço apical do canal, mas não se estendendo ao longo

de todo o comprimento das paredes do canal (Ricucci et al., 2009);

b) Culturas positivas de amostras de canais radiculares tomadas no momento da

obturação indicando um problema infeccioso persistente (Sjögren et al., 1997);

c) A incidência de doença pós-tratamento é maior em dentes com periodontite

apical pré-operatória do que nos dentes sem lesão. As taxas de falha no tratamento de dentes

vitais e necróticos não são iguais (Strindberg, 1956; Chugal et al., 2003; Østavik et al., 2004;

Ricucci et al., 2011)

26

A prevalência de alguns micro-organismos, como Enterococcus faecalis e fungos,

foram observadas em diferentes sítios, como a cavidade oral e os canais radiculares, ambientes

estreitamente conectados, especialmente na presença de infiltração coronária. Assim, é possível

que espécies do canal radicular provenham da cavidade oral, bem como espécies do canal

radicular migrem para a cavidade oral (Al-Ahmad et al., 2009, Zhu et al., 2010; Delboni et al.,

2017).

A fonte provável de E. faecalis em canais radiculares com insucesso do tratamento

endodôntico é a cavidade oral. Wang et al. (2012) notaram que a maior parte das amostras dos

canais radiculares que eram positivas para E. faecalis correspondiam a amostras de saliva que

também eram positivas para essa bactéria, indicando uma correlação com a presença de espécie

nos dois sítios.

Notoriamente, segundo a literatura, E. faecalis não é um colonizador oral comum

em cavidades bucais com dentição saudável. Usualmente, enterococos não são detectados na

saliva de pessoas dentadas que nunca receberam tratamento endodôntico (Sedgley et al., 2004;

Ravazi et al., 2007). Em contraste, um estudo reportou que 75% dos pacientes com tratamento

endodôntico, possuíam espécies de enterococos detectáveis na saliva (Gold et al., 1975).

Também foi sugerido que pode existir uma associação positiva entre a ocorrência de E. faecalis

e o número de visitas clínicas, devido à microinfiltração coronária através da restauração

temporária entre sessões do tratamento endodôntico (Siren et al., 1997). A fase de reabilitação

do elemento dental tratado é igualmente crítica para recontaminação, pois o uso do material

selador temporário por longos períodos pode levar a desadaptação e infiltração do mesmo.

Assim, a qualidade da restauração temporária pode ser importante na prevalência da infecção

por E. faecalis em canais radiculares (Zehnder et al., 2009).

Zhu et al. (2010), estudando a prevalência, fenótipo e genótipo de E. faecalis,

revelaram que não houve diferenças significativas entre a sua prevalência na saliva e nos canais

radiculares. Contudo, as cepas encontradas dessa espécie eram diferentes, o que sugere que um

único paciente pode ter diferentes cepas de E. faecalis em diferentes nichos da cavidade oral.

Delboni et al. (2017) investigaram a diversidade e similaridade entre os

genótipos de E. faecalis isolados de múltiplos sítios orais (saliva, câmara pulpar e canal

radicular) associados ao insucesso endodôntico, por meio de duas técnicas de reação em cadeia

de polimerase. Em seus resultados, os autores observaram a presença de 7 diferentes genótipos

de E. faecalis nas cepas isoladas. Notaram igualmente que em 80% dos pacientes esses mesmos

genótipos isolados do canal radicular, também estavam presentes na saliva ou na câmara pulpar.

27

Dessa forma, concluíram que as cepas de E. faecalis dos 3 sítios estudados são similares pelos

métodos aplicados e que a comunicação entre os ambientes orais pela microinfiltração coronária

é uma possível causa do insucesso endodôntico.

Em relação aos fungos em casos de insucesso, a associação encontrada por Egan

et al. (2001), foi altamente significante (P = 0,021), com uma probabilidade de 13,8 vezes de

haver fungos no canais, quando estes também estavam presentes na saliva. Os autores sugerem

que tais fungos podem ter invadido os canais radiculares durante o tratamento inicial por

infiltração coronária ou pela colonização dos túbulos dentinários.

2.3 MICROBIOTA DO INSUCESSO ENDODÔNTICO

Os micro-organismos capazes de sobreviver no interior de canais já tratados devem

ser resistentes às medidas antibacterianas administradas durante a limpeza e medicação e devem

sobreviver em um ambiente escasso de nutrientes, onde as relações com outras bactérias são

mínimas (Sundqvist et al., 1998).

Com o objetivo de caracterizar-se o perfil microbiológico da infecção

secundária/persistente muitos trabalhos foram conduzidos. Pode-se notar que o com o avanço

das técnicas de identificação, um número maior de espécies foi relacionado a essa condição

patológica. Por muito tempo predominou a utililização de técnicas de cultura para identificação

bacteriana, por meio delas acreditava-se que o insucesso era composto por monoinfecções, ou

então por uma diversidade bem reduzida de espécies. Em 1998, Sundqvist et al., por meio da

coleta microbiológica de 54 dentes previamente tratados e com presença de lesão periapical,

revelaram que a microbiota desses dentes era composta por espécies únicas predominantemente

Gram-positivas, e que E. faecalis era a bactéria mais comumente isolada. Apenas em um caso,

em que a qualidade de tratamento anterior foi considerada ruim por análise radiográfica, a flora

foi similar àquela encontrada em canais nunca tratados, contendo um grande número de

espécies.

Hancok et al. (2001), encontraram resultados semelhantes ao de Sundqvist et al.

(1998), em que mais de um terço de seus casos eram de monoinfecções, com uma média de 1,7

espécies por canal radicular. Ademais, observaram que quando a obturação do tratamento

prévio estava a mais de 2 mm do ápice radiográfico, havia um aumento estatisticamente

significativo nas chances de se encontrar bactérias intracanal (P<0,5). Canais com uma

28

qualidade da obturação considerada ruim apresentaram uma carga microbiana maior,

provavelmente devido a um ambiente similar ao da necrose pulpar.

Pinheiro e colaboradores, em 2003, recuperaram micro-organismos de 51 dentes

com infecção secundária/persistente. Na maioria dos casos, uma ou duas cepas por canal foram

encontradas. Das espécies microbianas isoladas, 57,4% eram anaeróbias facultativas e 83,3%

Gram-positivas. Enterococcus faecalis foi a espécie mais prevalente. Os anaeróbios

obrigatórios representaram 42,6% das espécies e os gêneros mais frequentemente isolados

foram Peptostreptococcus, que foi associado a sintomas clínicos (P <0,01). Também foram

observadas associações significantes entre: dor ou história de dor e infecções polimicrobianas

ou anaeróbias (P <0,05); sensibilidade à percussão e Prevotella intermedia / P. Nigrescens (P

<0,05); fístula e Streptococcus spp. (P <0,001) ou Actinomyces spp. (P <0,01); e dentes sem

selagem coronária e Streptococcus spp. ou Candida spp. (ambos com P <0,01).

Siqueira e Rôças (2004) utilizaram a técnica de PCR para investigar a ocorrência

de várias espécies microbianas em canais radiculares previamente tratados associados a lesões

perirradiculares recalcitrantes de pacientes brasileiros e encontraram bactérias anaeróbias

fastidiosas, como Pseudoramibacter alactolyticus; Propionibacterium propionicus; Filifactor

alocis e Dialister pneumosintes, em valores de prevalência relativamente elevados,

independentemente da qualidade da obturação dos canais.

Em um estudo, em que todos os casos examinados estavam mal obturados, as

espécies mais freqüentemente detectadas foram Enterococcus faecalis (64%), seguido por

Streptococcus spp. (21%) e Tannerella forsythensis (14%) (Rôças et al., 2004).

Quando Rôças e colaboradores (2008) estudaram a composição microbiológica

do insucesso endodôntico de 17 dentes em uma população alemã, pela técnica molecular

Reverse-capture Checkerboard, identificaram uma microbiota diversificada, contendo:

Streptococcus species (47% do casos), Lactobacillus species (35%), Dialister invisus (29%),

Eubacterium infirmum (29%), Prevotella intermedia (29%), Selenomonas sputigena (29%),

Synergistes oral clone BA121 (29%), e Treponema denticola (29%). E. faecalis (47%) e C.

albicans (6%) também foram identificados por PCR espécie-especifico. Contrariando as

pesquisas anteriores, a maior parte dos casos tiveram uma infecção mista, e E. faecalis, quando

presente, não foi a espécie mais dominante.

Com o objetivo de caracterizar e determinar a frequência da colonização

bacteriana em lesões periapicais e porções apicais de raízes submetidas a apicectomia,

29

Subramanian e Mickel (2009) coletaram, durante cirurgias parendodônticas, amostras do tecido

perirradicular e da porção radicular ressectada e encontraram diversos gêneros como,

Lactobacillus, Propionibacterium, Neisseria, Selenomonas, Abiotrophia e Bifidobacterium que

apresentavam uma associação significativa maior com a porção apical da raiz do que com a

lesão. Estas bactérias podem ter estado presentes como um biofilme na superfície externa da

raiz ou encontradas na porção apical do canal radicular.

A análise do conteúdo bacteriano dos canais radiculares provenientes do

insucesso, por métodos moleculares como o PCR, tem permitido a detecção de algumas

espécies bacterianas Gram-negativas de difícil cultivo, como Fusobacterium spp.,

Porphyromonas spp., Prevotella spp., Tannerella spp. e Treponema spp, além de revelar um

perfil heterogêneo da infecção polimicrobiana (Endo et al., 2013).

Outro estudo, utilizando análises moleculares, em consonância com os anteriores

mostra que comunidades bacterianas mistas ocorreram na maioria das amostras, onde as

espécies de Streptococcus, membros do filo Actinobacteria e P. alactolyticus foram mais

prevalentes e dominavam as comunidades bacterianas apicais em muitos casos (Antunes et al.,

2015).

2.3.1 Enterococcus faecalis

Independente da técnica de identificação utilizada (dependentes ou

independentes de cultura), E. faecalis, uma espécie Gram-positiva facultativa anaeróbia, é um

dos micro-organismos mais detectados em casos de retratamento (Sundqvist et al., 1998;; Rôças

et al., 2004; Siqueira e Roças, 2004; Willians et al., 2006; Ozbek et al., 2009a; Subramanian e

Mickel, 2009; Barbosa-Ribeiro et al., 2016), sendo capazes de suportar condições severas de

sobrevida no canal radicular com grande variação de pH, temperatura e tensão de O2 (Gomes

et al., 2008; Baik et al., 2011; Lee e Baek 2012). Quando expostas ao estresse ambiental,

algumas cepas podem adotar um estado viável mas não cultivável e ressuscitar quando as

condições normais são restabelecidas (Lleò et al., 2001). E. faecalis pode sobreviver à

prolongados períodos com quantidades ínfimas de nutrientes (Figdor et al., 2003). Ademais ele

pode crescer em mono-cultura em canais radiculares já preenchidos na ausência de suporte

sinérgico de outra bactéria (Fabricius et al., 1982).

30

Antunes e colaboradores (2015), notaram que a prevalência de E. faecalis, em

suas coletas de casos de insucesso, não foram tão pronunciadas (14%). Isso pode estar

diretamente relacionado com a qualidade do tratamento endodôntico e do selamento coronário,

que foram considerados adequados. Outro motivo pode ser as condições bacteriológicas do

canal radicular como um todo, já que este estudo foi restrito apenas a porção apical do sistema

de canais. Em dois casos em que E. faecalis foi detectado, ele era altamente dominante,

correspondendo a mais de 98% da população total de bactérias. Kaufman et al., (2005); Zoletti

et al., (2006) e Roças et al., (2008), também encontraram uma baixa prevalência dessa bactéria

em canais radiculares previamente tratados, o que questiona a acepção corrente de que E.

faecalis é a espécie mais importante envolvida em insucessos do tratamento endodôntico

Já nas infecções primárias, a prevalência de E. faecalis é baixa, o que pode ser

explicado pelas interações negativas ocorrendo na microbiota no canal radicular, isto é, outras

espécies podem inibir o seu crescimento (Sundqvist, 1992). Ainda, existe a possibilidade de

que, durante a preparação químico-mecânica, as espécies bacterianas anaeróbias mais

prevalentes sejam mais susceptíveis a serem eliminadas do que E. faecalis, demonstrando ser

resistente aos procedimentos e também aos medicamentos antimicrobianos intracanais,

incluindo o hidróxido de cálcio (Byström et al., 1958; Gomes et al., 1996). Várias maneiras

pelas quais E. faecalis sobrevive a ambientes extremamente alcalinos, foram reportadas, como:

a) à sua capacidade de regular o pH interno com uma eficiente bomba de prótons (Evans et al.,

2002); b) pelo efeito tampão da dentina, fazendo com que o alto pH não consiga alcançar os

túbulos dentinários (Haapasalo et al., 2000); e c) pela síntese de genes de transcrição e proteínas

de resposta ao estresse alcalino (Flahaut et al., 1997; Appelbe e Sedgley et al., 2007).

Vários mecanismos de sobrevivência de E. faecalis estão descritos na literatura,

como sua capacidade de: aderir e infiltrar células epiteliais (Guzman et al., 1989; Mohamed et

al., 2004) e formar biofilmes persistentes associados a infecção refratária (Kishen et al., 2006).

Subramanian e Mickel (2009) reforçaram tais achados, afirmando que E. faecalis pode

contribuir na persistência das infecções periapicais tanto pela formação de biofilmes, assim

como pela adesão e invasão de tecidos moles como a lesão periapical.

Para Rôças et al. (2004), a ocorrência frequente de E. faecalis em casos de

insucesso do tratamento endodôntico prévio, sugere que essa espécie pode ter um papel

relevante na etiologia das lesões periapicais persistentes. Contudo, também questionam se esse

micro-organismo é o principal patógeno associado ao insucesso ou apenas um sobrevivente,

31

que apresenta vantagem por sua habilidade de resistir às condições adversas dentro dos canais

radiculares obturados.

Estudos mostram que o papel como agente patogênico de E. faecalis deve ser

considerado, uma vez que esse possui diversos fatores de virulência, como: substâncias de

agregação, proteínas de superfície enterocócica, gelatinase, hialuronidade, citolisina tóxica,

produção de superóxido extracelular, ácido lipoteicóico e determinante de resistência a

antibióticos (Schleifer e Klipper-Balz, 1984; Portenier et al., 2003). Cada um deles pode estar

associado com vários estádios da infecção endodôntica, bem como da inflamação periapical.

Enquanto alguns produtos de E. faecalis podem estar diretamente ligados à danos nos tecidos

perirradiculares, uma grande parte destes é provavelmente mediada pela resposta do hospedeiro

à bactéria e aos seus produtos (Kayaoglu et al., 2004). Entre os fatores de virulência, o LTA,

localizado na parede celular de bactérias Gram-positivas, é o primeiro a ter contato com as

células hospedeiras e iniciar uma resposta inflamatória (Baik et al., 2008).

Além possuir esses fatores de virulência, E. faecalis também é capaz de dividi-los

com outras espécies para posterior contribuição em sua sobrevivência e capacidade de causar

infecção (Jett et al., 1994). Roças et al., (2004b) afirmam que sua capacidade de sobreviver e

persistir como um patógeno nos canais radiculares faz deste seu principal fator de virulência.

2.4 MÉTODOS MOLECULARES DE IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

Técnicas dependentes de cultura têm sido tradicionalmente utilizadas na

identificação da microbiota associada a infecções endodônticas (Sundqvist et al., 1998;

Molander et al., 1998; Hancock et al., 2001; Pinheiro et al., 2003; Gomes et al., 2004; Salehrabi

e Rotstein, 2010). Contudo, procedimentos baseados na identificação fenotípica têm algumas

desvantagens que podem resultar na subestimação dos micro-organismos que vivem em

determinado sistema (Siqueira e Rôças; 2003). Além disso, é difícil simular as condições

ambientais necessárias para o cultivo de micro-organismos fastidiosos.

Subramanian et al., em 2009, notaram, através da análise de suas amostras pela

clonagem e sequenciamento do gene 16S, que a maior parte das espécies detectadas foram

organismos ainda não cultivados, sugerindo que além dos patógenos previamente conhecidos,

várias bactérias ainda desconhecidas e não cultivadas podem ter um papel na patogênese da

doença perirradicular.

32

Os métodos moleculares, utilizados para diagnóstico, permitiram a detecção de

algumas espécies cultiváveis em dentes com insucesso do tratamento endodôntico em valores

de prevalência maiores do que nunca relatado por estudos de cultura. A detecção de espécies

cultiváveis em frequências mais elevadas por métodos moleculares pode ser explicada com base

na maior sensibilidade dos métodos quando comparados à cultura, ou mesmo pelo fato de nem

todas as cepas dentro de uma espécie poderem ser cultivadas. Além de detectar algumas

espécies cultiváveis em maior prevalência, os métodos moleculares também expandiram a lista

de patógenos putativos envolvidos com falhas de tratamento, incluindo algumas espécies

fastidiosas ou mesmo micro-organismos ainda não cultivados, como archea, que nunca fora

previamente isolada de canais tratados. (Siqueira e Rôças, 2005ab).

