presentation tese biof ufrj 2009

A chaperona ClpB/HSP104 de Trypanosoma cruzi

Roberta Alvares Campos

Turán Péter Ürményi

Lab. Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro

Programa de Biologia Molecular e Estrutural

IBCCF/UFRJ

Protozoário flagelado

Agente Etiológico

da Doença de Chagas

Organismo Eucarioto unicelular

Ordem: Kinetoplastida

- Mitocôndria única e alongada.

- organelas especializadas, ricas em kDNA = cinetoplastos.

Tripanossomatídeos

Trypanosoma cruzi (CL Brener)

The TIGR Genome Project - Julho de 2003

T. cruzi (Esmeraldo) - J. Craig Venter Institute

Afeta 18 milhões de pessoas em 21 países.

Trypanosoma brucei

Agente Etiológico Doença do Sono

Leischmania sp.

Leishmaniose.

Doenças Extremamene Negligenciadas, segundo a OMS.

O modelo de estudo Trypanosoma cruzi

Forma Epimastigota. (Docampo et al., 1975).

Doenças Globais: Doenças crônicas como o câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios neurológicos e a AIDS.

Doenças Negligenciadas:Como a malária, provocam um interesse “marginal” na indústria farmacêutica.

Doenças Extremamente Negligenciadas:Doença do sono, Chagas e Leishmaniose, afetam populações de extrema pobreza.

Fonte: DNDi – Drugs for Neglected Diseases 2007 (http://www.dndi.org.br/)

A Doença de Chagas

Vetorialsilvestre

domiciliar ouperidomiciliar

Transfusãosanguínea ouCongênita, damãe para feto.

Transplantesde órgãosinfectados

Via oral

leite maternoou alimentos

Acidentes

em laboratórios

O Ciclo de vida do T. cruzi. (Modificado do CDC, 2009).

Organismos evolutivamente antigos

Transcrição multigênica

Trans-splicing

Regulação gênica pós-transcricional

Mecanismos de resposta ao estresse diferenciado

As peculiaridades moleculares do T. cruzi

Estresse no ciclo biológico do T. cruzi

Hospedeiro mamífero

Baixo pH

Enzimas proteolíticas

Produtos oxidativos

Temperatura = 37⁰

Pontos potenciais de estímulos de stress no ciclo biológico do T. cruzi. Rondinelli, E. 1994.

Estresse & desnaturação protéica

As Chaperonas moleculares e sua importância

Proteínas

imunogênicas

ATPases - Superfamília de Proteínas AAA+ Clp/HSP100

Controle de qualidade de enovelamento protéico

ClpB/HSP104

ClpA (ClpP, ClpS, ClpX, ClpQ)

Clp/HSP100

Funções da proteína ClpB/HSP104

LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.

Estrutura da proteína Clp/HSP104

LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.

GIAMBIAGI DE-MARVAL et al., 1996.

CLOS et al., 1995.

Resultados anteriores com expressão de HSPs em tripanossomatídeos

CARVALHO et al., 1990.

103 kDa

92

75

61

29 37 40

OBJETIVOS

I. Caracterizar a estrutura gênica de ClpB/HSP104 de T. cruzi.

II. Investigar a expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque

térmico.

III. Propor a estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 por

modelagem molecular.

ESTRUTURA GÊNICA

T. cruzi CDSTc00.104705350

6821.20

HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (pseudogene), putative, serine peptidase (pseudogene),

putative, 7106.t00002


7027.59pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7179.t00009


6617.90ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (HSP100)(pseudogene), putative, 7023.t00008


9125.20HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 8007.t00002


8233.60heat shock protein 100 (clp protein), putative, 7649.t00006


1107.41ATP-dependent Clp protease subunit heat shock protein 100 (HSP100), putative, 8599.t00005


6941.229pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7147.t00033






8665.14ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (HSP100), putative, 7820.t00005


9127.10

HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78 (pseudogene), putative, serine peptidase, putative,

8008.t00001

Busca da sequência do gene ALVO clpb/hsp104 de

T. cruzi

Agosto 2005

GeneID: 3532962 Locus tag: Tc00.1047053508665.14 Protein: EAN81877

http://www.genedb.org/genedb/Search?organism=tcruzi&name=Tc00.1047053506821.20&isid=true






















Sequência incompleta do gene ClpB/HSP104 de T. cruzi, no banco dados do TcruziDB

Estratégia de mapeamento do terço final de Clp/HSP100

200 pb

Obtenção da sequência completa do gene ClpB/HSP104

GAP previsto de 33 pares de bases

Região Codificante total do GeneClpB/HSP104 = 2604 pbProteína de 868 Aa

Sequência completa de aminoácidos de ClpB/HSP104 em T. cruzi

Identidade de 71,9%

Alinhamento de sequências de Clp/HSP100

Análise filogenética preliminar da Proteína ClpB/HSP104

Modelo radial com calculo da distância genética Jukes-Cantor e Método de construção por Neighbor-Joining.

Obtenção de sonda molecular do gene clpB/hsp104

de T. cruzi

980 pb

Análise por padrão de fragmentos genômicos de

clpb/hsp104

Xh

oI

Eco

010

9

Xb

aI

Hin

d II

I

Não

-dig

.

