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Preservação de Germoplasma Vegetal, comÊnfase na Conservação in Vitro deVariedades de Mandioca

Introdução

O melhoramento genético de plantas tem contribuído sobremaneira para o aumento daprodução em diversas espécies de grande importância econômica e/ou social,beneficiando bilhões de pessoas, especialmente de menor poder aquisitivo, que vivemem países em desenvolvimento distribuídos por todo o mundo. Esses aumentos naprodução resultam da obtenção de novos genótipos, que apresentam rendimentos maiselevados, adaptados a diversas condições ecológicas, muitas das vezes adversas, eresistentes a pragas e doenças. No entanto, para a geração desses materiaismelhorados, torna-se necessário que características de interesse sejam incorporadasàs novas cultivares, dentro de programas de melhoramento genético bem definidos, deforma que possam ser, ao final de todo o processo, exploradas comercialmente.

A base do melhoramento genético de qualquer espécie está na sua diversidadegenética, o que reflete em respostas a melhores práticas agronômicas e resistência/tolerância a diversos fatores bióticos e abióticos. A diversidade contida em umgermoplasma deve ser protegida contra eventuais perdas e assim garantir suautilização para o aumento da produtividade. Os recursos genéticos vegetais são umreservatório natural de genes com potencial de uso para a produção sustentável degêneros essenciais à humanidade, tais como alimentos, fibras e medicamentos.Infelizmente, essa biodiversidade vem sendo destruída de uma forma muito rápida,haja vista a exploração descontrolada dos recursos naturais dentro dos diferentesecossistemas (Santos, 2001). O mais interessante é que aspectos como a própriageração e utilização de novas cultivares ou híbridos com características melhoradas,bem como a adoção de tecnologias avançadas e modernas práticas agrícolas, acabamcontribuindo para uma forte erosão e perda de recursos genéticos que atinge asespécies em geral. Para Mafla et al. (1993), a diversidade genética torna-se cada vezmais importante devido à intensidade de monoculturas contínuas visando aumentar aprodução em todas as principais regiões produtoras do mundo.

A preocupação com a prevenção da erosão genética despertou o interesse pelaconservação do germoplasma vegetal há mais de 30 anos, de modo a protegê-lo deeventuais perdas e garantir sua utilização sempre que necessário. Os recursosgenéticos de plantas podem ser conservados na forma de sementes, pólen, órgãosvegetativos e plantios no campo. É essencial que o método de conservação garanta amáxima viabilidade e estabilidade genética dos acessos, e também que os materiaispossam ser conservados isentos de patógenos, em um local controlado e acessível, deforma a facilitar sua multiplicação e uso (CIAT, 1984).

A variabilidade genética das espécies, a exemplo da mandioca (Manihot esculentaCrantz), vem diminuindo gradativamente e o potencial risco de erosão genética, tanto

Cruz das Almas, BAJaneiro, 2009

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ISSN 1809-5011

AutoresAntônio da Silva Souza1

Eng. Agrônomo, D.Sc.,[email protected].

Fernanda Vidigal DuarteSouza1

Bióloga, D.Sc.,[email protected].

Janay Almeida dosSantos-Serejo1

Eng. Agrônoma, D.Sc.,[email protected].

Tatiana Góes Junghans1


Osvaldo Pereira da Paz2

Eng. Agrônomo, [email protected].

Angélica Virgínia ValoisMontarroyos3


Vanderlei da Silva Santos1

Eng. Agrônomo, D.Sc.,[email protected].

Lucymeire Souza Morais4

Eng. Agrônoma, M.Sc.,[email protected].

1Pesquisador, Embrapa Mandioca eFruticultura Tropical.

2Assistente de Pesquisa, EmbrapaMandioca e Fruticultura Tropical.

3Bolsista da FACEPE/IPA.4Doutoranda em Biotecnologia da

UEFS.

2 Preservação de Germoplasma Vegetal, com Ênfase na Conservação in Vitro de Variedades de Mandioca

do germoplasma de material cultivado como desilvestre, pode ser atribuído a fatores comodesmatamentos incontrolados, incorporação de terraspara a agricultura em áreas de diversidade genética eavanço crescente das cidades e áreas industriais.Todos estes aspectos se agravam quando os bancos degermoplasma possuem um número muito elevado devariedades. Para se ter uma idéia dos riscos que umacoleção mantida sob condições de campo pode ter,entre 1980 e 1990 quase 60% dos acessos do bancode germoplasma de mandioca do NRCRI (National RootCrops Research Institute), em Umudike, Nigéria, seperderam devido ao ataque de pragas e doenças,ocorrência de incêndios e de condições adversas noclima (Mbanaso et al., 1993). Estes aspectos,associados à importância e necessidade davariabilidade genética para o melhoramento da cultura,justificam plenamente todos os esforços empreendidospara conservar o germoplasma de mandioca, umaeuforbiácea que desempenha um importante papelalimentar e social em diversas regiões tropicais domundo.

Adicionalmente, de modo geral, as espécies silvestrescontêm um grande número de características quepodem ser incorporadas às espécies cultivadas pormeio do melhoramento genético tradicional ou de

técnicas de engenharia genética. Devido ao potencialque possuem como fontes de características úteis parao melhoramento da mandioca, as espécies silvestres deManihot estão recebendo uma crescente atenção porparte das instituições de pesquisa, daí, inclusive, aimportância delas serem incorporadas a uma coleção invitro (Cabral et al., 2000). Um total de 397 genótiposde 29 espécies silvestres de Manihot está sendomantido in vitro no CIAT (Mafla et al., 1993), com oobjetivo principal de serem conservadas,intercambiadas e distribuídas entre instituições. NoBrasil existem 56% das 97 espécies silvestres deManihot já descritas para a América Latina. Asespécies silvestres de mandioca têm grande potencialcomo fonte de resistência a doenças e pragas, etolerância a fatores abióticos, além de abrirempossibilidades para a re-estruturação da arquitetura daespécie cultivada, tornando-a mais adequada àagricultura atual.

Nesta Circular pretende-se dar uma visão global dosprocedimentos de conservação de germoplasmavegetal que estão sendo estudados e/ou aplicados nosentido de evitar perdas de recursos genéticos (Fig. 1),enfatizando o sistema de preservação in vitro dogermoplasma de mandioca empregado na EmbrapaMandioca e Fruticultura Tropical.

Fig. 1. Esquema geral dos métodos de preservação do germoplasma vegetal.

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3Preservação de Germoplasma Vegetal, com Ênfase na Conservação in Vitro de Variedades de Mandioca

Métodos de conservação degermoplasma

A agricultura moderna utiliza variedades selecionadaspara alto rendimento e qualidade do produto dentro decada espécie, com um pequeno número de variedadesplantadas em áreas extensas, o que tem levado aoabandono das cultivares tradicionais (Navarro et al.,2005). Além disso, os desmatamentos incontrolados, aexpansão agrícola e o avanço crescente das cidades eáreas industriais estão provocando a perda de muitasespécies silvestres relacionadas com as cultivadas.Esta situação favorece uma forte erosão e perda derecursos fitogenéticos, que são o fruto de milhares deanos de evolução e que contêm os genes oucombinações de genes envolvidos com resistência apragas e doenças, tolerância a condições ambientaisadversas (salinidade, seca, temperaturas extremasetc.), produção e qualidade de alimentos, entre outroscaracteres.

As duas estratégias básicas de preservação degermoplasma, propostas como medidas de prevençãodo processo de erosão genética, são a conservação insitu e a conservação ex situ. Segundo Mroginski et al.(1991), os métodos alternativos empregados para aconservação do germoplasma de plantas superioressão ajustados de acordo com o sistema de propagaçãode cada espécie. Por exemplo, para fruteiras, como oabacaxizeiro [Ananas comosus (L.) Merril] e abananeira (Musa spp.), e espécies tropicais produtorasde raízes e tubérculos, como a mandioca, quenormalmente são propagadas de forma vegetativa, ossistemas de preservação mais recomendados são osbancos genéticos mantidos ex situ, no campo e/ou emlaboratório (in vitro).

Conservação in situ de germoplasmaConforme definições adotadas internacionalmente(Eira, 2001), a conservação in situ abrange: a) apreservação continuada de uma população nacomunidade à qual pertence e dentro do ambienteonde está adaptada; b) a manutenção e recuperaçãode populações viáveis de espécies em seusecossistemas e habitats naturais de ocorrência; e c) nocaso de espécies domesticadas ou cultivadas, apreservação naqueles locais onde tenham desenvolvidosuas propriedades características. Para Medeiros(2003), como os métodos alternativos de conservaçãode germoplasma são dispendiosos e de eficáciarelativa, a única forma segura de salvar espécies

vegetais, principalmente aquelas ameaçadas deextinção, é preservar os ecossistemas naturais em queelas vivem.

Conservação ex situ de germoplasmaA conservação ex situ do germoplasma implica namanutenção das espécies em locais diferentesdaqueles aos quais estão adaptadas, ou seja, fora deseus habitats naturais (Eira, 2001). Há mais de 20anos atrás, Reynolds (1987) estimou que mais de1.200 instituições em todo o mundo mantinham algumtipo de coleção ex situ. Essas coleções são chamadasde ativas e as instituições que as mantêm sãoresponsáveis por: a) garantir sua diversidade (seja pelainiciativa de coletar periodicamente recursosgenéticos, seja por favorecer o intercâmbio com outrosbancos de germoplasma); b) multiplicá-las; c) distribuí-las aos usuários; e d) promover sua caracterização pordiferentes metodologias (Vieira, 2000).

Nesse caso, a depender do material (sementes,embriões, outras estruturas vegetais, indivíduoscompletos etc.), a manutenção é realizada emcondições distintas, tais como: a) campo e casa devegetação; b) câmara com temperatura e umidaderelativa baixas; c) in vitro, em meio de cultura combaixa concentração salina; e d) sob criopreservação.

Conservação a campo e casa devegetaçãoPara várias espécies vegetais, entre elas muitasfrutíferas, florestais e palmáceas, não se dispõe desistemas eficientes de conservação de germoplasma,além da preservação das plantas no campo, in vivo. Noentanto, a manutenção de bancos de germoplasma emcondições de campo tem como desvantagem a suavulnerabilidade a uma série de fatores, tais como aerosão genética devido à não adaptação das espécies evariedades às novas condições ambientais, à contínuaexposição ao ataque de pragas, doenças e predadoreseventuais, intempéries climáticas, problemas edáficose vandalismo, podendo os acessos serem perdidosainda por falhas na identificação devidas a errohumano ou por problemas de cunho técnico-administrativo (Empresa Pernambucana de PesquisaAgropecuária, 1991; Mroginski et al., 1991, Brison etal., 1995; Eira, 2001). Aliado a tudo isso, o tradicionalmétodo de conservação de germoplasma no camporequer um elevado custo financeiro operacional,notadamente em relação à grande quantidade de mão-de-obra empregada no plantio inicial e subsequentes


replantios, bem como nas capinas, fertilização etratamentos contra pragas e doenças. Esses problemaspodem ser intensificados a depender da espécie,quando um maior espaço físico pode ser necessário,demandando um enorme trabalho, a exemplo do queacontece com plantas lenhosas (Matsumoto et al.,2001). Todos estes aspectos, portanto, justificam queo desenvolvimento de técnicas alternativas deconservação dos recursos genéticos, de preferência alongo prazo, torne-se uma importante prioridade.