Em 2002, Munson e colaboradores, utilizaram o sequenciamento de DNA para

identificar micro-organismos presentes em suas amostras e perceberam que a microbiota

associada a infecções endodônticas é muito mais diversa do que foi mostrado anteriormente por

estudos dependentes de cultura. O número médio de táxons recuperados de cada amostra foi de

20,2 combinando análises culturais e moleculares, e 12,6 por cultura isoladamente. Estudos

anteriores têm recuperado de 1 a 12 taxa por amostra utilizando métodos de cultura (Sundqvist,

1992).

Muitos avanços no diagnóstico molecular microbiano com métodos como o

checkerboard DNA-DNA hybridization, bem como a tecnologia de reação em cadeia da

polimerase (PCR) e seus derivados tem permitido uma maior detecção de microrganismos na

cavidade oral e nos canais radiculares (Siqueira e Rôças, 2005a).

2.4.1 Checkerboard DNA-DNA hybridization

Socransky et al. (1994) introduziram um método para hibridizar um grande

número de amostras de DNA contra um grande número de sondas de oligonucleótidos baseadas

em DNA genômico inteiro, marcado com digoxigenina ou 16S rDNA numa membrana de

suporte única. O DNA desnaturado de amostras clínicas é colocado em pistas numa membrana

de nylon utilizando um dispositivo chamado Minislot 30® (Immunetics, Cambridge, MA -

USA). Após a fixação das amostras à membrana, ela é colocada num Miniblotter 45®

(Immunetics, Cambridge, MA - USA) com as pistas de amostras a 90° das pistas do dispositivo.

As sondas de DNA genômico completo marcadas com digoxigenina são então carregadas em

33

pistas individuais do Miniblotter. Após hibridação, as membranas são lavadas e as sondas de

DNA são detectadas utilizando anti-corpo para digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina

e detecção de quimioluminescência. O método de checkerboard permite a determinação

simultânea da presença de uma multiplicidade de espécies bacterianas em amostras clínicas

únicas ou múltiplas.

A técnica de checkerboard oferece uma série de vantagens para o estudo de

múltiplas espécies de bactérias em grande número de amostras contendo misturas complexas

de micro-organismos, visto que essa técnica é rápida, sensível e relativamente barata. Ademais,

supera muitas das limitações das técnicas de cultura, incluindo a perda de viabilidade dos

organismos durante o transporte e o problema da recuperação de espécies difíceis de cultivar

(ou mesmo incultiváveis). Finalmente, a técnica fornece dados semi-quantitativos que podem

ser importantes para estudos de tratamento de infecções por biofilme, onde os níveis e

proporções das espécies podem ser acentuadamente diminuídos, mas as espécies não

eliminadas. O checkerboard tem, contudo, limitações, pois detecta apenas espécies para as

quais foram preparadas sondas de DNA. Assim, novos agentes patogênicos ou espécies

ambientalmente importantes que possam ser detectadas em cultura ou por outras técnicas

moleculares não serão detectados por este método (Socransky et al., 2004).

Esse método foi empregado na caracterização da microbiota da infecção primária

por Martinho et al., (2014) que observaram a prevalência de bactérias como Parvimonas micra

(16/21, 76%), Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum (15/21, 71%), e Porphyromonas

endodontalis (14/21, 66%). Vianna et al., (2008), que também estudaram casos de necrose

pulpar, encontraram, pelo checkerboard, frequência de Fusobacterium nucleatum sp.

polymorphum, Treponema socranskii, Parvimonas micra e Enterococcus faecalis, em suas

amostras iniciais. Após os procedimentos de modelagem e limpeza dos canais radiculares, um

total de 8 diferentes espécies, foram identificadas.

Na infecção secundária, Rôças e colaboradores (2008), verificaram que um número

médio de cinco espécies estava presente por canal, com cinco casos apresentando 10 ou mais

espécies. As vantagens são que métodos moleculares ajudam a explicar porquê bactérias foram

detectadas em todos os casos tratados com doença pós-tratamento neste e em outros trabalhos

(Rôças et al., 2004; Siqueira e Rôças, 2004), enquanto estudos dependentes de cultura

encontraram bactérias em 44% à 85% dos casos (Sundqvist et al., 1998; Molander et al., 1998;

Pinheiro et al., 2003).

34

2.4.2 Real-time PCR

Um dos métodos moleculares de identificação bacteriana mais usado é a reação em

cadeia da polimerase (PCR) e suas variações. O PCR é um método para a amplificação de

segmentos específicos de DNA ou cDNA transcritos reversamente do RNA. Muitas

modificações do procedimento padrão de PCR foram desenvolvidas, como: nested-PCR, PCR

de transcriptase reversa, multiplex PCR, e o real-time PCR. Destes a maior parte é qualitativo

ou semi-quantitativo, com uma exceção para o real-time PCR que permite a quantificação de

bactérias totais e espécies alvos (Diss, 2003; Ozbek et al., 2009b).

O real-time PCR permite a identificação e quantificação de bactérias cultiváveis e

incultiváveis com alta especificidade e sensibilidade (Siqueira e Rôças, 2005). O método

funciona por meio da análise de padrões de amplificação mostrados em tempo real, ou seja, a

cada ciclo do PCR o aumento de um sinal fluorescente (threshold cycle, CT) pode ser

determinado e é proporcional ao montante de DNA amplificado (Bustin 2002; Sedgley et al.,

2005). Essa variação do PCR apresenta vantagens sobre as técnicas dependentes de cultura e

sobre o PCR convencional, visto que: são mais rápidos; elucidam bactérias incultiváveis; tem

a habilidade tanto de identificar quanto de quantificar produtos do PCR; eliminam a etapa da

eletroforese em gel de agarose; e limitam a contaminação dos ácidos nucléicos, pois não há

manipulação pós-amplificação (Raoult et al., 2004).

Em um estudo de Sedgley e colaboradores (2006), foi comparada a habilidade dos

métodos de cultura e real-time PCR na detecção e quantificação de E. faecalis em amostras de

canais radiculares provenientes de infecções primárias e secundárias. A espécie foi detectada

em 10,2% e 79,5% das amostras pela cultura e por real-time PCR, respectivamente, sendo a

espécie foi mais prevalente nas coletas de retratamento.

Rôças e Siqueira (2012), utilizaram checkerboard e real-time para avaliar a

microbiota de 42 dentes submetidos ao retratamento endodôntico. Encontraram que

Propionibacterium spp, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus spp, e Pseudoramibacter

alactolyticus foram as espécies mais relevantes identificadas pelo checkerboard. Por PCR

quantitativo detectaram E. faecalis e Streptococcus spp. em 38% e 41% dos casos,

compreendendo 9,76% e 65,78% da contagem total de bactérias, que teve média de 3,2 x 105

por canal radicular.

35

Da mesma forma, estudando infecções secundárias, Antunes et al. (2015)

verificaram por real-time PCR, em 27 amostras da porção apical de canais radiculares

removidas durante cirurgia parendodôntica, que 21 dentes foram positivos para bactérias. Além

disso das 7 espécies estudadas, Streptococcus spp. foi a mais prevalente (76%). Com relação a

quantificação das células bacterianas, a média de bactérias totais foi de 5,7 x 104 por porção

apical da raiz. Streptococcus spp. compreendeu de 0.02%–99.9% do total de bactérias, enquanto

E. faecalis de 9%–99.8%, porém estando presente em apenas 3/21 casos.

Além de identificar e quantificar micro-organismos, é possível por essa

metodologia avaliar a redução microbiana após as etapas do tratamento endodôntico. Nesse

sentido, Sakamoto et al. (2007) em infecções primárias, observaram que após a instrumentação

com NaOCl como irrigante e depois de uso de medicação intracanal de hidróxido de cálcio, os

níveis de bactérias foram reduzidos em 99.67% e 99.85%, respectivamente, em relação as

amostras iniciais.

Blome et al. (2008) estudaram a redução de bactérias após instrumentação e uso de

medicação intracanal em infecções primárias e secundárias e com seus resultados notaram que

a média de bactérias da infecção primária na amostra inicial foi de 4,6 x 107, sendo reduzida

para 3,6 x 104 após a instrumentação e para 6,9 x 104 após o uso de medicação intracanal,

enquanto na infecção secundária os valores correspondentes foram: 2,1 x 106, 3,6 x 104 e 1,4 x

105.

2.5 FATORES DE VIRULÊNCIA

Os fatores de virulência bacterianos compreendem componentes estruturais

celulares e produtos liberados. Diferentes fatores de virulência geralmente agem em

combinação, em vários estágios da infecção, e um único fator pode ter várias funções em

estágios diferentes. Fatores de virulência estão envolvidos em cada etapa do processo infeccioso

(agregação, invasão, sobrevivência e dano) (Siqueira e Rôças, 2007).

Os micro-organismos desempenham um papel fundamental na patogênese da

periodontite apical, em grande parte em função dos seus fatores de virulência presentes na

parede celular (Manzur et al., 2007). Dentre eles o LPS, encontrado no envelope celular de

bactérias Gram-negativas, é o mais importante, e está envolvido no desenvolvimento da

36

inflamação periapical, ativando células do sistema imune e levando a liberação de uma

variedade de mediadores pró-inflamatórios (Pitts et al., 1982; Hong et al., 2004; Martinho et

al., 2010; Gomes et al., 2012; Herrera et al., 2015).

Além dele, outros fatores encontrados em bactérias Gram-postivas devem ser

investigados na doença periapical refratária. Enterococcus faecalis, por exemplo, contém vários

fatores de virulência, tais como ácido lipoteicóico (LTA), peptidoglicano, substância de

agregação, citolisina e enzimas líticas (Kayaoglu e Ørstavik, 2004, Barbosa-Ribeiro et al.,

2016).

2.5.1 Lipopolissacarídeo (LPS)

Os lipopolissacarídeos, também conhecidos como endotoxinas, constituem uma

parte da parede celular das bactérias Gram-negativas. Eles são liberados no processo de

desintegração da parede, depois da morte da célula, assim como durante sua multiplicação e

crescimento. Dentre as funções do LPS temos a ativação de macrófagos na produção de

diversos mediadores moleculares, como o fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucinas (IL)

(Nair, 2004). Tais medidores inflamatórios por sua vez, ativam os leucócitos inflamatórios,

modificam a permeabilidade vascular e induzem a reabsorção óssea (Artese et al., 1991; Matsuo

et al., 1992; Hong et al., 2004; Martinho et al., 2010b; Graves et al., 2011).

A presença de LPS tem sido reportada dentro do sistema de canais radiculares

(Martinho et al., 2008, 2010ab, 2014; Gomes et al., 2012; Herrera et al., 2014; Marinho et al.,

2015). Os micro-organismos multiplicam-se e morrem nos canais radiculares, liberando LPS

que egressa para a região periapical, onde eles iniciam e mantém a periodontite apical (Nair,

2004). Além disso, níveis elevados de endotoxinas estão relacionados à sintomatologia clínica

(Martinho et al., 2008).

Martinho e colaboradores, em 2014, encontraram endotoxinas em 100% (média

de 7,49 pg/mL) dos canais radiculares de dentes com infecção primária investigados. Os autores

igualmente observaram que os altos níveis de LPS estavam relacionados com o aumento na

produção de IL-6 e IL-10 por macrófagos, assim como com o tamanho da lesão periapical do

dente afetado. Esses resultados indicaram que as citosinas estudadas e a destruição óssea

parecem ser diretamente estimuladas por moléculas de endotoxinas.

37

Marinho et al. (2015), da mesma forma, encontraram endotoxinas em 100%

(média de 32,43 EU/mL) dos canais radiculares estudados. Ademais, determinaram os níveis

dos mediadores inflamatórios TNF-α e IL-1β após a estimulação de macrófagos com o conteúdo

endotóxico de dentes com periodontite apical depois de diferentes fases do tratamento. Os

pesquisadores verificaram que, após o preparo-químico mecânico e o uso de medicação

intracanal, ocorre uma redução dos níveis de endotoxinas, levando progressivamente a menor

ativação de células inflamatórias e menor produção de TNF-α e IL-1β.

Além se sua ação sobre macrófagos, o LPS pode ser um potente estimulador de

fibroblastos, que são os maiores constituintes do tecido conjuntivo (Kumada e Zhang 2010). Os

fibroblastos secretam metaloproteinases (MMPs) que são capazes de iniciar a degradação da

matriz extracelular de macromoléculas, o que parece ser um evento chave para a progressão do

processo inflamatório e destruição óssea na região periapical. As MMP-2 e MMP-9, por

exemplo, são sintetizadas pelos fibroblastos e pelas células da polpa, e foram relacionadas a

patogênese periodontal, a carcinogênese oral e a inflamação pulpar e periapical (Chang et al.,

2001; Tsai et al., 2005, Fracalossi et al., 2010; Accorsi-Mendonça et al., 2013).

Herrera et al., em 2014, realizaram um estudo para investigar os níveis de

endotoxinas em infecções endodônticas primárias, antes e depois do preparo químico-

mecânico, e para determinar a sua antigenicidade contra fibroblastos 3T3 através da atividade

gelatinolítica das MMPs. Os pesquisadores encontraram que o LPS estava presente em 100%

dos canais radiculares, com média de 21,83 EU/mL, e que após a instrumentação esse valor

diminuiu para 0,52 EU/mL. Com relação as MMPs observaram uma correlação entre os níveis

de expressão de MMP-2 e endotoxinas. Com base em seus resultados, puderam concluir que o

preparo químico-mecânico foi efetivo na redução de endotoxinas e consequentemente na

antigenicidade contra fibroblastos na atividade gelatinolítica.

Embora a infecção endodôntica secundária/persistente seja relacionada

comumente a bactérias Gram-positivas, Gomes et al. (2012), mostraram por meio de técnicas

moleculares que Porphyromonas, Prevotella, e Treponema spp, estão presentes na periodontite

pós-tratamento; além disso verificaram que todos os canais radiculares coletados apresentavam

LPS, com uma média de 3,96 EU/mL.

38

2.5.2 Ácido lipoteicóico (LTA)

Os ácidos lipoteicóicos são um grupo de moléculas anfipáticas estreitamente

relacionadas, constituídas por um esqueleto de poliglicerolfosfato unidos covalentemente a uma

porção glicolipídica (Wicken and Knox, 1975). O LTA é um importante fator de virulência de

bactérias Gram-positivas (Ginsburg, 2002; Ryu et al., 2009; Baik et al., 2011), que é liberado

durante a multiplicação celular e principalmente depois da bacteriólise por lisozimas (Ginsburg,

2002). Ele tem propriedades patogênicas análogas aos dos lipopolissacarídeos das bactérias

Gram-negativas (Ryu et al., 2009), resultando em danos aos tecidos pulpares e periapicais.

Kayaoglu e Ørstavik (2004) postularam que o LTA de E. faecalis pode causar

apoptose em linhas celulares relevantes (osteoblastos, osteoclastos, fibroblastos de ligamento

periodontal, macrófagos e neutrófilos). Ainda o ácido lipoteicóico, isolados de cepas de E.

faecalis ou de outras bactérias Gram-positivas, tem sido relatado como um estimulador de

leucócitos a liberarem vários mediadores que são conhecidos por desempenharem um papel em

várias fases da resposta inflamatória. Estes incluem a liberação do fator de necrose tumoral-alfa

(TNF-alfa), interleucina 1-beta (IL-1beta), interleucina 6 (IL-6) e interleucina 8 (IL-8), por

cultura de monócitos e por leucócitos do sangue humano (Bhakdi et al., 1991; Saetre et al.,

2001).

Tian et al., realizou um estudo in vitro em 2013, com o objetivo de examinar o

efeito do LTA extraído de E. faecalis na apoptose de osteoblastos e verificaram que o LTA

inibiram a proliferação de células humanas similares à odontoblastos MG63 e, além disso,

induziram a sua apoptose.

Telles et al. (2003), em seu trabalho, indicaram que o LTA de estreptococos

aumenta a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), um potente indutor

da angiogênese, permeabilidade celular, e edema em macrófagos e em células da polpa. A

angiogênese pode estar relacionada com a inflamação crônica caracterizada pela lesão

periapical.

Com relação à presença de LTA em canais radiculares com insucesso do tratamento

endodôntico, Barbosa-Ribeiro et al. (2016), quantificou os níveis de ácido lipoteicóico e de

bactérias cultiváveis em várias etapas do retratamento. Verificaram que, após o preparo químico

mecânico, os níveis de bactérias diminuíram 99,4% e os níveis de LTA, 24,8%. Os autores

concluíram e sugeriam que níveis elevados de bactérias e LTA podem ser responsáveis pela

39

manutenção de um processo inflamatório na região periapical e consequente falha do tratamento

endodôntico (Ryu et al., 2009; Baik et al., 2011); porém, estudos adicionais são necessários

para testar os níveis clínicos aceitáveis de LTA residual.

Revisando a literatura, observamos que existem poucos trabalhos procurando

observar a presença de micro-organismos, LPS e LTA em 3 sitios diferentes e interligados,

como a saliva, coroa dentária e canais radiculares. Este trabalho foi desenvolvido com este

objetivo, de maneira a esclarecer uma possivel via de infecção da saliva ao canal radicular. A

persistência de um grupo de micro-organismos e de seus fatores de virulência poderia sugerir

que estes exercem um papel na persistência ou surgimento da reinfecção endodôntica, o que

nos direcionaria na prevenção ou no combate à reinfecção e uma melhora nas técnicas de

retratamento endodôntico.