5 kb

2 kb

Eco

RI

Pst

I

Sal

I

Bam

HI

Hin

fI

Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104

EXPRESSÃO GÊNICA

Expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico

4o°C37°C29°C

Extrato Protéico

RNA Total

SDS-PAGEWestern blot

2D-IEFImmunobloting

Northern blot

qRT-PCR

Indução do mRNA ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico

Indução da Proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi em resposta ao

choque térmico

M 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 h 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 horas

Otimização das condições de amostras para 2D-IEF

Isoformas de ClpB/HSP104 de T. cruzi em diferentes temperaturas

250

150 100

75

50

37

15

A B29 37

150

100

75

50

37

15

29

MODELAGEM MOLECULAR

Utilização da Modelagem molecular

Discriminação entre as subfamilias das

Clps/HSP100.

Procura por domínios conservados.

Características estruturais podem ser úteis

para predizer funções.

A caracterização estrutural pode nos guiar ao

estudo de peptídeos candidatos para

diagnóstico de doença de Chagas.

Construção do modelo tridimensional da proteína

ClpB/HSP104 de T. cruzi por Modelagem Comparativa

Explora similaridades estruturais entre PTNs

Depende de um molde disponível no banco (PDB)

Pressupõe regiões de conservação evolutiva entre PTNs

Construção do modelo tridimensional da proteína

Análise e validação do modelo gerado

Moldes disponíveis no banco de dados - PDB

Domínios Conservados – NCBI conserved domain

Escolha do Molde/Template no PDB

Proteína Organismo ID PDB Identidade Similaridade Cobertura

ClpB T. thermophilus 1QVR 53% (457/858) 72% (613/858) 98,84%

ClpA E. coli 1KSF 43% (150/347) 61% (215/347) 39,94%

ClpB E. coli 1JBK 66% (128/192) 84% (162/192) 22,11%

ClpB P. falciparum 2P6S 62% (116/187) 81% (152/187) 21,54%

ClpB S. cerevisiae 2QR9 27% (56/204) 46% (94/204) 23,50%

Modelo “868” construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi

com o programa Modeller e visualizados com Pymol (WARREN, 2004). É um monômero que constitui a sexta parte do hexâmero da proteína.

Modelo tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi

Gráfico de Ramachandran

regiões muito favoráveis – 91.3%, regiões favoráveis – 7.3%, generosamente permitidas – 1.2% ,regiões desfavoráveis – 0.3%

Validação do modelo tridimensional proposto da proteína

ClpB/HSP104 de T. cruzi

Análises utilizando o programa MODELLER:Todos os 300 modelos obtiveram GA341 = 1.0 indicando a boa escolha do molde (template) pelo usuárioOs 300 modelos foram ranqueados segundo o Discrete Optimized Protein Energy (DOPE) quanto menor o DOPE, maior a acurácia do modelo.

Análise utilizando o programa PROCHECK:Os 300 modelos foramranqueados segundo o Gráficode Ramachandran.

(A) TClpB104 de T. thermophilus com os principais domínios estruturais da proteína (LEE et al., 2003).

(B) Modelo do monômero construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi. Em laranja = L1, em marinho = L2, em rosa = L3, em azul claro = L4. Os 2 monômeros foram colocados em eixos semelhantes para esta comparação. Programa Pymol (Yao & Warren, 2004).

Comparação estrutural T. thermophilus X T. cruzi construído

por modelagem molecular

Estudo de peptídeos candidatos da chaperona ClpB/HSP104 de T. cruzi para diagnóstico da doença de Chagas

(A) Modelo “868” de ClpB/HSP104 de T. cruzi (verde) fitado com o modelo de ClpP Humana (1TG6). (B) Modelos fitados com detalhes para os 2 peptídeos propostos para futuros alvos de diagnóstico.

Foi obtida a sequência completa do gene clpb/hsp104 de T. cruzi que dá origem auma proteína de 868 aminoácidos, com identidade de 71,9% quando comparadosaos genes ortólogos dos demais tripanossomatídeos.

Análises de Southern blot sugerem que o gene clpB/hsp104 está presente nogenoma de T. cruzi em cópia única.

Análises do teor relativo do mRNA mostraram que ocorre indução dos níveis demRNAs clpB/hsp104 de T. cruzi após o choque térmico, com um aumento de 4vezes a 37 ºC e de 2 vezes a 40ºC.

Análises de indução por choque térmico com a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi,mostraram que ela está presente tanto na temperatura normal de cultivo 29ºC,como em choque térmico, levando a um acúmulo da proteína à 37 ºC quanto a à40ºC, sendo mais evidente ao final de 24 horas de incubação à 37 ºC.

Conclusões

A proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi está presente em uma única isoforma à 29ºC com pI aproximado de 6.5, e o número de isoformas parece aumentar com o choque térmico a 37ºC.

Foi proposta uma estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi por modelagem molecular de boa qualidade e que definiu que a proteína de T. cruzi é uma ClpB/HSP104.

Conclusões

-Mapeamento do tamanho e da meia vida do mensageiro deClpB/HSP104 utilizando RNA Poly A+

-Análises proteômicas dos spots encontrados dos géis 2D-IEF emMALDI-TOF.

- Estudo detalhado dos 2 peptídeos funcionais propostos nestetrabalho, ligados a uma molécula de avidina no N-terminal paraensaios de captura em placas de Elisa para testes deimunogenicidade da proteína contra soros Chagásicos.

Perspectivas

RAC - Tese 24/07/2009

Agradecimentos especial as colaborações

Proteômica 2D-IEF

Lab. de Diagnóstico de Doenças Infecciosas

Líder: José Mauro Peralta

Giovani Veríssimo

Inst. de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/UFRJ

Modelagem molecular

Lab. de Física Biológica

Líder: Paulo Bisch

Manuela Leal

IBCCF/UFRJ

RAC - Tese 24/07/2009

MUITO OBRIGADO!

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Education