potencial genotóxico do extrato aquoso da raiz da planta

1

TERESINHA ROSA CABRAL

Potencial Genotóxico do Extrato Aquoso da raiz da planta Physalis

Angulata

Belém – Pará

2005

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2


Potencial Genotóxico do Extrato Aquoso da raiz da planta Physalis

Angulata

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Neurociências e Biologia Celular, do

Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal

do Pará, como requisito parcial para obtenção do grau de

mestre.

Prof. Orientador: Dr. Rommel M. R. Burbano

Belém – Pará

3

2005

Dados Internacionais da Catalogação-na-Publicação (CIP)

Biblioteca de Pós-Graduação do ICB-UFPA – Belém (PA)

Cabral, Teresinha Rosa

Potencial genotóxico do extrato aquoso daraiz da planta Physalis Angulata / Teresinha RosaCabral; orientador, Rommel Mario Rodríguez Burbano.– 2005.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará,Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduaçãoem Neurociências e Biologia Celular, Belém, 2005.

1. Plantas medicinais. 2. Plantas medicinais – Toxicidade.3. Solanaceae. 4. Toxicologia genética. 5. Matéria médicavegetal. I. Título.

4

CDD – 20. ed. 615.321

5


Potencial Genotóxico do Extrato Aquoso da raiz da

planta Physalis Angulata

Banca Examinadora:

________________________________________________Prof. Dr. Rommel Mario Rodrigues Burbano (orientador)Departamento de Biologia, CCB, UFPA

________________________________________________Prof. Dr. José Luiz Martins do NascimentoDepartamento de Fisiologia, CCB, UFPA

________________________________________________Profª Drª. Maristela Gomes da CunhaDepartamento de Patologia, CCB, UFPA

________________________________________________- Profª Dra. Marucia I. Medeiros de AmorimCentro de Ciências Biológicas e da Saúde, UNAMA

________________________________________________Prof. Dr. Edivaldo Herculano Corrêa de Oliveira (suplente)Departamento de Genética, CCB, UFPA

Belém – Pará

6

2005

DEDICATÓRIA▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬

AMIGOS

Tenho amigos que não sabem o quanto são meus amigos.

Não percebem o amor que lhes devoto e a absoluta necessidade que tenho deles.

A amizade é um sentimento mais nobre do que o amor, eis que permite que o objeto

dela se divida em outros afetos, enquanto o amor tem intrínseco o ciúme, que não

admite a rivalidade. E eu poderia suportar, embora não sem dor, que tivessem

morrido todos os meus amores, mas enlouqueceria se morressem todos os meus

amigos! Até mesmo aqueles que não percebem o quanto são meus amigos e o

quanto minha vida depende de suas existências.

A alguns deles não procuro, basta-me saber que eles existem. Esta mera condição

me encoraja a seguir em frente pela vida. Mas, porque não os procuro com

assiduidade, não posso lhes dizer o quanto gosto deles. Eles não iriam acreditar.

Muitos deles estão lendo esta crônica e não sabem que estão incluídos na sagrada

relação de meus amigos.

Mas é delicioso que eu saiba e sinta que os adoro, embora não declare e não os

procure. E às vezes, quando os procuro, noto que eles não tem noção de como me

são necessários, de como são indispensáveis ao meu equilíbrio vital, porque eles

fazem parte do mundo que eu, tremulamente, construí e se tornaram alicerces do

meu encanto pela vida. Se um deles morrer, eu ficarei torto para um lado. Se todos

eles morrerem, eu desabo!

Por isso é que, sem que eles saibam, eu rezo pela vida deles. E me envergonho,

porque essa minha prece é, em síntese, dirigida ao meu bem estar. Ela é, talvez,

fruto do meu egoísmo. Por vezes, mergulho em pensamentos sobre alguns deles.

Quando viajo e fico diante de lugares maravilhosos, cai-me alguma lágrima por não

estarem juntos de mim, compartilhando daquele prazer .Se alguma coisa me

consome e me envelhece é que a roda furiosa da vida não me permite ter sempre ao

meu lado, morando comigo, andando comigo, falando comigo, vivendo comigo,

todos os meus amigos, e, principalmente os que só desconfiam ou talvez nunca vão

saber que são meus amigos!

7

A gente não faz amigos, reconhece-os.

(Vinícius de Moraes)

8

Aos meus pais, João e Fátima, pelo amor

transmitido e por seus ensinamentos que me

tornaram a pessoa que sou.

9

Aos meus irmãos João, Léa, Conce, Gênia,

Bel, Pedro e Ivone, aos meus sobrinhos Fer,

Carol, Tiago, Pedro Henrique, Lucas, Leila por

existirem na minha vida, pois sei que sem eles

eu seria um pouco menos. E a minha Marina,

estímulo às minhas conquistas.

10

AGRADECIMENTOS▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬

Descobertas e aperfeiçoamentos importantesinvariavelmente envolvem a cooperação de muitasmentes. Eu posso ter recebido o crédito por terdeixado uma trilha, mas quando olho odesenvolvimento subseqüente, eu percebo que omérito pertence também aos outros. (Graham Bell)

Ao concluir este trabalho quero registrar minha gratidão às pessoas que

atuaram de modo fundamental para a sua realização.

Ao Profº Dr. Rommel Burbano, no processo de orientação deste trabalho.

A uma pessoa muito especial, Profª Dra. Isabel Cabral, por sua contribuição

imprescindível na construção deste trabalho.

A Coordenação do Curso de Pós-graduação em Neurociências e Biologia

Celular, UFPA.

De maneira muito especial à equipe do Laboratório de Citogenética Humana e

Genética Toxicológica, pelo apoio, mesmo que algumas vezes, apenas emocional.

11

A ciência será sempre uma busca, jamais um

descobrimento real. É uma viagem, nunca uma

chegada.

12

Karl Popper

13

RESUMO▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬

A Physalis angulata pertece à família Solanaceae que é largamente distribuída nas

regiões tropicais e subtropicais do mundo. Extratos e infusões desta planta são

amplamente usados em vários continentes na medicina popular para tratamento de

uma variedade de patologias, tais como: malária, gonorreia, dermatite, hepatite,

entre outras. Todavia, não há relatos de investigação da genotoxicidade de extratos

aquoso desta planta. Assim, o objetivo desta pesquisa foi investigar o potencialgenotóxico do extrato aquoso da P. angulata, nos linfócitos de sangue periférico

humano, usando os ensaios de aberrações cromossômicas e de eletroforese em gel

de células individualizadas ou teste do Cometa. Os resultados obtidos neste estudo

indicam que: (a) na presença do extrato aquoso nas concentrações de 0,1 µg/mL,

0,5 µg/mL, 1 µg/mL, observou-se um aumento na taxa de proliferação dos linfócitos

tratados (p<0,01), (b) as concentrações acima de 2 µg/mL as doses foram

consideradas citotóxicas, pois resultou em 50% de citotoxicidade comparada ao

controle negativo; (c) o extrato aquoso da P. angulata não apresentou efeito

clastogênico; (d) houve indícios de quebra de fitas simples do DNA ou outro tipo de

lesão nessa molécula, segundo o teste do Cometa. O Extrato aquoso da P. angulata

exibiu efeito tóxico sobre o cromossomo ou sobre a molécula de DNA.

14

ABSTRACT▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬

The Physalis angulata belong to the Solanaceae family that is widely distributed in

tropical and subtropical regions of the world. Extracts and infusions of this plant are

widely used in various continents in folk medicine to treat a variety of diseases such

as malaria, gonorrhea, dermatitis, hepatitis, among others. However, there are no

reports of investigation of genotoxicity of extracts or isolated compounds from this

plant. The objective of this research was to investigate the genotoxic potential of

aqueous extract of P. angulata, in human peripheral blood lymphocytes, using the

chromosomal aberrations assay and single cell gel electrophoresis (Comet Assay).

The results of this study indicate that: (a) in the presence of aqueous extract at

concentrations of 0.1 g / mL, 0.5 mg / mL, 1 mg / mL, there was an increased rate of

proliferation of lymphocytes treated (p <0.01), (b) concentrations above 2 mg / mL

doses were considered cytotoxic because it resulted in 50% cytotoxicity compared tonegative control, (c) the aqueous extract of P. angulata showed no clastogenic effect,

(d) there were no breaks single strands of DNA or other type of lesion in thismolecule, second test of the Comet. The aqueous extract of P. angulata showed toxic

effect on the chromosome or on the DNA molecule.

15

SUMÁRIO

I INTRODUÇÃOI.1 AS PLANTAS MEDICINAIS 11I.2 FITOTERÁPICOS NO SISTEMA DE SAÚDE BRASILEIRO 131.3 PESQUISA DE GENOTOXICIDADE EM PLANTAS MEDICINAIS 14

I.3.1 Alterações na Molécula de DNA 16a) Teste das Aberrações Cromossômicas 17b) Teste do Cometa (SCGE – Single Cell Gel Eletrophoresis) 17

I.3.2 A pesquisa da genotoxicidade de plantas medicinais no Brasil 18I.4 A Physalis angulata 20

I.4.1 Taxonomia 20I.4.2 Descrição da Planta 20I.4.3 Etnofarmacologia da Physalis angulata 24I.4.4 Efeito biológico de extratos e compostos derivados de P. angulata 26

a) Atividade antiinflamatória 27b) Atividade Imunomoduladora 27c) Atividade Antitumoral 27

II OBJETIVOS 30III MATERIAL E MÉTODOS 31III.1 MATERIAL BOTÂNICO 31III.2 OBTENÇÃO DO EXTRAÇÃO AQUOSO DA PLANTA P. angulata 31III.3 AMOSTRA CELULAR 31III.4 CULTIVO DE LINFÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO 32III.4.1 Teste do Cometa em linfócitos humanos 32III.4.2 Teste das Aberrações Cromossômicas 34III.5 Análise Estatística 34IV RESULTADOS 35IV.1 EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA Physalis angulata EM

LINFÓCITOS HUMANOS DE SANGUE PERIFÉRÍCO, TRATADOS INVITRO , AVALIADO PELO ENSAIO DO COMETA.

IV.2 EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA Physalis angulata EMLINFÓCITOS HUMANOS DE SANGUE PERIFÉRÍCO TRATADOS INVITRO , AVALIADO PELO ENSAIO CITOGENÉTICO DE ABERRAÇÕESCROMOSSÕMICAS.

V DISCUSSÃO 42VI CONCLUSÃO 43VII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 47

11

I - INTRODUÇÃO

I.1 – AS PLANTAS MEDICINAIS

Ao longo de sua história, o ser humano acumulou informações sobre o

ambiente que o cerca e, sem dúvida, toda essa informação foram baseadas na

observação constante e sistemática dos fenômenos e características da natureza e

na experimentação empírica desses recursos.

A preocupação em desvendar e resgatar o conhecimento referente ao uso

dos elementos do ambiente natural incluiu os conhecimentos relativos ao mundo

vegetal, em especial, o estudo das plantas medicinais.

Sabe-se que o uso das espécies vegetais com fins de tratamento e cura

de doenças e sintomas, se perpetuou na história da civilização humana e chegou até

os dias atuais.

A utilização de fitoterápicos1 e seus efeitos genotóxicos, tem sido alvo de

muitos estudos, pois o uso dos produtos naturais tem sido utilizado como uma

tentativa de buscar novas opções de combate a diferentes patologias, porém,

poucos estudos têm sido realizados acerca da genotoxicidade de fármacos.

Grande parte dos medicamentos comercializados são oriundos dos

produtos naturais, principalmente de plantas. Além disso, sabe-se que os produtos

naturais na medicina alternativa (homeopatia, florais de Bach) ou fitoterápica

(produtos de origem vegetal, como ervas medicinais) são utilizados por

aproximadamente 80% da população mundial, através dos chamados remédios

“naturais” (UICN, 1993).

Há um estímulo crescente, principalmente das indústrias farmacêuticas

para realização de estudos das propriedades farmacológicas de princípios ativos

isolados de plantas, na tentativa de descobrir novas moléculas de valor terapêutico,

1 Fitoterápico é todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais com finalidade profilática, curativa e para fins de diagnósticos, com benefício para ousuário. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pelareprodutibilidade e constância de sua qualidade: é o produto final acabado, embalado e rotulado, segundo aPORTARIA Nº 6/MS/SNVS de 31 de janeiro de 1995.

12

principalmente as encontradas nas florestas tropicais, tais como a existente na

região amazônica.

Para realização destes estudos, são adotados testes padronizados em

animais, usando extratos de milhares de plantas, porém estes testes são

demorados, têm custos elevados e os resultados nem sempre são os esperados

pela indústria. Para minimizar custos e aumentar a especificidade, os pesquisadores

recorrem ao conhecimento etnobotânico, a fim de dirigir os estudos experimentais, e

visando identificar substâncias ou compostos com efeito terapêutico comprovado,

cientificamente. Considerando a enorme biodiversidade, além do conhecimento

etnobotânico e etnofarmacológico, muito comum entre a população brasileira, o

Brasil poderia ser um país potencialmente importante neste mercado (FERREIRA,1998; BALICK & MENDELSOHN, 1992; ALICE et al, 1991)

A flora brasileira, com sua grande biodiversidade, apresenta muitas

plantas medicinais, com possível valor terapêutico, com base nas indicações

etnofarmacológicas, são usadas para o tratamento de doenças específicas, tais

como: quebra-pedra (Phyllanthus niruri L.), utilizada na redução de cálculo renal,

calêndula (Calendula officinalis L.) usada como cicatrizante e anti-séptico, ipê-roxo

(Tabebuia avellaneade) para asma e infecções, babosa (Aloe Vera) usada como

hidratante e antiinflamatório e pata-de-vaca (Bauhinia forficata) para curar diabetes

tipo II. Porém, pouco se conhece a cerca dos efeitos biológicos da grande maioriadessas plantas (BARROS et al., 2003; CHOI & CHUNG, 2003; DE MIRANDA et al,

2004; PEPATO et al., 2004)

É inegável a existência de muitos benefícios no uso de um produto

natural, porém necessariamente, não implica em ausência de efeitos colaterais.

Sabe-se que a utilização de algumas plantas medicinais pode causar riscos à saúdehumana, o que já foi registrado para plantas tais como: o confrei (Symphitum sp.L)

que pode causar lesões hepáticas, inclusive carcinoma (Hirono et al., 1978); a folha

do pessegueiro (Amygdalus pérsica L.) que contêm amigdalina, um glicosídeo

altamente tóxico que gera ácido cianídrico ao ser hidrolisado no organismo,

provocando a inibição da respiração celular e consequente anóxia; a flor dadedaleira (Digitalis purpúrea) que contêm digitalis, medicamento utilizado para

aumentar as contrações do coração em paciente com insuficiência cardíaca, porém

estes glicosídeos possuem dose terapêutica próxima à dose tóxica (MARULLAZ,

1991).

13

Adicionalmente, muitos xenobiontes, incluindo substâncias isoladas de

plantas medicinais, são capazes de induzir modificações químicas no DNA as quais

podem ser nocivas às células, pois interferem em processos vitais, como a

duplicação do DNA e a transcrição gênica, bem como podem agredir a estrutura doDNA promovendo lesões gênicas e cromossômicas (TRAORE et al., 2000; TAYLOR

et al., 2003; VERSCHAEVE et al., 2004). Estas alterações podem culminar com a

morte celular ou o desenvolvimento de processos neoplásicos.