40

3 PROPOSIÇÃO

1. Caracterizar a microbiota da saliva, câmara pulpar e canal radicular de infecções

provenientes do insucesso endodôntico, por meio da técnica de checkerboard.

2. Quantificar a carga bacteriana total, de Enterococcus faecalis e de

Streptococcus spp. nos 3 sítios, por meio de real-time PCR.

3. Quantificar o conteúdo endodôntico de LPS/LTA dos casos investigados.

4. Correlacionar as bactérias encontradas entre os sítios, dentro dos sítos e com o

LPS/LTA.

5. Correlacionar os micro-organismos e o LPS/LTA com os aspectos clínicos e

radiográficos dos casos selecionados.

41

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 AUTORIZAÇÃO PARA REALIZAÇÃO DA PESQUISA

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP) sob o protocolo 119/2015 e segue e

regulamentação da Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde.

Para participação deste estudo, os pacientes assinaram um termo de consentimento

livre e esclarecido, conforme as normas vigentes no referido Comitê de Ética em pesquisa

envolvendo seres humanos.

4.2 LOCAL DA PESQUISA

Inicialmente foram analisadas as fichas dos pacientes disponíveis na Área de

Endodontia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP) dos Cursos de

Atualização e Especialização.

4.3 SELEÇÃO DOS PARTICIPANTES DA PESQUISA

Os casos de pacientes com necessidade de retratamento endodôntico foram

selecionados a partir de fichas e encaminhamentos do serviço de Endodontia da Faculdade de

Odontologia de Piracicaba (FOP/UNICAMP). A amostra final foi constituída por 20 pacientes,

de ambos os sexos e independente de raça.

Os critérios de exclusão foram: tratamento endodôntico prévio realizado há menos

de 2 anos; dentes sem imagem radiográfica de lesão periapical; pacientes fazendo uso de

antifúngicos, antinflamatórios e antibióticos (< 3 meses); dentes com fratura radicular; dentes

com impossibilidade de isolamento absoluto e introdução do cone de papel em seu

comprimento de trabalho; e dentes com câmara pulpar em contato com o meio bucal e presença

de sintomatologia dolorosa espontânea.

42

4.4 EXAME CLÍNICO, ASPECTOS CLÍNICOS E RADIOGRÁFICOS

Foram anotados dados pessoais dos pacientes tais como idade e sexo, história

médica e dentária (incluindo o tempo que foi realizado o tratamento endodôntico anterior).

Durante o exame clínico foram registradas informações sobre o dente a ser retratado

e sua condição atual, segundo Pinheiro et al. (2003ab), em relação à qualidade da restauração

ou coroa, à presença de cáries, infiltrações coronárias e fraturas. Quanto à sintomatologia, foi

verificada a dor à percussão (horizontal e vertical) e à palpação. Também foram anotados dados,

tais como: presença ou ausência de edema dos tecidos periapicais, fístulas, mobilidade dental e

bolsa periodontal. Durante a coleta, o aspecto físico do canal radicular também foi registrado.

Todas essas características clínicas referentes ao dente investigado foram anotadas na ficha

clínica de cada paciente.

Na radiografia periapical foram avaliados os seguintes aspectos:

a. Presença de imagem de cárie sob a restauração, sugerindo uma infiltração

coronária.

b. Qualidade da restauração, sendo considerada boa quando bem adaptada, e ruim

quando há presença de falhas na margem, ou seja, de espaços vazios entre o material restaurador

e o substrato;

c. Limite da obturação dos canais radiculares, divididos em intervalos de ≤ 2 mm

e > 2 mm do ápice e sobre-estendidos;

d. Qualidade do tratamento endodôntico, sendo considerado bom quando a guta-

percha estava bem compactada e não se observavam áreas radiolúcidas na obturação ou entre o

material obturador e a parede do canal, com limite da obturação entre 0-2 mm do ápice; e

considerado ruim quando há presença de falhas radiolúcidas na obturação devido a guta-percha

mal compactada ou com limite da obturação maior que 2 mm do ápice radiográfico;

e. Presença e tamanho da lesão periapical relacionado ao dente tratado

endodonticamente (≤ 5 mm e > 5 mm);

f. Presença ou ausência de pino intra-radicular;

g. Espaço entre o pino e o material obturador medido em mm;

h. Presença ou ausência de prótese definitiva ou provisória.

43

4.5 PROCEDIMENTOS CLÍNICOS

As coletas clínicas foram realizadas na Clínica de Especialização da

FOP/UNICAMP e as amostras processadas no Laboratório de Microbiologia Endodôntica.

Foram realizadas coletas microbiológicas da saliva, da câmara pulpar e do canal

radicular durante o retratamento endodôntico, na mesma sessão odontológica. O paciente, logo

no início do atendimento, recebeu um frasco plástico esterilizado para dispensar o fluido salivar

acumulado naquele momento. Em seguida, iniciaram-se os procedimentos clínicos para as

coletas da face interna das restaurações ou pino intra-radicular e da guta-percha removida dos

canais durante a desobturação.

Parte do método que será utilizado neste estudo já foi descrito previamente em

detalhes por Gomes et al. (1994ab; 1996) e Vianna et al. (2008) e alguns princípios, para coletas

microbiológicas, foram adaptados para este estudo e estão descritos a seguir:

4.5.1 Coleta das amostras da saliva

Primeiro foi realizada a coleta da saliva não estimulada, que foi dispensada em um

recipiente vazio e esterilizado. Recomendou-se aos pacientes um jejum de, no mínimo, 2 horas

antes da consulta odontológica.

4.5.2 Coleta das amostras da câmara pulpar

Foi realizada a descontaminação da face do paciente com clorexidina 0,12% e

anestesia local na região do dente envolvido. Este recebeu um polimento coronário com pedra

pomes, e isolamento absoluto com vedamento da interface coroa-lençol com auxílio do

cianoacrilato, para evitar uma possível infiltração salivar.

Em seguida, foi feita a desinfecção do campo operatório, que compreende a

descontaminação da porção coronária do dente, do grampo, do lençol de borracha e do arco,

com swabs estéreis e umedecidos em água oxigenada 30% (v/v), NaOCl 2,5%, por 30 segundos

cada, e subsequente neutralização com solução estéril de tiosulfato de sódio 5% (Möller, 1966).

44

Depois, foi desgastada a interface dente-restauração ou coroa total e, quando presente, do pino

intra-radicular (formato recomendado para o uso do saca-pino MV, Trigona, Rio Claro, SP,

Brasil) preservando a face interna da restauração ou pino.

A coleta da câmara foi realizada durante a remoção do pino intra-radicular ou

restauração, como também da cárie, cimento endodôntico e material restaurador provisório,

quando presentes na porção coronária. A amostra foi coletada com um cotonete esterilizado e

imediatamente armazenada em criotubos apirogênicos, que foram posteriormente preenchidos

com água ultrapura.

4.5.3 Coleta das amostras do canal radicular

A abertura coronária foi realizada com alta rotação com sistema de irrigação do

equipo fechado. Dessa forma para reduzir o aquecimento da ponta esférica diamantada (#1012

ou #1014), foi utilizado soro fisiológico estéril. Ao adquirir a forma de contorno e conveniência

(#3082) da abertura coronária, o campo operatório e a câmara pulpar foram descontaminados

novamente, com as mesmas soluções, e neutralizados.

A coleta dos canais radiculares foi realizada durante a desobturação sem solventes,

utilizando lima Reciproc R25 (VDW, Munich, Alemanha). Quando uma lima K #15

(Maillefer/Dentsply, Ballaigues, Suíça) alcançou o comprimento do canal radicular

determinado na radiografia pré-operatória, foi utilizado o localizador apical (Novapex, Forum

Technologies, Rishon le-zion, Israel) para confirmar a patência (desobstrução apical) e obter o

comprimento de trabalho equivalente a posição zero no localizador apical. Com auxílio do

microscópio clínico (Opto Eletrônica S.A., São Carlos, SP) e uma tomada radiográfica

periapical, foi verificada a remoção do material obturador.

Para as coletas dos canais radiculares, cones de papel apirogênicos foram

introduzidos no comprimento pré-determinado pelo localizador apical, permanecendo nesta

posição por 60 segundos. Casos em que o canal se apresentou seco, este foi umedecido com

soro fisiológico esterelizado e apirogênico. Os cones foram armazenados em criotubos com

água ultrapura.

45

4.5.4 Armazenamento das amostras

As amostras identificadas foram imediatamente transportadas para o Laboratório

de Microbiologia Endodôntica e mantidas congeladas em -80ºC até o início das análises

laboratoriais.

4.5.5 Retratamento endodôntico

Os dentes foram preparados por meio do sistema Reciproc R40 ou R50 (VDW,

Munich, Alemanha) e complementados com limas manuais quando necessário. Após o término

do preparo foi determinada manualmente a lima anatômica final (LAF), possibilitando posterior

obturação do canal radicular.

Durante todo o preparo químico-mecânico (PQM), foi utilizado a clorexidina 2%

gel como substância química auxiliar e abundante irrigação com soro fisiológico 0,9%. Uma

lima de pequeno calibre foi utilizada para manter a patência do canal. Após a instrumentação,

foi confirmada a patência com a LAF e os canais foram irrigados com clorexidina 2% gel e soro

fisiológico. Foi inserido 1 mL de EDTA 17% no interior do canal radicular por 30 segundos

sob agitação ultra-sônica com a finalidade de remover a camada residual sendo a seguir

aspirado. O EDTA foi renovado por mais duas vezes. O protocolo de irrigação foi finalizado

com 5,0 mL de solução fisiológica.

Posteriormente, o dente foi obturado e selado com uma camada de 2 mm de

Coltosol (Vigodent, Rio de Janeiro, RJ, Brasil) na embocadura do canal. Foi aplicado ácido

fosfórico 37% por 15 segundos, adesivo Single Bond 3M (3M Dental Products, St Paul, EUA)

e 3 mm de resina fotopolimerizável Z 250 (3M Dental Products, St Paul, EUA).

46

4.6 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS

4.6.1 Checkerboard DNA-DNA hibridization

A metodologia empregada para a técnica de Checkerboard DNA-DNA

hybridization seguirá a descrição feita por Socransky et al. (1994). Propomos utilizá-la por

permitir a detecção da ocorrência de várias espécies em uma mesma reação (Socransky et al,

2004, Siqueira e Rôças, 2005a; Brito et al. 2008, 2012; Teles et al., 2012).

4.6.1.1 Extração do DNA microbiano

Tubos tipo Eppendorf com 150 uL da amostra foram agitados no Vortex (Agitador

de Tubos). Após esse procedimento, os tubos foram centrifugados a 12.000 g por 5 minutos. O

sobrenadante neles contido foi então descartado e o pellet ressuspendido com 150 μL de solução

TE e 100 μL de solução de hidróxido de sódio (NaOH). As suspensões contendo as amostras

coletadas foram aquecidas em banho-maria por dez minutos e em seguida neutralizadas pela

adição de 0,8 mL de 5 M de acetato de amônia (C2H7NO2). Com isto, as células bacterianas

foram lisadas e o DNA ficou suspenso na solução.

4.6.1.2 Aplicação das amostras na membrana de nylon

Uma membrana de nylon (15 x15cm) com carga positiva (Amersham Biosciences,

Chicago, IL - USA) foi montada no Minislot 30® (Immunetics, Cambridge, MA - USA). Cada

suspensão de amostra contendo DNA livre foi depositada nas fendas do Minislot 30® e o DNA

concentrado permaneceu depositado na membrana de nylon. A membrana foi removida do

aparato e o DNA, previamente depositado na mesma, foi fixado por intermédio de aquecimento

em forno a 120°C, por 20 minutos. As duas últimas canaletas do Minislot 30® foram reservadas

para a colocação dos controles, contendo uma mistura das espécies dos micro-organismos que

foram investigados pelas sondas de DNA, em duas concentrações, 105 e 106 células bacterianas.

47

4.6.1.3 Hibridização da membrana com as sondas de DNA

Após a fixação do DNA na membrana, esta foi pré-hibridizada a 42°C, por uma

hora, numa solução de 50% formamida, 1% caseína, 5 X SSC (Solução Salina Citratada), 25

mM de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/mL de RNA de levedura. A membrana foi então

colocada sob a placa acrílica do Miniblotter 45® (Immunetics, Cambridge, MA - USA),

rotacionada a 90° de sua posição original, com as linhas contendo o DNA fixado,

perpendiculares às canaletas do Miniblotter 45®. O Miniblotter 45® contém 45 canaletas que

servem, cada uma, para a colocação de uma sonda de DNA.

As sondas de DNA específicas para as espécies que foram usadas nesse estudo

(Tabela 1) foram confeccionadas usando o random primer digoxigenin labeling Kit (Boehringer

Mannheim, Indianápolis, IN - USA), como descrito por Feinberg e Vogelstein (1983).

48

Tabela 1. Relação das cepas empregadas para o desenvolvimento das sondas de DNA

bacteriano.

Espécies Cepas Espécies Cepas

Actinomyces israelii ATCC 12102* Fusobacterium nucleatum sp vincentii ATCC 49256*T

Actinomyces odontoloyticus I ATCC 17929* Parvimonas micra ATCC 33270*T

Actinomyces oris ATCC 43146* Porphyromonas endodontalis ATCC 35406*T

Aggregatibacter

actinomycetemcomitans A e B

ATCC 43718*

ATCC 29523*

Neisseria mucosa ATCC 19696*T

Campylobacter rectus ATCC 33238*T Prevotella intermedia ATCC 25611*T

Campylobacter showae ATCC 51146*T Porphyromonas gingivalis ATCC 33277*T

Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624* Prevotella melaninogenica ATCC 25845*T

Capnocytophaga ochracea ATCC 33596*T Prevotella nigrescens ATCC 33563*T

Capnocytophaga sputigena ATCC 33612*T

Propionybacterium acnes

( I +II )

ATCC 11827*

ATCC 11828*

Dialister pneumosintes ATCC 51894 Staphylococcus epidermidis ATCC 43541*T

Eikenella corrodens ATCC 23834*T Streptococcus intermedius ATCC 27335*T

Enterococcus faecalis ATCC 29212* Streptococcus mitis ATCC 49456*T

Enterococcus faeccium 6569 Treponema Socranskii S1 a

Enterococcus hirae 10541 Streptococcus mutans ATCC 25175

Eubacterium nodatum ATCC 33099* Streptococcus oralis ATCC 35037

Eubacterium saburreum ATCC 33271*T Tannerella forsythia ATCC 43037

Fusobacterium periodonticum ATCC 33693*T Treponema denticola B1a

Fusobacterium nucleatum sp

nucleatum ATCC 25586*T Veillonella parvula ATCC10790

Fusobacterium nucleatum sp

polymorphum ATCC 10953*T Filifactor alocis ATCC 35896*T

Gemella morbillorum ATCC 27829*T Streptococcus gordonii ATCC 10558*T

* ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD);a Cepas do Instituto Forsyth; T Tipo da cepa

49

Anteriormente ao seu uso, as sondas foram testadas com uma mistura controle

contendo as espécies investigadas, numa concentração de 104 células bacterianas. Suas

concentrações foram ajustadas de tal modo que a intensidade dos sinais de todas as sondas foi

semelhante.

Cada sonda de DNA contida numa solução de hibridização (45% formamida, 5 X

SSC, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5), 0,2 mg/mL de RNA de levedura, 10% de sulfato de

dextrano, 1% caseína e 20 mg/mL de sonda de DNA) foi removida com pipeta e colocada em

canaleta do Miniblotter 45®. De modo que cada canaleta do Miniblotter 45® fosse preenchida

com 135 μL de uma determinada sonda. As sondas hibridizaram perpendicularmente às linhas

contendo o DNA bacteriano fixado, propiciando um formato de xadrez com as linhas de DNA,

horizontais, e as sondas, verticais. O aparato, contendo o Miniblotter 45® e a membrana com

as sondas e o DNA das amostras bacterianas fixado, foram colocados dentro de um saco plástico

umedecido para evitar a desidratação das mesmas e incubados a 42° para que a hibridização

ocorresse. A hibridização das membranas com as sondas ocorreu durante um período mínimo

de 12 horas (overnight).

4.6.1.4 Detecção das espécies

Após a hibridização com as sondas, as membranas foram removidas do Miniblotter

45® e lavadas por 40 minutos a 65°C, numa solução adstringente de PO4 Buffer (tampão de

fosfato), a fim de remover sondas que não hibridizaram completamente. Em seguida, as

membranas foram imersas por 1 hora, sob agitação, numa solução bloqueadora contendo 0,1 M

ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20, 0,5% caseína, pH 8,0 e por 30 minutos

na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina (Anti-Digoxigenin-AP Fab

fragments-Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Alemanha) conjugado à fosfatase alcalina

numa diluição de 1/25.0000. As membranas foram, então, lavadas com uma solução de 0,1 M

ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20, pH 8,0, duas vezes por 20 minutos, e

uma vez por 5 minutos em 0,1 M Tris HCl, 0,1 NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5. Em seguida, as

membranas foram incubadas em uma solução detectora, CDP-Star Detection Reagent®

(Amershan Biosciences UK Limited, Buckinghamshire - UK), por 60 minutos à 37°C.

