Produo de poligalacturonases por Aspergillus niger em meio slido com diferentes densidades aparentes

Produo de Poligalacturonases por Aspergillus niger em Meio Slido com Diferentes EspessurasCntia Panarotto, Rmulo T. O. Valim, Eloane Malvessi e Mauricio M. Silveira

Universidade de Caxias do Sul Instituto de Biotecnologia

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RESUMO

A produo de endo e exo-poligalacturonases por Aspergillus niger T0005007-2 foi avaliada em diferentes espessuras de meio (0,5 a 8 cm), formulado com farelo de trigo (37% p/p), pectina ctrica purificada (6% p/p), como indutor de atividade enzimtica, e soluo de nutrientes. De um modo geral, os picos de atividade foram alcanados com 72 h de processo, observando-se um incremento na produo de enzimas nos meios com maior espessura, at 6 cm, com um pequeno decrscimo nas amostras de meios com 8 cm de altura. Na condio padro, 0,5 cm, obtiveram-se valores de 50 U/gms, para endo-poligalacturonase, e 152 U/gms, para exo-poligalacturonase. Com o aumento da espessura para 6 cm, foi identificado um significativo incremento nos valores de atividade enzimtica, atingindo, aproximadamente, 140 e 390 U/gms, para endo e exo-PG, respectivamente.

INTRODUO

As pectinases tm importantes aplicaes industriais, especialmente na rea de alimentos, em operaes como, extrao, clarificao e remoo de pectina de sucos de frutas, maceraes de vegetais e frutas e extrao de leos vegetais (Galiotou-Panayotou et al.,1997).

Para produo dessas enzimas, pode ser utilizado o processo em estado slido, que se caracteriza pela ausncia de gua livre, e teor de umidade mxima de 80% (p/p), ou submerso, caracterizado pela presena de gua livre. O sistema slido apresenta produtividades em pectinases mais altas que o submerso devido menor sensibilidade represso catablica. (Solis-Pereira et al., 1996; Maldonado et al.,1998).

Resduos de cereais como cascas de arroz, farelos de trigo, soja, entre outros, tm sido largamente utilizados como fonte de carboidratos, nitrognio protico e vitaminas, na formulao de meios para produo de pectinases em processos em estado slido (Cavalitto et al., 1996). O emprego de farelo de trigo destacado nos trabalhos de Maiorano (1990) e Kapritchkoff (1996), com Aspergillus oryzae, e de Dartora et al. (2002) com Aspergillus niger.

Algumas das caractersticas mais importantes da matria-prima que, alm de fonte de substrato e nutrientes, serve como suporte fsico para o crescimento microbiano, so: a porosidade, o tamanho e o formato das partculas. A porosidade corresponde capacidade de absoro de gua, que facilita o transporte de enzimas e metablitos entre o meio e o microrganismo. Com relao ao tamanho e formato das partculas, condies diretamente relacionadas, preciso que permitam a circulao de ar e a dissipao de gases e calor produzidos, os quais poderiam vir a prejudicar o rendimento do processo. Este aspecto fundamental para a definio da altura do substrato e da granulometria do meio que deve ser empregado no processo. (Bianchi et al., 2001).

Entre os tipos de biorreatores aplicveis a processos em estado slido, os de bandeja, de coluna e tambores rotativos so os mais comumente estudados. Particularmente o reator de bandeja, apresenta como vantagens em comparao com os demais, a relativa facilidade de controle da temperatura e de fornecimento de oxignio, devido camada de meio relativamente pouco espessa, e como desvantagens a dificuldade de automao do processo e a rea maior exigida para a planta de produo (Mitchel et al., 2000).

Neste contexto, proposto neste trabalho o estudo da produo de poligalacturonases fngicas, por processo em estado slido, em meio composto de farelo de trigo, fonte de indutor e sais, com diferentes espessuras.

MATERIAL E MTODOS

Microrganismo

A linhagem utilizada neste trabalho foi Aspergillus niger T0005007-2, cedida pela Universidade de Salta (Argentina). A conservao da linhagem foi feita em meio de cultura glicerinado (Maiorano, 1982), atravs de repiques mensais.

Meio de produo de pectinases Farelo de trigo foi utilizado como suporte e principal de fonte de carbono. Como nutrientes, foram utilizados (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4, FeSO4.7H2O, ZnSO4 e MnSO4, nas concentraes previamente descritas em Dartora (2002). gua destilada foi adicionada ao meio para atingir teor de umidade de 63%. Nos ensaios com diferentes espessuras de leito de meio, pectina ctrica Delaware (6% p/p) foi utilizada para a induo enzimtica.

As espessuras de leito de meio avaliadas foram 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0 e 8,0 cm, seguindo a formulao descrita na Tabela 1 e mantendo-se a densidade aparente.

Tabela 1 - Formulao dos meios utilizados no estudo com diferentes espessuras de leito de meio.

Espessuras de leito de meio

Componentes0,5cm1cm2cm4cm6cm8cm

farelo de trigo5,13g10,26g20,52g41,04g61,56g82,08g

pectina ctrica0,84g1,68g3,36g6,72g10,08g13,44g

soluo de sais2,57mL5,14mL10,28mL20,56mL30,84mL41,12mL

gua destilada1,51mL3,02mL6,04mL12,08mL18,12mL24,16mL

sol. de sais pH41,71mL3,42mL6,84mL13,68mL20,52mL27,36mL

Condies experimentais

Os ensaios foram conduzidos em estufa com atmosfera saturada em gua, temperatura de 30C. Para a realizao dos ensaios, foram utilizados frascos Becher de 800mL (90mm de dimetro x 175mm de altura). O inculo consistia de uma suspenso com 1.107 esporos/mL. Os frascos eram cobertos com uma fina camada de gaze e algodo hidrfobo. As amostras foram retiradas periodicamente durante o processo e submetidas aos tratamentos necessrios para a realizao das metodologias analticas descritas a seguir.

Mtodos analticos

A massa fermentada, coletada em determinados perodos do cultivo, era homogeneizada e macerada (mida) em gral.

Na determinao do teor de umidade, 1g da amostra foi submetido a secagem em estufa a 105C at atingir peso constante; aps resfriamento, a amostra foi novamente pesada e o teor de umidade presente no meio foi calculada (A.O.A.C., 1997).

Para a determinao do pH, foram adicionados 10mL de gua destilada s amostras secas, utilizadas para determinao de umidade. Aps agitao, foram mantidas em repouso por 10 min, e ento, procedeu-se a leitura do pH.

Para a extrao das enzimas, 15 mL de gua pH 4,0 foram adicionados 2,7g de massa fermentada, previamente macerada. Aps 30 min de agitao recproca a 200 rpm, a suspenso foi centrifugada a 9000 rpm (centrfuga Sigma modelo 4K15) a 4C, por 20 min, e o caldo utilizado para a determinao da atividade enzimtica.

A atividade de endo-poligalacturonase (endo-PG) foi estimada pela medida de reduo da viscosidade de soluo padro de pectina ctrica Delaware 0,63% (p/p), em tampo acetato 0,05M pH 4,0. Para a realizao deste mtodo, seguiram-se os procedimentos descritos por Malvessi (2000), com algumas adaptaes necessrias s condies do processo em estado slido. Uma unidade de endo-PG foi estimada como a quantidade de enzima que causa a reduo de 50% da viscosidade da soluo, nas condies padronizadas, e expressa em U/gms.

A atividade de exo-poligalacturonase (exo-PG) foi estimada pela quantificao de substncias redutoras liberadas de soluo 0,25% (p/v) de cido poligalacturnico em tampo acetato 0,1M pH 4,0, seguindo a metodologia descrita em Malvessi (2000). Uma unidade de exo-PG foi definida como 1 (mol de cido galacturnico liberado por min/ mL de extrato enzimtico, nas condies da reao.

O teor de acares redutores livres (AR) presentes no extrato enzimtico foi determinado pelo mtodo do DNS (Miller, 1959), utilizando soluo de glicose como padro.

Para a determinao de acares redutores totais (ART) no meio de fermentao, foi utilizada a metodologia descrita por Malvessi (2000), na qual 10mL de H2SO4 1,5M foram adicionados a 0,7g da massa homogeneizada e macerada, hidrolisados 100C por 30 min, seguindo-se o resfriamento em banho de gelo. Aps a neutralizao, as preparaes foram desproteinizadas e filtradas, sendo os acares redutores obtidos atravs desta tcnica, quantificados pelo mtodo DNS (Miller, 1959).

RESULTADOS E DISCUSSO

Os resultados dos ensaios contendo pectina purificada, so ilustrados nas Figuras 1 e 2. Entre as condies testadas, atividades mais baixas de endo-PG foram obtidos na condio padro, 0,5 cm de leito de meio, com valores em torno de 50 U/gms durante todo o cultivo, como evidenciado na Figura 1.

Figura 1 - Atividade de endo-poligalacturonase em funo do tempo, em cultivos com diferentes espessuras de leito de meio, com Aspergillus niger. (() 0,5 cm; (() 1,0 cm; (() 2,0 cm;

(() 4,0 cm; (() 6,0 cm; (() 8,0 cm

Com as espessuras de 1,0 e 2,0 cm, comportamentos semelhantes foram observados, com a obteno de maiores atividades de endo-PG em 120 h, de 76 e 78 U/gms, respectivamente. A partir de 4,0 cm, o pico de atividade de endo-PG foi obtido em 72 h de cultivo, atingindo cerca de 96 U/gms. Ttulos mais altos foram alcanados com 6,0 e 8,0 cm de espessura, alcanando praticamente 140 e 130 U/gms, respectivamente, em 72 h. Queda mais pronunciada da atividade enzimtica foi evidenciada na condio de 8 cm, a partir de 96 h de processo, como pode ser observado na Figura 1.

Para exo-PG, ttulos enzimticos mais altos foram obtidos em 96 h para 0,5, 1,0, 2,0 e 4,0 cm, cujos valores foram 115, 150, 164 e 246 U/gms, respectivamente. Por outro lado, os meios com 6,0 e 8,0 cm de espessura de leito de meio, apresentaram valores mais altos em 72 h, de 390 e 360 U/gms, respectivamente, seguido de queda de atividade at o final do cultivo, em 120 h, com perda de cerca de 50% da atividade enzimtica, nas condies avaliadas (Figura 2).

Figura 2 - Atividade de exo-poligalacturonase em funo do tempo, em cultivos com diferentes espessuras de leito de meio, com Aspergillus niger. (() 0,5 cm; (() 1,0 cm; (() 2,0 cm;

(() 4,0 cm; (() 6,0 cm; (() 8,0 cm

Entre as condies testadas, no foram observadas grandes variaes no perfil de pH durante os cultivos, mantendo-se em valores aproximados de 5,5-5,7. Excees foram observadas nos cultivos de 6,0 e 8,0 cm de espessura, mantendo-se em torno de 4,8 durante praticamente todo o cultivo.

Com relao ao consumo de substrato (AR) foi observado um declnio gradativo da concentrao. No caso do cultivo de 4,0 cm de espessura, em 72 h de cultivo, foi atingido, 0,03 g/gms e valores mais altos para 6,0 e 8,0 cm, de 0,08 e 0,11 g/gms, respectivamente. Com o decorrer da fermentao, houve um declnio da concentrao de acares redutores em todas as condies, atingindo, em mdia, 0,02 g/gms.

Na determinao de acares redutores totais (ART), em 72 h de cultivo, foram atingidos valores de 0,11, 0,17, 0,21 e 0,22 g/gms para 0,5, 4,0, 6,0 e 8,0 cm, respectivamente. Assim como observado na dosagem de AR, houve um decrscimo da concentrao de ART no decorrer do cultivo, mostrando a queda dos valores para 0,08, 0,13, 0,14 e 0,16 g/gms para as espessuras de 0,5, 4,0, 6,0 e 8,0 cm, respectivamente, no final de cultivo.

CONCLUSES

Resultados satisfatrios de atividade enzimtica de endo e exo-PG foram obtidos em meio contendo pectina ctrica industrializada, com leito de 6,0 cm de espessura, em 72 h de cultivo. Neste caso, os valores de atividade enzimtica, tanto de endo como de exo-PG, foram muito superiores aos obtidos na condio padro de 0,5 cm. Entretanto, como a definio da espessura ideal de um meio slido dependente das caractersticas deste meio, este parmetro dever ser reavaliado para outras composies.

Este trabalho foi realizado com financiamento da FAPERGS. Cntia Panarotto contou com bolsa de iniciao cientfica da FAPERGS. Rmulo T. O. Valim dispem de bolsa de iniciao cientfica concedida pela Pr-Reitoria de Ps-Graduao e Pesquisa da Universidade de Caxias do Sul.

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