prática 2 - 2015

8/16/2019 Prática 2 - 2015

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DESCARBOXILAÇÃO DE

AMINOÁCIDOS

Existem bactérias que possuem enzimas descarboxilasesespecíficas para determinado aminoácido:

Estas enzimas são capazes de atacar o grupo carboxilodo aminoácido originando uma amina ou diamina edióxido de carbono.

As três descarboxilases mais importantes, utilizadas naidentificação bacteriana, são as que actuam sobre osaminoácidos Arginina, Lisina e Ornitina.

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AMINOÁCIDOS

As enzimas descarboxilase são numerosas e cada uma delas éespecífica para um determinado substrato:

São enzimas adaptativas ou indutivas, ou seja, só são formadasquando a bactéria é cultivada em meio ácido e na presença dosubstrato específico;

Os produtos resultantes da descarboxilação vão provocar umaumento de pH do meio;

O processo de descarboxilação ocorre em anaerobiose, éirreversível e não oxidativo

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AMINOÁCIDOS

Metodologia:

Descarboxilase Base Moeller suplementado com oaminoácido em análise;

Tubos cobertos com parafina líquida estéril;

Incubação até 7 dias;

O resultado é dado por uma mudança da cor do meio.

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AMINOÁCIDOS

Com o isolamento do conteúdo dos tubos com parafina:

Todo o oxigénio existente no seu interior é consumido

pelas bactérias para o seu crescimento inicial;

Durante a descarboxilação dos aminoácidos e, à medidaque se produz dióxido de carbono, o pH do meio

aumenta:

A mudança do pH do meio leva à mudança da cor doindicador de pH presente.

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AMINOÁCIDOS

Após o período de incubação pode observar-se 3resultados diferentes:

Mudança da cor do meio para violeta - resultadopositivo;

Mudança da cor do meio para amarelo - resultadonegativo;

Sem mudança da cor do meio - sem reacção.

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Resultados: A - Reacção positiva;B - Reacção positiva débil;C - Reacção negativa.

A B C

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LIQUEFACÇÃO DAGELATINA

Determinar a capacidade de uma bactéria de produzir aenzima gelatinase, liquefazendo a gelatina;

As proteínas são moléculas muito grandes para entraremnas bactérias.

Têm que ser catabolizadas em compostos mais pequenos;

Enzimas exocelulares do tipo proteolítico (gelatinase) sãosecretadas por algumas bactérias.

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Prova da liquefacção da gelatina: A - Gelatinase negativa;B - Gelatinase positiva;C - Gelatinase positiva.

A

B

C

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PROVA DO VERMELHO DEMETILO

Os produtos finais da degradação da glicose dependem dosistema enzimático existente na bactéria;

A concentração de hidrogeniões (pH) depende da relaçãoentre dióxido de carbono e hidrogénio (CO2:H2) e esta, dociclo seguido no metabolismo da glicose;

Após 24 a 72 horas de incubação, as bactérias fermentativas vão produzir altas concentrações de metabolitos ácidos(ácido láctico, succínico, acético e fórmico);

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O indicador de pH, vermelho de metilo, é utilizadopara determinar o pH do meio;

Inicialmente todas as bactérias fermentativas dão uma

reacção positiva:

É necessário um tempo de incubação prolongado (2a 5 dias):

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Findo o período de incubação:

As bactérias MR positivas continuam a produzir metabolitos

ácidos, levando a uma diminuição de pH, mantendo-se omeio ácido (cor vermelha);

As bactérias MR negativas, descarboxilizam os metabolitosiniciais da fermentação, levando à produção de carbonatos,dióxido de carbono e acetoína, levando a um aumento do pHfinal do meio, que fica perto da neutralidade (cor amarela).

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REACÇÃO DE VOGES-PROSKAUER

Baseia-se na detecção de acetoína:

Produto final neutro da degradação da glicose;

Esta reacção “continua a reacção de vermelho de metilo”:

Muitas bactérias degradam o ácido pirúvico, dando origem a vários ácidos (ácidofórmico, acético e succínico) e ainda, álcool etílico, hidrogénio e dióxido de carbono;

Algumas bactérias são capazes de utilizar estes ácidos para produzirem 2, 3- butanodiol;

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A acetoína é um precursor do 2, 3-butanodiol, acumulando-se quando a bactéria é cultivada em aerobiose:

A produção de acetoína e 2, 3-butanodiol é um sistema reversível deoxidação-redução;

Na presença de oxigénio atmosférico e pH alcalino, estas duassubstâncias são oxidadas em acetileno e creatina:

A creatina é a substância necessária para o aparecimento da cor nareacção de Voges-Proskauer.

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Metodologia:

Utiliza-se o mesmo meio da prova de vermelho de metilo;

Após o período de incubação adiciona-se 2 reagentesdistintos:

!-naftol (intensificador da cor);

KOH (necessário para a alcalinização do meio).

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Reacção de Voges-Proskauer: A - Reacção negativa;B - Reacção positiva.

A B

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HEMÓLISE

Muitas bactérias patogénicas produzem hemolisinas,ou seja, enzimas capazes de degradar eritrócitos;

Para a detecção da hemólise utiliza-se o agar sangue(agar nutritivo suplementado com 5% (v/v) deeritrócitos de carneiro);

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HEMÓLISE

Existem 3 tipos distintos de hemólise:

!-hemólise em que se verifica uma hemólise incompleta dos eritrócitos; ascolónias surgem com um halo verde acizentado;

"-hemólise, em que se verifica uma hemólise completa dos eritrócitos; ascolónias surgem rodeadas por um halo claro;

#-hemólise, em que não se verifica qualquer tipo de hemólise doseritrócitos.

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Aeromonas salmonicida - bactéria"-hemolítica

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SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS

Os antibióticos são substâncias químicas utilizadas notratamento de doenças de etiologia bacteriana:

Interferem com o metabolismo microbiano semproduzirem um efeito semelhante no organismohospedeiro;

Importância terapêutica;

São utilizados em taxonomia bacteriana.

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SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS

Utiliza-se a técnica da difusão em placa (método de Kirby-Bauer):

Permite uma rápida determinação da sensibilidade da bactéria aosdiferentes antibióticos;

Mede-se o diâmetro do halo de inibição de crescimento bacteriano;

Compara-se o tamanho do halo de inibição com valores presentes emtabelas padronizadas.

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ANTIBIOGRAMAS

AntibióticoDiâmetro da zona de inibição (mm)

Resistente Intermédio Sensível Ampicilina (AMP-10) $ 11 12-13 % 14

Estreptomicina (S-10) $ 11 12-14 % 15

Tetraciclina (TE-30) $ 14 15-18 % 19

Oxitetraciclina (OT-30) $ 14 15-18 % 19

Florfenicol (FFC-300) $ 16 17-20 % 21

Ácido oxolinico (AO-3) $ 10 16-20 % 20

Trimetoprim-Sulfametazol (SXT-25) $ 16 17-19 % 20

Enrofloxacina (ENR-25) $ 15 16-20 % 21

Flumequina (UB-30) $ 10 16-20 % 20

Eritromicina (E-15) $ 13 14-17 % 18Principais antibióticos utilizados em aquacultura e respectivos halos de sensibilidade/inibição.

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