Finalmente, as membranas foram colocadas num cassete sob um filme radiográfico (Kodak®

X-OMAT Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São José dos Campos, SP) por aproximadamente

50

40 minutos, e os filmes revelados logo em seguida. Cada sinal produzido por uma determinada

sonda na amostra dos canais radiculares foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela

mesma sonda nos dois controles de concentrações 105 e 106. Assim sendo, o número (0) foi

registrado quando não houve detecção de sinal; (1) quando houve um sinal menos intenso que

o controle de 105 células; (2) a aproximadamente 105 células; (3) entre 105 e 106 células; (4) a

aproximadamente 106 células, e (5) mais que 106 células. Esses registros foram utilizados para

determinar os diferentes níveis das espécies investigadas em cada amostra.

4.6.2 Quantificação por meio do real-time PCR

Por meio de uma técnica de reação de cadeia de polimerase em tempo real, a

concentração da carga total de bactérias, de Streptococcus spp. e de Enterococcus faecalis foi

avaliada.

4.6.2.1 Primers utilizados

Para a identificação total, de Streptococcus spp. e de E. faecalis foram utilizados primers

universais e específicos reportados na literatura e listados na tabela 2.

Tabela 2. Pares de primers reportado na literatura, que foram utilizados na reação de real-time

PCR.

Espécies Pares de Primers (5´-3´)

Comprimento do

fragmento

amplificado em pb

Referências

E. faecalis CCG AGT GCT TGC ACT CAA TTG G CTC TTA TGC CAT GCG GCA TAA AC

138 Sedgley et al., 2005

Streptococcus

spp. AGA TGG ACC TGC GTT GT GCT GCC TCC CGT AGG AGT CT

~120-130 Dalwai et al., 2007

Universal 16S

rRNA TCC TAC GGG AGG CAG CAG T GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT

466 Nadkarni et al., 2002

51

4.6.2.2 Extração do DNA

Inicialmente, o DNA foi extraído dos 3 grupos estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular) com o kit de extração de DNA (QIAamp DNA Mini Kit: Qiagen Inc., Valencia, CA,

USA).

4.6.2.3 Reação de real-time PCR

O real-time PCR foi realizado no termociclador StepOne™ Real Time PCR System

(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com o mix de reações para PCR SyBR® Green

PCR Master Mix (Applied Biosystems). A amplificação foi realizada em um volume final de

10 μl, contendo 2 μl do modelo de DNA, onde a água foi o controle negativo. As corridas foram

realizadas em triplicata e a cada ciclo a adição de produtos do PCR foi detectada pelo aumento

da fluorescência do corante SYBR Green. O protocolo de amplificação foi o seguinte: 94/15,

57/50, 72/15 [temperatura (1ºC)/tempo (s)], e 40 ciclos para o primer universal, e 94/60, 60/60,

72/60 e 40 ciclos para E. faecalis e Streptococcus spp. Curvas de fusão foram utilizadas para

determinar a especificidade do PCR.

As cepas padrão E. faecalis (ATCC 29212) e S. mutans (ATCC 25175) foram utilizadas

como controle para as reações. As curvas padrão foram feitas com esses controles e usadas para

converter os valores dos CT´s (Threshold Cycle – ciclo de amplificação do gene) para o número

de células bacterianas totais, de E. faecalis (curva do E. faecalis) e de Streptococcus ssp. (curva

do S. mutans), utilizando os controles com quantidades já conhecida de DNA das bactérias

específicas. A análise dos dados foi realizada com o StepOne™ Software (Applied

Biosystems).

4.6.3 Endotoxinas (LPS) - Pyrogent-5000 Kinetic Turbidimetric Teste Limulus Amebocyte Lysate

(LAL) (Lonza, Walkersville, MD, EUA)

4.6.3.1 Materiais apirogênicos

Para a realização do teste LAL Pyrogent-5000, todos os materiais apresentavam-se

apirogênicos (livre de endotoxinas). Os materiais tornaram-se apirogênicos quando submetidos ao

52

calor seco (estufa) à 250ºC por um período de 30 minutos ou por energia ionizante (EMBRARAD,

Cotia, SP). Outros materiais já se apresentaram apirogênicos e esterilizados oriundos de fábrica

(Lonza, Walkersville, MD, EUA).

4.6.3.2 LAL Pyrogent-5000 (Lonza, Walkersville, MD, EUA)

Pyrogent-5000 é um ensaio cinético quantitativo para detecção de endotoxina de

bactéria Gram-negativa. Esse teste utiliza uma preparação de Lisado do Amebócito Limulus

(LAL), em combinação com um incubador fotométrico e um software apropriado, para detecção

fotométrica da endotoxina. Uma amostra é misturada com o reagente LAL reconstituído, colocada

em um fotômetro e monitorada automaticamente até o desenvolvimento de uma aparência de

turvação (densidade ótica). O tempo necessário antes da aparição da turvação (tempo de reação) é

inversamente proporcional a quantidade de endotoxina presente. A concentração de endotoxina

em amostras desconhecidas pode ser calculada a partir de uma curva-padrão.

Para o cálculo da concentração de endotoxina em amostras desconhecidas foi

estabelecida uma curva-padrão com quantidades conhecidas de endotoxina (Escherichia coli).

Esta foi preparada utilizando soluções com concentrações 0,01 EU/mL, 0,10 EU/mL, 1 EU/mL,

10 EU/mL, 100 EU/mL como descrito na Tabela 2 abaixo:

Tabela 3. Diluição da solução de endotoxina de E. coli para a determinação da curva padrão.

Tubos

apirogênicos

Concentração de

endotoxina (EU/mL)

Volume de água

reagente LAL

Volume de solução de endotoxina

adicionado à água apirogênica

1 10 0,9 mL 0,1 mL de 100 EU/mL solução

2 1 0,9 mL 0,1 mL de 10 EU/mL solução

3 0,10 0,9 mL 0,1 mL de 1 EU/mL solução

4 0,01 0,9 mL 0,1 mL de 0,10 EU/mL solução

Os valores da absorbância das soluções de endotoxina previamente preparadas foram

espectrofotometricamente medidos a 340 nm no leitor Biotek (ELX 808, Winooski, VT, EUA). A

absorbância a 340 nm deverá ser linear com os intervalos de concentração usados. A linearidade

da curva padrão dentro do intervalo de concentração foi usada para determinar os valores de

endotoxina. A reprodutibilidade foi verificada pela comparação das diferentes curvas.

53

4.6.3.3 Procedimentos para execução do teste

Foi impresso um esboço com o posicionamento da água apirogênica, da curva padrão,

das amostras e do controle positivo do produto (PPC) na microplaca de 96 poços (Corning Costar

Corporation, Cambridge, MA, EUA). Em seguida, foi dispensado cuidadosamente no interior dos

poços da microplaca: 100 µl das amostras e 100 µl dos controles positivos das mesmas, ambas em

duplicata. Nas amostras controles foram dispensados 10 µl da endotoxina, na concentração de 10

EU/mL, evitando a formação de bolha. Após o preenchimento das amostras e dos respectivos

controles previamente contaminados com E. coli, foi dispensado cuidadosamente no interior dos

poços da microplaca: 100 µl de água apirogênica (branco), padrões de endotoxina (100 µl da

concentração de 0,01 EU/mL; 0,1 EU/mL; 1 EU/mL; 10 EU/mL e 100 EU/mL). A placa foi pré-

incubada por ≥ 10 minutos a 37ºC + 1ºC, no leitor Biotek (ELX 808, Winooski, VT, EUA).

Próximo ao final do período de pré-incubação, cada frasco de reagente Pyrogent-5000 foi

reconstituído com 5,2 mL de tampão de reconstituição Pyrogent-5000. Após isso, foi dispensado

rapidamente 100 µL do reagente reconstituído de Pyrogent-5000 dentro de todos os poços da

microplaca, iniciando pela primeira coluna (A1-H1) e procedendo em sequência até a última

coluna utilizada. Com a tampa da microplaca removida foi iniciada a leitura.

4.6.3.4 Cálculo da concentração de endotoxinas

De forma contínua durante todo o ensaio, o leitor de microplacas foi monitorado na

absorbância de 340 nm de cada poço da microplaca. Usando a leitura de absorbância inicial de

cada orifício como seu próprio branco, o leitor determinou o tempo necessário para que a

absorbância aumentasse a 0,03 unidades. Este tempo foi denominado tempo de reação. O

software WinKQCL (Lonza, Walkersville, MD, EUA) executou automaticamente uma

correlação linear log/log do tempo de reação de cada padrão com a concentração de endotoxina

correspondente. Os parâmetros da curva padrão foram impressos no relatório. Se o valor

absoluto do coeficiente de correlação (r) fosse 0,980, um modelo polinomial podia ser usado

para construir uma curva padrão e, assim, predizer as concentrações de endotoxina das amostras

de teste.

54

4.6.4 Ácido Lipoteicóico (LTA) - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

As amostras foram eluídas em 600 µl de solução tampão (PBS – phosphate buffered

saline) contendo 0,1% de solução Tween 20 e 1 µl de coquetel de inibidores de protease (Sigma-

Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA). Os tubos foram agitados por 30 minutos e centrifugados a

10000 g por 5 minutos. O LTA foi quantificado por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA

- enzymelinked immunosorbent assay). Para tanto, foi utilizado um kit laboratorial específico

(Human lipoteichoic acids ELISA Kit, My BioSource, San Diego, EUA). Todos os reagentes

foram levados a temperatura ambiente e a solução diluente foi adicionada em cada poço

contendo o anticorpo monoclonal específico contra o ácido lipoteicóico. Os padrões e amostras

foram adicionados aos poços, permitindo a ligação da molécula de LTA ao anticorpo

imobilizado. Após um período de incubação específico, os poços foram lavados com solução

tampão e um segundo anticorpo policlonal específico contra a molécula e conjugado a fosfatase

alcalina foi adicionado. As placas foram novamente incubadas e lavadas. A seguir, foi

adicionado em todos os poços o substrato (NADPH), que iniciou a reação colorimétrica

catalisada pela fosfatase alcalina, seguido de incubação e adição da solução amplificadora da

reação colorimétrica. Após novo período de incubação, a solução de parada foi adicionada. O

desenvolvimento e a intensidade da cor foram quantificados utilizando um leitor de placas para

ELISA. A curva padrão foi feita com os padrões fornecidos no kit pelo fabricante

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Análise estatística foi efetuada com auxílio do software SPSS para Windows,

considerando um nível de significância de 5% e 1%.

Foi realizada a análise descritiva dos dados (frequências absolutas e relativas para

achados clínicos e para detecção de espécies microbianas).

O Teste Qui-quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fischer, quando apropriado,

foram utilizados para testar a hipótese nula de que não há associação entre aspectos clínicos e

radiográficos e a presença de determinada bactéria; entre bactérias específicas; e entre os sítios

estudados. Nos casos em que a hipótese foi descartada, ou seja, quando houve correlações

significantes (p< 0,05 ou p< 0,01), o teste de Odds ratio foi realizado. Associações positivas

55

foram aquelas em que os valores de Odds ratio foram maiores que 2 e associações negativas

aquelas em que os valores de Odds ratio foram menores que 0,5.

Os Testes de Correção de Pearson e Spearman (p< 0,05) também foram utilizados

para pesquisar as associações entre as concentrações de micro-organismos, LPS/LTA, e

aspectos clínicos e radiográficos.

56

5 RESULTADOS

5.1 PERFIL DOS CASOS COLETADOS

As características clínicas dos casos de insucesso endodôntico estudados estão

apresentadas na Tabela 3. Um total de 20 pacientes com faixa etária entre 18 e 65 anos (média:

42,2 anos) participaram como voluntários da pesquisa. Destes, 55% (11/20) eram do sexo

feminino e 45% (9/20) do sexo masculino. A média de tempo do tratamento endodôntico

anterior foi de 10,3 anos. No momento do atendimento, nenhum paciente relatou a presença de

sintomatologia dolorosa espontânea (00/20). Ao teste de palpação nenhum paciente relatou

sensibilidade no dente em questão (0/20). Ao teste de percussão vertical em seis casos os

pacientes relataram desconforto (06/20). Todos os dentes apresentavam-se restaurados (20/20),

nove possuíam pino intrarradicular (9/20), e onze exibiam sinais clínicos de microinfiltração

coronária (11/20). Quanto a obturação prévia, de acordo com os critérios radiográficos pré-

estabelecidos na metodologia, 9 dentes mostraram uma qualidade da obturação ruim (9/20),

enquanto no restante a obturação foi considerada boa (11/20). Nenhum dos pacientes

apresentou gengivite, mobilidade associada ao elemento dental ou exsudato. Na região apical,

todos os casos exibiram evidência radiográfica de lesão periapical, com média de 5,35 mm do

tamanho da lesão radiolúcida.

57

Tabela 4. Características clínicas dos pacientes com insucesso do tratamento endodôntico e presença de lesão periapical.

Caso Idade Gênero Dente TTP Sensibilidade

Coroa Pino Microinf. Obturação Canal Lesão (mm) Mobil. DE PV P

1 38 M 11 5 - + - Restaurado Não Sim Ruim Seco 5 Não

2 28 M 34 10 - - - Restaurado Não Não Ruim Seco 3 Não

3 47 M 44 10 - - - Restaurado Não Não Boa Seco 3 Não

4 38 F 22 8 - - - Restaurado Não Sim Boa Seco 4 Não

5 42 M 22 10 - - - Restaurado Sim Não Boa Seco 2 Não

6 64 F 45 20 - - - Restaurado Sim Não Boa Seco 2 Não

7 17 F 12 5 - - - Restaurado Não Sim Ruim Seco 5 Não

8 31 M 22 7 - - - Restaurado Sim Não Boa Seco 5 Não

9 65 M 45 20 - - - Restaurado Não Não Boa Seco 3 Não

10 52 F 15 20 - - - Restaurado Sim Não Ruim Seco 20 Não

11 30 M 22 3 - - - Restaurado Não Sim Boa Seco 10 Não

12 18 F 46 5 - - - Restaurado Não Não Boa Seco 3 Não

13 59 M 43 10 - + - Restaurado Não Sim Boa Seco 3 Não

14 61 F 23 10 - + - Restaurado Sim Sim Boa Seco 4 Não

15 31 F 15 2 - + - Restaurado Sim Sim Ruim Seco 4 Não

16 43 F 46 6 - + - Restaurado Não Sim Boa Seco 20 Não

17 43 F 21 10 - + - Restaurado Não Sim Ruim Seco 3 Não

18 59 F 25 18 - - - Restaurado Sim Não Ruim Seco 3 Não

19 23 M 11 7 - - - Restaurado Sim Sim Ruim Seco 2 Não

20 58 F 15 20 - - - Restaurado Sim Sim Ruim Seco 3 Não

TTP – Tempo do tratamento endodôntico prévio; Microinf – Microinfiltração; Mobil. – Mobilidade dentária; DE – Dor espontânea; PV – Dor a percussão vertical; P – Dor a palpação

58

5.2 COMPOSIÇÃO DA MICROBIOTA

5.2.1 Micro-organismos identificados pelo checkerboard

Bactérias foram detectadas em 100% das amostras microbiológicas da saliva,

câmara pulpar e canal radicular dos pacientes com necessidade de reintervenção

endodôntica de dentes associados à lesão periapical visível radiograficamente (20/20).

Dentre as bactérias investigadas as mais frequentes foram na saliva foram:

Streptococcus mutans (20/20 casos, 100%), Gemella morbillorum (20/20, 100%),

Streptococcus mitis (20/20, 100%), Streptococcus gordonii (20/20, 100%),

Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum (20/20, 100%), Fusobacterium periodonticum

(20/20, 100%), Campylobacter showae (20/20, 100%), Capnocytophaga ochracea

(20/20, 100%), Enterococcus faecalis (20/20, 100%), Veillonella parvula (20/20, 100%),

Parvimonas micra (20/20, 100%), Eubacterium saburreum (20/20, 100%), Treponema

socranskii (20/20, 100%), Enterococcus faecium (20/20, 100%), Enterococcus hirae

(20/20, 100%), como mostra a Figura 1.

Na câmara pulpar, as bactérias mais frequentes foram: Enterococcus faecium

(18/20 casos, 90%), Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum (17/20, 85%), Parvimonas

micra (17/20, 85%), Tannerella forsythia (16/20, 80%), Capnocytophaga ochracea

(15/20, 75%), Enterococcus faecalis (15/20, 75%), Eubacterium saburreumn (15/20,

75%), Staphylococcus epidermidis (14/20, 70%), Fusobacterium periodonticum (14/20,

70%), Enterococcus hirae (14/20, 70%), Streptococcus gordonii (13/20, 65%),

Campylobacter showae (13/20, 65%), Prevotella intermedia (12/20, 60%), Streptococcus

mutans (12/20, 60%), Gemella morbillorum (12/20, 60%), como mostra a Figura 2.