A identificação dos possíveis efeitos biológicos desses produtos naturais

com propriedades farmacológicas permite definir a melhor forma de sua utilização

em larga escala, sendo de impacto para populações de países subdesenvolvidos ou

em desenvolvimento, uma vez que o custo para a produção dos fitoterápicos é

inferior àquele para as drogas industrializadas (FERREIRA, 1998).

O consumo cada vez maior de fitoterápicos tem despertado o interesse

em pesquisas científicas nessa área, e o custo inferior na sua produção tem

motivado a implantação nos sistema de saúde pública.

I.2- FITOTERÁPICOS NO SISTEMA DE SAÚDE BRASILEIRO

Parte da população brasileira utiliza-se de vegetais para amenizar seus

males e as propriedades medicinais em muitas dessas plantas ainda reside apenas

em observações etnobotânicas. Paralelamente, estudos científicos têm comprovado

a atividade farmacológica de extratos vegetais, o que vem forçando o governo

brasileiro a estabelecer uma política de apoio às pesquisas com fitoterápicos bem

como sua utilização pelo Sistema Único de Saúde (SUS).

Assim sendo, alguns fitoterápicos vêm sendo introduzidos nas farmácias

do Sistema de Saúde de diversas cidades brasileiras, inclusive capitais, como pode

observado para o Programa de Plantas Medicinais da Secretaria do Estado de

Saúde do Rio de Janeiro, Farmácia Popular da Secretaria Municipal de Saúde de

Campinas (SP), Programas Farmácia Verde e Farmácia Viva, de Ipatinga e Betim

(MG).

Somando-se ao movimento internacional de valorização das plantas

medicinais em larga escala, e considerando-se os riscos no seu uso indiscriminado,

há pouco tempo o governo brasileiro passou a recomendar que os fitoterápicos

14

sejam alvos de investigação do seu potencial mutagênico antes de serem

comercializados. Tal ação foi implementada pelo Ministério da Saúde do Brasil por

meio da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) na Resolução-RE nº90,

de 16 de março de 2004, a qual determinou que os estudos de toxicidade pré-clínicade produtos fitoterápicos incluam a avaliação in vitro e in vivo de genotoxicidade,

sugerindo o teste da reversão de mutação em bactérias (com e sem ativação

metabólica), de danos a cromossomos de mamíferos e a avaliação do dano em

cromossomos de células hematopoiéticas de roedores (BRASIL, 2004).

Essa exigência deve-se ao fato de que, concomitante a comprovação do

efeito farmacológico é indispensável a investigação de genotoxicidade, visto que

esse efeito pode ser extrapolado como de risco para a saúde humana. Essa

determinação busca a segurança no uso da fitoterapia, ou seja, a minimização ou

eliminação de possíveis efeitos colaterais citotóxicos e genotóxicos do uso de

fitoterápicos, uma vez que esses efeitos foram identificados para alguns extratos de

plantas medicinais (VERSCHAEVE et al, 2004; TAYLOR et al, 2003; TRAORE et al,

2000).

Embora várias plantas sejam utilizadas com fins terapêuticos, inclusive

comercializadas, em muitos casos não se possui dados científicos que comprovem

sua eficácia e seu espectro toxicológico no homem. Porém, as exigências de

segurança, eficácia e qualidade, estabelecidas pelas agências regulamentadoras de

medicamentos, se tornaram mais rígidas, sendo que a permanência ou entrada no

mercado desses produtos está relacionada com o desenvolvimento de estudos

científicos objetivando a obtenção de matérias-primas controladas, o

desenvolvimento de tecnologias apropriadas para a obtenção de extratos vegetais e,

especialmente, a realização de ensaios biológicos (BRASIL, 2004).

I.3 – PESQUISA DE GENOTOXICIDADE DE PLANTAS MEDICINAIS

Segundo a Food and Drug Administration (FDA-USA, 1997) e outras

agências especializadas, a pesquisa de genotoxicidade de produtos naturais deve

se iniciar com a aplicação do teste de Ames que avalia a capacidade de compostosou misturas complexas induzirem mutações em Salmonella, tendo excelente

correlação com a genotoxicidade induzida no genoma humano. Complementando a

15

bateria mínima, tem-se os testes in vitro com células humanas com análise de

lesões no DNA e em cromossomos (testes do Cometa e das aberrações

cromossômicas) que refletem diretamente o potencial genotóxico do agente-teste,

útil para predição de riscos.

Há uma ampla variedade de agentes capazes de induzir lesões no DNA

celular, estas podem ser reparadas, restaurando a função biológica da informação

genética, ou podem não ser reparadas ou reparadas inadequadamente, resultando

em mutações. Algumas dessas mutações podem ser visualizadas como aberrações

cromossômicas, dessa forma, pode-se avaliar a atividade mutagênica de um agente

por meio de análise dessas alterações (GOLLIN, 2005).

Os linfócitos são indicadores sensíveis aos agentes genotóxicos, pois há

uma correlação entre os danos induzidos nas células do sangue e outras células

somáticas, servido de eficiente modelo para pesquisas de genotoxicidade, além de

apresentarem uma vida relativamente longa, circulam por todos os tecidos, e ainda,

são facilmente obtidos. Dentre os ensaios, tem-se os que utilizam linfócitos

circulantes, tais como a pesquisa de aberrações cromossômicas ou micronúcleo e oteste do cometa (ALBERTINI et al, 2000; RABELLO-GAY et al, 1991).

Os resultados dos ensaios in vitro utilizando linhagens celulares

estabelecidas ou linfócitos circulantes de sangue periférico podem ser extrapolados

para a exposição humana, porém, deve-se considerar as limitações dessa

extrapolação, uma vez que não é possível reproduzir todas as condições fisiológicas

da exposição in vivo, como por exemplo, o funcionamento dos sistemas de

biotransformação e de reparo de lesões no DNA (PRESTON, 2005).Mesmo considerando as limitações dos ensaios in vitro, estes são de

grande valia, pois possuem a vantagem de similaridade com o sistema humano e,

consequentemente com mutações importantes na etiologia de doenças

degenerativas como o câncer e outras doenças genéticas (FENECH, 2000;MOLLER et al, 2000).

A toxicidade genética não é uma medida de carcinogenicidade, mas é

frequentemente usada como indicador para o câncer, uma vez que os testes de

mutagenicidade medem o evento inicial ou intermediário da tumorigênese (NOWAK

et al, 2002), há uma associação entre os resultados positivos em testes de

toxicidade genética e a carcinogenicidade.

16

Sabe-se que as mutações gênicas atuam em etapas do processo de

carcinogênese e que ensaios que detectam compostos genotóxicos permitem

identificar substâncias com risco potencial à saúde humana. Dentre os principais

testes utilizados para detecção de potencial mutagênico de agentes químicos estãoos testes citogenéticos in vitro em células de mamíferos que podem detectar

alterações cromossômicas estruturais e/ou numéricas (RIBEIRO & MARQUES,

2003).

I.3.1 – Alterações na molécula de DNA

Em exposição ambiental, o DNA pode sofrer alterações em suas bases

nitrogenadas, que podem resultar em mutações estabelecidas após a sua

duplicação, na divisão celular, cuja consequência dependerá da extensão e

localização do evento. As mutações podem não ter efeito biológico, por não

atingirem os genes ou por não alterarem a estrutura e função das proteínas

correspondentes. As mutações gênicas tem um amplo espectro de efeitos, podendo

inclusive determinar a morte celular ou o crescimento desordenado das células,

caracterizando os neoplasmas (HASTY, 2005).

As mutações podem ser classificadas como mutações de ponto, quando

alteram poucos nucleotídeos, ou cromossômicas, quando envolvem milhares de

nucleotídeos e alteram a estrutura ou número dos cromossomos, sendo que os

agentes que induzem as aberrações cromossômicas estruturais são denominados

clastogênicos, enquanto aqueles que induzem aberrações numéricas são ditos

turbagênicos. Tais agentes podem ser de natureza química, física ou biológica

(CARRANO & NATARAJAN, 1988).

As alterações cromossômicas numéricas pode ser por ganho ou perda de

lote haplóide (euploidia) ou por alteração de cromossomos em número diferente do

número haploide (aneuploidias) (MITCHELL et al., 1995).

As alterações cromossômicas estruturais podem ser classificadas em

instáveis e estáveis, sendo que as instáveis conduzem à morte celular, como os

cromossomos em anel e multicêntricos. São consideradas estáveis as alterações na

estrutura cromossômica que não atrapalham o processo mecânico da divisão celular,

podendo desta forma passar para outras gerações celulares, como são as

translocações e deleções. Todavia, estas podem ser responsáveis por alterações na

função ou comportamento social da célula (MOORE & BENDER, 1993).

17

Independente da viabilidade, as alterações cromossômicas estruturais

são o resultado de quebra na estrutura da molécula de DNA seguidas de reparo

inexato ou ausência de reparo. Por conseguinte, a presença de alterações

cromossômicas é um indicativo de que a célula sofreu dano no DNA decorrente de

algum agente indutor. Da mesma forma, a presença de quebras cromatídicas

identificadas em metáfase é interpretada como uma mutação cromossômica em

potencial, pois o reparo não corrigiu a lesão inicial (BRYANT, 2004).

As quebras na dupla hélice de DNA podem ser causadas por agentes

exógenos, como as radiações ionizantes e inibidores de topoisomerases, ou por

agentes endógenos, como as espécies reativas de oxigênios (PIERCE et al, 2001).

Essas quebras, quando ocorrem em S tardio ou G2, podem ser corretamente

reparadas por recombinação homóloga. Todavia, a forma mais comum de reparo

desse tipo de lesão é a ligação das extremidades, a qual não é livre de erros por

desconsiderar a identidade das moléculas envolvidas no reparo, o que pode

conduzir a rearranjos complexos. Esta forma de reparo ocorre em toda a interfase

(LEES-MILLER &MEEK, 2003).

a) Teste de aberrações cromossômicas

A detecção de danos ocorridos no material genético pode ser feita por

vários métodos, dentre estes, os citogenéticos, geralmente usando células obtidas

de animais ou linfócitos de sangue periférico.

Estudos epidemiológicos indicam que há relação entre a frequência

elevada de aberrações cromossômicas em linfócitos de sangue periférico e risco

elevado para o desenvolvimento de doenças humanas, inclusive o câncer (BONASSI

et al, 1995; HAGMAR et al, 1998; NATARAJAN, 2002). Assim, as aberrações

cromossômicas são consideradas como importantes biomarcadores da exposição

humana a agentes genotóxicos (OBE et al, 2002) e vem sendo amplamente utilizada

em vários tipos celulares para diversos fins, tais como, genética toxicológica,

biomonitoramento e em dosimetria biológica, por sua sensibilidade aos danos

ocorridos ao DNA, além de apresentar uma taxa espontânea relativamente baixa

(NATARAJAN, 1993).

b) - Teste do Cometa (SCGE – Single Cell Gel Eletrophoresis)

18

Por definição o nucleóide é uma série de alças superenoveladas de DNA

desprovido de histonas, aderidas à matriz nuclear residual, do tamanho do núcleo da

célula. Caso existam quebras na molécula de DNA, a estrutura do nucleóide sofre

mudanças durante a microeletroforese, visto que as alças relaxadas de DNA e os

fragmentos livres de DNA danificado se desenovelam migrando para além do

nucleóide.

O teste do Cometa é muito utilizado no estudo de dano e reparo de DNA

por ser relativamente fácil e rápido, com sensibilidade semelhante à técnica

citogenética, além de requerer quantidade pequena de célula e não necessita de

proliferação celular (OSTLING & JOHANSON, 1984)

Em 1989, Olive seguriu o nome “Comet Assay” a este teste, devido ao

nucleóide com o DNA danificado, no momento de migração, ser semelhante a um

cometa. No teste, as células são analisadas e classificadas segundo o comprimentoe intensidade da cauda, a qual indica fitas de DNA danificadas (SINGH et al, 1988,

1991; POOL-ZOBEL et al, 1994; SPEIT et al, 1995). Atualmente, o tamanho, a

intensidade de flourescência, o aspecto e outras características dos cometas são

visualmente mensurados sob microscopia óptica ou por programas específicos de

análise de imagem (TICE, 1995).

O teste do Cometa é muito utilizado em estudos toxicogenético, pois

apresenta muitas vantagens quando comparado com outros testes para detecção de

substâncias genotóxicas. Esse teste detecta lesões genômicas que podem resultar

em mutação, que não foram corretamente reparadas, porém não quantifica

mutações estabelecidas. Por isso, pode ser também utilizado para estudos de reparo

do DNA, podendo trazer informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão

reparada, embora não possibilite inferir a fidedignidade do processo de reparo. O

teste permite a detecção de danos e seu reparo em uma única célula, e

conseqüentemente em determinada subpopulação celular, por isso sua relevância

para avaliação de compostos genotóxicos, visto que os danos no DNA são

freqüentemente célula e tecido-específicos (GONTIJO & TICE, 2003).

O ensaio do cometa combina a simplicidade das técnicas bioquímicas

para detecção de quebra de fita simples de DNA e/ou sítios álcali-lábeis com as

abordagens típicas dos ensaios citogenéticos, e algumas vantagens tais como:

sensibilidade para detecção de danos no DNA; a coleta de dados em células

individualizadas, o uso de amostras de células extremamente pequena; e qualquer

19

população de células de eucarioto pode ser utilizada para análise (SPEIT &

HARTMANN, 2005).

I.3.2 – A pesquisa da genotoxicidade de plantas medicinais no Brasil

O Brasil, sendo um país com enorme biodiversidade, pode contribuir para

o desenvolvimento de medicamentos produzidos a partir de plantas, porém percebe-

se um pequeno avanço nesta direção, pois existem vários produtos naturais sendo

utilizados com fins terapêuticos e comercializados, sem a comprovação científica de

sua atividade biológica no homem. A despeito disso, é inexpressiva a investigação

do potencial genotóxico de plantas medicinais brasileiras, tendo sido publicados

poucos trabalhos com esse enfoque, tais como:Vargas et al. (1991) empregou o teste do Salmonella para avaliar a

presença da atividade mutagênica dos extratos aquosos de Achyrocline satureoides

(Macela), Baccharis anômala, Luehea divaricata (Açoita cavalo), Iodina rhombifolia

(Cancorosa), Desmodium incanum (carrapicho-beiço-de-boi), Tibouchina asperior

(douradinha) e Maytenus ilicifolia (Espinheira Santa). O resultado positivo foi

observado apenas para as três primeiras, mediante ativação por enzimas

microssomais.Ribeiro et al. (1991, 1993) avaliaram a clastogenicidade in vivo de extrato

aquoso do fruto de Indigofera suffruticosa Mill. ; extrato hidroalcoólico da raiz de

Solanum agrarium Stendt e extrato aquosos e metanólicos de folhas e frutas de

Crotalaria retusa L e Crotalaria mucronata Desv. Os autores relataram atividade

genotóxica em I. suffuticosa na diluição de 25% da DL502 e os extratos obtidos das

frutas de Crotalaria retusa induziram um aumento dose-dependente na frequência de

aberrações cromossômicas.O óleo de Pterodon pubescens (sucupira), a lactona eremantina, extraída

da Eremanthus elaeagnus, ambos usados como cercaricida, e o alcaloide bondina,

extraído de Peumus boldus (boldo-do-chile), não tiveram atividade clastogênica em

experimentos com células de mamíferos in vivo e in vitro (TAVARES & TAKAHASHI,

1994; DIAS et al., 1995).