Segundo Vieira (2000), são mantidas vegetativamentea campo ou casa de vegetação as coleções de plantascom elevada heterozigosidade, períodos juvenis muitolongos, baixa produção de sementes, sementes queapresentam viabilidade reduzida e sementes cujaviabilidade ocorre por pouco tempo. Entre essasespécies encontram-se a batata (Solanum tuberosumL.), a batata-doce (Ipomea batatas L. Lam) e amandioca, que se multiplicam exclusivamente porpropagação vegetativa, e a banana que, além disso,não produz sementes viáveis. Tais espécies sãogeralmente conservadas em coleções no campo ou emcasa de vegetação, uma metodologia que apesar deeficiente, assegura a manutenção do germoplasmaapenas por um período de tempo considerado de curtoa médio prazo (Santos, 2001).

No caso específico da mandioca, a manutençãoconvencional dos bancos de germoplasma é feitamediante o cultivo contínuo no campo. Cadarenovação de um banco de germoplasma de mandiocase realiza freqüentemente com manivas oriundas docultivo anterior, as quais devem ser logo plantadaspara evitar que germinem e surjam brotaçõesprematuras, assim como o ataque de insetos e/oupatógenos. É interessante salientar que os sistemas depropagação vegetativa da mandioca via estacasacabam favorecendo a transmissão de pragas edoenças através de gerações sucessivas.

Conservação em câmara com temperaturae umidade relativa baixasEste é o sistema de conservação de germoplasma maisempregado para os indivíduos que se propagamsexuadamente, pois é por meio da semente que amaioria das espécies de plantas superiores semultiplica. O armazenamento visa proteger a sementeda deterioração e de danos, minimizar a perda dopoder germinativo e do vigor, bem como manter aidentidade da semente, sua condição física e pureza.

Com isso, os denominados bancos de sementesprevinem e evitam a perda de valiosos recursosgenéticos, conservando, devidamente caracterizadas eavaliadas, as coleções de germoplasma, que podem,então, ser exploradas em programas de melhoramento.Diante disso, as sementes se constituem na formamais comum de conservação ex situ, desde que nãoocorra uma alta taxa de perda da viabilidade após umlongo período de armazenamento sob baixatemperatura e baixo nível de umidade (Eira, 2001).

A metodologia convencional de conservação desementes empregada em bancos de germoplasmacompreende a desidratação, para teores de umidadeextremamente baixos (até cerca de 5% do teor inicial),e o armazenamento em câmaras com temperaturaabaixo de zero (-18 a -20°C). As sementes de muitasespécies vegetais mantêm alta taxa de viabilidade apóso armazenamento nessas condições por um longoperíodo de tempo, e são classificadas como ortodoxas,de acordo com a proposta formulada por Roberts em1973 (Santos, 2001). Como exemplos de espécies quepossuem sementes ortodoxas podem ser consideradosa graviola (Annona muricata L.), o murici [Byrsonimacrassifolia (L.) Rich], a aroeira-verdadeira(Myracrodruon urundeuva Fr. All.), o biribá [Rolliniamucosa (Jacq.) Baill.], o araçá pêra (Psidiumacutangulum DC), o araticum (Rollinia rugulosa Schl.) eo taperebá (Spondias mombin L.).

No entanto, sementes sensíveis à desidratação e aocongelamento, denominadas recalcitrantes, comunsem certas espécies aquáticas, em plantas queproduzem sementes grandes, em numerosas espéciesarbóreas e arbustivas, economicamente importantes enativas de regiões tropicais e subtropicais, bem comoem algumas arbóreas originadas de áreas temperadas,sofrem danos e perdem o poder germinativo quandoarmazenadas nas condições mencionadasanteriormente. São exemplos de plantas que possuemsementes recalcitrantes o dendê [Elaeis oleifera(Kunth.) Cortes], o coco (Cocus nucifera L.), aseringueira (Hevea brasiliensis M. Arg.), o cacau(Theobroma cacao L.), a mangueira (Mangifera indicaL.), a araucária [Araucaria angustifolia (Bert.) O.Kuntze], o açaí (Euterpe oleracea Mart.), o bacuri(Platonia insignis Mart.) e a pupunha (Bactris gasipaesKunth), as quais, sob temperatura e umidade relativabaixas, mantêm uma viabilidade que varia entre poucassemanas e alguns meses, o que, considerando-se oenfoque conservação de germoplasma, pode serconsiderado um período de tempo muito curto.


Existem ainda outras espécies de plantas, a exemplodo café (Coffea spp.), mamão (Carica papaya L.),jenipapo (Genipa americana L.) e citros (Citrus spp.),cujas sementes podem tolerar uma desidratação aténíveis relativamente baixos do teor de umidade, porémsofrem danos quando expostas por tempo prolongado atemperaturas próximas e abaixo de zero apósdesidratadas para teores de umidade inferiores a 7%.Sementes que apresentam este comportamento foramclassificadas como intermediárias por Ellis ecolaboradores em 1990, conforme Eira (2001).

Com os problemas que apresentam em relação àdesidratação e ao congelamento, torna-se necessário,portanto, o desenvolvimento de sistemas alternativosde conservação para as espécies que produzemsementes recalcitrantes e intermediárias.

Conservação in vitroConforme visto anteriormente, algumas espécies deplantas necessitam de procedimentos de conservaçãoalternativos. Este é o caso de espécies que apresentamsementes não-ortodoxas, se multiplicamexclusivamente por propagação vegetativa, já que nãoproduzem sementes viáveis ou apresentam intensaheterozigosidade ou elevada segregação, resultandoem expressão de caracteres indesejáveis na população,e também de espécies arbóreas de grande porte quedemoram muitos anos para passar do estádio juvenil àfase adulta reprodutiva. Para situações como essas, omais indicado é não utilizar a semente para aconservação do germoplasma, substituindo-a poroutros propágulos. Por exemplo, uma das alternativaspara a conservação do germoplasma de espécies comsementes recalcitrantes seria a criopreservação deembriões (Withers & Williams, 1998).

Diante da possibilidade de se obter plantas completas apartir do cultivo de células, tecidos ou órgãos, é que seatentou para as possibilidades que as técnicas in vitropoderiam ter na conservação dos recursosfitogenéticos, constituindo-se em alternativas valiosaspara a manutenção de coleções de plantas que podemser incorporadas em programas de melhoramentovegetal, especialmente de espécies tropicais. Aconservação in vitro se baseia no cultivo de coleçõesem laboratório, devendo ser considerada como partede uma estratégia geral de preservação de plantascom sementes recalcitrantes, que apresentam baixaviabilidade ou número reduzido (Vieira, 2000), e quenormalmente são propagadas vegetativamente. ParaGiacometti & Goes (1986), no armazenamento de

germoplasma in vitro é indispensável que se obtenhamculturas de uma ampla gama de genótipos em cadaespécie, a fim de que se conserve a maior variabilidadegenética possível, o que se complica quando se incluemespécies silvestres arbóreas.

O desenvolvimento de métodos de conservação in vitropara proteger espécies com riscos de extinção eparalelamente apoiar trabalhos com germoplasmas queapresentam problemas de preservação é um temaprioritário na área de recursos genéticos. Aconservação in vitro envolve a manutenção de plantasem laboratório, mediante subculturas periódicas desegmentos apicais e nodais. Esta técnica tem sidoaplicada com sucesso para a conservação denumerosas espécies de importância econômicarelevante, tanto oriundas de regiões temperadas comodos trópicos, tais como morango (Fragaria spp.),banana, mandioca, batata e batata-doce. Entretanto,os sistemas in vitro não eliminam a importância de semanter clones sob condições in vivo. No caso deespécies silvestres de mandioca por exemplo, Goes etal. (2000) recomendam a duplicação da coleção invitro em coleção dinâmica no campo, pois, destaforma, além de todas as vantagens da conservaçãodinâmica, cria-se a possibilidade de obtenção desementes de alta qualidade. São, portanto, coleçõesque se complementam e ambas podem se constituirem bancos ativos, apesar de ser dispendioso mantê-las,principalmente em locais distintos (Vieira, 2000).Apenas ocasionalmente o armazenamento in vitro seriaa única estratégia para conservar uma determinadaespécie (Roca et al., 1991).

Existe uma grande diversidade potencial de tipos detecidos de uma planta (explantes) que pode ser usadapara o estabelecimento de um sistema de conservaçãoin vitro. Em geral, o uso de métodos in vitro para aconservação de germoplasma inclui os seguintespassos: a) excisão do tecido ou órgão da planta-matriz;b) estabelecimento em meio nutritivo; c) conservaçãomediante um método apropriado; d) recuperação detecido viável oriundo da conservação; e e) regeneraçãode plantas (CIAT, 1984).

Para CIAT (1984) e Villalobos & Engelmann (1995),qualquer sistema de cultura de tecidos empregado paraa conservação in vitro deve atender duas exigências:

1) Garantia da estabilidade genética do materialpreservado - como um dos principais objetivos daconservação de germoplasma é manter a diversidade


genética das espécies em uma condição estável, nastécnicas de preservação usadas não se deve por emrisco a estabilidade genética dos acessos. Istonormalmente é alcançado pela cultura de meristemasapicais, que são tecidos ideais para a conservação porcausa da estabilidade genética e potencial morfogênicoem comparação com outros tecidos e células isoladas.

2) Implementação de protocolos bem definidos - taisprotocolos assegurariam uma alta porcentagem derecuperação de plantas a partir do materialarmazenado de uma ampla gama de germoplasmas.Quanto a este aspecto, deve-se considerar que osfatores determinantes para uma boa resposta naregeneração de plantas são as condições ambientais eo genótipo.

O processo de preservação in vitro apresenta diversasvantagens sobre o processo de conservação degermoplasma no campo, e dentre elas destacam-se: a)a necessidade de menor espaço para dispor o material;b) a manutenção de material vegetal livre de pragas epatógenos; c) a disponibilidade de material para serimediatamente propagado; d) a redução dos custos demanutenção; e) a alta taxa de multiplicação,independentemente de condições climáticas; f) aredução da erosão genética; e g) a simplificação eeficiência do processo de intercâmbio de germoplasma(Eira, 2001; Fortes & Pereira, 2001). Villalobos &Engelmann (1995) consideram ainda como vantagem ofato de que em plantas com ciclos reprodutivos curtos,como algumas espécies que produzem raízes etubérculos, e outras anuais, os intervalos detransferência in vitro são menos frequentes que o ciclono campo. Além disso, para Casazza et al. (2002), aaplicação de técnicas de micropropagação naconservação de espécies em extinção tem provado serútil para uma extensiva gama de espécies. A culturade tecidos pode produzir uma grande quantidade deplantas a partir de um mínimo de material vegetaloriginal, o que representa um baixo impacto napopulação nativa em extinção. Ademais, as plantasmicropropagadas podem ser usadas para suplementaro estoque natural de populações de plantas silvestres.