Já no canal radicular, as bactérias mais frequentes foram Prevotella

intermedia (20/20 casos, 100%), Streptococcus gordonii (20/20, 100%),

Capnocytophaga ochracea (20/20, 100%), Enterococcus faecalis (20/20, 100%),

Parvimonas micra (20/20, 100%), Eubacterium saburreum (20/20, 100%), Enterococcus

faecium (20/20, 100%), Streptococcus mutans (19/20, 100%), Gemella morbillorum

(19/20, 100%), Staphylococcus epidermidis (19/20, 95%), Fusobacterium nucleatum sp.

59

nucleatum (19/20, 95%), Prevotella nigrescens (19/20, 95%), Fusobacterium nucleatum

sp. vincentii (19/20, 95%) e Enterococcus hirae (19/20, 95%), como mostra a Figura 3.

Entre as bactérias presentes simultaneamente nos 3 sítios, as mais prevalentes

foram: Enterococcus faecium (18/20, 90%), Parvimonas micra (17/20, 85%),

Fusobacterium nucleatum (16/20, 80%), Enterococcus faecalis (15/20, 75%),

Eubacterium saburreum (15/20, 75%), Capnocytophaga ochracea (15/20, 75%).

Em relação a contagem das espécies na saliva, 39 das bactérias pesquisadas

foram encontradas, mas não em todos os casos, em altas concentrações (>105).

Enterococcus hirae foi encontrado em 90% das vezes em concentrações maiores que 105,

Treponema socranskii em 85% das vezes e Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum em

75%.

Na câmara pulpar, 36 espécies, em alguns casos, foram encontradas em

concentrações maiores que 105, entre elas: Enterococcus hirae, Fusobacterium nucleatum

sp. nucleatum e Staphylococcus epidermidis.

No canal radicular, 35 espécies, em alguns casos, foram encontradas em

concentrações maiores que 105, entre ntre elas: Fusobacterium nucleatum sp. vincentii,

Enterococcus hirae, Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum e Parvimonas micra.

60

Figura 1. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 = 105, 3

= 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) na saliva de pacientes com

insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por meio da técnica de

checkerboard.

61

Figura 2. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 = 105, 3

= 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) na câmara pulpar do dente de

pacientes com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por meio da técnica

de checkerboard.

62

Figura 3. Frequência de bactérias detectadas e seus níveis de DNA (1 = <105, 2 = 105, 3

= 105-106, 4 = 106, 5 = >106 [indicados pela legenda]) no canal radicular do dente de

pacientes com insucesso endodôntico e presença de lesão periapical, por meio da técnica

de checkerboard.

63

5.2.2 Distribuição da microbiota

A distribuição do número de espécies bacterianas por casos (Figura 4)

possibilitou observar que houve uma grande variação na diversidade quando comparadas

saliva, câmara pulpar e canal radicular.

A saliva apresentou uma diversidade bacteriana superior aos outros sítios,

com uma média de 34,85 ± 3,57 espécies por caso, seguida pelo canal radicular e câmara

pulpar com 28,9 ± 7,12 e 19,7 ± 12,37, respectivamente.

Em relação à distribuição do número de espécies entre saliva, câmara pulpar

e canal radicular, por casos, observamos que:

a. Os casos 1 e 19 foram os que apresentaram a maior diversidade e os

casos 12 e 20 a menor em relação aos outros casos investigados.

b. O caso 19 foi o mais homogêneo em número de espécies nos 3 sítios,

com desvios-padrão 2,5.

c. Os casos 1, 12 e 16 apresentaram um número decrescente de espécies

da saliva para a câmara pulpar e canal radicular.

64

Figura 4. Número de espécies por caso de insucesso coletado nos 3 sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal radicular), investigadas pelo

checkerboard.

65

5.2.3 Quantificação dos micro-organismos pelo real-time PCR

Foram avaliadas 20 amostras de cada sítio pelo real-time PCR, contudo,

análises da prevalência e contagem total do número de bactérias mostraram que na saliva

80% (16/20) das amostras foram positivas para bactérias com o primer universal

utilizado, a média de células bacterianas nesse sítio foi de (8,63 x 106 – 1,48 x 10-1); na

câmara pulpar 75% (15/20) das amostras apresentaram resultados positivos, com média

de células bacterianas de 6,78 x 105 (6,18 x 106 – 3,89 x 10-2) e; no canal radicular 70%

(14/20) das amostras quantificaram com média de 2,02 x 104 (1,42 x 105 – 3,70 x 10-2).

E. faecalis foi detectado em 5 das 16 (31%) amostras positivas para bactérias

na saliva, em 4 das 15 (27%) amostras positivas para bactérias na câmara pulpar, em 3

das 14 amostras positivas para bactérias e no canal radicular. Na saliva esse micro-

organismo correspondeu em média a 0,6% do total de bactérias, com média de 1,54 x 103

(2,79 x 103 – 7,75 x 102) células bacterianas. Na câmara pulpar a média de E. faecalis foi

de 17,4% do total de bactérias, com média de 1,57 x103 (2,20 x 103 – 1 x 103) células

bacterianas. Já no canal radicular, nos três casos onde foi identificado, as porcentagens

dessa bactéria foram de 2,9%; 10,4% e 14,2%, com média de 1,91 x103 (4,18 x 103 – 6,18

x 102) células bacterianas por canal radicular.

Streptococcus spp. foi detectado em 69% (11/16) das amostras da saliva, com

média de 10,7% do total de bactérias, e média de 2,23 x105 (8,25 x 105 – 1,59 x 101) de

células bacterianas. Na câmara pulpar sua frequência foi de 87% (13/15), com média de

9% do total de bactérias e média de 4,51 x104 (3,46 x 105 – 2,63 x 101) de células

bacterianas. Por fim, no canal radicular a frequência de Streptococcus spp. foi 71%

(10/14), correspondendo a média de 1% do total de bactérias e média de 4,8 x 102 (4,55

x 103 – 2,67) de células bacterianas por canal radicular.

Os dados acima estão apresentados na tabela 5.

66

Tabela 5. Quantificação e prevalência de bactérias totais, E. faecalis e Streptococcus spp., na saliva, câmara pulpar e canais radiculares de dentes

com insucesso do tratamento endodôntico e presença de lesão periapical.

Saliva Câmara pulpar Canal radicular

Total E. faecalis Streptococcus spp. Total E. faecalis Streptococcus spp. Total E. faecalis Streptococcus spp.

Prevalência (%) 16/20 (80) 5/16 (31) 11/16 (69) 15/20 (75) 4/15 (27) 13/15 (87) 14/20 (70) 3/14 (21) 10/14 (71)

Média 1,45 x 106 1,54 x 103 2,23 x 105 6,78 x 105 1,57 x 103 4,51 x 104 2,02 x 104 1,91 x 103 4,80 x 102

Mediana 1,78 x 105 1,01 x 103 6,91 x 104 9,68 x 103 1,54 x 103 1,52 x 102 3,86 x 103 9,32 x 102 2,73 x 101

Máximo 8,63 x 106 2,79 x 103 8,25 x 105 6,18 x 106 2,20 x 103 3,46 x 105 1,42 x 105 4,18 x 103 4,55 x 103

Mínimo 1,48 x 10-1 7,75 x 102 1,59 x 101 3,89 x 10-2 1,00 x 103 2,63 x 101 3,70 x 10-2 6,18 x 102 2,67

67

5.3 LIPOPOLISSACARÍDEOS E ÁCIDO LIPOTEICÓICO

O LPS foi encontrado em 95% das amostras coletadas. Com média na saliva de 0,90

EU/mL (±2,43), na câmara pulpar de 0,45 EU/mL (±0,72) e no canal radicular de 3,26 EU/mL

(±5,41) (Figura 5). Não houve correlação estatisticamente significante entre as concentrações

do LPS entre os sítios.

O LTA também foi encontrado em todas as amostras coletadas. Com média

decrescente da saliva para o canal radicular, sendo 724,65 pg/mL (±104,11); 678,97 pg/mL

(±71,95); 578,67 pg/mL (±80,47); nos 3 sítios respectivamente (Figura 6). Não houve

correlação estatisticamente significante entre as concentrações do LTA entre os sítios.

Figura 5. Média e desvio-padrão da concentração de LPS em EU/mL das

amostras de saliva, câmara pulpar e canal radicular.

68

Figura 6. Média e desvio-padrão da concentração de LTA em pg/mL das

amostras de saliva, câmara pulpar e canal radicular.

5.4 ASSOCIAÇÕES DA MICROBIOTA, LTA, LPS E ASPECTOS CLÍNICOS E

RADIOGRÁFICOS

5.4.1 Associações entre a microbiota identificada nos três sítos

Não houve associação estatisticamente significativa entre os micro-organismos da

saliva e da câmara pulpar, entre os micro-organismos da saliva e do canal radicular e entre os

micro-organismos da câmara pulpar e do canal radicular (p<0,05), quando todos os casos (20)

foram analisados juntos pelos Testes de Qui-quadrado de Pearson ou Teste Exato de Fischer.

No entanto, quando se separou os casos em 2 grupos: um grupo em que os dentes

apresentavam sinais de microinfiltração (11/20); e outro em que os dentes não apresentavam

sinais de microinfiltração (9/20), ocorreram associações estatisticamente significativas

(p<0,05).

No primeiro grupo da microinfiltração, uma associação positiva foi encontrada

entre Streptococcus oralis da Saliva e Streptococcus oralis do Canal radicular (p=0,015 e

ODDS=7).

69

No segundo grupo, dos dentes que não apresentaram sinais de microinfiltração,

apenas uma associação negativa foi encontrada, entre Campylobacter showae da Câmara pulpar

e Campylobacter showae do Canal radicular (p=0,048 e ODDS=0,250).

5.4.2 Associações dentro da microbiota identificada em cada sítio

Contudo, associações estatísticas positivas e negativas altamente significativas

(p<0,01) foram encontradas na microbiota, dentro de cada sítio separadamente. Assim, na saliva

2 pares de espécies apresentaram associações positivas (Apêndice 2), enquanto não houve

associações negativas. Na câmara pulpar o número de associações foi consideravelmente maior,

sendo 66 positivas (Apêndice 3) e 40 negativas (Apêndice 4). Por fim, no canal radicular 7

associações foram positivas (Apêndice 5) e 11 negativas (Apêndice 6). Todas com significância

estatística e valor de ODDS <0,5 e >2.

5.4.3 Associações entre bactérias Gram-negativas e LPS

Não houve associações estatisticamente significantes (p<0,05) entre o número total de

bactérias Gram-negativas identificadas em todos os sítios e em cada sítio separadamente e os

níveis de LPS na saliva, câmara pulpar e canal radicular.

No entanto, 4 associações positivas e 2 negativas (p<0,01) entre a concentração de

determinadas bactérias Gram-negativas (<105 à >106) e os níveis de LPS ocorreram (Tabela 4

e 5).

70

Tabela 6. Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies bacterianas Gram-

negativas e o LPS.

LPS Espécie no Sítio Significância

(valor de p)

Coeficiente

de correlação

Saliva Veillonella parvula na Câmara pulpar 0,004 0,611

Saliva Campylobacter showae na Câmara pulpar 0,007 0,580

Saliva Neisseria mucosa na Câmara pulpar 0,006 0,592

Canal radicular Capnocytophaga ochracea na Câmara pulpar 0,003 0,622

Tabela 7. Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies bacterianas Gram-

negativas e o LPS.

LPS Espécie no Sítio Significância

(valor de p)

Coeficiente

de correlação

Camara pulpar Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum na

Câmara pulpar

0,002 -0,648

Canal radicular Dialister pneumosintes no Canal radicular 0,002 -0,648

5.4.4 Associações entre bactérias Gram-positivas e LTA

Da mesma forma como ocorreu com o LPS e as bactérias Gram-negativas, ou seja, não

houve associações estatisticamente significantes entre o número total de bactérias Gram-

positivas identificadas em todos os sítios e em cada sítio separadamente e os níveis de LTA na

saliva, câmara pulpar e canal radicular.

No entanto, 1 associação positiva e 3 negativas (p<0,01) entre a concentração (<105 à

>106) de determinadas bactérias Gram-positivas e os níveis de LTA ocorreram (Tabela 6 e 7).

71

Tabela 8. Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies bacterianas Gram-

positivas e o LTA.

LTA Espécie no Sítio Significância

(valor de p)

Coeficiente

de correlação

Câmara pulpar Enterococcus hirae no Canal radicular 0,004 0,610

Tabela 9. Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies bacterianas Gram-

positivas e o LTA.

LTA Espécie e Sítio Significância

(valor de p)

Coeficiente

de correlação

Câmara pulpar Eubacterium nodatum na Câmara pulpar 0,004 -0,609

Câmara pulpar Streptococcus mitis na Câmara pulpar 0,006 -0,587

Canal radicular Eubacterium nodatum no Canal radicular 0,004 -0,618

5.4.5 Associações entre os micro-organismos e aspectos clínicos e radiográficos

Foram encontradas associações negativas estatisticamente significativas (p<0,05)

entre as espécies bacterianas investigadas pelo checkerboard e os aspectos clínicos (Tabela 8).

Não houve associações entre os aspectos radiográficos e os micro-organismos.

Não houve associações entre os níveis de bactérias totais, E. faecalis e

Streptococcus spp. e os aspectos clínicos e radiográficos.

Tabela 10. Associações negativas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas

investigadas e os aspectos clínicos observados.

Sinal/Sintoma Espécie Significância (valor de p) Valor do

ODDS

Percussão Dialister pneumosintes 0,042 0,429

Percussão Fusobacterium periodonticum 0,042 0,429

Percussão Eikenella corrodens 0,042 0,429

72

5.4.6 Associações entre o LPS e aspectos clínicos e radiográficos

Apenas uma correlação positiva estatisticamente significativa foi encontrada, entre

os níveis de LPS e o aspectos clínicos e radiográficos. Esta ocorreu entre o LPS da saliva e a

presença de fístula, com nível de significância de 0,022 e coeficiente de correlação moderada

de 0,508.

Não houve associações entre os aspectos radiográficos e o LPS.

5.4.7 Associações entre o LTA e aspectos clínicos e radiográficos

Entre os aspectos clínicos e a concentração de LTA, 2 correlações foram

encontradas. Uma moderada negativa (p=0,002 e coeficiente de correlação = -0,643) entre a

Percussão e o LTA da saliva. E outra regular positiva (p=0,035 e coeficiente de correlação =

0,473) entre a Percussão e o LTA da câmara pulpar.

Não houve associações entre os aspectos radiográficos e o LTA.

73

6 DISCUSSÃO

A infecção bacteriana é a principal causa do insucesso endodôntico, em que os

micro-organismos e seus sub-produtos presentes nos canais radiculares tem a capacidade de

causar danos a região periapical, por meio da introdução ou perpetuação de um processo

inflamatório. As bactérias podem contaminar os canais, na periodontite apical pós-tratamento,

basicamente por duas formas: através da persistência de espécies da infecção primária que não

foram eliminadas ou controladas suficientemente, sendo essa infecção classificada como

infecção persistente; ou mediante a penetração de micro-organismos da saliva pela

microinfiltração coronária de restaurações insatisfatórias, sendo está conhecida como infecção

secundária (Siqueira e Rôças, 2008; Vieira et al., 2012; Endo et al., 2013; Siqueira et al., 2014;

Dos Santos et al., 2014).

As formas pelas quais o insucesso do tratamento endodôntico prévio ocorre é

discutida na literatura. Siqueira e Rôças (2008) afirmam que a persistência de bactérias da

primeira infecção é o fator etiológico central do insucesso. Todavia, Pinheiro et al. (2003) e

Gomes et al. (2006a,b), notaram que a maior parte dos dentes pesquisados com infecção pós-

tratamento, apresentavam cáries ou selamento coronário defeituoso. O presente trabalho

concorda com essa constatação, haja vista que 55% dos casos apresentavam sinais de

microinfiltração coronária. Dessa forma, entende-se que a infiltração pode ser considerada uma

importante causa da falha do tratamento dos canais radiculares. Nesse sentido, o estudo da

microbiota e seus fatores de virulência é relevante para a compreensão dos motivos do

insucesso.

6.1 COMPOSIÇÃO DA MICROBIOTA DA SALIVA, CÂMARA PULPAR E CANAL

RADICULAR

Acreditou-se, por um longo tempo, que o insucesso endodôntico era composto

basicamente por monoinfecções, ou então por uma diversidade bem reduzida de espécies, em

que predominavam bactérias Gram-positivas anaeróbias facultativas. Em 1998, Sundqvist et

al., por meio da coleta microbiológica de 54 dentes previamente tratados e com presença de

lesão periapical, constataram que a microbiota destes era composta predominantemente por

espécies únicas Gram-positivas, e que E. faecalis era a bactéria mais comumente isolada. Da

74

mesma forma, Hanconk et al. (2001) e Pinheiro et al. (2003), encontraram de uma a duas cepas

bacterianas nos canais radiculares, com a dominância de Gram-positivos facultativos. Tais

estudos utilizaram técnicas dependentes de cultura, que possuem limitações quanto as técnicas

de cultivo e isolamento, e por isso subestimavam a composição da microbiota dos canais

radiculares.