2 A DL50 equivale à dose letal para 50% dos animais tratados. Em experimentos in vitro, equivale-seàquela dose que reduz à metade o índice mitótico.

20

A associação de pesquisas farmacológicas e de genotoxicidade permite

estabelecer um contraponto entre efeitos terapêuticos e dose segura a ser utilizada.

Assim, a ausência de pesquisas sobre a genotoxicidade de fitoterápicos é um fator

de risco para população, bem como compromete a finalização das pesquisas de

novos fármacos e a comercialização daqueles já identificados. Esse fato justifica a

realização de ensaios para investigação da genotoxicidade em Physalis angulata,

ainda inéditos na literatura pertinente.

Existe uma grande variedade de plantas utilizadas na medicina

alternativa, cuja utilização está baseada apenas em observações, porém existem

outras com valor terapêuticos confirmados cientificamente e outras que estão em

fase de estudos. Dentre estas últimas tem-se a Physalis angulata, objeto deste

estudo, no qual serão apresentadas suas propriedades terapêuticas e sua atividade

biológica, com ênfase nos efeitos sobre o DNA.

I.4 – A Physalis angulata

I.4.1 – TaxonomiaA planta Physalis angulata pertence ao reino Plantae, a divisão

Magnoliophyta, a classe Magnoliopsida, ordem Solanales e a família Solanaceae.

Nesta família existem aproximadamente duas mil espécies distribuídas em 95

gêneros, além de apresentar uma ampla variedade de plantas que são econômica

e/ou farmacologicamente importantes, dentre estas são encontrados os gênerosSolanum (batata) o Capsicum (pimenta), além do physalis (camapu) (TOMASSINI, et

al., 2000).

I.4.2 – Descrição da planta

O gênero Physalis inclui cerca de cento e vinte espécies conhecidas,

dentre estas podemos destacar P. alkekengi, P. lanceolata, P. latifólia e a P. angulata.

Como sinonímia científica a P. angulata pode ser identificada como:Physalis capsicifolia, Physalis lanceifolia, Physalis ramosissima, Physalis dubia Link;

Physalis linkiana Nees; Physalis ciliata Sieb et Zucc, com descrições botânicas

análogas (RODRIGUES, 1989; LORENZI, 1982; MARTINS, 1989). Neste gênero as

plantas apresentam caracteres herbários e hábitos perenes, e se distribuem ao

21

longo de regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente nas AméricasCentral e do Sul (KISSMANN & GROTH, 1995, TOMASSINI et al, 2000; SANTOS et

al., 2003).

A P. angulata apresenta forma de vida herbácea, que pode alcançar até

um metro de altura, é uma erva anual, muito ramosa e glabra, de caule ereto e

formato triangular na base e quadrangular, tanto na parte superior quanto nos ramos,

apresentando coloração verde clara (Figura 1). Suas folhas ovado-oblongas,

alternadas ou geminadas, dotadas de pecíolo longo, cerrada-dentada. Possui flores

pequenas e amareladas (Figura 2), e fruto comestível, apresentando-se como uma

baga de 2 a 3 cm de diâmetro, amarelo-esverdeado quando maduro, encerrado

totalmente pelo cálice, contendo grande quantidade de sementes, assemelhando-se

a um tomate (Figura 3) . Suas sementes apresentam grande poder germinativo,

preferencialmente em solos semi-úmidos e sombreados. Em conseqüência, é

amplamente encontrada na Amazônia, inclusive infestando lavouras e, portanto é

considerada como planta daninha, conforme apresentado na Figura 4 (LORENZI,

1982).

Dependendo do local onde é encontrada é da cultura popular regional, a

P. angulata é vulgarmente conhecida como camapu, mulaca, bolsa mullaca, canapu,

bicho-de-rã, mata-fome, juá-de-capote, camambu ou camaru (BRANCH & SILVA,

1983).O fruto de P. angulata é comumente consumido, no continente americano,

principalmente nas áreas rurais, tendo se tornado popular nas grandes cidades a

partir do crescente consumo na Europa e Japão. Em diferentes continentes, essevegetal tem ainda uma ampla utilização na medicina popular (SOARES et al., 2003).

22

Figura 1: Planta Physalis angulata, visualizando-se folhas, flores e frutos.

Figura 2: Visualização da flor da Physalis angulata.

23

Figura 3: Fruto da Physalis angulata revestido com o cálice.

Figura 4: Physalis angulata como erva daninha.

24

I.4.3 – Etnofarmacologia da P. angulata

A P. angulata é uma planta que ocorre nos trópicos, incluindo África, Ásia

e Américas e em todos esses continentes seu uso é bastante difundido na medicina

popular e, mais recentemente, pelos adeptos da fitoterapia nos demais continentes.

Em toda a Amazônia o infuso de diferentes partes da planta é empregado

contra problemas hepáticos, renais, reumatismo crônico, sedativo e diurético. Essa

planta também é amplamente utilizada no tratamento de gonorréia na América

Central e Caribe, sendo também descrita a utilização como anti-pirético, diurético,resfriados, entre outros (ALMEIDA, 1993; CÁCERES et al., 1995; KEMBER & RENG,

1995).

Essas e outras indicações de uso da P. Angulata estão compiladas na

Tabela 1.

25

Tabela 1: Indicação de uso etnobotânico da P. angulata em diferentes regiões do

mundo.

Local Utilização Etnobotânica

África Esterilidade, males da garganta

Gana Antipirético, estômago, síncope

Haiti Antipirético, diurético, hidropsia

Brasil Antipirético, analgésico, depurativo, diurético, sedativo,

dermatite, reumatismo, males da vesícula biliar, dos rins,

icterícia e hepatite.

China Expectorante, diurético e parto

Colômbia Antipirético, antiinflamatório, desinfectante, narcótico, asma,

dermatite

Gana Antipirético, estômago, síncope

Guatemala Malária, prevenção de aborto, gonorréia

Japão Antipirético, diurético, antídoto, resfriado, inchaços, garganta

Peru Antiinflamatório, asma, diabetes, desinfectante, analgésico,

hepatite, males do fígado, malária, reumatismo e dermatite

Suriname Diurético, malária, gonorréia, icterícia, nefrites

Taiwan Antipirético, diurético, hepatite, tumores

Trinidad Antipirético, anti-séptico, indigestão, nefrites, rinite

Raintree Nutrition – Tropical Plant Database, disponível em

http://www.raintree.com.br/produtos/mullaca_database.htm

26

I.4.4 - Efeitos biológicos de extratos e compostos derivados de P. angulata

Inúmeras pesquisas investigaram o efeito de extratos alcoólicos e

aquosos de diferentes partes morfológica da P. angulata, bem como de alguns

compostos isolados, identificando-se princípios ativos em folhas, flores, raízes, caulee frutos (CACERES et al, 1995; FREIBURGHAUS et al, 1996; CHOI e HWANG,

2003; SOARES et al, 2003; BASTOS, 2006).

A partir de estudos fitoquímicos na P. angulata vários compostos foram

isolados e quimicamente caracterizados. Dentre esses, encontram-se flavonoides,

alcaloides, glicosídeos, vitangulinas, fisangulinas e fisalinas, sendo que alguns

desses compostos eram desconhecidos da literatura científica (ROW et al,

1978;1980; SHINGU et al, 1992; ISMAIL et al, 2001).

Na comunidade científica, a planta têm sido o alvo de pesquisa

laboratorial e clínica e os estudos preliminares têm sugerido que ela é

imunomoduladora eficaz e citotóxica para vários tipos de células de câncer e que

possui propriedades antimicrobianas.

Nas espécies da família Solaneceae estão presentes alguns

vitaesteróides, dentre estes estão as vitafisalinas e fisalinas, distribuídos dentre

alguns gêneros dessa família. As plantas do gênero Physalis possuem fisalinas,

vitafisalinas, vitanolidos, ixocapalactonas, acnistinas dentre outras. Dentre os

vitaesteróides, as fisalinas são as mais produzidas pelo gênero Physalis as quaisforam isoladas nas seguintes espécies: P alkekengi, P. ixocarpa, P. lanifolia, P.

minima, P. peruviana, P. phyladelphia, P. pubescens, P. viscosa e P. angulata.

(TOMASSINI et al, 2000).

Os vitaesteróides encontrados na P. angulata, tem recebido especial

atenção dos pesquisadores por apresentarem diversas atividades biológicas, taiscomo: antimicrobiana (HWANG et al., 2004, CÁCERES et al., 1995, JANUARIO et

al., 2002), antiinflamatário (CHOI & HWANG, 2003), imunomoduladora (SOARES et

al., 2003), antitumoral, tripanossomicida (FREIBURGHAUS et al., 1996,

NAGAFUGIJI et al., 2004) antimoluscicidal (DOS SANTOS et al., 2003), antimalarica

(ANKRAH et al., 2003).

As atividades biológicas da P. angulata podem ser assim descritas:

a) Atividade Antimicrobiana

O poder antimicrobiano pôde ser constatado em diversos estudos.

Cáceres et al. (1995), utilizaram extrato hidroalcoólico de folha a 50% e verificaram a

27

atividade antigonorréica deste extrato sobre culturas de Neisseria gonorrhoeae.

Freiburghaus et al. (1996), utilizaram um extrato diclorometânico de caule de

Physalis angulata em cultura de Trypanosoma brucei rhodesiense, isolado na

Tanzânia, e verificaram a atividade anti-tripanossômica desse extrato, naconcentração de 0,1 µg/ml. Elegami et al. (2001), verificaram a atividade bactericida

de extratos de Physalis angulata extraídos com CHCl3, MeOH e H2O, em culturas de

Bacillus subtilis, Staphylococcus, Escherichia coli e Pseudomonas aeroginosa, com

zonas de inibição3 que variaram de 12-15 cm.

b) Atividade Antiinflamatória

Choi e Hwang (2003), em experimentos com ratos, demonstraram que oextrato metanólico das flores de P. angulata exibem uma ação antiinflamatória em

edema de pata induzido por carragenina, artrite induzida por formaldeído, além de

atividade antialérgicas contra dermatite de contato induzida por 2,4,

dinitrofluorobenzeno.

O extrato alcoólico de raízes também exibiu atividade antiinflamatória emedema induzido por carreginina em ratos (SOARES et al., 2003, BASTOS, 2004).

c) Atividade Imunomoduladora

A imunomodulação foi observada em estudos que mostraram esteróides(como as fisalinas B, F e G, mas não D) isolados de P. angulata causando uma

redução na produção de óxido nítrico por macrófagos estimulados com

lipopolisacarídeo bacteriano (LPS) e interferon-γ. LIN et al. (1992), também

demonstraram efeitos de várias frações de extrato de P. angulata na resposta

imunomodulatória, incluindo resposta na blastogênese e produção de anticorpos.

d) Atividade antitumoral

Fisalinas são obtidas a partir do extrato alcoólico de qualquer parte da

planta. Compõem um grupo de glicosídeos amargos, do tipo esteróides, cujas

atividades antineoplásicas e citotóxica in vivo e in vitro foram demonstradas contra

inúmeros tipos de células neoplásicas, por CHIANG et al. (1992a e b). Esses autores

3 Zona de inibição, nos antibiogramas, é a área de ação do disco da droga em uso, que age sobre asbactérias semeadas em placa de Petri, impedindo-as de crescerem.

28

identificaram atividade antineoplásica para as fisalinas F e D em linhagens celulares

humanas derivadas de diferentes tumores sólidos: HA22T (hepatoma), HeLa (cervix

uterino), KB-16 (carcinoma epidermóide de nasofaringe), Colo-205 (cólon) e Calu-1

(pulmão). Posteriormente, outro estudo do mesmo grupo de pesquisadores daNational Taiwan University apresentou o efeito antineoplásico das fisalinas F e B

sobre linhagens de diferentes leucemias, merecendo destaque a ação da fisalina F

sobre células de leucemia mielóide aguda e leucemia linfóide aguda de células B.

Todavia, os autores não apontam o mecanismo responsável por esse efeito.

O glicosídeo mirecitina-3-O-neoesperidosídeo demonstrou ter importante

toxicidade contra linhagens celulares de carcinoma epidermóide de nasofaringe,

adenocarcinoma de pulmão e, principalmente, contra células P388 de leucemia

linfocítica (Ismail & Alam, 2001).

JUANG et al, (1989), sugeriram que a vintagulina A, princípio ativo da P.

angulata inibe a topoisomerase II na concentração de 20 μM in vitro, detendo a

proliferação celular. Esse fato poderia justificar o papel dessa planta na

anticarcinogenicidade, pois as topoisomerases são enzimas celulares essenciais

para manutenção da estrutura da cromatina, atuando no relaxamento da tensão

gerada pela torção do DNA durante a transcrição gênica ou replicação do DNA na

divisão celular mitótica ou meiótica (MALIK & NITIS, 2004).

As topoisomerases quebram e religam uma fita (topoisomerase I) ou duas

fitas da molécula de DNA (topoisomerase II). Essa quebra possibilita a passagem

DAE uma fita sobra a outra, alterando o número de voltas na molécula de DNA,

evitando a superespiralização à frente da forquilha de replicação ou transcrição

(WANG, 1985; BERGER & WANG, 1996). Assim, as topoisomerases atuam na

manutenção da integridade do genoma. No momento das quebras do material

genético, elas se ligam covalentemente às extremidades 5' e 3' geradas por estas,

formando um complexo de clivagem DNA-enzima. Estes complexos estão presentes

em baixa concentração, porém alguns xenobiontes podem aumentar

signficativamente a concentração fisiológica ou o tempo de vida destas quebras,

podendo desencadear mutações no DNA e cromossomos (FERGUSON &

BAGULEY, 1996).

A inibição de topoisomerases tem sido associada a clastogenicidade, e

seu envolvimento na segregação cromossômica mitótica e meiótica sugerem a

associação desses inibidores com euploidias (poliploidias e endorreduplicação) em

29

Drosophila e humanos (ROWE et al., 1986; FRANCHITTO et al., 2000; CORTÉS &

PASTOR, 2003), era sugerido tais efeitos em linfócitos cultivados na presença de P.

angulata.

Este fato pode justificar a ação antineoplásica de extratos e compostosisolados de P. angulata com possibilidades de gerar lesões cromossômicas. A

despeito disso, nenhuma publicação sobre a genotoxicidade dessa planta foi

identificada na literatura pertinente.

30

II - OBJETIVOS

Geral

Investigar o potencial genotóxico do extrato aquoso da raiz da P. angulata.

Específicos:

a) investigar sua ação sobre a proliferação celular;

b) verificar se há efeito sobre as fibras do fuso, capazes de promover

aneuploidias ou poliploidias;

c) determinar sua capacidade de promover danos na estrutura da molécula de

DNA e dos cromossomos;

31

III - MATERIAL E MÉTODOS

III.1 - MATERIAL BOTÂNICO

A raiz da referida espécie foi coletada no estado do Pará, nos municípios

de Belém, Mojú e Castanhal, em áreas de plantação e terra firme. Imediatamente

após a colheita da planta toda, a raiz passou pelo processo de limpeza, onde esta foi

lavada em água corrente para a retirada dos resíduos de terra. Em seguida, o

material botânico foi pesado e processado para a extração do extrato bruto aquoso.