Considerando-se os aspectos expostos anteriormente,verifica-se por outro lado que a conservação in vitro degermoplasma passa por riscos como também acontececom as coleções em campo. Portanto, além dascontaminações, outros problemas acometem umacoleção in vitro e medidas como as que se seguem

devem ser adotadas para mantê-la de maneiraeficiente:

1) Manusear cuidadosamente os acessos durante assubculturas para evitar que ocorram misturas devariedades devido a erros de identificação.

2) Monitorar frequentemente o crescimento dasplantas in vitro para detectar a ocorrência deanormalidades, inclusive de genótipos variantes devidoao fenômeno da variação somaclonal.

3) Limpar de modo assíduo a sala de conservação, deforma a torná-la um ambiente com a maior condiçãoasséptica possível.

4) Evitar ao máximo a circulação de pessoas na sala deconservação, tornando seu acesso restrito aostécnicos vinculados ao laboratório e eventualmenteàquelas pessoas interessadas no tema.

5) Inspecionar regularmente os aparelhos que regulamas condições do ambiente da sala de conservação,principalmente os condicionadores de ar e o timer,responsáveis, respectivamente, pelo controle datemperatura e do fotoperíodo, de maneira a detectar aocorrência de acidentes ou falhas no funcionamentodesses equipamentos. Existem laboratórios quepossuem dispositivos eletrônicos, tanto na sala deconservação de germoplasma como de crescimentodas culturas, que disparam algum tipo de alarme tãologo aconteçam alterações bruscas e fortes nascondições ambientais, notadamente na elevação datemperatura.

Outras desvantagens de um banco de germoplasma invitro estão relacionadas com a necessidade deconstrução de instalações e a exigência de mão-de-obra especializada para o manuseio dos acessos.

Qualquer que seja o método adotado, a conservaçãode plantas in vitro se consegue mediante alterações nomeio nutritivo e ambiente de cultivo, principalmenteem relação à temperatura e intensidade luminosa, deforma a aumentar ao máximo o período entre assubculturas ou estendê-lo indefinidamente (Roca et al.,1991). Com isso, reduz-se a quantidade de mão-de-obra para o manuseio do material, o espaço físiconecessário para acondicionar as plantas e os riscos deocorrência de contaminações fúngicas e bacterianas,além de proporcionar ao melhorista acesso imediato a


todo o germoplasma da coleção ou pelo menos aaqueles genótipos que sejam de maior interesse para oprograma de melhoramento.

Como métodos de conservação in vitro degermoplasma, podem-se considerar os seguintes:

a) Crescimento Contínuo a Taxas NormaisEste método consiste apenas em extrair gemas apicaise laterais a partir de plantas cultivadas in vitro, antesque entrem em senescência, subcultivando ossegmentos em meio normalmente empregado namultiplicação do material, que é mantido sob condiçõesambientais propícias para a brotação edesenvolvimento dos explantes. No entanto, devido aocrescimento rápido dos cultivos, como geralmenteacontece, este método exige uma maior quantidade demão-de-obra e aumenta a possibilidade de perdas dosacessos por acidentes ou contaminações microbianascom as repetições mais frequentes das subculturas.Diante destes aspectos, para Malaurie et al (1998)este sistema é satisfatório apenas para a preservaçãotemporária de coleções e apoio ao intercâmbio degermoplasma.

b) Supressão Total do Metabolismo e Cresci-mento Celulares (Criopreservação)Santos (2001) considera que nenhuma das diferentesmetodologias existentes e em prática, no momento,para conservação do germoplasma vegetal, permitepreservar a longo prazo, com alta estabilidade genéticae biológica, espécies que são vegetativamentepropagadas ou que produzem sementes recalcitrantesou intermediárias. Portanto, torna-se necessário odesenvolvimento de sistemas de conservação a longoprazo de estruturas organizadas de plantas quepertençam aos grupos daquelas espécies, até porquesempre existe um maior ou menor risco deinstabilidade citogenética quando o germoplasma éconservado por muito tempo mediante técnicas decultivo in vitro de tecidos vegetais (CIAT, 1984).

Pelas razões expostas, esforços têm sido efetuadospara desenvolver procedimentos de conservação degermoplasma a temperaturas ultrabaixas oucriopreservação. No passado, a criobiologia foi voltadapara a preservação de frutas, hortaliças e outraspartes da planta. Esse procedimento permitiu que omaterial fosse preservado e tivesse ampliado o seutempo de conservação. Agora é possível estender osmétodos criobiológicos para a conservação de

germoplasma vegetal. Deter o estado de animação,reduzindo consideravelmente ou paralisando tanto osprocessos metabólicos como a deterioração celular, epreservar indefinidamente o genoma vegetal, sãoagora os principais objetivos desta ciência. Acriopreservação é uma técnica que permite manter omaterial biológico em nitrogênio líquido (-196°C) ou emsua fase de vapor (-150°C) por longos períodos detempo, uma vez que a essas temperaturas ultrabaixasprocessos como respiração e atividades enzimáticassão inativados (Withers & Williams, 1998), paralisandocompletamente o metabolismo celular nos explantes(Brison et al., 1995), incluindo as divisões celulares(Giacometti & Goes, 1986). Apesar de ser aindaconsiderado um método dispendioso e de eficáciarelativa para muitas espécies (Medeiros, 2003), trata-se de um sistema não-letal de conservação de tecidosbiológicos de maneira estável por animação suspensa.Muita controvérsia existe em relação à viabilidade demateriais preservados em nitrogênio líquido,principalmente pelos problemas que surgem com acomplexidade técnica e biológica dos processos decongelamento e descongelamento (Withers & Williams,1990). No entanto, vários trabalhos não têm mostradodeclínio na viabilidade, a exemplo do estudodesenvolvido por Wang et al. (2005), que mantiveramápices caulinares de mamão em nitrogênio líquidodurante dois anos e não detectaram nenhum efeitonegativo na regeneração de plantas. Além disso,acredita-se que o material criopreservado permanecegeneticamente estável.

c) Limitação do Crescimento para TaxasMínimasNeste sistema, que pode até ser considerado como umbanco ativo de germoplasma in vitro, brotos e plantas,derivados diretamente de ápices meristemáticos egemas laterais, são mantidos em condições físicas(fatores ambientais) e/ou químicas (composição dosmeios de cultura) que permitem estender ao máximo ointervalo das transferências para meios novos, semafetar a viabilidade e estabilidade genética dos cultivos(Roca et al., 1991). Inclusive, durante os subcultivoshá a possibilidade de selecionar explantes maisvigorosos, que darão origem a plantas de melhorqualidade para a manutenção in vitro.

Apesar de que diferentes tipos de explantes possamser empregados na conservação in vitro degermoplasma vegetal, dá-se preferência aos tecidosmeristemáticos devido às seguintes razões: a) as


probabilidades de ocorrência de mudanças genéticassão menores, já que a limitação da taxa decrescimento do material armazenado pode ter umefeito benéfico sobre a estabilidade da cultura, desdeque diminuindo a taxa de divisão celular deve-sereduzir a freqüência das mutações que ocorremdurante a duplicação de DNA na fase mitótica do ciclocelular; b) o germoplasma conservado está livre depatógenos; c) os meristemas são, freqüentemente, osexplantes mais apropriados para a micropropagação; ed) ocorre maior facilidade e segurança nosprocedimentos de intercâmbio e utilização imediata dogermoplasma (Mroginski et al., 1991; Villalobos &Engelmann, 1995; Vieira, 2000).

Em termos de fatores físicos e químicos que podem sermanipulados para limitar o crescimento das plantas invitro, os mais importantes, respectivamente, são atemperatura e a intensidade luminosa, e os meios decultura com concentrações mais baixas ou até mesmoomissão de elementos nutritivos e suplementados comagentes osmóticos e inibidores de crescimento.

Na manipulação desses fatores, a limitação docrescimento pode ser conseguida na maioria dos casoscom a redução da temperatura e da luminosidade dasala de conservação. A redução da temperatura para0-6°C e 15-20°C pode diminuir a taxa de crescimentoin vitro de muitas espécies de clima temperado e deplantas tropicais e subtropicais, respectivamente. Adiminuição da intensidade luminosa, por sua vez,também afeta a taxa de crescimento das plantas coma redução das exigências fotossintéticas e,consequentemente, do metabolismo celular.

Baixas concentrações de sais minerais e de sacarose,que são fatores essenciais para o crescimento dasplantas, também podem limitá-lo. A adição ao meio decultura de manitol ou sorbitol, como agentes de efeitoosmótico, reduzem a absorção de elementos mineraispelas células em função da pressão osmótica e, dessemodo, limita o crescimento das plantas.

Quanto aos inibidores de crescimento, a exemplo doácido abscísico (AAB), cuidados devem ser tomadosem relação ao seu uso, já que podem produzirmudanças fisiológicas ou gerar mutações, e assimameaçar a estabilidade genética dos materiaisconservados in vitro (Giacometti & Goes, 1986;Golmirzaie & Toledo, 1998).

O importante é que todos os procedimentos aplicadospara minimizar a taxa de crescimento sejam tambémcapazes de manter a máxima viabilidade dos cultivos,haja vista que uma alta eficiência de regeneraçãofacilita o desenvolvimento do ciclo seguinte deconservação. Esta viabilidade está também associadacom o genótipo, já que as variedades diferem emrelação à tolerância a temperaturas mais baixas.

O método de limitação do crescimento dos cultivos ataxas mínimas é o empregado no momento na EmbrapaMandioca e Fruticultura Tropical, em Cruz das Almas-BA, cujos detalhes serão mostrados na segunda partedesta Circular.

Estabilidade genética do germoplasmaconservado in vitroEm diversos métodos de propagação in vitro de plantastêm-se observado a ocorrência de alteraçõesgenéticas, que podem variar em um maior ou menorgrau em função da interação entre o sistema decultura de tecidos (composição do meio nutritivo,ambiente físico de cultivo etc.), a fonte de explanteempregada e o genótipo. A cultura de ápicescaulinares (meristema apical contendo 1 - 2 primórdiosfoliares), por exemplo, tem possibilitado altas taxas demultiplicação de muitas espécies vegetais, mantendo aestabilidade genética dos genótipos. No entanto,quando se trata da conservação in vitro degermoplasma, outro fator que também deve ser levadoem conta, no que diz respeito à estabilidade genéticados acessos, é a estratégia de preservação utilizada.

A estabilidade genética das culturas tem sido, durantemuito tempo, um motivo de inquietação quando sepensa em aplicar as técnicas in vitro para aconservação do germoplasma. Como sempre existe umrisco potencial de instabilidade citogenética quando ogermoplasma é mantido in vitro, é essencial que ocorraum monitoramento contínuo da estabilidade dasculturas. Assim, o monitoramento da estabilidadegenética in vitro de espécies cultivadas vem setornando uma questão prioritária, inclusive porquemuito pouco se conhece sobre estudos quantitativosrealizados em coleções armazenadas in vitro. Apenasum número limitado de artigos bem constituídosenfocam o efeito que o sistema da conservação invitro sob crescimento lento produz na estabilidadegenética do material vegetal preservado (Villalobos &Engelmann, 1995).


As possibilidades de alterações na estabilidadegenética do germoplasma estão associadas ao estádiode diferenciação do tecido em cultivo. Umaestabilidade relativamente alta está relacionada com acultura de tecidos organizados, que são menospropícios aos riscos do surgimento de variaçõessomaclonais, enquanto que explantes consideradoscomo desorganizados são normalmente sujeitos a umainstabilidade mais elevada. Entre as estruturasorganizadas destacam-se os meristemas, ápicescaulinares e gemas laterais como as mais estáveis,seguidas pelos embriões somáticos e gemasadventícias. Já os cultivos de células, protoplastos ecalos são considerados como os sistemas de cultura detecidos que apresentam maior instabilidade, ao menosteoricamente. De modo geral, os meristemas apicaissão os explantes particularmente apropriados para aconservação de germoplasma, haja vista o processoordenado de replicação cromossômica que apresentam(Giacometti & Goes, 1986), o que reflete em umasubstancial redução do risco de instabilidade genética,além, é claro, por se encontrarem livres demicroorganismos, requererem pouco espaço eapresentarem um alto potencial de propagação.

Em relação aos três métodos de conservação in vitrode germoplasma - Crescimento Contínuo a TaxasNormais, Limitação do Crescimento para TaxasMínimas e Supressão Total do Metabolismo eCrescimento Celulares - pode ocorrer mais ou menosvariações em função da formação e regeneração viagemas adventícias durante o período dearmazenamento. Na medida em que se reduz atemperatura de um tecido, o metabolismo celulardiminui até chegar a um estado de ‘suspensãoanimada’ quando a temperatura alcança níveisinferiores a -150°C. A esta temperatura, os processosbiológicos cessam e as possíveis causas deinstabilidade serão, então, minimizadas ou eliminadas(Roca et al., 1991), sendo que nenhuma modificaçãoque poderia ser atribuída à criopreservação já foidivulgada (Villalobos & Engelmann, 1995), o quedemonstra o potencial desta metodologia.

Sob condições de crescimento lento, as característicasmais importantes que são avaliadas no armazenamentode cultivos derivados de ápices ou gemas são:contaminação, senescência foliar (relação número defolhas verdes/número de folhas mortas), número debrotos verdes (importante para uma micropropagaçãoposterior), número de gemas viáveis (verdes) em

relação ao comprimento do caule (verde), presença ouausência de raízes, ocorrência de calo e, claro, aestabilidade genética das culturas. Considerando queneste sistema de conservação são efetuadossubcultivos com certa freqüência, existe algum riscode ocorrência de instabilidade, que aumentasubstancialmente quando determinadas espécies, aexemplo da bananeira (Musa spp.), são mantidas invitro, especialmente em um sistema de crescimento ataxas normais. Os genótipos de Musa mostram umatendência de instabilidade in vitro (Withers & Williams,1998), ao contrário da mandioca, onde nenhumaalteração, com base em descritores morfológicos,bioquímicos (isoenzimas) e moleculares, foi observadaem material de campo originado da cultura in vitro deápices caulinares, depois de três ciclos sucessivos deconservação sob crescimento lento (Villalobos &Engelmann, 1995).

A interação entre os diversos fatores envolvidos nocultivo in vitro e o estresse que a planta sofre nessacondição acabam propiciando uma situação deinstabilidade genética. Faz-se necessário, portanto,avaliar periodicamente o germoplasma, utilizando,preferencialmente, técnicas moleculares (marcadoresde DNA ou protéicos) e citogenéticas (Vieira, 2000),haja vista que, adotando-se critérios morfológicos,torna-se difícil detectar diferenças entre os genótiposmantidos in vitro (Roca et al., 1991).

Protocolo de conservação in vitro degermoplasma de mandioca sobcondições de crescimento mínimo

Como já mencionado, nesta segunda parte da Circularse discorrerá sobre a conservação in vitro degermoplasma de mandioca mediante o sistema deLimitação do Crescimento para Taxas Mínimas,enfocando o caso particular da Embrapa Mandioca eFruticultura Tropical.

O banco in vitro de mandioca na Embrapa Mandioca eFruticultura Tropical foi iniciado em 1988, com oobjetivo geral de evitar o perigo potencial da erosãogenética dos acessos cultivados de Manihot esculentae manter a variabilidade necessária aos programas demelhoramento genético da cultura. No processo,variedades de mandioca, oriundas de diversas regiõesbrasileiras e vários países, e que formam o banco ativo


de germoplasma implantado a campo, forampaulatinamente transferidas para a condição in vitro,via a cultura de ápices caulinares em meios nutritivosdefinidos e sob condições ambientais totalmentecontroladas.

Este procedimento de conservação in vitro degenótipos de mandioca envolve várias etapas (Fig. 2),as quais serão descritas e ilustradas com todos ospormenores para que este protocolo possa serfacilmente reproduzido.

A partir de estacasPlantas com idade entre 8 e 14 meses (Fig. 3A), sadiase vigorosas, devidamente identificadas quanto aogenótipo, normalmente cultivadas em bancos degermoplasma estabelecidos a campo, são selecionadas,podadas a 10-15 cm do solo (Fig. 3B) e seccionadasem estacas com aproximadamente 15-20 cm decomprimento, empregando um facão bem afiado ouuma serra manual (Fig. 3C). Caso não seja possívelobter plantas diretamente de bancos de germoplasma,pode-se recorrer a material de campos experimentaisou até mesmo de áreas de produtores, desde que ogenótipo seja comprovadamente reconhecido e queesteja sob um bom controle fitossanitário.

Fig. 2. Esquema geral dos métodos atualmente empregados na

preservação de germoplasma vegetal.

Estabelecimento dos explantesA introdução de acessos de mandioca no sistema deconservação in vitro geralmente ocorre de duasformas: a partir de brotos germinados em estacas, omodo mais comumente empregado, ou de plantas quejá estão sendo cultivadas em laboratório.

Fig. 3. Plantas de mandioca em bom estádio de desenvolvi-

mento para fornecimento de manivas (A), podadas a cerca de

10-15 cm do solo (B) e seccionadas em estacas de 15-20 cm

com serra manual (C).

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As estacas são, então, plantadas em casa devegetação, em bandejas de isopor contendo substratocomposto por fibra de coco e Plantmax®, na proporçãode 1:1 (Fig. 4A). Caso se trate de um substrato que vaiser reutilizado, deve preferencialmente ser esterilizadopor autoclavagem durante uma hora, sob temperaturade 121ºC e pressão de 1,05 gk/cm² (Fig. 4B).Opcionalmente, estacas contendo duas gemas (Fig.5A) podem ser plantadas em câmara de propagaçãorápida (Fig. 5B), uma estrutura que é empregada emum sistema alternativo de multiplicação acelerada dematerial de plantio de mandioca. Em ambos os casos,as estacas podem ser tratadas com um fungicida(Manzate ou Brassicol, respectivamente a 1,5 ou 2 g/L)associado a um inseticida (Malatol ou Dimetoato,respectivamente a 1 ou 2,5 g/L) em imersão por 5minutos, para eliminar qualquer praga presente nomaterial de plantio.

Nesta etapa do processo, três aspectos devem serlevados em consideração. O primeiro diz respeito aoterço superior da planta selecionada, que, por ser maisherbáceo, produzirá brotos menos vigorosos e,portanto, deve ser eliminado (Fig. 6A). O segundoaspecto é que o corte efetuado no momento doseccionamento da maniva deve ser feito em ânguloreto (Fig. 6B), de forma transversal, para que ocorrauma formação mais uniforme de raízes nas manivas.Neste momento, pode-se comprovar se realmente aplanta estava no estádio adequado de crescimentopara colheita da maniva, observando-se o diâmetro damedula das estacas. Este diâmetro deve ser em tornode 50% da medula total da maniva. Por último,cuidados devem ser tomados durante a colheita eretirada da planta matriz do campo, bem como porocasião do seccionamento da maniva, tratamentofitossanitário, transporte das estacas para a casa devegetação e seu plantio em substrato, de maneira quenão ocorram danos mecânicos nas suas gemas eepiderme (Fig. 6C), protegendo-as ao máximo paragarantir uma boa taxa de germinação e formação debrotos bem desenvolvidos.

A concentração de microrganismos que podem causarcontaminações, presentes na superfície dos tecidos, édependente das condições ambientais onde as plantasfornecedoras de explantes são cultivadas. Certamenteela será mais baixa em tecidos provenientes decâmaras climatizada e de termoterapia, e mais altanaqueles oriundos de casa de vegetação, câmara de

Fig. 4. Plantas de estacas de mandioca em casa de vegetação

(A) e substrato acondicionado em saco de plástico e

autoclavado para reutilização (B).

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Fig. 5. Estacas de duas gemas plantadas (A) câmaras de

propagação acelerada de material de plantio de mandioca (B).

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propagação rápida e campo. Diante das condições não-assépticas da casa de vegetação, ambiente indicadoneste protocolo para o cultivo de estacas de mandioca,é interessante que os brotos sejam manipulados com amaior assepsia possível, para reduzir a probabilidade decontaminação dos ápices caulinares quandoestabelecidos in vitro.

a) Desinfestação dos BrotosRealizada obrigatoriamente na câmara de fluxolaminar, sob condições assépticas, esta etapa visaeliminar os microrganismos presentes na superfície doexplante. No processo de desinfestação procura-seeliminar bactérias e fungos, principalmente, e assimevitar as contaminações. Naturalmente, os meristemasapicais em si estão isentos da presença demicrorganismos. No entanto, os apêndices situados noseu entorno podem conter microrganismos que vãodesencadear todo um processo de contaminação.

As contaminações se constituem em um dos pontosmais críticos de todo o processo in vitro, já que podemcausar prejuízos consideráveis tanto noestabelecimento dos ápices caulinares no meio decultura como nas fases seguintes de multiplicação e

Fig. 6. Terço superior de planta de mandioca (A), estacas

cortadas em ângulo reto (B) e setas indicando danos nas

gemas e superfície das manivas (C).