Mais recentemente, as análises do conteúdo bacteriano intracanal por técnicas

moleculares e independentes de cultura, permitiram a descoberta de novas espécies. Esses

métodos são mais sensíveis e precisos que os convencionais métodos de identificação cultura-

dependentes. Nesta pesquisa, optou-se pelo uso do checkerboard e real-time PCR como

métodos de identificação e quantificação, respectivamente. O checkerboard, um método semi-

quantitativo, proposto por Socransky em 1994, utiliza sondas específicas de DNA que se ligam

aos micro-organismos da amostra. Dessa forma, um contingente de 40 bactérias mais

frequentemente associadas à patologia endodôntica foram investigadas por essa técnica.

Por esse estudo ficou comprovado que a microbiota da infecção

secundária/persistente é heterogênea e contém inclusive bactérias Gram-negativas, como

Prevotella intermedia e Capnocytophaga ochracea, que foram identificadas em todos os canais

radiculares. Com estas, mais 14 espécies foram altamente prevalentes, sendo encontradas em

mais de 90% dos canais radiculares (Prevotella intermedia, Streptococcus gordonni,

Capnocytophaga ochracea, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Parvimonas micra,

Eubacterium saburreum, Enterococcus hirae, Fusobacterium nucleatum sp. vincentii,

Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum , Staphylococcus epidermidis,

Gemella morbillorum, Streptococcus mutans), sendo destas 8 Gram-positivas e 8 anaeróbias

facultativas. Resultados que divergem dos de Rôças et al., (2012) que encontraram no

retratamento de dentes com periodontite apical, também pelo checkerboard, que as espécies

mais frequentes foram: Propionibacterium acnes (22/42 casos [52%]), Fusobacterium

nucleatum sp. nucleatum (10/42 [24%]), Streptococcus ssp (7/42 [17%]), Propionibacterium

acidifaciens (6/42 [14%]), Pseudoramibacter alactolyticus (6/42 [14%]), Enterococcus faecalis

(5/42 [12%]), e Tannerella forsythia (5/42 [12%]). Os resultados diferenciam-se não só pelas

bactérias mais frequentemente detectadas, mas também pela quantidade de espécies que foram

recuperadas, visto que Rôças et al., (2012) encontraram apenas 5 casos com mais de 5 espécies

diferentes, quanto este trabalho encontrou uma média de 29 espécies por canal radicular.

Os resultados de Murad et al., (2014), que utilizaram o checkerboard, assemelham-

se parcialmente aos deste presente trabalho, principalmente quanto a alta prevalência do gênero

75

Enterococcus: em seu estudo Enterococcus faecium (36%), Streptococcus epidermidis (36%),

Eubacterium saburreum (28%), Parvimonas micra (28%), Streptococcus sanguis (28%),

Capnocytophaga sputigena (28%), Leptotrichia buccalis (28%), Enterococcus faecalis (28%),

and Staphylococcus warneri (28%) foram as espécies mais prevalentes. Ainda, outros métodos

moleculares de identificação foram utilizados na investigação da microbiota associada ao

insucesso endodôntico, entre eles, encontramos o PCR e o pyrosequenciamento, nos quais os

gêneros mais encontrados foram: Fusobacterium; Porphyromonas e Prevotella, e as espécies:

E. faecalis; P. micra; P. gingivalis e F. alocis (Hong et al., 2013; Gomes et al., 2008). Em

concordância, nós encontramos elevada prevalência dos mesmos três gêneros e de quase todas

as espécies, com exceção apenas para P. micra que não foi pesquisada nesse estudo.

Com relação a análise semi-quantitativa do checkerboard, Fusobacterium

nucleatum. sp. vincentii, Enterococcus hirae, Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum e

Parvimonas micra, quando encontrados, estavam presentes em mais de 80% das vezes em

concentrações maiores que 105 células bacterianas por canal radicular. E. faecalis esteve

presente nessa mesma proporção em apenas 7 casos, lembrando que o mesmo foi identificado

em todos os casos. Henriques et al. (2016), também observou que, embora E. faecalis tivesse

uma prevalência de 97,5% em suas amostras, apenas em 2,5% delas apareceu em altas

concentrações.

O gênero Enterococcus é o mais encontrado em diversos trabalhos que avaliaram a

microbiota do insucesso endodôntico (Pinheiro et al, 2003a; Peciuliene et al., 2001; Gomes et

al., 2004; Siqueira e Roças, 2004; Subramanian e Mickel, 2009; Endo et al., 2013; Barbosa-

Ribeiro et al., 2016; Delboni et al., 2017). Em nossas amostras do canal radicular, E. faecalis

(100%), E. faecium (100%) e E. hirae (95%) foram encontrados. Embora alguns estudos

relatem a baixa prevalência ou concentração desse micro-organismo e questionem sua função

na patologia periapical pós-tratamento (Rôças e Siqueira 2012; Henriques et al., 2016), a sua

capacidade de sobrevida em condições severas com grande variação de pH, temperatura e

tensão de O2 (Gomes et al., 2008; Baik et al., 2011; Lee e Baek 2012); sua capacidade de

suportar períodos prolongados com poucos nutrientes (Figdor et al., 2003); sua habilidade em

formar biofilmes (Subramanian e Mickel, 2009); além de seus diversos fatores de virulência

(substâncias de agregação, proteínas de superfície enterocócica, gelatinase, hialuronidade,

citolisina tóxica, produção de superóxido extracelular, ácido lipoteicóico e determinante de

resistência à antibióticos) (Schleifer e Klipper-Balz, 1984; Portenier et al., 2003), evidenciam

que o papel de E. faecalis como agente patogênico deve ser considerado.

76

Neste trabalho, além dos canais radiculares, a microbiota da saliva e da câmara

pulpar, associadas, também foi estudada. Em relação às espécies mais detectadas, na saliva

encontramos: Streptococcus mutans, Gemella morbillorum, Streptococcus mitis, Streptococcus

gordonii, Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum, Fusobacterium periodonticum,

Campylobacter showae, Capnocytophaga ochracea, Enterococcus faecalis, Veillonella

parvula, Parvimonas micra, Eubacterium saburreum, Treponema socranskii, Enterococcus

faecium, e Enterococcus hirae, em 100% das amostras. Estas, embora em maior número de

espécies identificadas, apresentaram certa similaridade com as bactérias mais prevalentes nos

canais, 6 delas (S. gordonii, C. ochracea, E. faecalis, P micra, E. saburreum, E. faecalis) foram

encontradas em todos os casos tanto na saliva quanto nos canais radiculares. A saliva pode ser

um agente constante de contaminação para os canais radiculares em casos de microinfiltração

coronária, vários estudos correlacionaram a falta de adequado selamento coronário com uma

possível causa do insucesso do tratamento anterior (Sanders e Sanders, 1994; Pinheiro et al.,

2003; Gomes et al., 2006a,b; Delboni et al., 2017). Wang et al. (2012), reportaram uma

prevalência consideravelmente mais baixa de E. faecalis na saliva (19%) e canal radicular

(38%) de dentes associados ao insucesso, quando comparado aos nossos achados. Por outro

lado, um estudo reportou que 75% dos pacientes com tratamento endodôntico, possuíam

espécies de enterococos detectáveis na saliva (Gold et al., 1975).

Na câmara pulpar, nenhum micro-organismo foi detectado em todos os casos, como

aconteceu nos dois outros sítios orais investigados. Entre os mais prevalentes, encontramos:

Enterococcus faecium (18/20 casos, 90%), Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum (17/20,

85%), Parvimonas micra (17/20, 85%), Tannerella forsythia (16/20, 80%), Capnocytophaga

ochracea (15/20, 75%), Enterococcus faecalis (15/20, 75%) e Eubacterium saburreumn (15/20,

75%). Todas essas bactérias também foram encontradas em altos valores de prevalência nos

canais radiculares. A câmara pulpar é um ambiente intermediário entre a saliva e o canal

radicular, e pode estar em contato com a saliva quando da presença de microinfiltração

coronária.

Entre as bactérias presentes simultaneamente nos 3 sítios, as mais prevalentes

foram: Enterococcus faecium (18/20, 90%), Parvimonas micra (17/20, 85%), Fusobacterium

nucleatum (16/20, 80%), Enterococcus faecalis (15/20, 75%), Eubacterium saburreum (15/20,

75%), Capnocytophaga ochracea (15/20, 75%). Apenas um estudo (Delboni et al., 2017)

correlacionou saliva, câmara pulpar e canais radiculares em casos de retratamentos de dentes

com lesões periapicais associadas. Contudo, nesse trabalho os pesquisadores avaliaram apenas

77

uma bactéria, E. faecalis, quanto a sua diversidade e similaridade entre os genótipos isolados e

observaram que as cepas eram similares, o que sugere que a microinfiltração é uma causa

possível do insucesso.

Com relação ao número de espécies por sítio, a saliva apresentou uma diversidade

bacteriana superior aos outros sítios, com uma média de 34,85 ± 3,57 espécies por caso, seguida

pelo canal radicular e câmara pulpar com 28,9 ± 7,12 e 19,7 ± 12,37, respectivamente. O caso

19 (Figura 4) foi o mais homogêneo em número de espécies nos três sítios, além disso, este

estava associado a presença de microinfiltração coronária. Os casos 1, 12 e 16 apresentaram um

número decrescente de espécies da saliva para a câmara pulpar e canal radicular, dentre eles

apenas o 12 não apresentou microinfiltração. Tais resultados poderiam sugerir uma via de

contaminação da saliva, passando para a câmara pulpar e em seguida para os canais radiculares.

Contudo, não existem trabalhos na literatura para se fazer essas comparações. Os aspectos

biológicos da microinfiltração coronária não foram ainda bem esclarecidos. Apenas um

trabalho na literatura comparou a similaridade entre esses 3 sítios (Delboni et al., 2017).

A respeito do método de quantificação empregado, o real-time PCR permite a

quantificação total de bactérias, assim como de espécies alvo, por meio da análise dos padrões

de amplificação ao longo de um número de ciclos de PCR, utilizando sondas fluorogênicas

(Sedgley et al., 2005). No presente trabalho, níveis de bactérias totais, E. faecalis e

Streptococcus spp. foram investigados.

Alguns estudos prévios igualmente avaliaram infecções persistentes/secundárias

associadas com periodontite apical pós-tratamento por real-time PCR (Sedgley et al.,

2005,2006; Williams et al., 2006; Blome et al., 2008; Rôças et al., 2012; Antunes et al., 2015).

Neste trabalho a quantificação da carga de bactérias totais dos canais radiculares

revelou que 70% das amostras apresentaram resultados positivos para bactérias, além disso, a

média de células bacterianas por canal foi de 2,02 x 104. Similarmente, Antunes e colaboradores

(2015) detectaram micro-organismos em 77% das amostras criopulverizadas das porções

apicais de dentes submetidos ao retratamento cirúrgico. Nos casos positivos a média dos níveis

de bactérias totais foi de 5,7 x 104 células. Ainda, pesquisas anteriores que utilizaram cones de

papel para a realização das coletas (Sedgley et al., 2006; Blome et al., 2008; Rôças e Siqueira,

2012), como feito nesse estudo, constataram que a contagem de bactérias em dentes

previamente tratados foi de 103 a 107 células bacterianas.

78

A prevalência de E. faecalis nos canais radiculares foi de 21% (3/14), representando

a média de 9,17% (1,91 x103 células) da população bacteriana intrarradicular. Entretanto

trabalhos como o de Siqueira e Rôças, em 2004, e Ozbek et al., em 2009, mostraram uma

prevalência bem superior desta espécie. Resultados de Blome et al. (2008), Rôças e Siqueira

(2012), e Antunes et al. (2015) corroboram com os nossos, visto que encontraram E. faecalis

em 10%; 38%; e 14% das amostras provenientes de canais radiculares previamente tratados

com presença de lesão periapical, questionando o papel dessa espécie como principal patógeno

do insucesso endodôntico. Além disso, os níveis de células bacterianas foram aproximados aos

nossos, com: 9,79 x 103; 1,28 x 103 e 2,8 x 104, respectivamente. Por outro lado, a dominância

de 91% e 98% de E. faecalis em relação ao montante total de bactérias encontrada em alguns

casos de insucesso (Rôças e Siqueira, 2012; Antunes et al., 2015) divergiram desse estudo, no

qual a porcentagem dessa bactéria, em relação ao total, não passou de 14,2%. Tal fato pode

estar relacionado à comunidade bacteriana complexa com alto número de espécies (28,9 ± 7,12)

encontrada nos canais radiculares desse trabalho, confirmada pelo método de checkerboard.

Primers para a quantificação de Streptococcus spp. por real-time PCR, foram

igualmente utilizados, sendo encontrada a prevalência de 71% (10/14), correspondendo em

média a 1% das bactérias totais, com média de 4,8 x 102 (4,55 x 103 – 2,67) células bacterianas

por canal radicular. O mesmo gênero foi identificado em alta frequência, de forma semelhante,

em pesquisas prévias relacionadas a doença pós-tratamento endodôntico (Pinheiro et al., 2003;

Sakomoto et al., 2007). Com relação a parcela de Streptococcus spp. na população de bactérias,

Antunes et al. (2015) verificaram que em 6 dos 16 casos onde o gênero foi encontrado, eles

corresponderam a mais de 95% do total de bactérias. Nesse mesmo sentido, Rôças e Siqueira

(2012) notaram que a média de estreptococos foi de 65,78% do total. Estes resultados divergem

desse trabalho, e indicam que embora o gênero possa ser dominante em casos de insucesso,

mais estudos são necessários para a compreensão de sua participação no processo patológico

periapical.

Na saliva, a média de células bacterianas totais foi de 1,45 x 106 (16/20 casos), com

a proporção média de 0,6% de E. faecalis (5/16 casos) e 10,7% de Streptococcus spp. (11/16

casos). Apenas um trabalho anterior (Sedgley et al., 2005) usou o PCR quantitativo para

analisar a saliva em casos de periodontite apical pós-tratamento. Nele as bactérias totais e E.

faecalis foram quantificados e seus resultados apontaram que menos de 0,005% das bactérias

em 5 casos positivos eram E. faecalis, enquanto a carga da população bacteriana foi de 5,92 x

105 a 5,69 x 107 de células por amostra.

79

Na câmara pulpar, a média de células bacterianas totais foi de 6,78 x 105 (15/20),

com a proporção média de 17,4% de E. faecalis (4/15 casos) e 9% de Streptococcus spp. (13/15

casos) em relação ao contingente total de células. Não existem dados na literatura sobre essa

metodologia na câmara pulpar em casos de insucesso para comparação.

A respeito da análise dos 3 sítios conjuntamente, foi possível notar valores

decrescentes dos níveis bacterianos totais da saliva para a câmara pulpar e canais radiculares

(1,45 x 106; 6,78 x 105; 2,02 x 104), contudo não houve correlação entre essas cargas nos 3 sítios

estudados.

Quanto ao E. faecalis, esteve presente em maior proporção na câmara pulpar

(médias: 17,4%; 1,57 x103 células), seguido pelo canal radicular (médias: 9,16%; 1,91 x103

células) e saliva (médias: 0,6%; 1,54 x 103 células), com número de células bacterianas muito

similares entre os sítios. Streptococcus spp., apresentou maior carga da saliva (médias: 10,7%;

2,23 x105 células), para câmara pulpar (médias: 9%; 4,51 x104 células) e canal radicular

(médias: 1%; 4,8 x 102 células).

Algumas amostras foram negativas para a presença de bactérias pelo método de

real-time PCR, enquanto no checkerboard todas foram positivas. O fato de bactérias não serem

encontradas não significa que elas não estavam presentes, pois podem nao ter sido detectadas

mesmo por um método molecular sensível (Antunes et al., 2015). Da mesma forma, as

prevalências de E. faecalis e Streptococcus foram consideravelmente menores no real-time do

que no checkerboard.

De acordo com Siqueira e Rôças (2004) essas divergencias podem ter sido causadas

pela escolha dos primers utilizados. Wellinghausen et al. (2004) afirmam que o caráter misto

de uma microbiota pode resultar na diminuição da sensibilidade do real-time PCR. No seu

trabalho os autores observaram disparidades na identificação de culturas puras e mistas, o que

foi atribuido a potenciais limites de sensibilidade quando utilizado o real-time PCR. Nós

encontramos pelo checkerboard que a microbiota dos três sítios estudados era mista, com

médias altas do número de espécies (34,85 ± 3,57 na saliva; 19,7 ± 12,37 na câmara pulpar e

28,9 ± 7,12 no canal radicular). Desta forma as diferentes prevalências de bactérias totais, E.

faecalis e Streptococcus spp. entre os dois métodos moleculares utilizados, podem ser

explicadas por essas teorias.

80

6.2 NÍVEIS DE LIPOPOLISSACARÍDEOS E ÁCIDO LIPOTEICÓICO

O LPS, encontrado no envelope celular de bactérias Gram-negativas, desempenha

um papel fundamental na patogênese da periodontite apical e na destruição óssea, ativando

células do sistema imune como macrófagos e levando a liberação de uma variedade de

mediadores pró-inflamatórios, como o fator de necrose tumoral e inter-leucinas (Pitts et al.,

1982; Hong et al., 2004; Martinho et al., 2010; Gomes et al., 2012). Além da ativação de células

imunológicas, as endotoxinas podem possuir antigenicidade contra fibroblastos através da

atividade gelatinolítica das metalo-proteínases (MMPs), sendo responsáveis pela degradação

do colágeno, principal componente das membranas basais (Collier et al., 2011; Herrera et al.,

2014).