A identificação e classificação do material botânico foram feitas pelo Dr.

Ricardo Secco, curador do herbário do Museu Emílio Goeldi, onde uma exsicata da

espécie foi depositada.

III.2 – OBTENÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DA PLANTA P. angulata

O extrato bruto foi obtido da raiz da planta, as quais foram pesadas após

a colheita, a partir da qual extraiu-se por decocção. Adicionando 150 g de raiz,

devidamente lavadas em 700 mL de água super-pura (Milli-Q plus), para assim

proceder a decocção que será realizada em manta aquecedora a 100° C, sendo que

o extrato obtido será concentrado até 14% do volume inicial. O decocto foi

congelado e estocado em freezer à temperatura de –20° C para subseqüente

liofilização. Assim, um pó de extrato foi obtido, e foi estocado à temperatura de 4 a 8

°C, para evitar contaminação e deteriorização.

III.3 – AMOSTRA CELULAR

Foram coletados 5 mL de sangue periférico com seringa heparinizada, de

seis doadores voluntários, de ambos os sexos, na faixa etária de 18 a 32 anos.

32

Os estudos genéticos foram aprovados pelo Comité de Ética da

Universidade Federal do Triângulo (Protocolo nº 440) e Comité de Ética do Hospital

Universitário João de Barros Barreto de Belém-PA, Brazil.

III.4 – CULTIVO DE LINFÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO.

Para a realização do ensaio, os linfócitos foram cultivados em meio de

cultura HAM-F10 (Sigma) complementado com estreptomicina (0,01 mg/mL),

penicilina (0,005 mg/mL), 20% de soro bovino fetal (Cultilab) e 2% de

fitohemaglutinina (Gibco). Seis horas após o início da incubação, quando as células

encontravam-se em G1, adicionou-se o extrato aquoso da P. angulata, nas

concentrações finais de 1µg/mL, 0,5 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL e 6 µg/mL. Foram

ainda realizadas culturas controle negativo e controle positivo, nesta última

utilizando-se a doxorrubicina (CAS 25316-40-9) como agente genotóxico, na

concentração de 0,15 µg/mL. Todos os frascos foram envolvidos em alumínio, a fim

de bloquear a exposição à luz.

Após 47 horas de cultivo agita-se manualmente cada frasco de cultura

retirando-se 300 µL de cada para a realização do ensaio Cometa, e o restante do

material será utilizado para análise citogenética das aberrações cromossômicas.

III.4.1 – Teste do Cometa em linfócitos humanos

a) Preparação da lâmina

- Derreteu-se a solução de agarose comum em microondas, manteve-se em

banho-maria a 60ºC em frasco com altura suficiente para um lâmina.

- Mergulhou-se a lâmina na agarose e removeu-se o excesso de agarose da face

posterior da lâmina com o auxílio de lenço de papel.

- As lâmina foram mantidas sob temperatura ambiente/12 h e posteriormente

armazenadas a 4ºC, em geladeira.

b) No dia da colheita

- Retirou-se as lâminas pré-gelatinizadas da geladeira; deixando em

temperatura ambiente.

- Derreteu-se a agarose LMP (baixo ponto de fusão) em tampão, e manteve-se em

banho-maria 37ºC;

33

- As lâminas foram mergulhadas em solução de lise final, cobertas com papel

alumínio e mantidas em geladeira (4ºC);

c) Procedimento para Colheita

- Descartou-se o meio de cultura com o tratamento;

- Lavou-se as células 2 vezes com 5 mL PBS em temperatura ambiente;

- Centrifugou-se em 1250 rpm por 5 minutos;

- Desprezou o sobrenadante com pipeta Pasteur;

- Adicionou-se 500 µL de tripsina 0,025%, com intuito das células perderem a

adesão de contato, aguardando-se em torno de 2 minutos;

- Inativou-se a tripsina com 5 mL de meio de cultivo contendo soro bovino fetal;

- Centrifugou-se em 1250 rpm por 5 minutos; desprezou-se o sobrenadante

deixando cerca de 0,5 mL de meio de cultura;

d) Desnaturação, Eletroforese, Neutralização e Fixação

- Em tubo de 500 µL, colocar 300 µL de suspensão celular com 120 µL de agarose

LMP (0,5%) a 37ºC.

- Depositou-se a suspensão celular sobre lâmina pré-gelatinizada com ponto de

fusão normal (1,5%), após solidificação do gel (4°C);

- Submeteu-se a lâmina a citólise; e em seguida a eletroforese em tampão

alcalino (300 mA, 0,5-1 V/cm, <4°C, pH 13).

- Cobriu-se a lâmina com tampão PBS; deixando-as no escuro por 20 minutos

para se desnaturar o DNA.

- A corrida eletroforética foi realizada sob 25 V e 300 mA, por 20 minutos, na

ausência de luz, com a cuba depositada em um recipiente contendo gelo;

- Após a corrida retirou-se as lâminas do tampão e fez-se a neutralização em 5 mL

de Tris (0,4 M, pH 7,5) por 15 minutos (3 ciclos de 5 min).

- Deixou-se as lâminas escorrendo por cerca de 15 minutos;

- Mergulhou-se as lâminas em etanol absoluto para fixação por 10 minutos.

- Após a secagem as lâminas foram guardadas em caixa de vidro na geladeira.

e) Coloração e Leitura

- Para que fosse feita a leitura, é necessário corar, e para isso, depositou-se 100

µL de brometo de etídio 0,002 mg/mL sobre a lâmina e cobriu-se com lamínula.

34

- Após a coloração a análise é feita no aumento de 400 X, em filtro de excitação

515-560 nm de comprimento de onda e filtro de barreira 590 nm;

- Terminada a leitura descartar a lamínula, deixar a lâmina secar e guardar.

Sempre manuseando o material com luvas.

III.4.2 – Teste das Aberrações Cromossômicas

As preparações citológicas para a para a obtenção de cromossomos

metafásicos em linfócitos do sangue periférico humano foram obtidas baseando-sena técnica de Moorhead et al. (1960), com os seguintes passos:

- As células foram cultivadas conforme descrito no item II.4

- Após retirar a aliquota para o cometa, adicionou-se 0,1ml colchicina (0,016%

Sigma) para bloquear a divisão celular, deixando-a agir por duas horas;

- Transferiu-se as culturas para tubo de centrífuga de fundo cônico;

- Após a centrifugação por 10 min a 1000 rpm, retirou-se o sobrenadante e colocou-

se lentamente, 4mL de solução de KCl 0,075 M sobre o botão de células;

- homogeneizou-se gentilmente com pipeta Pasteur e deixando na estufa a 37ºC por

5 minutos;

- Centrifugou-se novamente por 5 minutos a 1000 rpm,m retirou-se o sobrenadante e

acrescentou-se 5 mL de fixador recém-preparado (metanol:ácido acético 3:1),

homogeneizando o material;

- Centrifugou-se (1000 rpm/5 minutos) e trocou-se o fixador mais duas vezes.

- A suspensão celular obtida foi depositada em lâminas adequadamente limpas, as

quais foram coradas em solução de Giemsa em tampão fosfato.

- As lâminas foram identificadas e, sob microscopia ótica em objetiva com aumento

de 100x, foram analisadas 100 metáfases (2n=46±2);

III.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA

O teste F (ANOVA) de dois critérios foi utilizado para detectar diferenças

entre as freqüências de aberrações cromossômicas, bem como para os valores de

IM que podem ser observados nas diversas doses do extrato e seus respectivoscontroles (AYRES et al., 2003).

35

O teste T de Student foi realizado quando o teste F identificou diferenças

significativas. Em todas as análises foram estabelecidos em 5% o nível de

significância.

36

IV - RESULTADO

IV.1 – AVALIAÇÃO DO EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA P.

angulata EM LINFÓCITOS HUMANOS, DE SANGUE PERIFÉRICO, TRATADOS IN

VITRO, UTILIZANDO O ENSAIO DO COMETA

Em cada teste, foram analisados 100 células classificando-as de 0 a 4,

conforme o comprimento e intensidade da cauda do Cometa: (a) tipo 0, sem danos

(<5%); (b) tipo 1, baixo nível de danos (5-20%); (c) tipo 2, médio nível de danos (20-

40%), (d) tipo 3, alto nível de danos (40-95%), (e) tipo 4, dano total (>95%). Foram

analisadas apenas as células que apresentaram núcleos de mesmo tamanho, e

desprezados os núcleos apoptóticos. Após a leitura foi calculado o score de cada

tratamento multiplicando-se o número de núcleos observados em cada classe pelo

valor da classe, obtendo-se o score total de cada tratamento.

Todos os experimentos foram conduzidos no mínimo duas vezes e os

dados obtidos foram qualitativamente reproduzíveis, embora a variabilidade na taxa

de danos do DNA tenha sido identificada nos linfócitos dos doadores.

A Figura 4 ilustra algumas das classes de Cometa observadas neste

estudo e a Tabela 2 apresenta a frequência média das diferentes classes deCometas observados em linfócitos humanos tratados in vitro com diferentes

concentrações de P. angulata.

A eficiência do teste em identificar genotoxicidade induzida pôde ser

verificada entre os indivíduos nas diferentes concentrações utilizadas, considerando-

se a distribuição das células nas diferentes classes.

A análise dos dados da Tabela 2 demonstrou que o tratamento feito com

as quatro maiores concentrações de extrato, aumentou de forma significativa a

frequência de células com Cometa e o índice de danos no DNA quando comparado

ao controle negativo (p<0,05). A distribuição dos cometas entre as classes 1, 2, 3 e 4

também foi alterada pelas doses crescentes do extrato, aumentando-se a ocorrência

de lesões à medida que se aumentou a concentração do produto testado, sendo

mais significativo nas classes 3 e 4.

37

(a)

(b)

(c)

Figura 4: Cometas de classes 0 (a), (b) 2, (c) 4 observados em linfócitos humanostratados com extrato aquoso de P. angulata.

38

Tabela 2: Proporção de danos no DNA, freqüência de células com Cometas edistribuição entre as classes de Cometas em linfócitos humanos tratados in vitro comdiferentes concentrações de extratos aquoso de P. angulata.

Tratamento

µg/mL

Classe de Cometa (%) Índice de Dano

do DNA ± SD

Células com

cometas (%)0 1 2 3 4

Controle negativo(n=6)

57,2 32,2 8,2 2 0,4 0,15 ± 0,19 42,8

Controlepositivo*(n=6)

32 29,7 32 3 3,3 1,15a ± 0,19 73,8a

Extrato

0,1 (n=6) 50,2 34 2,2 3,6 0,2 0,75 ± 0,14 49,8

0,5 (n=6) 38,2 41 16,2 4,2 0,4 0,87a ±0,28 61,8

1,0 (n=6) 32,6 45,2 16,8 4,2 0,4 0,93a ± 0,33 69,4

2,0 (n=6) 38,6 33,4 22,2 4,2 1,6 0,90a ± 0,26 61,4

3,0 (n=6) 40 33,8 19,4 5 1,8 0,95a ± 0,12 60,0

6,0 (n=6) 42,7 28 20 8,3 1 1,14a ± 0,65 57,3

a Estatisticamente diferente do grupo controle negativo (p<0,05)SD: Desvio Padrão*Doxorrubicina: 0,15µg/mL

39

IV.2 EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA P. angulata EMLINFÓCITOS DE SANGUE PERIFÉRICO TRATADOS IN VITRO AVALIADO PELOENSAIO CITOGENÉTICO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS.

Neste ensaio, foram computadas as alterações cromossômicas numéricas

ou estruturais, observando-se a posição do centrômero, alterações no grau de

ploidia e aberrações estruturais, tais como lesões acromáticas (gaps), quebras

cromatídicas e rearranjos complexos, como anéis, trirradiais e quadrirradiais.

Para monitorar a toxicidade celular induzida pelo agente em questão, foi

determinado o índice mitótico pela contagem do número de metáfases em 2000

linfoblastos/cultura, aplicando-se a seguinte fórmula:

IM= Número de metáfases X 100

2000 linfoblastos

Os dados obtidos de índice mitótico neste ensaio estão apresentados na

Tabela 3, enquanto que os dados de aberrações cromossômicas estão na Tabela 4.

Conforme os resultados obtidos neste ensaio, o índice mitótico revelou

que o extrato aquoso da P. angulata induziu um aumento dose dependente e

estatisticamente significativo na taxa de proliferação dos linfócitos tratados com 0,1

µg/mL; 0,5 µg/mL e 1 µg/mL. Porém, a partir da concentração de 2 µg/mL alcançou-

se a dose citotóxica (CD50), a qual é expressa como a dose que resultou em 50%

de citotoxicidade comparada à cultura controle.

Nos dados apresentados na Tabela 4 pode-se observar que as

aberrações cromossômicas nas culturas tratadas foram uniformemente distribuídas e

em taxas similares àquelas observadas na amostra controle. Ou seja, não foi

identificado qualquer efeito genotóxico estatisticamente significativo do extrato

aquoso da P. angulata durante o tratamento nas concentrações 0,1 µg/mL, 0,5

µg/mL e 1 µg/mL, em relação às culturas não-tratadas ( p=0,754).

A inclusão dos gaps como aberrações cromossômicas não alterou esse

resultado, uma vez que sua ocorrência também não diferiu entre as amostras

(F=1,083; p=0,405) ou tratamentos (F=2,583; p=0,118).

Considerando-se os diferentes tipos de alterações observadas, tem-se

que não houve prevalência na frequência de quebras cromatídicas ou

cromossômicas, bem como nas frequências de gaps.

40

Apenas uma célula exibiu alteração complexa, do tipo troca

intercromatídica, gerando uma figura quadriradial (Figura 5), tendo sido considerada

um evento isolado.

As euploidias também foram consideradas como um evento raro, pois

somente uma célula tetraploide foi observada em todos os experimentos realizados.

O efeito citotóxico do extrato aquoso da P. angulata em concentrações de

2 e 3 µg/mL, impossibilitou a realização do teste das aberrações cromossômicas nas

culturas tratadas com estas concentrações.

Os dados obtidos nesse estudo foram utilizados para a elaboração de um

artigo científico a ser submetido para publicação em revista especializada (anexo 1).

Figura 5: Metáfase de linfócito tratado com 1 µg/mL do extrato aquoso dePhysalis angulata, exibindo uma troca cromatídica entre diferentescromossomos, gerando uma figura quadrirradial.

41

Tabela 3: Valores referentes aos índices mitóticos (%) obtidos em culturas delinfócitos tratadas com diferentes concentrações de extrato aquoso de P. angulata.

AMOSTRA 0 µg/mL 0,1 µg/mL 0,5 µg/mL 1 µg/mL 2 µg/mL 3 µg/mL

1 0,70 2,25 2,30 2,30 0,85 0,50

2 0,90 1,45 0,80 1,15 0,03 0,50

3 0,65 1,40 1,55 1,15 0,05 0,03

4 0,65 1,85 1,75 1,35 0,25 0,25

5 0,75 1,75 1,90 1,45 0,35 0,40

6 0,85 1,65 1,85 1,35 0,25 0,35

Média 0,75 1,73 1,78 1,46 0,34 0,38

Desvio Padrão 0,22 1,92 2,30 3,69 1,45 0,21

p* <0,01 <0,01 <0,01 <0,05 <0,05

*valor de p em relação à amostra controle (0 µg/mL)

42

Tabela 4: Distribuição de alterações cromossômicas observadas em linfócitoshumanos após tratamento in vitro com extrato aquoso de P. angulata.Amostras Metáfases

normaisMetáfases alteradas

Ctb Csb Ctg Csg Outras alterações

0 µg/mL1 1002 95 1 43 98 1 14 1005 99 16 99 1Total 591 2 1 6 00,1 µg/mL1 97 2 12 99 13 99 14 100 0 05 99 16 99 1Total 593 3 0 3 10,5 µg/mL1 1002 993 100 tetraploidia4 98 1 0 1 05 1006 99 1Total 596 1 0 1 11 µg/mL1 99 2 Quadrirradial*2 1003 1004 1005 99 16 99 1Total 597 3 0 0 1*quebras cromatídicas envolvidas no rearranjo listados na coluna ‘outras alterações’

43

- Ctb: quebra cromatídica; Csb: quebra cromossômica; ctg:gap cromatídico; Csg:gapcromossômico.

44

V – DISCUSSÃO

Grande parte da população mundial utiliza as plantas medicinais com fins

terapêuticos. Além disso, muitos dos medicamentos industrializados são obtidos a

partir de extratos de plantas (FERREIRA, 2004), situação esta, que desperta

interesse tanto das indústrias quanto dos centros de pesquisas científicas a respeito

da ação dessas plantas.

Sabendo que alguns fármacos são capazes de interagir com a molécula

de DNA, provocando lesões cromossômicas (VERSCHAEVE et al, 2004; TAYLOR et

al, 2003; TRAORE et al, 2000), este trabalho teve com objetivo a análise dos

possíveis efeitos mutagênicos e/ou genotóxicos do extrato aquoso da P. angulata,

em linfócitos de sangue periférico humano.A P. angulata é uma planta que ocorre na África, Ásia e América, sendo

que em todos os continentes seu uso é bastante difundido na medicina popular, por

apresentar atividade biológica no tratamento de várias doenças, seja através de

seus extratos brutos ou compostos isolados, desta forma, faz-se necessário avaliar

seu efeito mutagênico e/ou genotóxico, conforme recomendam as agências

internacionais de regulamentação de produtos farmacêuticos.

No presente estudo, os experimentos foram feitos usando-se o extratoaquoso da P. angulata, adicionando-se na fase G1 do ciclo celular,

concomitantemente à fitohemaglutinina, e as células foram cultivadas por 47 horas,

ou seja, permitindo-se passar por dois ciclos de divisão celular. O extrato foi testado

em diferentes concentrações: 0,1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL e 3 µg/mL de

meio de cultura, sendo que essas doses foram escolhidas baseando-se nas doses

utilizadas no trabalho em que o extrato aquoso suprimiu o processo inflamatório

carragenina-induzido em ratos (BASTOS et al, 2005). A utilização deste recurso fez-

se necessário, pois não foram encontrados na literatura, trabalhos que

investigassem a genotoxicidade desta planta em cultivo celular que pudessem servir

de parâmetro para este estudo.

Neste estudo, a genotoxicidade foi investigada por meio dos testes do

Cometa e de aberrações cromossômicas em metáfase, enquanto a citotoxicidade foi

avaliada pelo índice mitótico.

45

A mais típica resposta observada após a exposição in vitro a agentes

genotóxicos sejam de natureza química ou física, é a citotoxicidade, medida por

diferentes métodos, incluindo-se o índice mitótico em linfócitos cultivados. Esse

índice representa a proporção de células na fase de mitose do ciclo celular, portanto

a diminuição deste reflete a quiescência ou entrada da célula na fase G0 do ciclo.

Em experimentos in vitro, o índice mitótico é utilizado também para monitorar a

toxicidade celular induzida. O grau de citotoxicidade serve para selecionar o período

do cultivo e as concentrações a serem testadas adequadamente, servindo assim

para avaliar os riscos ao homem, de determinados compostos aos quais estão

expostos.

No presente estudo foi observado, através da avaliação do índicemitótico, que o extrato aquoso da P. angulata induziu um aumento estatisticamente

significativo na taxa de proliferação dos linfócitos tratados com concentração de 1

µg/mL (p<0,01), enquanto nas concentrações acima de 2 µg/mL houve uma

diminuição no índice mitótico (p>0,05), considerando-se essas como doses

citotóxicas alcançando-se o CD50, pois diminui em 50% o índice mitótico comparado

à cultura controle.

Na literatura, um único estudo investigou a citotoxicidade da P. angulata

(WU et al, 2004), porém os autores utilizaram um extrato cerca de quatro vezes

menos concentrado, linhagem celular estabelecida e o parâmetro utilizado para

investigação da citotoxicidade foi a indução de apoptose, o que inviabiliza a

comparação de resultados. Seus dados mostraram que o extrato etanólico é mais

citotóxico que o extrato aquoso em concentração muito mais elevada que no

presente estudo. Este fato pode ter sua explicação nas diferenças entre os

experimentos.Dentre as diversas atividades biológicas apresentadas pela P. angulata,

pode-se destacar: antimicrobiana, antiinflamatória, imunomoduladora,tripanossomicida, antimoluscidal, antimalárica e a antitumoral (HWANG et al., 2004;

NAGAFUJI et al., 2004; ANKRAK et al., 2003; CHOI & HWANG, 2003; DOS

SANTOS et al., 2003; SOARES et al., 2003; JANUÁRIO et al., 2002;

FREIBURGHAUS et al., 1996; CÁCERES et al., 1995 e CHEN et al., 1989).

Entre os benefícios atribuídos a P. angulata, BASTOS et al (2005)

demonstraram que seu extrato aquoso suprimiu um processo inflamatório

carragenina-induzido em ratos, todavia o presente estudo indicou um aumento

46

significativo na proliferação de linfócitos T humanos fitohemaglutinina-estimulados.

Esse estímulo à proliferação de linfócitos poderia ser explicado como uma resposta

inespecífica, ou seja, uma ativação policlonal, e desta forma pode-se sugerir para o

referido extrato da P. angulata um papel adjuvante na resposta imune, o que deve

ser melhor investigado experimentalmente, pelo grande interesse em

imunomoduladores.

Uma outra atividade benéfica dessa planta é aquela antineoplásica, e

para melhor explorar tal tema, faze-se necessário citar que os principais agentes

antineoplásicos são classificados de acordo com seu modo de ação, podendo ser

divididos em: agentes citotóxicos, hormônios e agentes diversos. Dentre os agentes

citotóxicos, tem-se os agentes alquilantes, antimetabólicos, antimotóticos e

inibidores de topoisomerases, categorias que abrigam agentes genotóxicos (SILVA

et al., 2003; RANGE et al., 2004).

Segundo JUANG et al (1989), a vitangulina A, composto extraído da P.

angulata a partir de seu extrato alcoólico, é capaz de inibir a topoisomerase II. Sendo

as topoisomerases enzimas celulares que participam de diversos processos

metabólicos como a replicação, recombinação, transcrição e segregação

cromossômica, os agentes capazes de inibi-las podem levar o DNA a ter uma

topologia desfavorável durante e após a replicação, permitindo assim, a ocorrência

de recombinação homóloga e não-homóloga, propiciando a formação de aberrações

cromossômicas (MALIK & NITISS, 2004).

Com o término da replicação do DNA, as topoisomerases II, separam as

várias fitas de DNA recém-formadas durante a condensação progressiva da

cromatina que leva à mitose. Elas também separam as cromátides no início da

anáfase, que estavam associadas na metáfase. Desta forma, qualquer interferência

nesta função, conduz a um aumento na recombinação mitótica e pode inibir a

segregação cromossômica normal durante a anáfase, resultando em aneuploidias.

Existem inibidores de topoisomerases II que são capazes de formar cromossomos

quadrirradiais (DA SILVA et al., 2003). Assim considerando, a ausência de

aneuploidia, euploidia e clastogenicidade descritas no presente estudo, indicam queno extrato aquoso da P. angulata não existem substâncias capazes de inibir a ação

das topoisomerases.

As fisalinas também são compostos isolados obtidos a partir do extrato

alcoólico de qualquer parte da P. angulata, tiveram suas atividades antineoplásicas e

47

citotóxicas demonstradas em experimentos in vivo e in vitro. A fisalina F teve efeito

antileucêmico em camundongos e exibiu excelente efeito contra linhagens celulares

humanas derivadas de diferentes tumores sólidos, principalmente HA22T

(hepatoma) e HeLa (cérvix uterino), mas também foi citotóxica em outros tiposcelulares (CHIANG et al, 1992a). Em um estudo posterior, esses autores

demonstraram que as fisalinas F e B atuam eficazmente sobre linhagens de

diferentes leucemias, merecendo destaque à ação da fisalina F sobre células de

leucemia mieloide aguda e leucemia linfoide aguda de células B (CHIANG et al.,

1992b). Todavia, não apontam o mecanismos responsável por esse efeito.

Nas condições aplicadas neste estudo, o extrato aquoso da P. angulata

não induziu qualquer efeito sobre a citocinese ou fibras do fuso celular, visto que não

houve aumento no número de células com aneuploidia ou poliploidia. Da mesma

forma, a ausência de lesões na estrutura dos cromossomos na presente

investigação sugere que a vitangulina A não se encontra presente no extrato aquoso

desta planta.

O ensaio do Cometa permite identificar alterações de fita simples e dupla,

bem como a presença de sítios apurínicos. No presente estudo, as células

submetidas ao tratamento com P. angulata apresentaram tais alterações em

frequência estatisticamente significativa. Esses dados não corroboram aqueles

obtidos no ensaio de aberrações cromossômicas, sugerindo que as quebras de fita

simples e os sítios apurínicos, identificados no ensaio Cometa, foram reparados,

não sendo convertidos em quebras cromatídicas ou cromossômicas, ambas lesões

não identificadas neste estudo.

Nas concentrações acima de 2 µg/mL, foi observado o efeito citotóxico do

extrato aquoso da P. angulata, impossibilitando a realização do teste das aberrações

cromossômicas nas culturas tratadas, porém sugerimos que esta inibição do

crescimento celular, deve-se a quantidade elevada da substância ao meio de cultura,

e não pela ação do extrato sobre o DNA.

Os diferentes tipos de lesões observadas nas metáfases tiveram baixa

freqüência, tendo sido considerados eventos raros, desta forma os dados desteestudo indicam que o extrato aquoso da P. angulata, se exibiu efeito tóxico sobre o

cromossomo, pode ter sido reparado.Neste estudo investigando a genotoxicidade do extrato aquoso da P.

angulata, nenhuma atividade genotóxica foi observada nos ensaios de aberrações

48

cromossômicas com linfócitos de sangue periférico, porém no teste do Cometa

houve aumento da frequência de células com cometas e o índice de danos no DNA.

Ainda assim, para aumentar a segurança dos resultados obtidos nesta investigação,

sugere-se a realização de estudos adicionais, tais como ensaios com camundongos

e com microrganismos (teste de Ames), bem como testes antimutagênicos.

49

VI – CONCLUSÃO

Analisando os resultados obtidos no presente estudo a cerca do extrato

aquoso da planta P. angulata, pode-se concluir que:

a) O referido extrato apresentou características de um agente

imunomodulador, pois estimulou a proliferação de linfócitos T nas

concentrações de 0,1 µm/mL, 0,5 µm/mL e 3 µm/mL.

b) O referido extrato, a partir da concentração de 2 µg/mL, alcançou a

dose citotóxica (CD50), a qual é expressa como a dose que resultou

em 50% de citotoxicidade comparada à cultura controle;

c) A ausência de observação de aneuploidias ou poliploidias leva a

inferir que o extrato aquoso da P. angulata não provoca efeitos

sobre as fibras do fuso.

d) Em uma análise quantitativa, esse extrato promoveu danos na

estrutura da molécula de DNA, avaliados pelo teste do Cometa,

porém não foi clastogênico no teste de aberrações cromossômicas.

50

VII – REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ALBERTINI, R.J., ANDERSON, D., DOUGLAS, G.R., HAGMAR, L., HEMMINKI, K.,MERLO, F., NATARAJAN, A.T., NORPA, H., SHUKER, D.E.G., TICE, R., WATERS,M. D. AND AITIO, A. IPCS guidelines for the monitoring ofe genotoxic effects ofcarcinogens in humans. Mutat. Res. 463:111-172, 2000.

ALICE CB, VARGAS VM, SILVA GA, DE SIQUEIRA NC, SCHAPOVAL E.E, GLEYEJ, HENRIQUES, J.A, HENRIQUES, A.T. Screening of plants used in south Brazilianfolk medicine. J Ethnopharmacol. 35(2):165-71. 1991.

ALMEIDA, E.R. Plantas Medicinais Brasileiras, Conhecimentos Populares eCientificos. Hemus Editora Ltda.: São Paulo, Brazil, 1993.

ANKRAH, N.A., NYAKO, A.K., ADDO, P.G., OFOSUHENE, M., DZOKOTO, C.,MARLEY, E., ADDAE, M.M., EKUBAN, F.A. Evalutation of efficacy and safety of aherbal medicine usede for the treatment of malaria. Phytother. Res. 17(6):697-701,2003.

AYRES, M., AYRES JR, M.,AYRES, D.L.,SANTOS, A.A.S. Bio Estat 2.0 AplicaçõesEstatísticas na Áreas das Ciências Biólógicas e Médicas (Sociedade Civil Mamirauá,CNPq, eds.). Belém, Sociedade Civil Mamirauá, CNPq, Brasília, DF, Brazil,292p.2004.

BALICK, M.J. AND MENDELSOHN, R. Assessing the aconomic valuer of traditionalmedicines from tropical forests. Conserv Biol: 6, 128–130, 1992.

BARROS ME, SCHOR N, BOIM MA. Effects of an aqueous extract from Phyllantusniruri on calcium oxalate crystallization in vitro. Urol Res. 30(6):374-9, (2003).

BASTOS, G.N.T, SANTOS, A.R.S, FERREIRA, V.M.M., COSTA, A.M.R., BISPO, C.I.,SILVEIRA, A.J.A. AND DO NASCIMENTO, J.L.M. Antinociceptive effect of theaqueous extract obtained from roots of Physalis angulata L. on mice. J.Ethnopharmacol. 103(2): 241-245, 2006.

BERGER, J.M. AND WANG, J.C. Recent developments in DNA topoisomerase IIstructure and mechanism. Curr Op Struc Bio 6:84-90 1996.

BONASSI, S.,,ABBONDANDOLO, A., CAMURRI, L., DAL PRÁ, L., DE FERRARI, M.,DEGRASSI, F., FORNI, A., LAMBERTI, L., LANDO, C., PADOVANI, P., SBRANA, I.,VECCHIO, D, PUNTONI, R. Are chromosome aberrations in circulating lymphocytespredictive of future cancer onset in humans? Preliminary results of an Italian cohortstudy. Cancer Genet Cytogenet, 79:133-135, 1995.