B

C

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Assim, aproximadamente aos 12-15 dias, a dependerda variedade, as gemas brotam e se desenvolvem,tanto em casa de vegetação (Fig. 7A) como emcâmara de propagação rápida (Fig. 7B), ocasião emque os ápices já podem ser cortados. Com o auxílio deuma tesoura afiada e/ou uma lâmina de bisturi nova, osbrotos são extraídos, com um tamanho em torno de1,5-2,0 cm (Fig. 7C), e colocados em um béquerpequeno, previamente identificado com o nome dogenótipo, contendo um pouco de água destilada e/oudeionizada para evitar que desidratem, mesmo sendolevados imediatamente para o laboratório, o querefletirá em uma maior taxa de sucesso no cultivo dosápices caulinares. Os brotos são, então, transportadospara o laboratório, a fim de se proceder suadesinfestação, o isolamento e o estabelecimento invitro dos ápices caulinares.

Fig. 7. Brotações em estacas de mandioca cultivadas em casa

de vegetação (A), câmara de propagação rápida (C) e brotos

(C) de onde serão extraídos os ápices caulinares.

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enraizamento das plantas. Diante desse potencial derisco, é fundamental prevenir as contaminações e,antes mesmo de iniciar o processo de desinfestaçãodos explantes, vestir um guarda-pó, que só deve serusado dentro das instalações do laboratório, e lavar asmãos e antebraços com água e sabão e enxaguá-loscom álcool 70%. Existe uma ampla gama desubstâncias químicas que possuem ação germicida epodem ser empregadas na desinfestação dosexplantes. De modo geral, as mais utilizadas são oetanol e aquelas à base de cloro. O etanol deve serusado antes do hipoclorito, pois, além da açãogermicida, exerce, ainda, a de surfactante, eliminandoas bolhas de ar presentes na superfície do explante epermitindo que o cloro tenha um maior contato com omaterial vegetal.

Inicialmente, fora da câmara de fluxo laminar, deve-seeliminar as folhas maiores que não fazem parte daregião apical (Fig. 8A), retornando os brotos para obéquer com água. Prontos para o processo dedesinfestação, os brotos são levados para a câmara defluxo laminar, transferidos para uma pequena bolsa demalha de nylon ou gaze, submersos em álcool 50%durante 1 minuto (Fig. 8B). Nessa concentração de50%, o álcool não provoca uma desidratação rápidanos tecidos e, além de atuar como germicida, tem apropriedade de ser surfactante, quebrando a tensãosuperficial do tecido e, consequentemente, facilitandoa ação do agente desinfestante sobre o explante. Logodepois os brotos são submersos em água deionizadaautoclavada por 15 segundos e posteriormente emsolução de hipoclorito de sódio a 0,25% por 3 minutos(Fig. 8C). Em seguida devem ser imersos em águadeionizada autoclavada por três vezes consecutivas(aproximadamente durante cinco segundos cada vez),substituindo a água após cada imersão, de forma aeliminar resíduos do cloro nos explantes, o que pode,além de causar lesões nos tecidos, alterar o pH domeio nutritivo e assim prejudicar o estabelecimento e odesenvolvimento posterior dos ápices caulinares.

Manter os brotos no béquer em uma pequena lâminade água, para evitar que desidratem, e proceder aextração dos ápices caulinares logo em seguida,evitando, portanto, que uma permanência prolongadados brotos na água cause o amolecimento dos tecidose dificultem o isolamento.

b) Isolamento dos Ápices CaulinaresOs ápices caulinares extraídos de brotações de estacasplantadas em casa de vegetação e câmara depropagação rápida são mais apropriados para iniciarum sistema de micropropagação de mandioca do queaqueles retirados de plantas no campo, por três razões:a) menor concentração de microrganismos nasuperfície dos tecidos; b) facilidade de coletar osbrotos em um local mais próximo do laboratório; e c)as estacas se constituem em uma fonte contínua deprovisão de ápices caulinares por um tempoconsiderável.

O tamanho do ápice caulinar é um ponto crítico parasua regeneração e conseqüente formação de umaplanta completa, considerando-se especialmente se oobjetivo do cultivo in vitro é também a eliminação devírus. Geralmente, quanto maior o tamanho do ápicecaulinar maior a probabilidade de regeneração deplantas. No entanto, maiores serão as possibilidadesdessas plantas possuírem vírus, quando for o caso,tornando-se necessário, portanto, reduzir o tamanho doápice caulinar até o limite que permita uma alta taxade recuperação de plantas isentas daqueles patógenos,principalmente se as estacas empregadas como fontesde explantes não forem expostas à termoterapia.

Fig. 8. Eliminação de folhas, da esquerda para a direita, em

brotos de mandioca (A), para desinfestação em álcool a 50%

(B) e hipoclorito de sódio a 0, 25% (C).

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Devido ao diminuto tamanho do ápice caulinar damandioca após seu isolamento, esta operação deve sera mais rápida e precisa possível, de forma a evitar adesidratação dos tecidos e assegurar a maior taxapossível de sobrevivência dos explantes. Essadesidratação é favorecida tanto pelo fluxo de ar dacâmara como pelo calor gerado pelas lâmpadas domicroscópio estereoscópico, que tem de serobrigatoriamente utilizado no processo, por causa dominúsculo tamanho dos explantes. Trabalhando nocampo visual de um microscópio estereoscópico, comaumentos de 10 a 40X (Fig. 9A), vai-se eliminandogradativamente os apêndices (folhas e estípulas) com oauxílio de pinça e bisturi contendo uma lâmina número11 (Fig. 9B), até que se consiga visualizar o ápicecaulinar, que tem como característica marcante umforte brilho. Nesse momento, o ápice caulinarapresenta 1-3 primórdios foliares e um tamanho de até0,5 mm, devendo, então, ser cortado, de forma quefique aderido à ponta da lâmina (Fig. 9C), para facilitarsua transferência ao meio de cultura. Este corte deveser feito de forma rápida e cuidadosa, para evitar adesidratação excessiva dos tecidos e garantir ummaior índice de sobrevivência dos explantes.

conjunto de bisturi e lâmina seria utilizado, então, paraproceder a eliminação das folhas e estípulas na faseinicial da operação.

c) Estabelecimento In Vitro dos ÁpicesCaulinaresColocar rapidamente o ápice caulinar sobre asuperfície de 2,5 mL do meio de cultura deestabelecimento (Fig. 10), previamente distribuídos emtubos de ensaio de 14 mm de diâmetro e 100 mm detamanho, transferindo-os posteriormente para a salade crescimento, sob condições de temperatura de27±1ºC, densidade de fluxo de fótons de 30 µmol/m2/s e fotoperíodo de 16 horas. Recomenda-se cobrir ostubos de ensaio com 1-3 camadas de gaze, durante os10 primeiros dias do estabelecimento, para reduzir aluminosidade e permitir uma rápida diferenciação e ummelhor desenvolvimento dos explantes. Tem-seobservado que o emprego de tubos de ensaio pequenosno cultivo de ápices caulinares de mandioca implica empequena formação de calo, o que reflete em maiorrapidez na regeneração de plantas. O calo pareceinterferir na diferenciação normal do tecido vascularentre a raiz e o caule dificultando seu funcionamento(CIAT, 1980).

Fig. 9. Broto de mandioca no campo visual do

estereomicroscópio, eliminação gradativa de apêndices (folhas

e estípulas) (B) e ápice caulinar apropriadamente extraído e

pronto para ser estabelecido in vitro (C).

Recomenda-se que a lâmina de bisturi utilizada nocorte final do ápice caulinar seja usada apenas comesta finalidade, para que se fazer uma incisão muitoprecisa, evitando provocar danos nos tecidos. Outro

Fig. 10. Ápice caulinar de mandioca aderido na ponta de

lâmina de bisturi (no detalhe) sendo inoculado em meio de

cultura de estabelecimento.

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Uma adequada composição do meio de cultura édeterminante para desencadear os processosmorfogenéticos necessários à regeneração de plantas,pois fornece aos meristemas os nutrientes e demaisfatores de crescimento necessários para sua

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diferenciação em caules, folhas e raízes. É derelevante importância incluir na sua formulação umaapropriada combinação de substâncias reguladoras decrescimento, representadas por uma auxina, umacitocinina e uma giberelina. Essas substâncias iniciamas reações químicas, mudam a composição químicadentro das plantas e, quando associadas a fatoresambientais, como luz e temperatura, interagem com osprocessos bioquímicos durante o crescimento ediferenciação (Almeida et al., 1997/98). No casoespecífico da mandioca, esses reguladores decrescimento têm sido representados, geralmente, peloácido naftalenoacético (ANA), benzilaminopurina (BAP)e ácido giberélico (AG3), haja vista os bons resultadosque propiciam ao cultivo in vitro dos ápices caulinaresdessa euforbiácea.

O meio de cultura empregado no estabelecimento invitro de ápices caulinares de mandioca é composto

pelos sais minerais do MS (Murashige & Skoog, 1962),suplementado com tiamina-HCl, inositol, reguladores decrescimento e sacarose (Mafla et al., [200-?]),gelificado com ágar ou Phytagel® e pH ajustado em5,7-5,8 (Tabela 1), com KOH (ou NaOH) 0,5-1,0N,após a adição de todos os componentes. Com este pH,ligeiramente ácido, o meio de cultura favorece ocrescimento dos ápices caulinares estabelecidos.

Esta composição básica do meio de estabelecimentoassociada às concentrações de ANA, BAP e AG3,indicadas na Tabela 1, têm permitido alcançar 100%de regeneração de plantas a partir do cultivo in vitrode ápices caulinares da quase totalidade dos genótiposde mandioca que vêm sendo micropropagados.

Depois de distribuídos nos tubos de ensaio (Fig. 11A), omeio deve ser autoclavado a uma temperatura de121ºC e pressão de 1,05 kg/cm², durante 20 minutos(Fig. 11B).

Tabela 1. Meios de cultura empregados nas fases do estabelecimento in vitro de ápices caulinares, multiplicação/enraizamento e conservação in vitro de germoplasma de mandioca.


formação de um caule muito pequeno com numerosasgemas, porém sem raízes; e d) falta total decrescimento e desenvolvimento (CIAT, 1980).Procedimentos otimizados em todo o processo demicropropagação da mandioca refletirão na eliminação,ou pelo menos, minimização, dessas alterações.

Fig. 11. Distribuição (A) e autoclavagem (B) do meio de

cultura de estabelecimento in vitro de ápices caulinares de

mandioca.

Fig. 12. Ápices caulinares de mandioca em diferenciação.

Fig. 13. Brotos de mandioca originado do cultivo in vitro de

ápices caulinares mostrando as primeiras folhas (A) e forma-

ção indesejável de calo (B).

A B

Após os 10 primeiros dias, eliminar a gaze e transferiros ápices caulinares, que já devem apresentar umtamanho em torno de 0,5 cm (Fig. 12), uma coloraçãoverde-pálido e alguma diferenciação de suasestruturas, para tubos de ensaio de Ø = 16 x A =125 mm, contendo 3,0 mL do meio de cultura deestabelecimento recém preparado.

Fig. 14. Plantas

de mandioca

empregadas no

estabelecimento

in vitro de um

banco de

germoplasma.

Os eventos de diferenciação dos tecidos continuamevoluindo e com mais 10-20 dias já haverá a formaçãode um pequeno caule com 1,0-1,5 cm de tamanho e aexpansão de algumas folhas (Fig. 13A).Frequentemente acontece o desenvolvimento de umpequeno calo na base e/ou o crescimento de raízes(Fig. 13B), que devem ser eliminados e o material jápode ser conduzido para a fase seguinte do processo,que é a multiplicação. No entanto, como o padrão geralde desenvolvimento dos meristemas apicais dependeda variedade de mandioca, da composição do meio decultura ou da interação de ambos os fatores, podeocorrer as seguintes alterações: a) formação de umcaule sem raízes, em cuja base cresce apenas calo (asraízes são formadas depois de um longo período depermanência do caule no meio de cultivo); b) formaçãode um pequeno caule com raízes muito longas; c)

A B

A partir de material in vitroNeste caso, o procedimento é facilitado e agilizado, hajavista que os genótipos já estão sendo cultivados in vitro(Fig. 14), dispensando-se, portanto, os diversos passosobservados anteriormente, quando os ápices caulinaressão extraídos de brotos oriundos de estacas cultivadasem casa de vegetação. Outra vantagem desteprocedimento é que as plantas selecionadas para aextração das gemas apicais e/ou laterais já se encontramisentas de contaminações provocadas por fungos,bactérias e outros agentes, anulando-se praticamente apossibilidade do surgimento de tais microrganismos nosmateriais que serão conservados in vitro.

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MicropropagaçãoIndependentemente do procedimento adotado noestabelecimento dos explantes, todo material ésubmetido a uma etapa de multiplicação in vitro oumicropropagação, de maneira a se obter a quantidadede plantas de cada genótipo necessária para aconservação em si. Esta fase deve ser conduzida deforma a obter uma taxa de multiplicação satisfatória,sem interferir na qualidade do material. Essa qualidade,associada à uniformidade no desenvolvimento dasplantas, será muito importante para a formação dosistema radicular, processo fundamental para o êxitoda conservação in vitro.

Portanto, com base nestes aspectos e visando aobtenção de plantas de mandioca de qualidade, a etapada micropropagação deve abranger três pontosbásicos: as subculturas, a composição do meionutritivo e as condições ambientais de cultivo.

SubculturasConforme mencionado anteriormente, faz-senecessário multiplicar cada genótipo de mandioca parase conseguir o número de plantas que será destinado àconservação. Entretanto, além da quantidade, deve-seatentar para a produção de plantas bem homogêneasem termos de desenvolvimento e que mantenham ascaracterísticas genéticas da planta matriz. Para isso,quando a planta atingir um tamanho que permita tersua haste seccionada em várias microestacas, deveser micropropagada. É muito importante, antes deiniciar o processo de micropropagação, analisar oaspecto da plantas, se apresenta um bom vigorvegetativo, coloração verde e ausência de problemascomo vitrificação e tecidos necrosados. Igualmenteimportante é observar a cultura contra a luz da câmarade fluxo laminar para verificar se há ocorrência decontaminações bacterianas e/ou fúngicas. Apósconcluir que a planta apresenta condições satisfatóriaspara ser multiplicada, deve ser retirada do tubo deensaio com o auxílio de uma pinça de tamanho médio,até que sua parte basal (sistema radicular com ou semmeio de cultura) fique cerca de 1,0 cm da boca dotubo. Eliminar todas as folhas, exceto a primordial,com uma tesoura, e cortar a haste da planta próximo àboca do tubo, deixando-a cair sobre papel de filtroesterilizado. Outro procedimento que pode ser adotadoé retirar a planta do tubo de ensaio, depositá-la sobre opapel de filtro (Fig. 15A) e eliminar as folhas com umalâmina de bisturi número 10. De uma forma ou deoutra, o passo seguinte consiste em, utilizando pinça e

bisturi, seccionar a planta a partir da região apical emsegmentos de 1,0-1,5 cm, contendo 1-3 gemas, demaneira que o corte superior de cada microestaca sejafeito 1-2 mm acima da gema mais alta (Fig. 15B).Pegar a microestaca pela parte superior com umapinça grande (25 cm de tamanho) e inseriraproximadamente 1/3 dela no meio de cultura (Fig.15C). A pinça deste tamanho facilita introduzir amicroestaca no meio de cultura de multiplicação/enraizamento, haja vista que o tubo de ensaiorecomendado para esta etapa possui 15 decomprimento.

Fig. 15. Planta de mandioca para ser micropropagada (A),

microestaca lateral mostrando a gema axilar (B) e

microestacas cultivadas em meio de multiplicação/

enraizamento (C).

C

A B

Como uma planta de mandioca cultivada in vitro émuito tenra, esta operação deve ser realizada o maisrápido possível, para evitar que a exposição ao fluxocontínuo de ar da câmara provoque a desidratação dostecidos. Além da agilidade no manuseio do material,outra medida interessante para evitar a desidratação étrabalhar com um pequeno número de explantes porvez.

Outro aspecto a ser considerado está relacionado como tipo do explante, haja vista que esta característica,juntamente com seu tamanho e a composição do meiode cultura, irão refletir na taxa de multiplicação. Umaplanta de mandioca para ser micropropagada éseccionada em segmentos entre 1,0 e 1,5 cm detamanho, resultando geralmente em uma microestacacontendo a gema apical e as demais com pelo menosuma gema lateral. Posteriormente, com o cultivo in

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vitro, as gemas se diferenciam em parte aérea (caule efolhas) e raízes. Para uma formação mais homogêneade plantas, as microestacas que contêm gemas lateraisdevem ser colocadas, preferencialmente, em meio deestabelecimento, enquanto aquelas que possuem agema apical podem ser cultivadas também nessemesmo meio ou no meio de multiplicação/enraizamento. As microestacas cultivadas no meio deestabelecimento deverão ser transferidas para o meiode multiplicação/enraizamento após 15 dias. Noentanto, caso se necessite de material em um espaçode tempo mais curto, cultivar todas as microestacasno meio de multiplicação/enraizamento.

Outro ponto a ser verificado é a frequência dassubculturas, que devem ser feitas quando as plantasestiverem em crescimento ativo, evitando-semultiplicar aquelas que já estão mostrando algum sinalde senescência nas partes aéreas e com o meio decultura apresentando uma tonalidade amarronzada.Assim, ao atingir a tampa do tubo de ensaio, cadaplanta geralmente apresenta o máximo de vigor e deveser novamente seccionada, repetindo-se um novo ciclode micropropagação a cada 75-90 dias, a depender dogenótipo.

Meio de culturaNormalmente, para a maioria das espécies vegetais, omeio de cultura empregado na fase de multiplicaçãotem a mesma composição básica (sais minerais evitaminas) utilizada na etapa anterior, a deestabelecimento. Para a mandioca tal regra também seaplica e a variação que existe entre os dois meios dizrespeito às concentrações de ANA, BAP e AG3, quesão mais baixas no de multiplicação/enraizamento(Tabela 1), permanecendo iguais as doses dos demaiscomponentes (sais minerais, tiamina-HCl, inositol esacarose). O meio de multiplicação/enraizamentotambém é solidificado com ágar ou Phytagel®, sendoque a concentração do segundo gelificante deve seraumentada para 2 g/L. O pH também é ajustado em5,7-5,8 e o meio autoclavado a uma temperatura de121ºC e pressão de 1,05 kg/cm², durante 20 minutos.

Podem ser empregados tubos de ensaio de tamanhogrande, de Ø = 18, 20 ou 25 x A = 150 mm,contendo, respectivamente, 5, 7 ou 10 mL de meio decultura. Para fins de economia, ao utilizar tubos de 25x 150 mm (Fig. 16A), pode-se distribuir até trêsmicroestacas por recipiente. No entanto, em outrostipos de recipientes as plantas de mandioca se

desenvolvem bem, a exemplo de frascos de vidroredondos (Ø = 6,5 cm x A = 10,0 cm) (Fig. 16B) ecaixas de plástico quadradas (A = 8,0 cm x L = 7,5cm) (Fig. 16C), com 40 e 70 mL de meio, onde sãocultivados, respectivamente, até 5 e 9 explantes.

Ao contrário do que acontece com muitas outrasespécies, quando se faz necessário um meio de culturapara o alongamento e outro para o enraizamento dosnovos brotos, as variedades de mandioca alongam eenraízam muito bem no mesmo meio de multiplicação,o que se constitui em uma considerável economia.

Fig. 16. Micropropagação da mandioca em meio de multiplica-

ção/enraizamento distribuído em tubo de ensaio (A), frascos de

vidro (B) e caixas de plástico (C).

CA

B

Condições ambientaisA taxa de crescimento in vitro pode ser controladamediante ajustes em aspectos inerentes ao materialvegetal (genótipo, tipo de explante) e ao meio decultura (nutrientes orgânicos e inorgânicos, reguladoresde crescimento, concentração osmótica, o estadofísico e seu pH), conforme comentado anteriormente,bem como aos fatores relacionados com as condiçõesfísicas do ambiente de cultivo, ou seja, temperatura,umidade, luminosidade e fotoperíodo. Entre essesfatores, a temperatura e a luminosidade se destacamcomo os de maior influência sobre as respostasmorfogenéticas in vitro.

Em geral, grande parte das plantas é cultivada in vitrosob temperatura entre 25 e 30°C. No caso da

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mandioca, ela vem sendo cultivada em umatemperatura contínua de 27±1°C, mantida comtermostato, haja vista que, por se tratar de umaespécie tropical, tem o ciclo de vida desenvolvido emum clima relativamente uniforme.

Por sua vez, a luz exerce um grande efeitomorfogenético no desenvolvimento da planta in vitro,desempenhando um papel importantíssimo nosprocessos da fotossíntese, fotomorfogênese efototropismo. Ela promove o crescimento edesenvolvimento das plantas mediante três fatores:qualidade (comprimento de onda), quantidade(intensidade luminosa ou fluxo de fótons) e duração(fotoperíodo). No entanto, apesar de se reconhecer aimportância morfogenética destes componentes, osestudos realizados com o objetivo de analisá-los sãoescassos (Villalobos & Thorpe, 1991). No Laboratóriode Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca eFruticultura Tropical, a mandioca é cultivada in vitrosob densidade de fluxo de fótons de 30 µmol/m2/s,proporcionada por lâmpadas fluorescentes brancasfrias em ciclo de fotoperíodo/escuro de 16/8 horascontrolado por um timer.

Além disso, Mafla et al. ([200-?]) chamam a atençãopara um outro fator ambiental que é a umidaderelativa. Caso seja maior que 70%, condição que podepropiciar o desenvolvimento de microrganismos eaumentar o risco de contaminação das culturas, énecessário usar um desumidificador, equipamento quepermite regular esse fator. E esta preocupação é aindamaior quando se tratar de uma coleção in vitro, ondeos acessos devem ser mantidos em ambiente com omáximo de assepsia.

Avaliação das culturas em multiplicaçãoEm todas as etapas do processo de cultivo in vitro detecidos de plantas deve-se monitorar rigorosamente osurgimento de contaminações, o desenvolvimento dosexplantes de partida, o crescimento e o enraizamentodas plantas, e o estado do recipiente de cultura.Bactérias e fungos (Fig. 17A) são os contaminantesmais comuns dos meios nutritivos e podem serfacilmente detectados nos cultivos in vitro,especialmente se o agente gelificante for alguma gomatipo ‘gelan’, a exemplo do Phytagel® (Fig. 17B), quedeixa o meio nutritivo bem mais transparente que oágar (Fig. 17C). Uma vez comprovado que estácontaminado, o material deve ser imediatamenteisolado e autoclavado durante uma hora sob

temperatura de 121°C (1,05 kg/cm2). No entanto,CIAT (1984) recomenda que no caso do surgimento decontaminações em cultivos de materiais valiosos e/ouescassos, deve-se excisar o ápice o mais distantepossível da área contaminada, sob condições derigorosa assepsia. Para fazer a excisão, se extraiparcialmente a planta do tubo, de tal forma que saiaapenas a extremidade superior do tecido,supostamente limpo. Corta-se o ápice com a ajuda deuma tesoura, depositando-o sobre papel esterilizado.Imediatamente, com a ajuda de um bisturi, corta-se 1mm da base para eliminar o tecido danificado e seinocula o ápice em um meio novo.

Fig. 17. Planta de mandioca contaminada por bactéria (A) e

meios de cultura gelificados com Phytagel® (B) e ágar (C).

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B

Quanto ao desenvolvimento da planta in vitro, atentarpara as estruturas do sistema radicular e do caule, quedevem apresentar um crescimento normal, nãoatrofiado. As folhas devem possuir uma coloraçãoverde intensa, sem manchas cloróticas.

O estado e a tampa do tubo de ensaio não devemapresentar nenhuma ruptura, e sua identificação,sempre visível, são também aspectos a seremcontrolados para que se possa ter maior sucesso noscultivos.

ConservaçãoApós essa rigorosa avaliação dos materiais na fase demicropropagação, as plantas bem desenvolvidas podemser seccionadas e as microestacas, também com umtamanho de 1,0-1,5 cm, contendo a gema apical e asgemas laterais subsequentes (Fig. 18A), colocadas nomeio de conservação e mantidas na sala de

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crescimento por um período em torno de 15 dias (Fig.18B). Este prazo é suficiente para que ocorradesenvolvimento das primeiras folhas e raízes (Fig.18C), condição necessária para que os acessos sejamtransferidos para a sala de conservação.

empregadas para conservar in vitro o banco degermoplasma são: temperatura de 22±1°C, densidadede fluxo de fótons de 10 µmol/m2/s e fotoperíodo de12 horas. A exemplo do que acontece na sala decrescimento, a temperatura e o fotoperíodo da sala deconservação são também controlados por umtermostato e um timer, respectivamente (Fig. 19).

Fig. 18. Microestacas apical e laterais (A), cultivadas no meio

de conservação e mantidas na sala de crescimento (B) e planta

de mandioca com folhas e sistema radicular em estádio

adequado de transferência para a sala de conservação (C).

C

A

B

No banco in vitro de germoplasma de mandioca daEmbrapa Mandioca e Fruticultura Tropical mantêm-setrês tubos de ensaio por genótipo, cada tubo com trêsplantas. Nos itens seguintes se discorrerá sobre oprocedimento adotado no processo de conservação invitro do germoplasma de mandioca.

Meio de culturaO meio de cultura usado para desacelerar ocrescimento dos cultivos, prolongando o intervalo entrea subculturas, constitui-se das concentrações normaisdos sais minerais do MS básico, contendo tambémtiamina-HCl, inositol, reguladores vegetais, sacarose(Mafla et al., [200-?]) e um agente solidificante, quepode ser o ágar ou Phytagel®, com o pH ajustado em5,7-5,8 (Tabela 1). A exemplo dos meios de culturacitados anteriormente, o meio empregado naconservação in vitro dos acessos de mandioca deve sertambém autoclavado em uma temperatura de 121°C epressão de 1,05 kg/cm2, por 20 minutos.

Condições ambientaisTambém na conservação in vitro deve-se levar emconsideração a interação entre diversos fatores,especialmente a temperatura e a luminosidade, deforma a reduzir a taxa de crescimento das plantas. Nocaso da mandioca, as condições ambientais

Fig. 19. Termostato (abaixo) e timer, aparelhos empregados

no controle da temperatura e do fotoperíodo da sala de

conservação, respectivamente.

Manutenção dos acessosNo sistema de crescimento lento, com as mudançasefetuadas no ambiente físico de cultivo (temperatura,intensidade luminosa e fotoperíodo) e no meio de cultura(nutrientes orgânicos e inorgânicos, reguladoresosmóticos ou inibidores de crescimento) reduz-se ometabolismo das plantas e, conseqüentemente,aumenta-se ao máximo o intervalo entre astransferências (o ideal seria estendê-lo indefinidamente).Procura-se, dessa maneira, sem afetar a viabilidade dasplantas, reduzir a quantidade de mão-de-obraempregada, os custos operacionais e materiais, e osriscos potenciais de contaminação por fungos ebactérias, além de deixar todo o germoplasmadisponível para ser explorado, especialmente emprogramas de melhoramento genético. Lemos et al.(2002) consideram que períodos entre 1 e 2 anospodem ser satisfatórios para a conservação dogermoplasma a curto ou médio prazo, o que se aplicaperfeitamente à cultura da mandioca, haja vista queeste protocolo, associando as condições ambientais comos fatores relativos ao material vegetal, especialmenteo genótipo, permite que acessos de mandioca sejamconservados por períodos de até 18 meses.

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Avaliação das culturas em conservaçãoPara determinar o momento em que os acessos podemser subcultivados e evitar que entrem em senescência,o monitoramento do banco de germoplasma in vitrodeve focalizar principalmente o vigor e a viabilidadedas plantas, e o estado fitossanitário dos tubos. Aelevada umidade dentro do tubo de ensaio (Fig. 20A)ou qualquer outro recipiente de cultivo e a presença deaçúcar no meio nutritivo favorecem o crescimento demicrorganismos responsáveis pelas contaminações(Fig. 20B), que podem se tornar um grave problemapara a conservação in vitro de um banco degermoplasma.

Paralelamente, se durante as inspeções visuais nobanco de germoplasma se comprovar a presença decontaminações bacterianas ou fúngicas, é interessanteque os tubos afetados sejam imediatamente isolados eposteriormente esterilizados em autoclave duranteuma hora sob temperatura de 121ºC (1,05 gk/cm² depressão). No entanto, caso se trate de um acessomuito valioso e/ou escasso e que seja difícil de localizarpara coleta e reintrodução in vitro, deve-se adotar omesmo procedimento recomendado no item 3.2.5.Caso a contaminação persista e atinja todos os tubosde um determinado acesso na coleção, pode-se seguiro processo de desinfestação indicado por Mafla et al.([200-?]). Nesse processo, se a contaminação forbacteriana, adiciona-se algum antibiótico ao meio decultura, a exemplo da Vancomicina, a umaconcentração de 40 mg/L. Caso se trate de umacontaminação provocada por fungos, realiza-se adesinfecção com diferentes concentrações dehipoclorito de sódio, ligeiramente superiores àsrecomendadas na desinfestação dos brotos paraextração e estabelecimento in vitro dos ápicescaulinares. É possível, com estas medidas, recuperar

Fig. 20. Detalhe da elevada umidade relativa no interior do

tubo de ensaio (A) e contaminação fúngica em uma planta de

mandioca (B).

Fig. 21. Meio de cultura mostrando um aspecto cristalino no

início (A) e uma tonalidade amarronzada em etapa posterior da

conservação (B), e plantas de mandioca apresentando colora-

ção verde nas suas folhas e caules.

BA

Com o passar do tempo, o meio de cultura queinicialmente apresenta-se cristalino (Fig. 21A) torna-seamarelado e progressivamente vai adquirindo umacoloração amarronzada (Fig. 21B), como consequênciada secreção de metabólitos das raízes, especialmentede tipo fenólico. Paralelamente, deve-se observar queas plantas tenham folhas e caules verdes, e que asraízes apresentem crescimento vigoroso (Fig. 21C).

A crescente concentração de metabólitos no meio decultura, tornando-o de cor amarronzada, pode causartoxicidade às plantas. Quando os cultivos seapresentem amarelados, desfolhados, porém mantendoas gemas apicais e laterais esverdeadas, devem sertransferidos para um meio de cultura novo.

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algum material contaminado, que será posteriormentereintroduzido na coleção in vitro, tão logo sejacomprovada a ausência de contaminação.

SubcultivosNesse processo, por motivo de segurança, pode-sedeixar um dos três tubos de ensaio de cada acesso dereserva. Secciona-se as plantas dos outros dois tubos eseleciona-se as nove microestacas mais vigorosas,especialmente aquelas localizadas no terço superior decada planta. Essas microestacas são transferidas paraum meio fresco e também cultivadas, inicialmente, porcerca de duas semanas, na sala de crescimento, até aformação das primeiras folhas e iniciação do sistemaradicular, sendo posteriormente translocadas para ascondições de conservação. Com isto, tem-se um novociclo de conservação de nove plantas, distribuídas emtrês tubos de ensaio.

Base de dadosSegundo Roca et al. (1991), uma coleção genética emlaboratório deve manter e atualizar continuamente umbanco informatizado, que contenha informaçõesrelacionadas com todos os aspectos da conservação invitro dos acessos, tais como dados de passaporte,caracterização genotípica, indexação de doenças,micropropagação, intercâmbio internacional,equipamentos e material de consumo, e outrosaspectos logísticos do processo. No entanto, por nãohaver uma estrutura que permita fazer todo essecontrole no manejo do banco de germoplasma demandioca da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropicalconservado em laboratório, alguns dados vêm sendoregistrados, de forma que posteriormente possam serinseridos em um banco informatizado. Esses dadoscompreendem as datas de estabelecimento in vitro eas transferências subsequentes, os meios de culturaempregados em cada etapa e observaçõesrelacionadas com o aspecto vegetativo das plantas decada acesso.

Conclusões e perspectivas

Os métodos convencionais de conservação degermoplasma possuirão sempre um papelpreponderante no desenvolvimento de programas demelhoramento genético. Entretanto, métodosalternativos vêm assumindo uma crescente

importância na conservação das espécies. Essesmétodos devem ser ajustados e utilizados sempre como intuito de eliminar problemas que dificultem ouimpeçam a exploração de germoplasmas valiosos. Poroutro lado, tais procedimentos devem ser evitados nomomento em que não sejam realmente necessários ouse tornem até mesmo sofisticados para determinadasespécies e locais, onde alternativas mais simplespodem contribuir de forma muito mais significativa.

Para várias espécies de propagação vegetativa eprodutoras de raízes e tubérculos, a exemplo damandioca, a conservação in vitro de germoplasma sobcondições de crescimento lento, em um ambientecontrolado, já é um sistema viável e habitual. Oestabelecimento de estratégias que possam associar ecomplementar a conservação em nível de campo coma preservação do banco in vitro trará muito maisbenefícios, disponibilizando o acesso a materiais aserem incorporados em programas de melhoramento efacilitando o intercâmbio de germoplasma demandioca, inclusive em abrangência internacional.

O desenvolvimento de sistemas cada vez mais simplesde criopreservação, inclusive sem a necessidade deutilizar os sofisticados e caros equipamentos decongelamento, tem gerado grandes perspectivas paraa criopreservação de plantas nos próximos anos.

O importante de tudo isso é que, tanto em sistemas deconservação sob limitação do crescimento como emqualquer outro método alternativo, seja mantida afidelidade genética dos acessos, fator crucial para aexploração racional e eficiente dos bancos degermoplasma.

Referências bibliográficas

ALMEIDA, W. A. B. de; MATOS, A. P. de; SOUZA, A. da

S. Influência da benzilaminopurina (BAP) no

desenvolvimento de plântulas do abacaxizeiro (Ananas

comosus (L.) Merr.) cultivadas in vitro. Magistra, Cruz das

Almas, BA, n. 10, p. 55-63, 1997/98.

BRISON, M.; BOUCAUD, M. T. de; DOSBA, F.

Cryopreservation of in vitro grown shoot tips of two

interespecific Prunus rootstocks. Plant Science, Limerick,

v. 105, n. 2, p. 235-242, 1995.


CABRAL, G. B.; CARVALHO, L. J. C. B; SCHAAL, B. A.Root induction of wild species of Manihot under in vitroculture. In: CARVALHO, L. J. C. B.; THRO, A. M.;VILARINHOS, A. D. (Ed.). INTERNATIONAL SCIENTIFICMEETING CASSAVA BIOTECHNOLOGY, 4., 2000,Salvador. Proceedings... Brasília, DF: Embrapa-Cenargen,2000. p. 383-387.

CASAZZA, G.; SAVONA, M.; CARLI, S.; MINUTO, L.;PROFUMO, P. Micropropagation of Limonium cordatum(L.) Mill. for conservation purposes. Journal ofHorticultural Science & Biotechnology, v. 77, n. 5, p.541-545, 2002.

CIAT. El cultivo de meristemas de yuca. Cali, 1980. 40 p.(CIAT. Guia de Estudio. Serie 045C-02.02).

CIAT. El cultivo de meristemas para la conservación degermoplasma de yuca in vitro; unidad audiotutorial. Cali,1984. 44 p. (CIAT. Guia de Estudio. Serie 045C-05.03).

EIRA, M. T. S. Conservação de germoplasma na forma desementes, in vitro e criopreservação. In: SIRGEALC -SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AAMÉRICA LATINA E CARIBE, 3.; REUNIÃO LATINOAMERICANA DE ESPECIALISTAS EM Arachis, 3.;REUNIÃO LATINO AMERICANA DE ESPECIALISTAS EMRECURSOS GENÉTICOS FLORESTAIS, 3., 2001,Londrina. Anais... Londrina: IAPAR, 2001. p. 30-32.

EMPRESA PERNAMBUCANA DE PESQUISAAGROPECUÁRIA. Programa de biotecnologia vegetal(Plant biotechnology programme). Recife: IPA, 1991. 13p. (IPA. Documentos, 14).

FORTES, G. R. de L.; PEREIRA, J. E. S. Preservação invitro da batata com ácido acetilsalicílico e duas fontes decarboidrato. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF,v. 36, n. 10, p. 1261-1264, out. 2001.

GIACOMETTI, D. C.; GOES, M. de. Conservação degermoplasma de espécies frutíferas pelo uso dabiotecnologia. Revista Brasileira de Fruticultura, Cruz dasAlmas, BA, v. 8, n. 3, p. 39-46, 1986.

GOES, M. de; MENDES, R. A.; SOUZA-SIQUEIRA, C. S.;LABUTO, L. B. Cultura de tecidos de três espéciessilvestres de Manihot. In: CARVALHO, L. J. C. B.; THRO,A. M.; VILARINHOS, A. D. (Ed.). INTERNATIONALSCIENTIFIC MEETING CASSAVA BIOTECHNOLOGY, 4.,2000, Salvador. Proceedings... Brasília, DF: EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia, 2000. p. 388-395.

GOLMIRZAIE, A.; TOLEDO, J. In vitro conservation ofpotato and sweetpotato germplasm. In: CIP program report1997-98. Lima: CIP, 1998. p. 351-356.

LEMOS, E. E. P. de; FERREIRA, M. de S.; ALENCAR, L.M. C. de; RAMALHO NETO, C. E.; ALBUQUERQUE, M.M. de. Conservação in vitro de germoplasma de cana-de-açúcar. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, DF, v.37, n. 10, p. 1359-1364, 2002.

MAFLA, G.; ROA, J. C.; ARANZALES, E.; DEBOUCK, D.G. Manual de procedimientos para la conservación in vitrodel germoplasma del género Manihot. Cali: CIAT, [200-?].50 p.

MAFLA, G.; ROCA, W.; REYES, R.; ROA, J. C.; MUÑOZ,L.; BACA, A. E.; IWANAGA, M. In vitro management ofcassava germplasm at CIAT. In: ROCA, W. M.; THRO, A.M. (Ed.). INTERNATIONAL SCIENTIFIC MEETING OF THECASSAVA BIOTECHNOLOGY NETWORK, 1., 1992,Cartagena. Proceedings... Cali: CIAT, 1993. p. 168-174.(CIAT. Working Document, 123).

MALAURIE, B.; TROUSLOT, M.-F.; BERTHAUD, J.;BOUSALEM, M.; PINEL, A.; DUBERN, J. Medium-termand long-term in vitro conservation and safe internationalexchange of yam (Dioscorea spp.) germplasm. ElectronicJournal of Biotechnology, Valparaiso, v. 1, n. 3, Dec.1998.

MATSUMOTO, T.; MOCHIDA, K.; ITAMURA, H.; SAKAI,A. Cryopreservation of persimmon (Diospyros kakiThunb.) by vitrification of dormant shoot tips. Plant CellReports, Berlin, v. 20, p. 398-402, 2001.

MBANASO, E. N. A.; NWACHUKWU, E. C.; ENE, L. S.O. Progress on cassava improvement throughbiotechnology at the National Root Crops ResearchInstitute, Umudike. In: ROCA, W. M.; THRO, A. M. (Ed.).INTERNATIONAL SCIENTIFIC MEETING OF THECASSAVA BIOTECHNOLOGY NETWORK, 1., 1992,Cartagena. Proceedings... Cali: CIAT, 1993. p. 111-115.(CIAT. Working Document, 123).

MEDEIROS, J. de D. A biotecnologia e a extinção dasespécies. Revista Biotecnologia Ciência eDesenvolvimento, Brasília, DF, n. 30, p. 109-113. jan./jun. 2003.

MROGINSKI, L. A.; ROCA, W. M.; KARTHA, K. K.Crioconservación del germoplasma. In: ROCA, W. M.;MROGINSKI, L. A. (Ed.). Cultivo de tejidos en laagricultura: fundamentos y aplicaciones. Cali: CIAT, 1991.p. 715-730.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapidgrowth and bio assays with tobacco tissue cultures.Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p. 473-497, 1962.


NAVARRO, L.; PINA, J. A.; JUÁREZ, J.; ARREGUI, J.

M.; ORTEGA, C.; NAVARRO, A.; BALLESTER-OLMOS, J.

F.; VIVES, M. del C.; MONTALT, R.; DURÁN-VILA, N.;

GUERRI, J.; MORENO, P.; CAMBRA, M.; MEDINA, A.;

ZARAGOZA, S. El programa de mejora sanitaria de

variedades de cítricos en España: 30 años de historia.

Phytoma, Valencia, n. 170, p. 14-23, 2005.

REYNOLDS, J. F. Summary and future direction: chemical

regulation in tissue culture. HortScience, Alexandria, v.

22, n. 6, p. 1206-1207, 1987.

ROCA, W. M.; ARIAS, D. I.; CHÁVEZ, R. Métodos de

conservación in vitro del germoplasma. In: ROCA, W. M.;

MROGINSKI, L. A. (Ed.). Cultivo de tejidos en la

agricultura: fundamentos y aplicaciones. Cali: CIAT, 1991.

p. 697-713.

SANTOS, I. R. I. Criopreservação de germoplasma vegetal.

Bitecnologia Ciência & Desenvolvimento, Brasília, DF, n.

20, p. 60-65, 2001.

VIEIRA, M. L. C. Conservação de germoplasma in vitro.

Botecnologia Ciência & Desenvolvimento, Brasília, DF, n.

14, p. 18-20, 2000.

VILLALOBOS, V. M.; ENGELMANN, F. Ex situconservation of plant germplasm using biotechnology.World Journal of Microbiology and Biotechnology,Oxford, v. 11, p. 375-382, 1995.

VILLALOBOS, V. M.; THORPE, T. A. Micropropagación:conceptos, metodología y resultados. In: ROCA, W. M.;MROGINSKI, L. A. (Ed.). Cultivo de tejidos en laagricultura: Fundamentos y aplicaciones. Cali: CIAT,1991. p. 127-141.

WANG, Y.-L.; FAN, M.-J.; LIAW, S.-I. Cryopreservation ofin vitro-grown shoot tips of papaya (Carica papaya L.) byvitrification. Botanical Bulletin of Academia Sinica, Taipei,v. 46, p. 29-34, 2005.

WITHERS, L. A.; WILLIAMS, J. T. Conservação in vitro derecursos genéticos de plantas. In: TORRES, A. C.;CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos etransformação genética de plantas. Brasília, DF: Embrapa-SPI: Embrapa-CNPH, 1998. p. 297-330.

WITHERS, L. A.; WILLIAMS, J. T. Germplasmconservation in vitro and cryopreservation. In: TORRES,A. C.; CALDAS, L. S. (Ed.). Técnicas e aplicações dacultura de tecidos de plantas. Brasília, DF: ABCTP:

Embrapa-CNPH, 1990. p. 267-286.

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Presidente: Aldo Vilar Trindade.Secretária: Maria da Conceição P. Borba dos Santos.Membros: Abelmon da Silva Gesteira, Ana LúciaBorges, Antonio Alberto Rocha Oliveira, CarlosAlberto da Silva Ledo, Davi Theodoro Junghans,Eliseth de Souza Viana, Léa Ângela Assis Cunha,Marilene Fancelli.

Supervisão editorial: Ana Lúcia Borges.Revisão de texto: Cláudia Fortes Ferreira, Jorge LuizLoyola Dantas.Tratamento das ilustrações: Saulus Santos da Silva.Editoração eletrônica: Saulus Santos da Silva.

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