Como o LPS é uma parte estrutural de bactérias Gram-negativas, a maior parte dos

trabalhos que avaliaram e quantificaram esse fator de virulência estão relacionados a infecção

primária. O teste cinético turbidimétrico LAL, foi utilizado nesse estudo e por vários autores

que verificaram os níveis de endotoxinas das infecções primárias. Nesse tipo de infecção as

médias dos níveis variaram entre 7,49 EU/mL e 35,2 EU/mL (Martinho et al., 2010; Gomes et

al., 2012; Marinho et al., 2015).

Todavia, confirmamos que a microbiota associada a infecção secundária/persistente

é heterogênea, contendo tanto bactérias Gram-positvas, como bactérias Gram-negativas com

altas prevalências. Dessa forma, o estudo do LPS nesses casos é relevante. Em nosso trabalho,

o LPS foi encontrado em 100% dos canais radiculares, com média de 3,36 EU/mL (0 – 17,4

EU/mL). Níveis que estão de acordo com os encontrados por Gomes et al. (2012), em um estudo

em que quantificaram o LPS em 15 casos de falha do tratamento endodôntico, com

concentração média de endotoxinas de 3,96 EU/mL por canal radicular.

Mais que a identificação dos patógenos e do LPS, relacionados ao insucesso

endodôntico, é de suma importância o estudo dos fatores de virulência das bactérias Gram-

positivas, como o LTA, visto que este também poderá desencadear uma resposta imune no

hospedeiro, tanto pela ligação a receptores específicos (CD14 e receptores toll-like 2) como por

eventos não específicos (ativação do sistema complemento, liberação de citocinas pró-

inflamatórias, ativação de neutrófilos, regulação da angiogênese, entre outros) (Costa et al.,

2003; Ryu et al., 2009).

81

O ácido lipoteicóico, por meio da utilização do kit Human lipoteichoic acids ELISA

Kit (My BioSource, San Diego, EUA), foi encontrado em 100% das amostras do canal radicular,

com uma média de 578,67 pg/mL (±80,47). Barbosa-Ribeiro et al (2016), com a mesma

metodologia, encontraram LTA em todos seus casos de canais radiculares previamente tratados

com presença de lesão periapical (574.0± 94.7 pg/mL) e verificaram uma redução de 36% em

sua concentração após o preparo químico-mecânico e medicação intracanal.

O LTA é um fator de virulência pouco pesquisado na literatura, apenas Barbosa et

al. (2016) verificaram seu nível em canais radiculares associados ao insucesso endodôntico,

antes do presente trabalho; porém a alta carga de Gram-positivas nas infecções secundárias

traduz a relevância de sua investigação. Ademais, altos níveis de LTA podem ser responsáveis

pela manutenção do processo inflamatório na região periapical e consequente insucesso do

tratamento endodôntico (Ryu et al., 2009).

Também quantificamos o LPS e LTA na saliva e na câmara pulpar, contudo não houve

correlações entre os níveis desses fatores de virulência entre os 3 sítios estudados.

6.3 ASSOCIAÇÕES DA MICROBIOTA, LTA, LPS E ASPECTOS CLÍNICOS E

RADIOGRÁFICOS

A literatura evidencia que o insucesso do tratamento endodôntico pode ocorrer pela

capacidade de alguns micro-organismo de sobreviver aos protocolos do tratamento (Siqueira et

al., 2014). Ainda, outros estudos afirmam que as bactérias podem adentrar aos canais

radiculares durante ou após a finalização do tratamento por microinfiltração coronária (Siren et

al., 1997; Wang et al., 2012). Neste estudo, foram investigadas as vias de recontaminação por

meio da análise de associações entre os micro-organismos da saliva e da câmara pulpar, entre

os micro-organismos da saliva e do canal radicular e entre os micro-organismos da câmara

pulpar e do canal radicular.

Não houve associação estatística dos micro-organismos entre os sítios (p<0,05),

quando todos os casos foram analisados juntos. Contudo, quando separou-se os casos em 2

grupos: um grupo em que os dentes apresentavam sinais de microinfiltração (11/20); e outro

em que os dentes não apresentavam sinais de microinfiltração (9/20), ocorreram associações

estatisticamente significativas (p<0,05). No primeiro grupo da microinfiltração, uma associação

positiva foi encontrada entre Streptococcus oralis da Saliva e Streptococcus oralis do Canal

82

radicular (p=0,015 e ODDS=7). No segundo grupo, dos dentes que não apresentaram sinais de

microinfiltração, apenas uma associação negativa foi encontrada, entre Campylobacter showae

da Câmara pulpar e Campylobacter showae do Canal radicular (p=0,048 e ODDS=0,250).

Estudos como o de Gold et al. (1975) e Wang et al. (2012) associaram a prevalência de E.

faecalis na saliva e canais radiculares de casos de periodontite apical pós-tratamento, nesse

estudo inclusive essa bactéria foi detectada em 75% dos casos nos três sítios orais investigados,

mas sem associações estatísticas significativas.

A correlação encontrada entre o S. oralis da saliva e do canal radicular, pode sugerir

que a prevalência dessa espécie nos canais radiculares está condicionada a sua prevalência na

saliva, possivelmente devido a infiltração dessa de um sítio para o outro. As espécies de

Streptococos têm sido comumente detectadas em casos submetidos ao retratamento (Hancock

et al., 2001; Pinheiro et al., 2003a; Rôças et al., 2008). Roças et al. (2012), encontraram que

esse gênero pode ser dominante na comunidade bacteriana associada a patologia pós-

tratamento.

O desenvolvimento da patologia endodôntica é dependente de associações entre as

espécies. Associações bacterianas podem ser importantes, agindo sinergicamente e aumentando

sua virulência, o que agrava os danos causados ao hospedeiro (Gomes et al., 1994b). Por isso,

investigamos igualmente as associações entre as espécies que habitavam o canal radicular,

câmara pulpar e saliva por sítio isoladamente.

Associações altamente significativas positivas e negativas (p<0.01) entre as

espécies bacterianas foram encontradas dentro de todos os sítios. Associações positivas

significam que uma bactéria pode favorecer o crescimento da segunda, por meio da

transferência de fatores de crescimento, mudanças no ambiente físico-químico ou oferecendo

um sítio de ligação para a espécie secundária. Associações negativas significam que uma

espécie pode produzir substâncias letais a outra, pode competir por nutrientes e substratos, ou

destruir sítios de ligação necessários para o estabelecimento das espécies secundárias

(Socransky et al., 1998).

No canal radicular foram observadas 7 correlações positivas entre Porphyromonas

gingivalis/Streptococcus intermedius, Campylobater rectus/Veillonella parvula, Veillonella

parvula/Streptococcus intermedius, Capnocytophaga sputigena/Filifactor alocis, Treponema

denticola/Eikenella corrodens, A actinomycetencomytans (a+b)/Streptococcus oralis e

Streptococcus oralis/Eikenella corrodens. Além de mais 11 associações negativas, que ainda

não foram reportadas na literatura. Na saliva foram encontradas 2 correlações positivas entre:

83

Actinomyces israelli/Eikenella corrodens e Prevotella nigrescens/Capnocytophaga gingivalis.

Na câmara pulpar notaram-se muitas associações tanto positivas (66) quando negativas (40),

sendo as de maiores valores de ODDS, Campylobater rectus/Gemella morbillorum e

Campylobater rectus/Streptococcus mutans, e de menores valores Streptococcus

intermedius/Prevotella melaninogenica e Streptococcus intermedius/Capnocytophaga

sputigena. Associações entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas; entre anaeróbios

estritos e anaeróbios facultativos; e entre cocos e bacilos, foram encontradas, fortalecendo ainda

mais o fato de que as infecções secundárias ou persistentes são compostas por comunidades

microbianas mistas. A câmara pulpar teve o maior número de associações, uma possibilidade é

que isso tenha ocorrido devido a forma como este sítio foi coletado, raspando as paredes

dentinárias com um cotonete, ou seja, as bactérias foram coletadas do biofilme das paredes,

onde a coexistência de bactérias em comunidades é estabelecida na literatura (Larsen et al.,

2002; Chávez de Paz et al., 2015).

Em relação à correlação das bactérias identificadas nos três sítios e os aspectos

clínicos, associações negativas estatisticamente significantes (p<0,05) foram encontradas entre

um aspecto clínico e bactérias específicas, dentre elas: D. pneumosintes, F. periodonticum e E.

corrodens e sensibilidade à percussão. Nenhuma bactéria foi relacionada aos achados

radiográficos. Em contraste, Gomes et al., (2008) estudando 45 dentes com periodontite apical

pós-tratamento, observaram que T. denticola e P. micra foram estatisticamente associados

(p<0.05) a sensibilidade à percussão; P. endodontalis e P. nigrescens foram associados com

exsudatos purulentos (p<0.05) e P. nigrescens foi associado com a presença de dor espontânea

e abscesso (p<0.05). Wang et al., 2012, também estudando casos de insucesso, notaram

correlação positiva entre os níveis de bacilos Gram-negativos e a área da lesão periapical.

Os fatores de virulência também foram associados aos níveis dos micro-organismos

(<105 à >106) e aos aspectos clínicos e radiográficos. Entre bactérias Gram-negativas e o LPS

houve quatro associações positivas e duas negativas (p<0,01). Entre as positivas estavam:

Veillonella parvula na câmara pulpar e o LPS da Saliva; Campylobacter showae na câmara

pulpar e o LPS da saliva; Neisseria mucosa na câmara pulpar e o LPS da saliva; e

Capnocytophaga ochracea na câmara pulpar e o LPS do canal radicular. E entre as negativas:

Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum na câmara pulpar e LPS da câmara pulpar; e Dialister

pneumosintes no canal radicular e LPS do canal radicular. Entre bactérias Gram-positivas e o

LTA, uma associação positiva e três negativas (p<0,01) foram encontradas, a positiva ocorreu

entre Enterococcus hirae no canal radicular e o LTA da câmara pulpar; e as negativas foram

84

todas na câmara pulpar, entre o LTA e Eubacterium nodatum, Streptococcus mitis e

Eubacterium nodatum. A presença de associações entre a bactéria que está em um sítio com o

fator de virulência encontrado em outro pode sugerir a comunicação entre esses ambientes.

A respeito da associação entre os aspectos clínicos e radiográficos e o LPS, apenas o

LPS da saliva apresentou uma correlação moderada positiva (coeficiente de correlação=0,508)

com a presença de fístula (p=0,02). Gomes et al., (2012), que investigaram o LPS em infecções

primárias e secundárias, não encontraram associações entre esse fator de virulência e os sinais

sintomas clínicos na infecção secundária, em contrapartida na infecção primária o LPS foi

positivamente associado com a sensibilidade à percussão. Martinho et al. (2008) e Jacinto et al.

(2005) também encontraram essa associação na infecção primária. Na infecção secundária,

além desse trabalho, Horiba et al. (1991) achou uma correlação positiva, porém entre dente

sintomático e o LPS. Com relação aos aspectos radiográficos, nenhuma associação foi

encontrada, contudo, trabalhos anteriores relacionaram os altos níveis de LPS com maiores

áreas de radioluscência apical (Horiba et al., 1991; Endo et al., 2012 e Gomes et al., 2012).

Entre o LTA e os aspectos clínicos, existiu uma correlação regular positiva

(p=0,035 e coeficiente de correlação = 0,473) entre a percussão e o LTA da câmara pulpar e

uma correlação moderada negativa (p=0,002 e coeficiente de correlação = -0,643) entre a

percussão e o LTA da saliva. Ainda não existem trabalhos na literatura acerca de possíveis

associações entre os níveis de LTA e os aspectos clínicos e radiográficos na infecção

secundária.

Resumindo, podemos dizer que apesar da microbiota dos canais radiculares ser

constantemente revisitada, através da utilização de novos métodos de detecção de micro-

organismos, ainda existem poucos trabalhos tentando correlacionar não apenas a microbiota,

mas também seus fatores de virulência, com os aspectos clínicos e radiográficos apresentados

pelos pacientes. Também existem poucos estudos avaliando a resistência dos micro-organismos

e de seus fatores de virulência frente aos procedimentos endodônticos, visando a melhoria no

combate ou prevenção da infecção secundária, elevando assim o índice de sucesso do

tratamento. Portanto sugere-se que trabalhos futuros devam continuar correlacionando a

microbiota de diferentes sítios orais no intuito de compreender a origem da infecção secundária.

85

7 CONCLUSÃO

Baseado nos diversos métodos utilizados neste estudo e nos resultados obtidos,

pode-se concluir que:

Pelo método de checkerboard DNA-DNA hybridization, a infecção endodôntica

secundária/persistente é heterogênea e apresenta tanto bactérias Gram-positivas quanto

Gram-negativas, anaeróbias facultativas e estritas. As bactérias mais prevalentes nos

três sítios estudados foram: Enterococcus faecium, Parvimonas micra, Fusobacterium

nucleatum, Enterococcus faecalis, Eubacterium saburreum e Capnocytophaga

ochracea.

Pelo método de real-time PCR, foram encontrada as médias de células bacterianas totais

de 1,45 x 106; 6,78 x 105 e; 2,02 x 104, na saliva, câmara pulpar e canal radicular,

respectivamente. A proporção média de E. faecalis nesses mesmos sítios foi de 0,6%;

17,4% e; 9,17%. Streptococcus spp. correspondeu em média a 10,7%; 9% e; 1% das

bactérias totais na saliva, câmara pulpar e canal radicular, respectivamente.

Associações estatísticas positivas e negativas altamente significativas (p<0,01) foram

encontradas na microbiota dentro de cada sítio separadamente.

Nas associações estatísticas (p<0,05) entre sítios, dos dentes que apresentam sinais de

microinfiltração (11/20), uma associação positiva foi encontrada entre Streptococcus

oralis da saliva e Streptococcus oralis do canal radicular (p=0,015 e ODDS=7). Nos

dentes que não apresentam sinais de microinfiltração (9/20) uma associação negativa

foi encontrada, entre Campylobacter showae da câmara pulpar e Campylobacter showae

do canal radicular (p=0,048 e ODDS=0,250).

Três associações estatisticamente significantes negativas (p<0,05) entre os aspectos

clínicos e os micro-organismos foram observadas, sendo estas entre a percussão e

Dialister pneumosintes, Fusobacterium periodonticum e Eikenella corrodens.

86

O LPS esteve presente em 95% das amostras dos canais radiculares, com média de 3,26

EU/mL. Não houve correlação entre os níveis desse fator de virulência nos sítios. Já

entre a concentração de bactérias Gram-negativas e o LPS foram encontradas 4

associações positivas e 2 negativas (p<0,01). O LPS da saliva apresentou uma

correlação moderada positiva com a presença de fístula (p=0,02).

O LTA esteve presente em 100% das amostras dos canais radiculares, com média de

578,67 pg/mL. Também não houve correlação entre os níveis do ácido lipoteicóico nos

sítios. Entre a concentração de bactérias Gram-positivas e o LTA foi encontrada 1

associação positiva e 3 negativas (p<0,01). A percussão e o LTA da câmara pulpar

apresentaram uma correlação regular positiva (p=0,035).

Existe uma similaridade entre as microbiotas das 3 regiões estudadas, com maior

detecção de LTA do que LPS. Associações entre microrganismos presentes na saliva,

câmara pulpar e canal radicular sugerem possível comunicação entre os sítios.

87

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103

APÊNDICE 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

104

105

106

APÊNDICE 2. Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies bacterianas

encontradas na saliva.

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Actinomyces israelli Eikenella corrodens 0,005 35,000

Prevotella nigrescens Capnocytopaga gingivalis 0,004 17,000

107

APÊNDICE 3. Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na câmara pulpar.

(continua)

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Campylobater rectus Gemella morbillorum 0,001 77,000

Campylobater rectus Streptococcus mutans 0,001 77,000

Streptococcus oralis Prevotella melaninogenica 0,001 72,000

Streptococcus oralis Capnocytophaga sputigena 0,001 72,000

Fusobacterium nucleatum. sp.

vincentii

Streptococcus intermedius 0,002 65,000

Eubacterium saburreum Enterococcus faecalis 0,005 56,000

Eubacterium saburreum Capnocytophaga ochracea 0,005 56,000

Actinomyces oris Porphyromonas endodontalis 0,005 36,000

Streptococcus mitis Filifactor alocis 0,005 35,000

Campylobater rectus Campylobacter showae 0,004 33,000

Dialister pneumosintes Streptococcus gordonii 0,004 33,000

Streptococcus oralis Fusobacterium nucleatum sp.

polymorphum

0,004 33,000

Streptococcus oralis Streptococcus mitis 0,004 33,000

Fusobacterium nucleatum sp.

polymorphum

Prevotella melaninogenica 0,004 33,000

Fusobacterium nucleatum sp.

polymorphum

Capnocytophaga sputigena 0,004 33,000

Campylobacter showae Gemella morbillorum 0,004 33,000

Streptococcus gordonii Gemella morbillorum 0,004 33,000

Streptococcus gordonii Streptococcus mutans 0,004 33,000

Eubacterium nodatum Streptococcus oralis 0,007 30,000

Eubacterium nodatum Prevotella melaninogenica 0,007 30,000

Eubacterium nodatum Capnocytophaga sputigena 0,007 30,000

108

APÊNDICE 3. Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na câmara pulpar.