Branch, L.C. and Silva, MFD. Folk medicine of Alter Chão, Pará, Brasil. ActaAmazonica 13:737, 1983.

Brasil, 2004. Ministério da Saúde, Agência de Vigilância Sanitária. Legislação pararegistro de medicamentos. Disponível em

51

http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/registro/legis.htm (acessado em 3 de marçode 2005).BRYANT, P.E. Repair and chromosomal damage. Radiotherapy Oncol. 72(3): 251-256, 2004.

BURDEN, D.A., OSHEROFF, N. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase IIand drugs targeted to the enzyme. Biochem. Biophys Acta. 1400 (1-3):139-54, 1998.

CÁCERES, A., MENÉNDEZ, H., MÉNDEZ, E., COHOBÓN, E., SAMAYOA, B.E.,JAUREGUI, E., PERALTA, E., CARRILLO, G. Antigonorrhoeal activity of plants usedin Guatemala for the treatment of sexually transmited diseases. J. Ethnopharmacol,48: 85-88, 1995.

CAMPINAS, Secretaria Municipal de Saúde. Programa Botica da Família. Disponívelno site HTTP://campinas.sp.gov.br/saude/unidades/botica/botica.htm 9acessado emjulho 2005)

CARRANO, A.V., NATARAJAN, A.T. Considerations for population monitoring usingcytogenetic techniques. Mutat Res 204: 379-406, 1988.

CHIANG, H.C., JAW, S.M.,CHEN, P.M, KAN, W.S. Antitumor agente, physalins Ffrom Physalis angulata L. Anticancer Res. 12(3):837-43, 1992a.

CHIANG, H.C., JAW, S.M.,CHEN, P.M. Inhibitory effects of physalins B and physalinsF on various human leukemia cells in vitro. Anticancer Res. 12(4):1155-62, 1992b.

CHOI, S., CHUNG, M. A review on the relationship between aloe vera componentsand their biologic effects. Seminars in Integrative Medicine 1(1):53-62, 2003.

CHOI, E.M, HWANG, J.K.. Investigations of anti-inflamatory and antinociceptiveactivities of Piper cubeba, Physalis angulata and Rosa hybrida. J. Ethnoparmacol89:171-175, 2003.

CRFMG – Conselho Regional de Farmácia de Minas Gerais. Disponível no sitehttp://www.crfmg.org.br/jornal/Dez04/fitoterapia.html (acessado em julho de 2005.

DE MIRANDA, F.G, VILAR, J.C, ALVES, I.A, CAVALCANTI, S.C, ANTONIOLLI, A.R.Antinociceptive and antiedematogenic properties and acute toxicity of Tabebuiaavellanedae Lor. ex Griseb. inner bark aqueous extract.BMC Pharmacol. 1(1):6.2001;

DA SILVA, J.,HERRMANN, S.M., HEUSER, V., PERES, W. POSSA MARRONI, N.,GONZÁLEZ-GALLEGO, J.,ERDTMANN, B. Evaluation of the genotoxic effect of rutinand quercetin by comet assay and micronucleus test Food Chem Toxicol 40( 7), 941-947 , 2002.

DIAS, F.L, TAKAHASHI, C.S, SAKAMOTO-HOJO, E., VICHNEWSKI, W., SARTI, SJ.Genotoxicity of the natural cercaricides "sucupira" oil and eremanthine in mammaliancells in vitro and in vivo. Environ Mol Mutagen. 26(4):338-44, 1995

52

ELEGAMI,A.A., ALMAGBOUL, A.Z., OMER, M.E.A., EL TOHAMI, M.S. Sudaneseplants used in folkloric medicine: screening for antibacterial activity. Part X.Fitoterapia, 72, (7):810-817, 2001.

FENECH, M. The in vitro micronucleus technique. Mutat Res/Fundamental andMolecular Mechanisms of Mutagenesis. 455,(1-2):81-95, 2000.

FERGUSON, L. R., BAGULEY, B.C. Mutagenicity of anticancer drugs that inhibittopoisomerase enzymes. Mutat Res 355:91-101,1996.

FERREIRA, S. H (Org). Medicamentos a partir de plantas medicinais no Brasil.Academia Brasileira de Ciências, Rio de Janeiro, 1998. Disponível emhttp://www.sbq.org.br/PN-NET/plantas_medicinais.pdf

FREIBURGHAUS, F.,KAMINSKY, R., NKUNYA, M.H.H., BRUN, R. Evaluation ofAfrican medicinal plants for their in vitro trypanocidal activity. J. Ethnopharmacol55:1-11, 1996.

GOLLIN, S.M. Mechanisms leading to chromosomal instability Seminars in CancerBiology, 15 (1):33-42, 2005.

GONTIJO, A.M.M.C. & TICE, R. Teste do Cometa para detecção de dano no DNA ereparo em células individualizadas, in RIBEIRO, L.R., SALVADORI, D.M.F, &MARQUES, E.K. (org). Mutagênese Ambiental. Canoas:Ed. ULBRA, 2003. pp:247-280.

HAGMAR,L., BONASSI, S., STRÖMBERG,U.,MIKOCZY,Z, LANDO, C., HANSTEEN,I.L., MONTAGUD, A.H.,KNUDSEN. L., NORPPA,H., REUTERWALL,C.TINNERBERG, H., BRØGGER, A., FORNI, A., HÖGSTEDT, B., LAMBERT, B.,MITELMAN, F., NORDENSON, I., SALOMAA, S., SKERFVING, S. Cancer predictivevalue of cytogenetic markers used in occupational health surveillance programs: areport from an ongoing study by the European Study Group on CytogeneticBiomarkers and Health. Mutat. Res., 405 (2),:171-178, 1998.

HASTY, P. The impact of DNA damage, genetic mutation and cellular responses oncancer prevention, longevity and aging: observations in humans and mice. MechAgeing Dev. 126 (1):71-77, 2005.

HIRONO I., MORI H, HAGA M. Carcinogenic activity of Symphytum officinale. J NatlCancer Inst. 61(3):865-9, 1978.

HWANG, J.K., SHIM, J.S., CHUNG, J.Y. Anticariogenic activity of some tropicalmedicinal plants against Streptococcus mutans. Short report. Fitoterapia 75(6):596-598, 2004.

ISMAIL, N., ALAM, M. A novel cytotoxic flavonoid glycoside from Physalis angulata.Fitoterapia 72:676-679, 2001.

IUCN – Guidelines on the conservation of medicinal plants. IUCN, WHO, WWF.Gland, Switzerland, 1993.

53

JANUÁRIO, A. H. FILHO, E.R., PIETRO, R.C., KASHIMA, S., SATO, D.N, FRANÇA,S. C. Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae) PhytotherRes 16(5):445-448, 2002.

JUANG, J.K, HUANG,H.W.,CHEN, C.M., LIU, H.J. A new compound, whithangulatinA, promotes type II DNA topoisomerase-mediad DNA damage. Biochem Biophys ResCommun. 159 (3):1128-34, 1989.

KEMBER, M., E. RENG. Plantas medicinales de uso popular en la AmazoniaPeruana. AECI and IIAP: Lima, Peru. 1995.

KISSMANN K.G., GROTH, D. Plantas infestantes e nocivas, Tomo III, BASFSA,p.485-487, 1995.

LAVAGNA S.M, SECCI, D, CHIMENTI P, BONSIGNORE L, OTTAVIANI A, BIZZARRIB. Efficacy of Hypericum and Calendula oils in the epithelial reconstruction of surgicalwounds in childbirth with caesarean section. Farmacol. 56 (5.7):451-3, 2001.

LEES-MILLER, S. P. AND MEEK, K. Repair of DNA double strand breaks by non-homologous end joining. Biochimie 85: 1161-1173, 2003.

LIN, Y.S., CHIANG,H.C, KAN, W.S, HONE, E., SHIH, S.J., WON, M.H.Immunomodulatory Activity of Various Fractions Derived from Physalis angulata LExtract. American Journal of Chinese Medicine, vol XX (3-4):233-243, 1992.

LORENZI, H. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas emedicinais. Nova Odessa, SP, 1982. p372

MALIK, M., NITISS, J.L. DNA repair functions that control sensitivity totopoisomerase-targenting drugs. Eukaryotic cell. 3(1):82-90, 2004.

MARTINS, M.J. Plantas Medicinais de uso na Amazônia. CEJUP, 2a.ed. 1989. pp31-32.

MARULLAZ, P.D. Digitalis: is there a future for this classical ethnopharmacologicalremedy? J Ethnopharmacol. 32(1-3):111-5, 1991.

MITCHELL, I.D., LAMBERT, T.R, BURDEN, M.,SUNDERLAND, J., PORTER, R.L.,AND CARLTON, J.B. Is polyploidy an important genotoxic lesion?. Mutagenesis.10(2):79-83, 1995.

MØLLER, P., KNUDSEN, L.E, LOFT, S., WALLIN, H.. The Comet Assay as a RapidTest in Biomonitoring Occupational Exposure to DNA-damaging Agents and Effect ofConfounding Factors.

MOORHEAD,P.S, NOWELL,P.C., MELLMAN, W.J; BATTIPS, D.M. HUNGERFORD,D.A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral bloodExp Cell Res, 20(3):613-616, 1960.

54

MOORE, .R.C.,BENDER, M.A. Time sequence of events leading to chromosomalaberration formation. Environ Mol Mutag, 22(4):208-213, 1993.

NAGAFUJI, S., OKABE, H., AKAHANE, H., ABE F. Trypanocidal Constituents inPlants 4.Withanolides from the Aerial Parts of Physalis angulata. Biol. Pharm Bull,27(2) :193-197, 2004.

NATARAJAN A. T. Techniques for biomonitoring of human populations for geneticeffects. Rev. Brasil. Genet. 16(3): 841-847, 1993.

NOWAK MA, KOMAROVA NL, SENGUPTA A, JALLEPALLI PV, SHIH IEM,VOGELSTEIN B, LENGAUER C. The role of chromosomal instability in tumorinitiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 10;99(25):16226-31, 2002.

OBE G., PFEIFFER, P., SAVAGE, J.R., JOHANNES, C., GOEDECKE W,JEPPESEN, P., NATARAJAN, A.T, MARTÍNEZ-LÓPEZ, W., FOLLE, G.A., DRETS,M.E. Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution. Mutat Res.504(1-2):17-36, 2002.

OLIVE PL. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect inChinese hamster V79 spheroids. Radiat Res.117(1):79-92, 1989.

OSTLING O, JOHANSON KJ Bleomycin, in contrast to gamma irradiation, inducesextreme variation of DNA strand breakage from cell to cell. Int J Radiat Biol RelatStud Phys Chem Med. 52(5):683-91, 1987.

PEPATO, M.T, BAVIERA, A.M, VENDRAMINI,R.C., BRUNETTI, I.L. Evaluation oftoxicity after one-months treatment with Bauhinia forficata decoction instreptozotocin-induced diabetic rats. BMC Complement Altern Med. 4:7 (2004).(Published online).

PFEIFFER, P., GOEDECKE, W.,OBE, G. Mechanisms of DNA double-strand breakrepair and their potential to induce chromosomal aberrations Mutagenesis, 15(4):289-302, 2000.

PIERCE, A.J., STARK, J.M., ARAUJO, F.D., MOYNAHAN, M.E., BERWICK,M.,JASIN,M. Double-strand breaks and tumorigenesis (Review), Trends in Cell Biol11(11): S52-S59, 2001.

POOL-ZOBEL, B.L, DORNACHER, I, LAMBERTZ, R, KNOLL, M, SEITZ, H.K.Genetic damage and repair in human rectal cells for biomonitoring: sex differences,effects of alcohol exposure, and susceptibilities in comparison to peripheral bloodlymphocytes. Mutat Res. 551(1-2):127-34, 2004.

PRESTON, R.J. Extrapolations are the Achilles Heel of Risk Assessment MutatRes/Reviews 589(3):153-157 , 2005.

RABELO-GAY, M.N., RODRIGUES, M.A.R., MONTELEONE-NETO, R. Mutagênese,teratogênese e carcinogênese: critérios de avaliação. Ribeirão Preto, SociedadeBrasileira de Genética, 1991. 246p.

55

RANG, H.P, DALE, M.M., RITTER, J.M.,MOORE, P.K. Farmacologia (tradutores:Patrícia Lydie Vouex, Antonio José Magalhães da Silva Moreira). 5ª.Rio de Janeiro,Ed. Elsevier 2004. 904p.

RIBEIRO, L.R., BAUTISTA, A.R., SILVA, A.R., SALES, L.A., SALVADORI, D.M,MAIA, P.C. Toxicological and toxicogenetic effects of plants used in popular medicineand in cattle food. Mem Inst Oswaldo Cruz. 86(2):89-91 1991.

RIBEIRO, L.R, SILVA, A.R., BAUTISTA, A.R., COSTA, S.L., SALES, L.A., RIOS, A.C,SALVADORI, D.M. Clastogenic effect of extracts obtained from Crotalaria retusa L.and Crotalaria mucronata Desv. on mouse bone marrow cells. Mutat Res. 300(3-4):253-8, 1993.

RIBEIRO, L.R., MARQUES, K.M. A importância da mutagênese ambiental nacarcinogênese humana. In: RIBEIRO, L.R., SALVADORI, M.F., MARQUES, E.K.(Org.) Mutagênsese Ambiental. Canoas: Ed.ULBRA, 2003, pp:21-28.

RIO DE JANEIRO: Secretaria de Estado de Saúde do Rio de Janeiro. ProgramaEstadual de Plantas Medicinais – PROPLAM, é Lei Estadual nº 2.537 de 15/04/96,regulamentada pelo Decreto Governamental nº23.052, de 16/04/97, criando oConselho Estadual de Plantas Medicinais – CEPLAM. Disponível no site:(http://www.saude.rj.gov.br/proplam). Acessado em 17/08/2005.

RODRIGUES, R.M. A flora da Amazônia. Belém, Ed. CEJUP, 1989. p 54.

ROW, L. R., SARMA, N.S., MATSUURA, T., NAKASHIMA, R. Physalins E and H,New physalins from Physalis angulata e and Physalis lancifolia. Phytochemistry17:1641-1645, 1978.

ROW, L. R., REDDY, K.S., SARMA, N.S.,MATSUURA, T., NAKASHIMA, R. Newphysalins from Physalis angulata and Physalis lancifolia, structure and reactions ofphysalins D, I, G and K. Phytochem 19:1175-1181,1980.

SANTOS, J.A.A., TOMMASSINI, T.C.B., XAVIER, D.C.D., RIBEIRO, I.M., SILVA,M.T.G., MORAIS FILHO, Z.B. Molluscicidal activity of Physalis angulata L. extractsand fraction on Biomphalaria tenagophila (d'Orbigny, 1835) under laboratoryconditions. Mem Inst Oswaldo Cruz. 98:425-428, 2003.

SHINGU, K., YAHARA, S., OKABE, H., NOHARA, T.. Three New Withanolides,Physagulins E, F and G from Physalis angulata L. Chem. Pharm. Bull 40(9):2448-2451, 1992.

SILVA, J, HERRMANN, S.M., HENRIQUES, J.A.P. (org.). Genética Toxicológica.Porto Alegre: Alcance, 2003, 424p.

SILVA, J, HERRMANN, S.M., HEUSER, V., PERES, W., POSSA MARRONI, N.,GONZALEZ-GALLEGO, J., ERDTMANN, B. Evaluation of the genotoxic effect ofrutin and quercetin by comet assay and micronucleus test. Food Chem Toxicol.40(7):941, 2002.

56

SINGH, N.P, MCCOY, M.T., TICE, R.R., SCHNEIDER, E.L.. A simple technique forquantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp CellRes.175(1):184-91, 1988.

SINGH, N.P, DANNER, D.B., TICE, R.R, BRANT, L., SCHNEIDER, E.L.DNA damageand repair with age in individual human lymphocytes. Mutat Res. 237(3-4):123-30,1991.

SOARES, M.B.P., BELLINTANI, M.C. RIBEIRO, I.M. TOMASSINI, T.C.B, SANTOS,R. R. Inhibition of macrophage activation and lipopolysaccaride-induced death byseco-steroids purified from Physalis angulata L. Eur J Pharmacol 459:107-112,2003.

SPEIT, G, HARTMANN, A. The comet assay: a sensitive genotoxicity test for thedetection of DNA damage. Methods Mol Biol. 291:85-95, 2005.

TAVARES, D.C., TAKAHASHI, C.S. Evaluation of the genotoxic potential of thealkaloid boldine in mammalian cell systems in vitro and in vivo. Mutat Res.321(3):139-45, 1994.

TAYLOR, J.L., ELGORASHI, E.E., MAES, A., VAN GORP, U., DE KIMPE, N., VANSTADEN, J., VERSCHAEVE, L. Investigating the safety of plants used in SouthAfrican traditional medicine: testing for genotoxicity in the micronucleus and alkalinecomet assays. Environ Mol Mutagen. 42(3):144-54, 2003.

TICE, R.R., AGURELL, E., ANDERSON, D., BURLINSON, B., HARTMANN, A.,KOBAYASHI, H., MIYAMAE, Y., ROJAS, E., RYU, J.C., SASAKI, Y.F. Single cellgel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. EnvironMol Mutagen.;35(3):206-21, 2000.

TOMASSINI, T.C.B., BARBI, N.S., RIBEIRO, I.M, XAVIER, D.C.D. Gênero Physalis -uma revisão sobre vitaesteróides. Quím. Nova 23(1):47-57, 2000.

TRAORE, F., GASQUET, M., LAGET, M., GUIRAUD, H., DI GIORGIO, C., AZAS, N.,DOUMBO, O., TIMON-DAVID, P. Toxicity and genotoxicity of antimalarial alkaloid richextracts derived from Mitragyna inermis O. Kuntze and Nauclea latifolia. PhytotherRes.;14(8):608-11, 2000.

VARGAS, V.M., GUIDOBONO, R.R., HENRIQUES, J.A. Genotoxicity of plantextracts. Mem Inst Oswaldo Cruz. 86(2):67-70, 1991.

VERSCHAEVE, L., KESTENS, V., TAYLOR, J.L., ELGORASHI, E.E., MAES, A., VANPUYVELDE, L., DE KIMPE, N., VAN STADEN, J. Investigation of the antimutageniceffects of selected South African medicinal plant extracts. Toxicol In vitro. 8(1):29-35,2004.

WANG, J.C. DNA topoisomerases. Annu Rev Biochem 54:665-697, 1985.

57

Wu, S.J., Ng,L.T, Chen, C.H, Lin, D.L., Wang, S.S, Lin, C.C. Antihepatoma activity ofPhysalis angulata and P. peruviana extracts and their effects on apoptosis in humanHelp G2 cells. Life Sciences 74 (9):2061-2073, 2004.

Anexo 1

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO DA PHYSALIS ANGULATA L. EM

LINFÓCITOS HUMANOS

RAQUEL ALVES DOS SANTOS1, TERESINHA ROSA CABRAL2, ISABEL ROSA CABRAL2, LUSÂNIA MARIA

GREGGI ANTUNES3,4, CRISTIANE PONTES ANDRADE3, PLÍNIO CERQUEIRA DOS SANTOS CARDOSO 1,

MARCELO DE OLIVEIRA BAHIA2, CLAUDIA PESSOA5, JOSÉ LUIS MARTINS DO NASCIMENTO2,

ROMMEL RODRÍGUEZ BURBANO2, CATARINA SATIE TAKAHASHI1,6

1. Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São

Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.

2. Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brazil.

3. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG,

Brazil.

4. Departamento Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.

5. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do

Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.

6. Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.

Key words: P. angulata, micronuclei, comet assay.

RESUMOA Physalis angulata L pertence à família Solanaceae que é largamente distribuída nas regiões

tropicais e subtropicais do mundo. Extratos e infusões desta planta são amplamente usados em

vários continentes na medicina popular para tratamento de uma variedade de patologias, tais como:

malária, gonorreia, dermatite, hepatite, entre outras. Todavia, não há relatos de investigação da

genotoxicidade de extratos ou compostos isolados desta planta. Assim, o objetivo desta pesquisa foi

investigar o potencial genotóxico do extrato aquoso da P. angulata, nos linfócitos de sangue

periférico humano, usando os ensaios de aberrações cromossômicas e de eletroforese em gel de

células individualizadas ou teste do Cometa. Os resultados obtidos neste estudo indicam que: (a) na

presença do extrato aquoso nas concentrações de 0,1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1 µg/mL, observou-se um

aumento na taxa de proliferação dos linfócitos tratados (p<0,01), (b) as concentrações acima de 2

µg/mL as doses foram consideradas citotóxicas, pois resultou em 50% de citotoxicidade comparada

ao controle negativo; (c) o extrato aquoso da P. angulata não apresentou efeito clastogênico ou

aneugênico; (d) não houve indícios d quebra de fitas simples do DNA ou outro tipo de lesão nessa

molécula, segundo o teste do Cometa. O Extrato aquoso da P. angulata exibiu efeito tóxico sobre o

cromossomo ou sobre a molécula de DNA, portanto, mostrou-se inadequado ao consumo humano,

todavia são necessários testes adicionais, especialmente, ensaios in vivo para garantir maior

segurança na sua utilização terapêutica.

INTRODUÇÃO

Physalis angulata L pertence à famíliaSolanaceae que é amplamente distribuída emtoda América Tropical. Essa planta é usada namedicina popular de diferentes paísese daÁfrica, Ásia e América, no tratamento de dor,febre, inflamações, malária, asma, dermatite,reumatismo (Soares et al., 2003; Choi andHwang, 2003).

Diferentes extratos dessa planta têm exibidoatividade in vitro anti-tripanosomal, anti-inflamatória e bactericida, sendo letal paraalgumas bactérias patogênicas ao homem taiscom Staphylococcus, Escherichia coli, Neisseriagonorrhoeae and Pseudomonas aeruginosa.

A despeito das propriedades medicinaisatribuídas à P. angulata, não há relatos sobresua atividade genotóxica, conforme asrecomendações para validação dos fitoterápicos.

No presente estudo, nós avaliamos aformação de danos cromossômicos na moléculade DNA induzidos pelo extrato aquoso da P.angulata em linfócitos periféricos humanos.

Para medir os danos na molécula de DNA esistema de reparo, realizou-se o teste doCometa, também chamado de eletroforese decélula única em gel alcalino. Essa técnicapermite detectar quebras na fita simples do DNA,sítios álcali-lábeis e ligações cruzadas DNA-DNAe DNA-proteína, tenso alta sensibilidade paradetecção de danos no DNA em baixos níveis.

Adicionalmente foram investigadas lesõescromossômicas pelo teste das aberraçõescromossômicas e do micronúcleo, este últimomais eficiente na identificação do efeitoaneugênico.

MATERIAL E MÉTODOS

Extrato da plantaEspécimes de P. angulata foram coletados

em Belém, Estado do Pará, Brasil, eidentificadas (Herbário e Laboratório de Neuro-Química, Departamento de Fisiologia,Universidade Federal do Pará, comprovante denúmero 15). 150 g de raiz da planta P. angulataforam lavadas em água e fervidas em 700 mL deágua ultrapura (Milli-Q plus), concentrando-se a14% do volume inicial, que foi congelado (-20 ºC), liofilizada e foram obtidas 2.712 g de extrato.Este extrato foi dissolvido em água destilada efiltrado em filtro Millipore 0,22 μm. Esta soluçãofoi mantida a 4ºC e protegida da incidência deluz até o uso. Bleomicina (CAS 9041-93-4) foiadquirida da Biosintética (Brasil) e utilizados noensaio de micronúcleo como um controlepositivo, e doxorrubicina (CAS 25316-40 - 9) foiadquirido da Eurofarma Laboratórios (São Paulo,Brasil) e usado como um controle positivo emensaio do cometa. A Citocalasina B (CAS 14930-96-2), foi adquirida da Sigma (St. Louis, MO,E.U.A.).

Cultura de linfócitosLinfócitos humanos do sangue periférico

foram usados para os ensaios in vitro.Os linfócitos foram obtidos de seis voluntários

saudáveis, não-fumadores, três machos e trêsfêmeas com idade entre 18-30 anos com osseus consentimento. O sangue totalheparinizado (0,5 mL) foi adicionada a 4,5 mL domeio contendo 78% RPMI 1640 (SigmaChemical Co., E.U.A.), 20% de soro fetal bovinoinativado (Gibco-Invitrogen, Denmark),antibióticos (penicilina 0,005 mg/mL eestreptomicina 0,01 mg/mL), estimulados com2% de fitohemaglutinina (PHA; Gibco- Invitrogen,

Denmark). Cada amostra de sangue foi testadaco diferentes concentrações do extrato da P.angulata estabelecidas em experimentospreliminares (0,1, 0,5, 1,2,3 e 6 µg/mL de meiode cultura). Adicionalmente foram estabelecidasas culturas controle negativo (não-tratadas) epositiva.

Teste do MicronúcleoPara o teste do micronúcleo, após 24 horas

de cultivo as células foram tratadas com asdiferentes concentrações de P. Angulata. ACitocalasina B (6 mg / mL) foi adicionado a 44 h.Depois 72 h, a 37º C, as células foram coletadaspor centrifugação, lavadas e submetidos a umahipotonia leve (1% de citrato de sódio) eimediatamente fixado com metanol: ácidoacético ácido. As lâminas foram preparadas deacordo com procedimento padrão decitogenética e coradas com Giemsa a 4%. Aslâminas foram codificadas e analisadas pormicroscopia óptica em aumento de 400x 1000X,se necessário. Para cada experimento, foramcomputados 2000 linfócitos binucleados com ocitoplasma bem preservado. Os micronúcleosforam identificados de acordo com os critérios deFenech et al. (2003).

Teste das Aberrações CromossômicasPara o teste das aberrações cromossômicas,

seis horas após o início da incubação, quandoas células encontravam-se em G1, adicionou-sea solução aquosa de P. angulata nas mesmasconcentrações do teste de micronúcleo. A culturacontrole positivo foi tratada com doxorrubicinanas concentração de 0,15 µg/mL. Todos osfrascos foram envolvidos em papel alumínio, afim de bloquear a exposição à luz.

Após 47 horas de cultivo agitou-semanualmente cada frasco de cultura, retirando-se 300 µL de cada um para a realização doensaio do Cometa. Em seguida, o crescimentocelular foi bloqueado pela adição de colchicina(0,016% SIGMA).

Procedeu-se a preparação citológica paraobtenção de cromossomos metafásicos,realizando-se a hipotonização e a fixação emmetanol e ácido acético.

O material celular obtido foi depositado emlâminas adequadamente limpas e corado emsolução de GIEMSA em tampão fosfato.

As lâminas foram codificadas e, sobmicroscopia óptica (100X), foram analisadas 100metáfases (2n=46±2) nas quais computou-se asalterações cromossômicas numéricas ouestruturais, observando-se a posição docentrômero, alterações do grau de ploidia eaberrações estruturais, tais como lesõesacromáticas (gaps), quebras cromatídicas erearranjos complexos, como anéis e trocascromatídicas.

Para monitorar a toxicidade celular induzidapelo agente em questão, foi determinado oíndice mitótico pela contagem do número demetáfases em 2000 linfoblástos/cultura,aplicando-se a seguinte fórmula.

IM = número de metáfases X 1002000 linfoblástos

Ensaio do CometaUma alíquota de 300 µL de cultura foi

depositada num tubo de 500 µL e em seguidaadicionados 120 µL de agarose com baixo pontode fusão (0,5%), depositando-se tal misturasobre uma lâmina pré-preparada com agarosecom ponto de fusão normal (1,5%). Após asolificação do gel (4ºC) o material foi submetidoà citólise e em seguida à eletroforese emtampão alcalino (300 mA, 0,5-1 V/cm, <4ºC, pH13). As lâminas foram então neutralizadas emTris (0,4 M, pH 7,5) e fixadas em etanolabsoluto. Posteriormente, deu-se a coloraçãocom brometo de etídio com análise imediata sobmicroscopia de flourescência (filtro 516-560 nm,barreira de filtro de 590 nm e aumento total de400X).

Foi possível a visualização de imagensmicroscópicas com contorno circular (sem danosno DNA) ou estruturas em forma de “cometa”

(com danos no DNA). A extensão de imagemsignifica a distância de migração da fita de DNAdanificada, que foi classificada segundo SINGHet al (1988,1991), POOL-ZOBEL et al (1994) eSPEIT et al (1995), onde a proporção de DNApresente na cauda do Cometa os agrupa emcinco categorias: 0 = sem danos (<5%); 1 =baixo nível de danos (5-20%); 2 = médio nível dedanos (20-40 %); 3 = alto nível de danos (40-95%); 4 = dano total (>95%).

Análise EstatísticaO Teste F (ANOVA) de dois critérios foi

utilizado para detectar diferenças entre asfrequências de aberrações cromossômicas emicronúcleos bem como para os valores de IMobservados nas diversas doses do extrato eseus respectivos controles (AYRES et al, 2003).

O Teste T de Student foi realizado quando oteste F identificou diferenças significativas.

Em todas as análises foi estabelecido em 5%o nível de significância.

RESULTADOS

A Tabela 1 apresenta a distribuição dosCometas observados em linfócitos humanostratados in vitro com diferentes concentraçõesda P. angulata. Nela, pode-se observar que, apartir da concentração de 0,1 µg/mL, houve umaumento significativo no escore de danos noDNA (p=0,043) com uma distribuição uniformeentre as diferentes classes de danos (0-4).Todavia, deve ser ressaltado que as lesõesdetectáveis por meio do teste do Cometa sãoainda passíveis de reparo, e portanto não devemser extrapoladas diretamente para o efeito invivo.

Adicionalmente, na Tabela 2 pode-seobservar que o tratamento com o extrato aquosode P. angulata em doses iguais ou inferiores a 1µg/mL promoveu aumento no índice mitótico emrelação à cultura controle. Todavia, a partir dessa

dose, observou-se a indução de efeito citotóxiconas concentrações utilizadas investigadas.

A Tabela 3 apresenta dados sobre a pesquisade efeitos citogenéticos do fitoterápico emquestão, onde pode ser observado que não foiidentificado qualquer efeito genotóxicoestatisticamente significativo do extrato aquosode P. angulata durante o tratamento na fase G1do ciclo celular nas concentrações 0,1 µg/mL;0,5 µg/mL e 1 µg/mL.

Na análise de aberração cromossômica, afrequência de células com quebras cromatídicase cromossômicas foi igual ou inferior a 3%, nãodiferindo entre as culturas tratadas e expostas(F=1; p=0,438), todavia a amostra no 1 exibiumaior taxa de aberrações, diferindo dos demais(p=0,003). A inclusão dos gaps não alterou esseresultado, uma vez que sua ocorrência tambémnão diferiu entre as amostras (F=1,083; p=0,405)ou tratamentos (F=2,583; p=0,118).

Os dados da análise de MN em linfócitosbinucleados são apresentados nas Tabelas 4 e5.

A Tabela 4 mostra os resultados do total decélulas binucleadas com MN e o total de MNapós tratamento com o composto-teste nasdiferentes concentrações. O tratamento com asquatro menores concentrações de extratoaquoso da P. angulata não mostrou aumentosignificativo no total de células binucleadas comMN, quando comparado às culturas não tratadas(p>0,05). Linfócitos tratados com extrato aquosoda raiz da P. angulata na concentração 3 e 6µg/mL exibiram um aumento significativo no totalde células com MN (p<0,05). De modo geral, umMN foi observado por célula, mas algumascélulas apresentaram dois ou três MN.

DISCUSSÃO

Os princípios ativos em extratos de uamvariedade de plantas de regiões tropicais esubtropicais são estudados para possíveisutilização na saúde humana (Arouma, 2003).Para se investigar a atividade genotóxica da P.

angulata, diferentes concentrações de seuextrato aquoso foram empregadas no teste deaberrações cromossômicas, micronúcleo eCometa.

O estudo de danos em nível cromossômico éparte essencial da Genética Toxicológica porqueessas lesões são um importante evento noprocesso de carcinogênese (Fenech, 2000). Osmicronúcleos são pequenos corposextranucleares originados na mitose a parte defragmentos acêntricos ou cromossomos inteirosque não forma incluídos no núcleo durante oprocesso de replicação do DNA e citocinese(Fenech, 1997)

P. angulata nas menores concentraçõestestadas não induziu efeito genotóxico nostestes empregados, todavia, observou-se quenas concentrações mais elevadas (3 e 6 µg/mL)houve aumento na frequência de micronúcleos,concentrações essas que inviabilizaram aanálise de aberrações cromossômicas.

O fato de algumas plantas exibirem atividadegenotóxica depende da presença de compostos,em seus extratos e das condiçõesexperimentais. As fisalinas B, F e G purificadasde P. angulata tem forte atividadeimunosupressora em macrófagos emcamundongos (Soares et al, 2003). Outroscompostos isolados de P. angulata exibiramatividade contra a forma epimastigota etripomastigota do T. cruzi in vitro, demonstrandosua potencialidade como agentesquimioterapêutico para tratamento de doença deChagas (Nagafugi et al., 2004).

O extrato aquoso da P. angulata exibiutoxicidade no presente estudo em concentraçõesa partir de 2 µg/mL. Um único estudo investigoua citotoxicidade da P. angulata, porém os autoresutilizaram um extrato, cerca de quatro vezesmenos concentrado, linhagem celularestabelecida e o parâmetro utilizado parainvestigação da citotoxicidade foi a indução porapoptose, o que inviabiliza a comparação dosresultados (Wu et al, 2004).

Os diferentes tipos de lesões observadas nasmetáfases tiveram baixa frequência, tendo sidoconsiderados eventos raros, desta forma osdados do presente estudo indicam que o extratoaquoso não exibiu efeito tóxico sobre ocromossomo ou sobre a molécula de DNA, e,portanto, sob a ótica da genotoxicidade mostra-se seguro para utilização terapêutica.

Esses dados indicam que o efeitoantineoplásico da planta observado in vivo e invitro não deve ser obtido por via genotóxica,devendo ser investigadas as demais vias.

Este é o primeiro estudo investigando agenotoxicidade do extrato aquoso da raiz da P.angulata, e aqui nenhuma atividade genotóxicafoi observada nos ensaios de aberraçõescromossômicas e no teste do Cometa. Todavia,para aumentar a segurança dos resultadosobtidos nesta investigação, sugere-se arealização de estudos adicionais, tais comoensaios em camundongos e commicrorganismos (teste de Ames), bem comoantimutagênicos.

AGRADECIMENTOSEste estudo recebeu apoio financeiro do

CNPq. CPA recebeu bolsa do BIC/FAPEMIG.

REFERÊNCIAS

Aruoma OI (2003). Methodologicalconsiderations for characterizing potentialantioxidant actions of bioactive componentsin plant foods. Mutat Res 523: 9-20.

Bailar JC, Mosteller F (1992). Medical uses ofstatistics. Boston, MA: New England JournalMedicine Books, 1992.

Canalle R, Burim RV, Callegari JL, Takahashi CS(2001). Assesment of the cytotoxic andclastogenic activities of the sesquiterpenelactone lynchnopholide in mammalian cellsin vitro and in vivo. Cancer Detec Prev 25:93-101.

Chiang HC, Jaw SM, Chen CF, Kan WS (1992a).Antitumor agent, physalin F from Physalisangulata L. Anticancer Res 12: 837-843.

Chiang HC, Jaw SM, Chen CF (1992). Inhibitoryeffects of physalin B and physalin F onvarious human leukemia cells in vitro.Anticancer Res 12: 155-162.

Choi EM, Hwang JK (2003). Investigations ofanti-inflammatory and antinociceptiveactivities of Piper cubeta, Physalis angulataand Rosa hybrida. J Ethnopharm 89: 171-175.

Fenech M (1997). The advantages anddisavantages of the cytokinesis-blockmicronucleus method. Mutat Res 392: 11-18.

Fenech M (2000). The in vitro micronucleustechnique. Mutat Res 455: 81-95.

Fenech M, Crott JW (2002). Micronuclei,nucleoplasmic bridges and nuclear budsinduced in folic acid deficient humanlymphocytes- evidence for breakage-fusion-bridge cycles in the cytokinesis- blockmicronucleus assay. Mutat Res 504: 131-136.

Fenech M, Chang WP, Kirsch-Volders M,Holland N, Bonassi S, Zeiger E; HUmanMicron Nucleus project (2003). HUMNproject detailed description of the scoringcriteria for the cytokinesis-blockmicronucleus assay using isolatedlymphocytes cultures Mutat Res 534: 65-75.

Gontijo AMMC, Tice R (2003). Comet Assay:detection of DNA damage and DNA repair inindividual cells (Teste do cometa para adetecção de dano no DNA e reparo emcélulas individualizadas). In: MutagêneseAmbiental, Canoas, ULBRA, Ribeiro LR,Salvadori DMF, Marques EK, Eds. pp. 247-275.

Hsieh WT, Huang KY, Lin HY, Chung JG (2006).Physalis angulata induced G2/M phasearrest in human breast cancer cells. FoodChem Toxicol 44: 974-983.

Islaih M, Halstead BW, Kadura IA, Li B, Reid-Hubbard JL, Flick L, Altizer JL, Thom DeahlJ, Monteith DK, Newton RK, Watson DE(2005). Relationships between genomic, cellcycle, and mutagenic responses of TK6 cellsexposed to DNA damaging chemicals. MutatRes 578: 100-116.

Ismail N, Alam M (2001). A novel cytotoxicflavonoid glycoside from Physalis angulata.Fitoterapia 72: 676-679.

Januário AH, Filho ER, Pietro RC, Kashima S,Sato DN, França SC (2002).Antimycobacterial physalins from Physalisangulata L. (Solanaceae). Phytother Res 16:445-448.

Kuo PC, Kuo TH, Damu AG, Su CR, Lee EJ, WuTS, Shu R, Chen CM, Bastow KF, Chen TH,Lee KH (2006). Physanolide A, a novelskeleton steroid, and other cytotoxicprinciples from Physalis angulata. Org Lett8: 2953-2956.

Lin YS, Chiang HC, Kan WS, Hone E, Shih SJ,Won MH (1992). Immunomodulatory activityof various fractions derived from Physalisangulata L. extract. Am J Chin Med, 20:233-243.

Magalhães HI, Veras ML, Torres MR, Alves AP,Pessoa OD, Silveira ER, Costa-Lotufo LV,de Moraes MO, Pessoa C (2006). In vitroand in vivo antitumor activity of physalins Band D from Physalis angulata. J PharmPharmacol 58: 235-241.

Nagafuji S, Okabe H, Akahane H, Abe F (2004).Trypanocidal constituents in plants 4.Withanolides from the aerial parts ofPhysalis angulata. Biol Pharm Bull 27: 93-197.

Maistro EL, Carvalho JCT, Mantovani MS(2004). Evaluation of the genotoxic potentialof the Caseaaria sylvestris extract on HCTand V79 cells by the comet assay. Toxicol inVitro 18: 337-342.

Schmid W (1973). Chemical mutagen testing onin vivo somatic mammalian cells. AgentsActions 3: 77-85.

Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL(1988). A simple technique for quantitation oflow levels of DNA damage in individual cells.Exp Cell Res 175: 184-191.

Soares MB, Bellintani MC, Ribeiro IM, TomassiniTC, Ribeiro dos Santos R (2003). Inhibitionof macrophage activation andlipopolysaccaride -induced death by seco-steroids purified from Physalis angulata L.Eur J Pharmacol 459: 107-112.

Surrallés J, Xamena N, Creus A, Catalán J,Norppa H, Marcos R (1995). Induction ofmicronuclei by five pyrethroid insecticides inwhole-blood and isolated humanlymphocytes cultures. Mutat Res 341: 169-184.

Wu SJ, Ng LT, Chen CH, Lin DL, Wang SS, LinCC (2004). Antihepatoma activity of Physalisangulata and P. peruviana extracts and theireffects on apoptosis in human Hep G2 cells.Life Sci 74: 2061-2073.

Anexo 1

Tabela 1: Proporção de danos no DNA, frequência de células com Cometas e distribuição entre asclasses de Cometas em linfócitos humanos tratados in vitro com diferentes concentrações de extratosaquoso de P. angulata.

Tratamento µg/mL Classe de Cometa (%) Índice de Dano noDNA

Células comcometas

0 1 2 3 4 ± SD (%)

Controle negativo(n=6)

57,2 32,2 8,2 2 0,4 0,15 ± 0,19 42,8

Controlepositivo*(n=6)

32 29,7 32 3 3,3 1,15a ± 0,19 73,8a

Extrato

0,1 (n=6) 50,2 34 2,2 3,6 0,2 0,75 ± 0,14 49,8

0,5 (n=6) 38,2 41 16,2 4,2 0,4 0,87a ±0,28 61,8

1,0 (n=6) 32,6 45,2 16,8 4,2 0,4 0,93a ± 0,33 69,4

2,0 (n=6) 38,6. 33,4 22,2 4,2 1,6 0,90a ± 0,26 61,4

3,0 (n=6) 40 33,8 19,4 5 1,8 0,95a ± 0,12 60,0

6,0 (n=6) 42,7 28 20 8,3 1 1,14a ± 0,65 57,3a Estatisticamente diferente do Grupo controle (p<0,05)SD: Desvio Padrão*DXR: 0,15µg/mL

Tabela 2: Valores referentes aos índices mitóticos (%) obtidos em culturas de linfócitos tratadas

com diferentes concentrações de extrato aquoso de P. angulata.

AMOSTRA 0 µg/mL 0,1 µg/mL 0,5 µg/mL 1 µg/mL 2 µg/mL 3 µg/mL

1 0,70 2,25 2,30 2,30 0,85 0,50

2 0,90 1,45 0,80 1,15 0,03 0,50

3 0,65 1,40 1,55 1,15 0,05 0,03

4 0,65 1,85 1,75 1,35 0,25 0,25

5 0,75 1,75 1,90 1,45 0,35 0,40

6 0,85 1,65 1,85 1,35 0,25 0,35

Média 0,75 1,73 1,78 1,46 0,34 0,38

Desvio Padrão 0,22 1,92 2,30 3,69 1,45 0,21

p* <0,01 <0,01 <0,01 <0,05 <0,05

*valor de p em relação à amostra controle (o µg/mL)

Tabela 3: Distribuição de alterações cromossômicas observadas em linfócitos humanos apóstratamento in vitro com extrato aquoso de P. angulata.

Amostras Metáfases

normais

Metáfases alteradas

Ctb Csb Ctg Csg Outras alterações

0 µg/mL

1 100

2 95 1 4

3 98 1 1

4 100

5 99 1

6 99 1

Total 591 2 1 6 0

0,1 µg/mL

1 97 2 1

2 99 1

3 99 1

4 100 0 0

5 99 1

6 99 1

Total 593 3 0 3 1

0,5 µg/mL

1 100

2 99

3 100 tetraploidia

4 98 1 0 1 0

5 100

6 99 1

Total 596 1 0 1 1

1 µg/mL

1 99 2 Quadrirradial*

2 100

3 100

4 100

5 99 1

6 99 1

Total 597 3 0 0 1*quebras cromatídicas envolvidas no rearranjo listados na coluna ‘outras alterações’- Ctb: quebra cromatídica; Csb: quebra cromossômica; ctg:gap cromatídico; Csg:gap cromossômico.

Anexo 1

Tabela 4. Indução de micronúcleos em linfócitos humanos cultivados e tratados com extrato aquosos

de P. angulata L.

Tratamentos Total de BNcom MN

Total deMN

Distribuição de MN em BN

0 MN 1 MN 2 MN 3 MN

Controle negativo 23 25 11977 21 2 0

Controle positivo 245 274 11755 219 23 3

P. angulata

0,1 µg/mL 25 26 11975 24 1 0

0,5 µg/mL 23 27 11977 19 4 0

1 µg/mL 26 26 11974 26 0 0

2 µg/mL 34 37 11966 32 1 1

3 µg/mL 38 40 11962 36 2 0

6 µg/mL 37 41 11963 34 2 1

12000 células analisadas/tratadas;BN: células binucleadas; MN: micronúcleo*Bleomicina: (BLM) = 1,5 µg/mL ( 10µl/cultura)a p<0,05 tratado VS controle negativo

Tabela 5 – Indução de citotoxicidade em cultura de linfócitos humanos tradada com extrato dePhysalis angulata L.

Tratamento

µg/mL

Distribuição de células de acordo com o

número de núcleo

%BN IPBC ± DP

1 2 3 4

Controle negativo *n=6) 1227 1438 191 144 47,93 1.742

Controle positivo* (n=6) 1852 1019 71 58 33,96 1.426

PAE (n=6)

0.1 (n=6) 1157 1584 136 123 52.80 1.701

0.5 (n=6) 1284 1442 138 136 48.06 1.661

1.0 (n=6) 1291 1496 119 94 49.86 1.642

2.0 (n=6) 1186 1514 151 149 50.46 1.705

3.0(n=6) 1289 1517 121 73 50.56 1.635

6.0(n=6) 1199 1500 163 138 50.00 1.817

12000 células analisadas e tratadas ; %BN: percentagem de células binucleadas; DP: Desvio Padrão.IPBC: Indíce de proliferação cytokinesis blocked {[M1 + 2(M2) + 3(M3 + M4)]/ N}*Bleomycina: [BLM] = 1.5 µg/ml (10 µl/cultura)

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