(continuação)

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Fusobacterium nucleatum sp.

vincentii

Streptococcus oralis 0,007 30,000

Fusobacterium nucleatum sp.

vincentii

Prevotella melaninogenica 0,007 30,000

Fusobacterium nucleatum sp.

vincentii

Capnocytophaga sputigena 0,007 30,000

Campylobacter showae Fusobacterium periodonticum 0,007 30,000

Campylobacter showae Staphylococcus epidermidis 0,007 30,000

Streptococcus gordonii Staphylococcus epidermidis 0,007 30,000

Parvimonas micra Tannerella forsythia 0,004 17,000

Eubacterium saburreum Staphylococcus epidermidis 0,000 15,000

Capnocytophaga ochracea Staphylococcus epidermidis 0,000 15,000

Parvimonas micra Enterococcus faecalis 0,009 8,500

Streptococcus mitis Capnocytophaga sputigena 0,000 8,000

Tannerella forsythia Staphylococcus epidermidis 0,003 8,000

Capnocytophaga ochracea Streptococcus gordonii 0,001 7,500

Streptococcus oralis Streptococcus intermedius 0,000 7,000

Staphylococcus epidermidis Gemella morbillorum 0,001 7,000

Staphylococcus epidermidis Streptococcus mutans 0,001 7,000

Staphylococcus epidermidis Prevotella intermedia 0,001 7,000

Veillonella parvula Actinomyces oris 0,001 6,000

Dialister pneumosintes Actinomyces israelli 0,001 6,000

Eubacterium saburreum Gemella morbillorum 0,004 5,000

Eubacterium saburreum Streptococcus mutans 0,004 5,000

Eubacterium saburreum Prevotella intermedia 0,004 5,000

109

APÊNDICE 3. Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na câmara pulpar.

(conclusão)

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Enterococcus faecalis Prevotella intermedia 0,004 5,000

Capnocytophaga ochracea Gemella morbillorum 0,004 5,000

Capnocytophaga ochracea Streptococcus mutans 0,004 5,000

Capnocytophaga ochracea Prevotella intermedia 0,004 5,000

Porphyromonas endodontalis Streptococcus oralis 0,000 4,500

Campylobater rectus Porphyromonas endodontalis 0,001 4,000

Veillonella parvula Porphyromonas endodontalis 0,001 4,000

Dialister pneumosintes Porphyromonas endodontalis 0,001 4,000

Treponema denticola Actinomyces odontolyticus I 0,004 4,000

Treponema denticola Eikenella corrodens 0,004 4,000

Prevotella nigrescens Actinomyces odontolyticus 0,004 4,000

Prevotella nigrescens Eikenella corrodens 0,004 4,000

Actinomyces oris Prevotella melaninogenica 0,003 3,333

Actinomyces oris Capnocytophaga sputigena 0,003 3,333

Porphyromonas endodontalis Streptococcus intermedius 0,002 3,000

Eubacterium nodatum Porphyromonas gingivalis 0,003 3,000

Fusobacterium nucleatum sp.

vincentii

Treponema denticola 0,003 3,000

Fusobacterium nucleatum sp.

vincentii

Prevotella nigrescens 0,003 3,000

Streptococcus intermedius Treponema denticola 0,003 3,000

Streptococcus intermedius Prevotella nigrescens 0,003 3,000

Campylobater rectus Streptococcus mitis 0,005 3,000

Streptococcus oralis Treponema denticola 0,007 2,333

Streptococcus oralis Prevotella nigrescens 0,007 2,333

110

APÊNDICE 4. Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na câmara pulpar

(continua)

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Streptococcus intermedius Prevotella melaninogenica 0,000 0,071

Streptococcus intermedius Capnocytophaga sputigena 0,000 0,071

Prevotella melaninogenica Streptococcus mitis 0,000 0,077

Porphyromonas endodontalis Actinomyces israelli 0,000 0,091

Campylobater rectus Streptococcus gordonii 0,000 0,125

Porphyromonas gingivalis Fusobacterium nucleatum sp.

vincentii

0,003 0,125

Porphyromonas gingivalis Streptococcus intermedius 0,003 0,125

Eubacterium nodatum A actinomycetencomytans (a+b) 0,001 0,143

Streptococcus intermedius Fusobacterium nucleatum sp.

polymorphum

0,001 0,143

Streptococcus intermedius Streptococcus mitis 0,001 0,143

Prevotella melaninogenica Filifactor alocis 0,000 0,154

Capnocytophaga sputigena Filifactor alocis 0,000 0,154

Porphyromonas gingivalis Streptococcus oralis 0,007 0,188

Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica 0,007 0,188

Porphyromonas gingivalis Capnocytophaga sputigena 0,007 0,188

Treponema denticola Prevotella melaninogenica 0,007 0,188

Treponema denticola Capnocytophaga sputigena 0,007 0,188

Prevotella nigrescens Prevotella melaninogenica 0,007 0,188

Prevotella nigrescens Capnocytophaga sputigena 0,007 0,188

Treponema Socranskii Gemella morbillorum 0,001 0,200

Eubacterium saburreum Tannerella forsythia 0,001 0,200

Enterococcus faecalis Tannerella forsythia 0,001 0,200

111

APÊNDICE 4. Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies

bacterianas encontradas na câmara pulpar

(conclusão)

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Fusobacterium nucleatum sp.

vincentii

Porphyromonas endodontalis 0,002 0,214

Streptococcus intermedius Filifactor alocis 0,002 0,214

Streptococcus oralis Actinomyces israelli 0,003 0,231

Campylobater rectus Staphylococcus epidermidis 0,001 0,250

Porphyromonas endodontalis Gemella morbillorum 0,001 0,273

Filifactor alocis Prevotella intermedia 0,001 0,273

Actinomyces israelli Streptococcus gordonii 0,003 0,300

Enterococcus hirae Tannerella forsythia 0,003 0,333

A actinomycetencomytans (a+b) Campylobater rectus 0,005 0,333

A actinomycetencomytans (a+b) Gemella morbillorum 0,005 0,333

A actinomycetencomytans (a+b) Streptococcus mutans 0,005 0,333

Streptococcus mitis Gemella morbillorum 0,005 0,333

Streptococcus mitis Streptococcus mutans 0,005 0,333

Porphyromonas endodontalis Campylobacter showae 0,005 0,364

Porphyromonas endodontalis Streptococcus gordonii 0,005 0,364

Campylobater rectus Eubacterium saburreum 0,004 0,375

Campylobater rectus Capnocytophaga ochracea 0,004 0,375

Eubacterium saburreum Parvimonas micra 0,009 0,400

112

APÊNDICE 5. Associações positivas significantes (p<0,01) entre as espécies bacterianas

encontradas no canal radicular.

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Porphyromonas gingivalis Streptococcus intermedius 0,001 72,000

Campylobater rectus Veillonella parvula 0,009 8,500

Veillonella parvula Streptococcus intermedius 0,001 7,500

Capnocytophaga sputigena Filifactor alocis 0,000 6,500

Treponema denticola Eikenella corrodens 0,000 6,000

A actinomycetencomytans (a+b) Streptococcus oralis 0,000 5,500

Streptococcus oralis Eikenella corrodens 0,008 2,250

113

APÊNDICE 6. Associações negativas significantes (p<0,01) entre as espécies bacterianas

encontradas no canal radicular.

Primeira espécie Segunda espécie Significância

(valor de p)

Valor do

ODDS

Treponema denticola Actinomyces odontolyticus 0,000 0,071

A actinomycetencomytans (a+b) Streptococcus intermedius 0,000 0,222

Fusobacterium nucleatum sp.

polymorphum

Streptococcus mitis 0,004 0,250

Porphyromonas gingivalis Veillonella parvula 0,001 0,286

Actinomyces odontolyticus I Filifactor alocis 0,005 0,308

Streptococcus oralis Streptococcus intermedius 0,005 0,364

Porphyromonas gingivalis Fusobacterium nucleatum sp.

polymorphum

0,007 0,429

Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica 0,007 0,429

Streptococcus intermedius Prevotella melaninogenica 0,007 0,429

Eubacterium nodatum Veillonella parvula 0,008 0,444

A actinomycetencomytans (a+b) Veillonella parvula 0,008 0,444

114

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

1 A. actinomycetencomytans, A. israelli,

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. alocis,

F. periodonticum, G. morbillorum, N. mucosa,

P. micra, P. endodontalis, P. gingivalis, P.

intermedia, P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. denticola, T.

forsythia, T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. israelli

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum,

E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, S. epidermidis,

S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. mutans,

S. oralis, T. forsythia, T. socranskii,

V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

C. sputigena, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii,

F. periodonticum, G. morbillorum, P. micra,

P. gingivalis, P. intermedia, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

2 A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E.

saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. pidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. denticola, T. socranskii,

V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. israelli

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. odontolyticus, A. oris, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans,

T. forsythia, T. denticola, T. socranskii

115

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

3 A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. corrodens, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii,

F. periodonticum, G. morbillorum, N. mucosa,

P. micra, P. endodontalis, P. gingivalis,

P. intermedia, P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. oris, C. rectus,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum,

E. saburreum, F. alocis, G. morbillorum,

P. micra, P. intermedia, P. melaninogenica,

S. epidermidis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans,

T. forsythia, T. socranskii, V. parvula

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. gingivalis,

P. intermedia, P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, T. forsythia, V. parvula

4

A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. gingivalis, C. ochracea,

D. pneumosintes, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. periodonticum, G. morbillorum, N. mucosa,

P. micra, P. endodontalis, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. israelli,

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. gingivalis, P. intermedia, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. denticola, T. socranskii,

V. parvula

A. oris, C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. intermedia,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. mitis, S. mutans, T. forsythia, T. socranskii

116

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

5 A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum,

E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

P. micra, T. forsythia

A. israelli, A. oris, C. showae, C. ochracea,

D. pneumosintes, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. intermedia, P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans,

T. forsythia, T. socranskii

6 A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum,

E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

C. ochracea, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. saburreum, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum, P. micra,

P. intermedia, S. epidermidis, S. mutans,

T. forsythia

C. ochracea, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. vincentii,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. intermedia, P. nigrescens, S. epidermidis,

S. gordonii, S. mutans, T. forsythia,

T. socranskii

117

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

7 A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum,

E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. periodonticum, G. morbillorum, N. mucosa,

P. micra, P. endodontalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, T. denticola, T. socranskii,

V. parvula

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, F. nucleatum

sp. nucleatum, F. nucleatum sp. polymorphum,

P. micra, T. forsythia, V. parvula

A. oris, C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

C. sputigena, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. intermedia, P. nigrescens, S. epidermidis,

S. gordonii, S. mitis, S. mutans, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

8

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. periodonticum, G. morbillorum, N. mucosa,

P. micra, P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. socranskii,

V. parvula

C. showae, C. ochracea, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. periodonticum, G. morbillorum, P. micra,

P. intermedia, S. epidermidis, T. forsythia,

T. socranski

A. actinomycetencomytans, A. oris, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, G. morbillorum,

P. micra, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, T. forsythia, T. socranskii,

V. parvula

118

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

9

A. actinomycetencomytans, A. israelli,

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. israelli,

C. showae, C. rectus, C. ochracea,

D. pneumosintes, E. faecalis, E. faecium,

E. nodatum, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. intermedia, S. epidermidis, S. gordonii,

S. mutans, S. oralis, T. forsythia, V. parvula

A. actinomycetencomytans, C. rectus,

C. ochracea, C. sputigena, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, G. morbillorum,

P. micra, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. socranskii,

V. parvula

10 A. actinomycetencomytans, A. israelli

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

C. showae, C. rectus, C. ochracea, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum, P. micra,

P. intermedia, S. epidermidis, S. gordonii,

S. mutans, T. forsythia

A. actinomycetencomytans, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum,

E. saburreum, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, G. morbillorum,

P. micra, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

119

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

11

A. israelli, A. odontolyticus, A. oris, C. showae,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. intermedia, P. nigrescens, S. epidermidis,

S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. mutans,

S. oralis, T. forsythia, T. denticola,

T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. israelli, A. oris,

C. showae, C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

C. sputigena, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

C. showae, C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

C. sputigena, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, G. morbillorum,

P. micra, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans,

T. forsythia, T. socranskii, V. parvula

12

A. actinomycetencomytans, A. israelli,

A. odontolyticus, A. oris, C. showae,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. gingivalis, P. intermedia, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans,

S. oralis, T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, C. showae,

C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. periodonticum, G. morbillorum, P. micra,

S. epidermidis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans,

T. forsythia, T. socranskii

A. israelli, C. ochracea, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum, P. micra,

P. intermedia, S. epidermidis, S. gordonii

120

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

13 A. actinomycetencomytans, A. israelli,

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. israelli,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis, C.

ochracea, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. intermedia, S. epidermidis, S. gordonii,

S. mutans, T. forsythia, T. socranskii,

V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. corrodens, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

14

A. actinomycetencomytans, A. israelli

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. israelli, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. ochracea, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

S. epidermidis, S. gordonii, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. corrodens, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. gingivalis, P. intermedia, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. denticola, T. socranskii,

V. parvula

121

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

15

A. actinomycetencomytans, A. israelli, A. oris,

C. showae, C. rectus, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. intermedia,

S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. mutans,

S. oralis, T. socranskii, V. parvula

D. pneumosintes, E. faecium, F. periodonticum,

P. micra

A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. corrodens, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. gingivalis, P. intermedia, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. denticola, T. socranskii,

V. parvula

16 A. actinomycetencomytans, A. israelli

A. oris, C. showae, C. rectus, C. ochracea,

C. sputigena, D. pneumosintes, E. corrodens,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. nodatum,

E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. periodonticum, G. morbillorum, N. mucosa,

P. micra, P. endodontalis, P. gingivalis,

P. intermedia, P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. israelli, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. periodonticum, G. morbillorum, P. micra,

P. endodontalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. socranskii, V. parvula

C. showae, C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

C. sputigena, D. pneumosintes, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. gingivalis,

P. intermedia, P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, T. forsythia, V. parvula

122

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

17 A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. corrodens, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. mitis, S. mutans,

S. oralis, T. forsythia, T. socranskii, V. parvula

A. israelli, C. gingivalis, C. ochracea,

D. pneumosintes, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. periodonticum, S. gordonii

A. actinomycetencomytans, C. showae,

C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

18 A. actinomycetencomytans, A. israelli

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

F. nucleatum sp. nucleatum

A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. corrodens, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. gingivalis, P. intermedia, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. denticola, T. socranskii,

V. parvula

123

Apêndice 7. Quadro de espécies bacterianas, por caso de insucesso coletado, nos três sítios estudados (saliva, câmara pulpar e canal

radicular), investigadas pelo checkerboard.

Casos Saliva Câmara pulpar Canal radicular

19 A. actinomycetencomytans, A. israelli,

A. odontolyticus, A. oris, C. showae, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. corrodens, E. faecalis,

E. faecium, E. hirae, E. nodatum, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, N. mucosa, P. micra,

P. endodontalis, P. gingivalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. denticola, T. socranskii, V. parvula

A. israelli, A. odontolyticus, A. oris, C. showae,

C. rectus, C. gingivalis, C. ochracea,

C. sputigena, D. pneumosintes, E. corrodens,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. alocis, F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. intermedia, O. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans,

S. oralis, T. forsythia, T. denticola, V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

A. oris, C. showae, C. rectus, C. gingivalis,

C. ochracea, C. sputigena, D. pneumosintes,

E. corrodens, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. gingivalis, P. intermedia, P. melaninogenica,

P. nigrescens, S. epidermidis, S. gordonii,

S. intermedius, S. mitis, S. mutans, S. oralis,

T. forsythia, T. denticola, T. socranskii,

V. parvula

20 A. actinomycetencomytans, A. odontolyticus,

C. showae, C. rectus, C. ochracea, C. sputigena,

D. pneumosintes, E. faecalis, E. faecium,

E. hirae, E. nodatum, E. saburreum, F. alocis,

F. nucleatum sp. nucleatum,

F. nucleatum sp. polymorphum,

F. nucleatum sp. vincentii, F. periodonticum,

G. morbillorum, P. micra, P. endodontalis,

P. gingivalis, P. intermedia, P. melaninogenica,

S. epidermidis, S. gordonii, S. intermedius,

S. mitis, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

A. oris, C. showae, C. gingivalis, E. faecium,

F. nucleatum sp. nucleatum, F. periodonticum,

V. parvula

A. actinomycetencomytans, A. oris, C. rectus,

C. gingivalis, C. ochracea, D. pneumosintes,

E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. saburreum,

F. nucleatum sp. vincentii, G. morbillorum,

P. micra, P. endodontalis, P. intermedia,

P. melaninogenica, P. nigrescens, S. gordonii,

S. intermedius, S. mutans, S. oralis, T. forsythia,

T. socranskii, V. parvula

124

ANEXO 1 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP