Universidade de Lisboa Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Animal

Pesquisa e caracterização de mutações em genes

relacionados com o metabolismo do ferro em

indivíduos com hiperferritinemia grave

Vera Lúcia Viana Santos

Dissertação

Mestrado em Biologia Humana e Ambiente

2012

Universidade de Lisboa Faculdade de Ciências

Departamento de Biologia Animal

Pesquisa e caracterização de mutações em genes

relacionados com o metabolismo do ferro em

indivíduos com hiperferritinemia grave

Dissertação orientada por:

Doutora Maria Paula Duarte Faustino Gonçalves (Departamento de Genética Humana,

Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge)

Professora Doutora Ana Maria Viegas-Crespo (Departamento de Biologia Animal, Faculdade de

Ciências da Universidade de Lisboa)

Vera Lúcia Viana Santos

Dissertação

Mestrado em Biologia Humana e Ambiente

2012

Aos meus avós

Florêncio Viana, Alzira Viana e Emília Rosa

na esperança que se orgulhem de mim lá onde estão.

i

Agradecimentos

Gostaria de dirigir as primeiras palavras deste trabalho a todos os que, durante a sua

realização, me colocaram desafios e me disponibilizaram diversas formas de apoio, pelo que a

todos expresso o meu reconhecido agradecimento:

Ao Professor Doutor José Pereira Miguel, Presidente do Conselho Directivo do INSA, e ao

Doutor João Lavinha, coordenador da Unidade de Investigação e Desenvolvimento do

Departamento de Genética Humana do INSA, que autorizaram e permitiram a realização deste

trabalho.

À Doutora Paula Faustino, pela oportunidade de realizar este trabalho, por toda a sua

amabilidade, sabedoria, orientação e por me ter acolhido tão bem no seu grupo.

À Professora Doutora Ana Crespo pela disponibilidade demonstrada na qualidade de

orientadora interna.

Ao Bruno, pelas preciosas indicações e ensinamentos, por se ter mostrado sempre disponível e

por ter acompanhado o meu trabalho. O maior agradecimento é para ti.

Às minhas colegas de laboratório, à Andreia pela confiança que sempre depositou em mim e à

Rute pela disponibilidade para me ajudar.

Aos colegas do grupo de investigação em metabolismo do RNA pelos óptimos momentos que

passamos juntos.

Às minhas amigas, à Cláudia pela entreajuda e por estar sempre presente ao longo de todo o

trabalho. À Dany por ter estado sempre ao meu lado, nos bons e nos maus momentos, apesar

de haver um oceano a separar-nos. À Vanessa pela dedicação sem fim, ajuda e infinita

paciência para me escutar. Às três agradeço a amizade e imprescindível apoio. Sem vocês tinha

sido mais difícil.

Aos meus amigos Agri, André, Hugo, Mariazinha e Tixa por terem sido tolerantes em relação a

todas as minhas ausências.

À minha família em especial ao meu pai pelo incentivo e confiança que sempre depositou em

mim, e à minha mãe pelos valores que me incutiu ao longo da vida. A ambos agradeço o

esforço e os sonhos de que abdicaram em prol dos meus. Ao Miguel pela disponibilidade,

auxílio e amizade.

À minha irmã, por todo o amor, compreensão, amizade, preocupação e infindável apoio ao

longo da minha vida e deste trabalho. Obrigada por me fazeres acreditar que eu posso

alcançar o universo.

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Projecto FCT, PEst-OE/SAU/UI0009/2011.

ii

Resumo

O Ferro desempenha um papel biológico muito importante nos organismos vivos. No entanto,

tanto o seu excesso como a sua deficiência no organismo humano estão associados a

consequências negativas para a saúde. A Hemocromatose Hereditária (HH) é dos distúrbios

genéticos mais comuns em indivíduos de ascendência Norte-Europeia. Caracteriza-se por uma

absorção excessiva de ferro a nível intestinal e sua consequente acumulação em vários órgãos.

As complicações mais frequentes da doença são cirrose hepática, carcinoma hepatocelular,

cardiomiopatias, diabetes, problemas endócrinos, artrite e hiperpigmentação da pele. O gene

HFE é o principal associado à patologia (HH clássica, tipo I). Os genótipos mais comuns são a

mutação C282Y em homozigotia e a heterozigotia composta desta com a mutação H63D. Têm

surgido evidências de que mutações noutros genes possam estar envolvidas nesta patologia.

Entre estes encontra-se o gene do Receptor 2 da Transferrina (TfR2) sendo a HH resultante

(Hemocromatose do tipo III) caracterizada por sintomas clínicos idênticos aos da forma

clássica. A Hemocromatose do tipo II, ou Hemocromatose Juvenil, é a forma mais grave da

doença devido ao facto da sobrecarga de ferro ocorrer a um ritmo mais acelerado levando a

problemas em idades jovens. Este tipo de HH ocorre devido a mutações no gene da

Hemojuvelina, HJV (HH do tipo 2A) ou no da Hepcidina (HAMP) (HH do tipo 2B).

O objectivo principal deste estudo consistiu na pesquisa e caracterização de mutações em

genes relacionados com o metabolismo do ferro (HFE, TfR2, HJV, HAMP, BMP-6), em 11

indivíduos com hiperferritinemia muito grave (ferritina sérica > 2500 μg/L), cujos fenótipos não

eram justificáveis pelos genótipos HFE apresentados. As sequências génicas foram

amplificadas por metodologias de PCR e a análise mutacional dos fragmentos amplificados foi

efectuada recorrendo à sequenciação automática. Nesta análise foram detectadas 9

alterações, sendo que 3 delas são identificadas pela primeira vez neste estudo (a P124L no

gene HJV, a c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A no gene BMP-6). Posteriormente foram

realizados estudos in silico às sequências proteicas de modo a identificar possíveis alterações a

nível estrutural recorrendo ao programa bioinformática PolyPhen-2 e aos modelos HumDiv e

HumVar. Para além disso, também se procedeu à análise do impacto das alterações

nucleotídicas a nível do splicing utilizando para esse fim o software Human Splicing Finder.

Foi possível através desta pesquisa justificar a sobrecarga em ferro em 2 dos indivíduos em

estudo. Num dos casos, colocamos a hipótese de que a conjugação da homozigotia para a

mutação C282Y em HFE e da alteração R752H em heterozigotia no gene TfR2 seja o motivo da

sobrecarga em ferro verificada. No outro caso, encontrou-se a alteração P124L em

heterozigotia no gene HJV, que em co-herança com a homozigotia para a alteração C282Y,

também poderá estar na origem da hiperferritinemia grave.

A HH não clássica é caracterizada por uma grande heterogeneidade genética, que traduz

mecanismos fisiológicos complexos inerentes à homeostase do ferro, ainda não

completamente conhecidos. Com este estudo contribuímos para aumentar o conhecimento

sobre a fisiopatologia deste tipo de Hemocromatose e esclarecemos as relações

genótipo/fenótipo nalguns dos casos estudados.

Palavras-chave: Ferro; Hemocromatose Hereditária; Hiperferritinemia; HFE; TfR2; HJV; HAMP;

BMP-6;

iii

Abstract

Iron plays a very important role in biological organisms. However, its excess and deficiency in

the human body are both associated with negative health consequences. Hereditary

Haemochromatosis (HH) is an autossomal recessive disorder commonly found in Caucasians of

Northern European ancestry. It is characterized by an increased intestinal iron absorption and

subsequent accumulation on several organs, resulting in tissue damage. Hepatic cirrhosis,

hepatocellular carcinoma, cardiomyopathy, diabetes, endocrine abnormalities, arthritis and

skin hyperpigmentation are some examples of the most frequent clinical manifestations. HFE

gene is the main gene associated to the disease (HH type I). The most common genotypes

found in HH patients are the homozygosity for the C282Y mutation or its compound

heterozigosity with the H63D mutation. Some studies have shown that there are HH cases

without mutations in the HFE gene, where other iron metabolism related genes are involved.

Among these, is the Transferrin Receptor 2 gene (TfR2) which is associated with HH type III,

characterized by clinical symptoms similar to the ones observed with the classical HH. On other

hand, HH type II, also named juvenile haemochromatosis is a severe form of the disease,

where iron overload occurs faster and the patients present cardiomyopathy and/or endocrine

abnormalities at young age. This type of HH is the result of mutations in the hemojuveline

(HJV) (HH type 2A) or hepcidin (HAMP) (HH type 2B) genes.

The main aim of this study was to perform a mutational screening in 5 genes related with iron

metabolism (HFE, TfR2, HJV, HAMP, BMP-6) in 11 individuals presenting severe

hyperferritinemia (serum ferritin level > 2500 μg/L), whose phenotypes were not justified by

HFE genotypes. It was also intended the characterization of the mutations newly found. Gene

sequences were amplified by PCR methodologies and mutational analysis of amplified

fragments was performed by automated sequencing. In this analysis we detected 9 DNA

alterations, 3 of them reported for the first time in this study (P124L in the HJV gene, c.1281-

197 T→C and c.1542+4 G→A in BMP-6 gene). In silico studies were performed in order to

identify possible changes at protein structural level using the bioinformatics program

PolyPhen-2 and HumDiv e HumVar models. Furthermore, the impact of nucleotide changes at

the splicing level was also explored using the Human Splicing Finder software.

Through this study was possible to justify the iron overload in 2 of the individuals analyzed. In

one case, we put the hypothesis that the combination of homozygosity for the mutation C282Y

in HFE and the heterozygosity for the R752H in TfR2 gene is the reason for the observed iron

overload. In another case, we found one change in heterozygosity, P124L in HJV gene that co-

inheritance with homozygosity for the C282Y in HFE, can also be the cause of severe

hyperferritinemia.

The nonclassical HH is characterized by a large genetic heterogeneity, which translates into

complex physiological mechanisms involved in iron homeostasis, some of them still unclear.

This study was intended to contribute to increase knowledge of the pathophysiology of this

type of haemochromatosis.

Keywords: Iron; hereditary hemochromatosis; hyperferritinemia; HFE; TfR2; HJV; HAMP; BMP-

6;

iv

Índice geral

Páginas

Agradecimentos i

Resumo ii

Abstract iii

Índice geral iv

Índice de Figuras vi

Índice de Tabelas viii

Abreviaturas e Notações

x

I-Introdução 1

I.1-Ferro 2

I.2-Metabolismo do ferro 3

I.2.1-Absorção 3

I.2.2-Transporte, distribuição e armazenamento 4

I.2.3-Homeostase do ferro 6

I.2.3.1-Regulação intracelular 6

I.2.3.2-Regulação sistémica 6

I.3-Alterações patológicas no metabolismo do ferro 9

I.3.1-Diferentes tipos de Hemocromatose Hereditária e sua base molecular 11

I.3.1.1-Hemocromatose do tipo I 12

I.3.1.2-Hemocromatose do tipo II ou Hemocromatose Juvenil 15

I.3.1.3-Hemocromatose do tipo III 17

I.3.1.4-Hemocromatose do tipo IV ou Doença da Ferroportina 18

I.3.2-Diagnóstico 19

I.3.3-Tratamento

20

II-Objectivos

21

III-Materiais e Métodos 23

III.1-População estudada 24

III.1.1-Critérios de selecção da amostra 24

III.1.2-Obtenção de material genético 24

III.2-Reacção em cadeira da polimerase (PCR) 24

III.2.1-Amplificação por PCR de regiões dos genes em estudo 24

III.3-Electroforese em gel de agarose 31

III.4-Purificação dos produtos de amplificação 32

III.5-Sequenciação dos produtos purificados 32

III.6-Análise bioinformática 33

III.6.1-Análise das sequências nucleotídicas 34

III.6.2-Análise das alterações a nível proteico 34

III.6.3-Análise do impacto das alterações nucleotídicas a nível do splicing

34

IV-Resultados 35

IV.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro 36

IV.2-Pesquisa de alterações no gene HJV 37

IV.2.1-Alteração P124L 37

IV.2.1.1-Estudo do impacto da alteração P124L na proteína HJV 38

v

IV.2.1.2-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing 38

IV.3-Pesquisa de alterações no gene BMP-6 39

IV.3.1-Alteração c.857+12 C→T 39

IV.3.1.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing 40

IV.3.2- Alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C 41

IV.3.2.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing 42

IV.3.3-Alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C 43

IV.3.3.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing 45

IV.3.4-Alteração c.1542+4 G→A 46

IV.3.4.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing 47

IV.4-Pesquisa de alterações no gene TfR2 47

IV.4.1-Alteração c.1851 C→T 47

IV.4.1.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing 48

IV.4.2-Alteração R752H 48

VI.4.2.1-Estudo do impacto da alteração R752H na proteína TfR2 49

IV.4.2.2-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing

50

V-Discussão dos Resultados 52

V.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro 53

V.2- Discussão da relação genótipo / fenótipo nos diversos casos analisados 54

V.2.1-Caso 1 54

V.2.2-Caso 2 57

V.2.3-Caso 4 58

V.2.4-Caso 10 59

V.2.5-Caso 11 59

V.2.6-Casos onde não se detectaram alterações nos genes analisados

59

VI-Conclusão

61

VII-Referências Bibliográficas

64

VIII-Anexos 70

vi

Índice de Figuras

Páginas

Figura I.1: Regulação da absorção intestinal de ferro.

4

Figura I.2: Distribuição do ferro no organismo humano adulto.

5

Figura I.3: Homeostase do ferro.

8

Figura I.4: Base genética e gravidade dos fenótipos comuns de hemocromatose.

12

Figura I.5: Estrutura do gene HFE, respectivo mRNA e proteína.

13

Figura I.6: Representação esquemática de mutações descritas no gene HFE.

15

Figura I.7: Representação esquemática de mutações descritas no gene HJV.

16

Figura I.8: Representação esquemática de mutações descritas no gene HAMP.

17

Figura I.9: Representação esquemática de mutações descritas no gene TfR2.

18

Figura I.10: Representação esquemática de mutações descritas no gene SLC40A1.

18

Figura III.11: Marcadores de massa molecular.

32

Figura IV.12: Detecção e identificação da mutação P124L no exão 3 do gene HJV

37

Figura IV.13: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína HJV de 10 espécies de mamíferos diferentes, utilizando o software PolyPhen-2.

38

Figura IV.14: Previsão da patogenicidade da alteração P124L na proteína HJV através do programa Polyphen-2.

38

Figura IV.15: Detecção e identificação da alteração c.857+12 C→T a jusante do exão 2 do gene BMP-6.

39

Figura IV.16: Detecção e identificação das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no gene BMP-6.

41

Figura IV.17: Detecção e identificação das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C no gene BMP-6.

44

Figura IV.18: Detecção e identificação das alterações c.1542+4 G→A no gene BMP-6.

46

Figura IV.19: Detecção e identificação da alteração c.1851 C→T no exão 16 do gene TfR2.

47

Figura IV.20: Detecção e identificação da alteração R752H no exão 18 do gene TfR2.

49

Figura VI.21: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína TfR2 de 10 espécies de mamíferos diferentes, utilizando o software PolyPhen-2.

50

vii

Figura IV.22: Previsão da patogenicidade da alteração R752H na proteína TfR2 através do programa Polyphen-2.

50

Figura V.23: Esquema representativo dos genes estudados e da localização das alterações encontradas.

53

viii

Índice de Tabelas

Páginas

Tabela I.1: Classificação genética da Hemocromatose

10

Tabela III.2: Regiões dos genes estudadas

25

Tabela III.3: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene HFE

25

Tabela III.4: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene TfR2

26

Tabela III.5: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene HJV

26

Tabela III.6: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene HAMP

27

Tabela III.7: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene BMP-6

27

Tabela III.8: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HFE e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

28

Tabela III.9: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene TfR2 e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

28

Tabela III.10: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HJV e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

29

Tabela III.11: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HAMP e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

29

Tabela III.12: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene BMP-6 e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

29

Tabela III.13: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HFE

30

Tabela III.14: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene TfR2

30

Tabela III.15: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HJV

30

Tabela III.16: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HAMP

31

Tabela III.17: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene BMP-6

31

Tabela III.18: Condições laboratoriais utilizados por cada reacção para a sequenciação automática

33

ix

Tabela III.19: Condições de PCR para a sequenciação automática

33

Tabela IV.20 Características dos indivíduos em estudo, genótipo HFE e outros genes onde foram detectadas alterações

36

Tabela IV.21: Descrição do efeito da alteração c.371 C→T no splicing do RNA de HJV

39

Tabela IV.22: Descrição do efeito da alteração c.857+12 C→T no splicing do RNA de BMP-6

40

Tabela IV.23: Descrição do efeito das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no splicing do RNA de BMP-6

43

Tabela IV.24: Descrição do efeito das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C no splicing do RNA de BMP-6

46

Tabela IV.25: Descrição do efeito da alteração c.1542+4 G→A no splicing do RNA de BMP-6

47

Tabela IV.26: Descrição do efeito da alteração c.1851 C→T no splicing do RNA de TfR2

48

Tabela VI.27: Descrição do efeito da alteração c.2255 G→A no splicing do RNA de TfR2

51

Tabela V.28: Alterações moleculares identificadas neste estudo 54

x

Abreviaturas e Notações

A Adenina

β2-M Beta-2-Microglobulina

BMP-6 Proteína morfogenética do osso-6 (Bone morphogenic protein-6)

C Citosina

Cp Ceruloplasmina

DCYTB Citocromo b duodenal (Duodenal cytochrome b)

DMT1 Transportador de metais divalentes 1 (Divalent metal transporter-1)

DNA Ácido desoxirribonucleico

EtBr Brometo de Etídeo

Fe Símbolo químico do ferro

Fe2+ Forma ferrosa de ferro

Fe3+ Forma férrica de ferro

Fe2Tf Transferrina associada ao ferro

FPN-1 Ferroportina 1

Ft Ferritina

G Guanina

HAMP Hepcidina (Hepcidin anti-microbial peptide)

HCP Proteína transportadora de ferro hémico

HFE High Fe ou Fe elevado

HH Hemocromatose Hereditária

HJ Hemocromatose Juvenil

HJV Hemojuvelina

Hp Hefastina

INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge

IREs Elemento de resposta ao ferro (Iron Responsive Elements)

IRPs Proteína reguladora do ferro (Iron Regultory Proteins)

IVS Intrão

MHC I Complexo maior de histocompatibilidade classe I

xi

RNA Ácido ribonucleico

mRNA RNA mensageiro

pb Pares de bases

PCR Reacção em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction)

p/v Percentagem expressa em peso por volume

ROS Espécies reactivas de oxigénio (Reactive oxygen species)

SLC40A1 Gene da ferroportina (Solute carrier family 40 member 1)

SNP Polimorfismo de um nucleótido (Single-nucleotide polymorphism)

T Timina

Tf Transferrina

TfR1 Receptor 1 da transferrina

TfR2 Receptor 2 da transferrina

V Volts

I-Introdução

I-Introdução

- 2 -

I.1-Ferro

O Ferro (Fe) tem um papel biológico muito importante nos organismos vivos. É um

micronutriente essencial mas potencialmente perigoso (Andrews and Schmidt, 2007). Trata-se

do metal mais abundante na crosta terrestre, estando tanto o seu excesso como a sua

deficiência no organismo humano associados a consequências negativas para a saúde (Aisen et

al., 2001).

A maioria das células utiliza o ferro como co-factor em processos bioquímicos. É fundamental

no transporte de oxigénio e na síntese de DNA, sendo também essencial no metabolismo

celular (Wang and Pantopoulos, 2011). A utilidade deste deve-se a uma coordenação química

flexível e à sua capacidade redox, permitindo a associação a proteínas e ligação a moléculas de

oxigénio, possibilitando também a transferência de electrões e a mediação de reacções de

catálise. O ferro pode encontrar-se em solução na forma ferrosa (Fe2+) ou na forma férrica

(Fe3+), sendo a troca de electrões entre estas duas formas o que lhe confere o potencial redox

(Aisen et al., 2001).

Apesar de muito abundante a maior parte do ferro encontra-se na forma Fe3+, a qual é

praticamente insolúvel em água a pH neutro. Assim sendo, de forma a tornar possível a sua

utilização, os organismos vivos evoluíram sistemas complexos de transporte e distribuição,

bem como uma homeostase sujeita a um controlo interno (Andrews and Schmidt, 2007). A

troca de electrões é essencial para as reacções redox que ocorrem a nível celular. Contudo,

esta capacidade de troca electrónica potencia a formação de espécies reactivas de oxigénio

(ROS) que aumentam o stresse oxidativo comummente associado a danos celulares (Garrick,

2011), dado estas possuírem a capacidade de danificar moléculas biológicas como os lípidos,

carbohidratos, proteínas e ácidos nucleicos (Roy and Enns, 2000).

A alimentação humana fornece duas formas de ferro, o hémico e o não hémico. O primeiro

encontra-se na carne e é facilmente absorvido, graças à acção de enzimas pancreáticas que

libertam o grupo heme da molécula de globina no lúmen intestinal. O ferro não hémico está

presente essencialmente em cereais, grãos e em alguns vegetais, e é menos absorvido que o

hémico (Johnson-Wimbley and Graham, 2011). A fracção mais importante do ferro celular

encontra-se associada a proteínas na forma hémica. De entre estas, as hemoproteínas mais

comuns são a hemoglobina e a mioglobina que transportam oxigénio, respectivamente, no

sangue e nos músculos. O ferro não hémico encontra-se sobretudo em metaloproteínas, as

quais desempenham diversos papéis funcionais desde a transferência de electrões à catálise

(Papanikolaou and Pantopoulos, 2005).

O organismo humano adulto contém cerca de 3 a 4 g de ferro. Diariamente são absorvidas a

partir da dieta alimentar entre 1 a 2 mg de modo a compensar as perdas diárias ocorridas pela

transpiração, descamação das células epiteliais e por processos hemorrágicos (Zhang and Enns,

2009). Não existe nenhuma via de excreção eficaz deste metal, deste modo um organismo

saudável deverá ter a capacidade de avaliar a sua quantidade de ferro interna e de responder

adequadamente às suas oscilações, alterando os processos de absorção e de acumulação, pois

a ausência de resposta ou respostas indevidas podem levar ao aparecimento de diversas

patologias (Roy and Enns, 2000).

I-Introdução

- 3 -

I.2-Metabolismo do Ferro

I.2.1-Absorção

Em mamíferos, o ferro da dieta é absorvido no duodeno ao nível dos enterócitos (Figura I.1). A

absorção ocorre em dois passos principais: absorção pela membrana apical e transferência

para a corrente sanguínea através da membrana basolateral (Fleming and Sly, 2002).

O ferro não hémico absorvido a partir dos alimentos encontra-se maioritariamente na forma

Fe3+ sendo necessária a sua redução à forma Fe2+. Esta redução ocorre devido à acção de uma

reductase férrica denominada citocromo b duodenal (DCYTB) expressa nas vilosidades do

lúmen intestinal, na zona do duodeno. Assim sendo, esta reductase é o primeiro elemento

importante na absorção do ferro. A sua expressão aumenta em resposta à carência e níveis

baixos de ferro e hipoxia (Mckie et al., 2001). Por outro lado, a absorção do ferro hémico

parece ser mediada por uma proteína transportadora (HCP) expressa ao nível dos enterócitos

intestinais. Este receptor foi descrito recentemente e quando alterado parece modificar a

absorção do ferro que se encontra nesta forma. Quando a expressão deste transportador é

aumentada como resultado de hipóxia ou deficiência em ferro verifica-se consequentemente

um aumento dos níveis de ferro no organismo (Shayeghi et al., 2005; Wang et al., 2010).

O transportador de metais divalente 1 (DMT1) é responsável pela entrada dos iões Fe2+ do

lúmen intestinal para a mucosa requerendo um pH baixo para funcionar (Gunshin et al., 2005).

Após a entrada na célula o Fe2+ pode ser armazenado intracelularmente na forma de ferritina

(Ft) (esta acomoda até 4500 átomos de Fe3+ por molécula), ou pode atravessar o enterócito até

à zona basolateral onde se localiza a proteína ferroportina-1 (FPN-1), responsável pela saída de

ferro da célula e a sua entrada em circulação (Garrick, 2011). O ferro que é retido na Ft

endotelial é perdido após 2 ou 3 dias para o lúmen intestinal por processos de descamação

(Andrews and Schmidt, 2007).

A FPN-1 parece ser o único exportador de ferro nas células duodenais, assim como nos

macrófagos, hepatócitos e nos trofoblástos sinciciais da placenta. A exportação de ferro pela

FPN-1 depende da interacção de duas oxidases: ceruloplasmina (Cp) presente em circulação e

hefastina (Hp) localizada na membrana basolateral dos enterócitos. Estas são responsáveis

pela conversão de Fe2+ em Fe3+ que será depois incorporado na transferrina (Tf) (Zhang and

Enns, 2009). Esta proteína existente em circulação tem elevada afinidade com o ferro, sendo a

responsável pelo seu transporte a nível sistémico (Zhang and Enns, 2009; Johnson-Wimbley

and Graham, 2011)

I-Introdução

- 4 -

Figura I.1: Regulação da absorção intestinal de ferro. O ferro hémico é absorvido pela proteína transportadora de ferro hémico (HCP), sofre endocitose, e o Fe

2+ é libertado dentro do endossoma ou

lisossoma. A porção de ferro não hémico inclui Fe2+

e Fe3+

. O Fe3+

é reduzido a Fe2+

pelo ácido ascórbico no lúmen intestinal ou por ferroreductases, onde se inclui a citocromo b duodenal (DCYTB). Na membrana apical, o meio ácido potencia a passagem do Fe

2+ para o enterócito através do transportador

de metais divalente 1 (DMT1). Na membrana basolateral, a passagem do ferro para a transferrina (Tf) em circulação é mediado pela ferroportina 1 (FPN-1) em associação com a hefastina (Hp). A hepcidina tem afinidade para a FPN-1, causando a sua internalização e degradação levando a uma diminuição da exportação do ferro para o sangue. O ferro que não é transferido para a circulação é armazenado no enterócito sob a forma de ferritina (Adaptado de Zimmermann and Hurrell, 2007).

I.2.2-Transporte, distribuição e armazenamento

A maioria das células do organismo adquire/liberta ferro recorrendo ao “ciclo da transferrina”

(Garrick, 2011). O fluxo deste elemento do interior dos enterócitos para o sangue ocorre

através da membrana basolateral e é mediado pela FPN-1. O ferro é, posteriormente, oxidado

pela Hp e Cp entrando em circulação ligado à Tf (Fe2Tf). Este complexo é então distribuído pelo

organismo de acordo com as necessidades celulares (Papanikolaou and Pantopoulos, 2005;

Zimmermann and Hurrell, 2007). A Tf tem elevada afinidade com o ferro em circunstâncias

homeostáticas e é a proteína responsável pelo seu transporte em circulação. A Ft armazena-o

em altas concentrações mantendo-o sem acesso a substratos que levem à formação de ROS.

Em humanos sem patologias associadas ao metabolismo do ferro, cerca de 30% dos locais da

transferrina plasmática com função de ligação ao ferro estão ocupados (Andrews and Schmidt,

2007; Li et al., 2010).

O complexo Fe2Tf é distribuído na corrente sanguínea, ligando-se posteriormente ao receptor

1 da transferrina (TfR1), expresso na superfície celular. O complexo Fe2Tf-TfR1 entra nas

células por endocitose, a acidificação do endossoma provoca a dissociação do Fe3+ do

complexo Tf-TfR1 (Garrick, 2011). O ferro é depois libertado para o citoplasma da célula por

intermédio do DMT1 presente na membrada do endossoma, enquanto a Tf livre e o TfR1 são

recicladas para a superfície celular. O ferro que entra nas células eritróides é direccionado para

I-Introdução

- 5 -

as mitocôndrias onde é incorporado na protoporfirina originando grupos heme. Nos outros

tipos celulares é armazenado como ferritina e hemosiderina (Andrews, 1999).

Um homem adulto tem normalmente entre 35 a 45 mg de ferro por quilograma de massa

corporal. Nas mulheres esse valor é geralmente menor devido às perdas de sangue

decorrentes da menstruação. No organismo humano, mais de dois terços do ferro é utilizado

pela eritropoiese. As reservas no organismo estão maioritariamente localizadas nos

hepatócitos e nos macrófagos reticuloendoteliais. Estes últimos fagocitam os eritrócitos

senescentes armazenando o ferro que fica disponível para ser posteriormente reutilizado. Esta

reciclagem é muito importante dado que a eritropoiese requer cerca de 20 mg de ferro

diariamente, mas só 1 a 2 mg são normalmente absorvidas por dia através do duodeno (Figura

I.2) (Roy and Enns, 2000; Frazer et al., 2003).

Figura I.2: Distribuição do ferro no organismo humano adulto. Devido a processos como a descamação da pele é perdido ferro diariamente, sendo a reposição efectuada por absorção diária de cerca de 1 a 2mg proveniente da alimentação. A maior parte do ferro que está em circulação encontra-se ligada à hemoglobina. A reciclagem do ferro presente nos eritrócitos senescentes mediado pelos macrófagos é crucial para manter os níveis de ferro. Os maiores reservatórios de ferro são o fígado, os macrófagos reticuloendoteliais e o tecido muscular (Adaptado de Andrews, 1999).

I-Introdução

- 6 -

I.2.3-Homeostase do ferro

O facto de não existir uma via de excreção eficiente de ferro do organismo, faz com que a

quantidade que é absorvida a partir da alimentação e as perdas que ocorrem estejam sujeitas

a um crítico processo de regulação a fim de manter a homeostasia (Andrews, 1999). Em

indivíduos saudáveis, o sistema de manutenção da homeostase é responsável pela regulação

da requisição, absorção, acumulação e controlo das reservas deste elemento. No entanto, a

absorção em humanos parece assumir o papel mais importante na regulação do balanço do

ferro do que a sua eliminação (Finch, 1994). A homeostase do ferro é regulada através de dois

mecanismos: um intracelular, consoante a quantidade de ferro que a célula possui, e outro

sistémico, onde a hepcidina tem um papel muito importante.

I.2.3.1-Regulação intracelular

Relativamente à regulação intracelular, de forma a evitar o excesso ou deficiência de ferro no

interior da célula, existem proteínas reguladoras as proteínas reguladoras do ferro (IRPs) que

controlam a expressão pós-transcricional de alguns genes envolvidos no metabolismo do ferro

através de elementos de resposta ao ferro (IREs). Estes elementos em hairpin estão localizados

nas regiões não transcritas (5´-UTR ou 3´-UTR) de vários RNA mensageiros (mRNAs) que

codificam proteínas envolvidas no metabolismo do ferro. Os IREs são reconhecidos pelas

proteínas IRPs e controlam a transcrição dos genes, a estabilidade ou a tradução dos mRNAs.

Assim os genes que possuem estas estruturas são directamente regulados pelo ferro

(Campillos et al., 2010; Arora, 2012). As interacções IRE/IRP regulam o nível de expressão de

mRNAs que codificam para proteínas necessárias à aquisição (TfR1, DMT1), armazenamento

(Ft), utilização e exportação de ferro (Muckenthaler et al., 2008).

Quando existe deficiência deste elemento na célula, as IRPs ligam-se aos IREs que são

sequências altamente conservadas e que se encontram nas regiões 3´ ou 5´ do mRNA. Se os

IREs estão na extremidade 3´ do mRNA, quando se ligam as IRPs, estas protegem o mRNA da

degradação e promovem a síntese proteica (ex. do TfR1), promovendo uma maior absorção de

ferro pela célula; simultaneamente a ligação IRPs aos IREs na extremidade 5´ do mRNA

(exemplo da ferritina) impedem a sua tradução, diminuindo assim o armazenamento de ferro

na célula. Quando existe excesso de ferro no interior das células, as IRPs são inactivadas, a não

ligação dos IRPs ao IRE na extremidade 5´ do mRNA favorece a síntese da proteína (exemplo da

ferritina), enquanto na extremidade 3´ bloqueia a tradução (ex TfR), diminuindo assim a

absorção de ferro pela célula (Muckenthaler et al., 2008; Arora, 2012).

I.2.3.2-Regulação sistémica

O primeiro fenómeno de regulação na absorção do ferro ocorre a nível do duodeno e é o

chamado “bloqueio da mucosa”. Após a ingestão de uma grande quantidade de alimentos

ricos em ferro e consequente aumento do seu nível nos enterócitos, a absorção deste

elemento pelo intestino é activamente reduzida passadas algumas horas. Esta diminuição da

absorção ocorre devido a uma rápida diminuição no nível de mRNA do DCYTB e do DMT1.

Desta forma, os elementos transportadores de ferro são inversamente regulados pelo nível

deste nos enterócitos, podendo existir um bloqueio da absorção directamente no lúmen

I-Introdução

- 7 -

intestinal e na membrana basolateral nos enterócitos duodenais, caso seja detectado um

excesso de ferro (Frazer et al., 2003).

Existe outro mecanismo de regulação do ferro que é denominado “regulação das reservas”.

Neste caso, a absorção deste elemento da dieta ocorre de acordo com as reservas do

organismo. Em situações de escassez a absorção pode triplicar, no entanto quando os níveis

regularizam, a absorção retorna ao normal em alguns dias, de forma a impedir que venha a

ocorrer um excesso de ferro no organismo. O funcionamento desta via de regulação implica a

sinalização entre o fígado, músculos e o intestino. Esse mecanismo não está completamente

entendido e tem sido proposto que requer a programação de percursores das células das

criptas do epitélio intestinal após a detecção da saturação da transferrina plasmática (Taylor et

al., 1988; Roy and Enns, 2000).

Finalmente a absorção de ferro pode ainda ser controlada por outro sinal, conhecido como

“regulador de eritropoiese”. Este sinal é muito importante na regulação da absorção porque a

maioria do ferro no organismo é utilizado neste processo. Assim sendo, a regulação pela

eritropoiese é mais eficiente para aumentar a absorção deste elemento do que a “regulação

das reservas” (Andrews, 1999; Papanikolaou and Pantopoulos, 2005) acima descrita. A

natureza deste mecanismo, ainda não está completamente esclarecido, no entanto, sabe-se

que está relacionado com a síntese de hepcidina. Este sinal é assim, sensível a mudanças na

taxa de eritropoiese, levando um aumento da taxa a uma diminuição da produção de

hepcidina (Fried, 2009).

Tal como referido anteriormente, a ausência de um mecanismo específico para eliminar o

excesso de ferro exige que exista uma fina comunicação entre os locais de absorção, utilização

e armazenamento. O elemento primordial desta regulação sistémica é a hormona hepcidina

produzida no fígado (Hentze et al., 2010). Esta é codificada pelo gene HAMP localizado no

braço longo do cromossoma 19 (19q13.1) (Ganz, 2003) e é secretada a partir do fígado pelos

hepatócitos (Peslova et al., 2009).

A hepcidina é o regulador central do ferro e a sua produção nos hepatócitos varia em resposta

ao aumento da quantidade deste elemento no organismo, assim como em caso de inflamação,

infecção, anemia, hipóxia e aumento da taxa de eritropoiese (Camaschella and Silvestri, 2011).

A deficiência na quantidade desta hormona é responsável por sobrecarga de ferro, enquanto o

seu excesso leva ao aparecimento de anemia (Babitt et al., 2006).

Quando os níveis de ferro no organismo são elevados, o aumento de hepcidina em circulação

promove a sua interacção com a FPN-1, levando primeiro à internalização desta e à sua

posterior degradação proteolítica. Desta forma é impedida a libertação de ferro dos

hepatócitos, macrófagos e enterócitos (Dunn et al., 2007). Essa perda de FPN-1 na superfície

celular conduz a uma redução da exportação de ferro das células, aumentando a sua

concentração intracelular (Zhang and Enns, 2009). Assim, a hepcidina controla a absorção

intestinal e a libertação de ferro dos macrófagos para o plasma num processo de retroacção

negativa (Dunn et al., 2007). Para além da acção sobre a FPN-1, a hepcidina regula ainda

negativamente o DMT1 duodenal, impedindo a entrada de ferro para os enterócitos (Mena et

al., 2008) (Figura I.3).

I-Introdução

- 8 -

Em condições fisiológicas, a expressão de hepcidina nos hepatócitos é regulada por um

conjunto de proteínas também expressas nestas células como a HFE (High Fe ou Fe elevado),

receptor 2 da transferrina (TfR2), hemojuvelina (HJV), proteínas morfogénicas do osso (BMP),

matriptase-2, entre outras (Zhang and Enns, 2009). Estas proteínas, expressas à superfície

celular, têm a capacidade de activar várias vias de transdução de sinal, incluindo as vias BMP-

SMAD, JAK-STAT e HIF1 que culminam com a alteração da transcrição do gene HAMP. Destas a

BMP-SMAD parece ser particularmente importante e perturbações nestas vias vão abolir a

resposta da hepcidina a diversos estímulos. A HJV é membro de uma família de proteínas que

funciona como co-receptor para as proteínas BMP. Esta liga-se a receptores do tipo BMP-1 e

por estimulação com outras BMPs que melhoram a fosforilação da SMAD1/5/8. Essas SMADs

activadas formam complexos que se movem até ao núcleo das células onde podem estimular a

expressão de hepcidina (Darshan and Anderson, 2009) (Figura I.3).

Figura I.3: Homeostase do ferro. Quando os níveis de ferro no organismo são elevados, proteínas como a HFE, Hemojuvelina (HJV) e o Receptor 2 da Transferrina (TfR2) aumentam a expressão hepática de hepcidina. A HJV actua como co-receptor para os ligandos BMP que activam a via de sinalização SMAD induzindo a expressão da hepcidina. A via pela qual a HFE e a TfR2 induzem a expressão da hepcidina continua por esclarecer (marcada na figura a tracejado). A infecção e inflamação aumentam o nível de citocinas, como a interleucina-6 (IL-6) que estimulam a expressão de hepcidina. Esta liga-se posteriormente à FPN1 na superfície de macrófagos, enterócitos e hepatócitos. O complexo é depois internalizado e degradado, diminuindo a libertação de ferro das células e reduzindo a sua absorção no intestino. A hepcidina também diminui a expressão de proteínas envolvidas na absorção de ferro no intestino, como o DCYTB, o DMT1. Em contraste, o aumento da actividade eritropoiética suprime a expressão da hepcidina, assim como estados de anemia e hipóxia. Na figura, as linhas sólidas indicam as vias de transdução de sinal conhecidas, a tracejado estão indicadas as vias ainda não completamente esclarecidas (Adaptado de Dunn et al., 2007)

Tal como referido, a expressão de hepcidina é regulada em parte por BMPs, (Babitt et al.,

2006) tendo sido os níveis de mRNA do BMP-6 associados a alterações nas concentrações de

mRNA do gene HAMP (Kautz et al., 2008). Esta associação foi confirmada através da

observação de ratinhos em que o gene BMP-6 foi desactivado e onde se verificou um aumento

significativo da quantidade de ferro no fígado e noutros órgãos. Nesses casos, verificou-se a

I-Introdução

- 9 -

presença de outras moléculas BMPs, mas que não compensaram a ausência de BMP-6,

sugerindo assim que a função regulatória do ferro é exclusiva da proteína BMP-6, entre o

grupo das BMPs (Andriopoulos et al., 2009). A observação de que o excesso de ferro em

ratinhos com alterações no BMP-6 é significativamente maior do que em ratinhos com

deficiência ao nível do gene HFE, fez levantar a hipótese de que, em humanos, mutações no

gene BMP-6 possam causar sobrecarga grave em ferro, como por exemplo alguns casos de

hemocromatose juvenil, para a qual a base genética ainda não foi caracterizada (Meynard et

al., 2009).

Um outro factor regulador da expressão da hepcidina é, como referido, o TfR2. Este é

predominantemente expresso em hepatócitos. Tal como o TfR1, o TfR2 é uma proteína

membranar, com cerca de 45% de aminoácidos idênticos ao TfR1. A diferença fundamental

entre estas duas proteínas encontra-se no domínio citoplasmático. A presença de mutações no

TfR2 causa uma forma recessiva de Hemocromatose Hereditária, o que levanta a hipótese que

este receptor seja, também ele, sensível aos níveis de ferro no organismo (Zhang and Enns,

2009).

I.3-Alterações patológicas no metabolismo do ferro

O mecanismo de regulação do metabolismo do ferro é muito complexo e existem vários

factores genéticos e ambientais que podem causar a desregulação deste sistema levando a um

aumento ou a uma diminuição da quantidade deste elemento no organismo, sendo que ambos

os fenómenos comprometem a saúde e podem originar doenças de gravidade variável

(Andrews, 1999).

Os efeitos clínicos da carência de ferro estão descritos na literatura médica desde o século XVI,

em relatos de um distúrbio denominado clorose que afectava raparigas adolescentes

(Guggenheim, 1995). Actualmente, a deficiência neste elemento é a doença nutritiva mais

comum no mundo afectando cerca de 2 biliões de pessoas (Zimmermann and Hurrell, 2007).

Apesar de ser mais comum em países em desenvolvimento, verifica-se uma elevada

prevalência desta carência em determinadas populações de países industrializados como os

Estados Unidos (CDC, 2002). Os sintomas e sinais da deficiência em ferro são parcialmente

evidenciados pela presença de anemia. Estes incluem palidez, fadiga, fraca resistência ao

exercício físico e diminuição da capacidade de trabalho (Andrews, 1999). Para além disso,

vários estudos indicam que existe uma relação entre a carência deste elemento e problemas

cognitivos e comportamentais em crianças (Grantham-mcgregor and Ani, 2001). A falta de

ferro resulta na maioria dos casos da deficiente ingestão deste metal ou numa absorção

ineficaz, contudo, hemorragias, tumores e parasitoses também podem provocar a sua

diminuição no organismo (Andrews, 1999).

Contrariamente, a sobrecarga em ferro conduz à sua deposição e acumulação em vários

órgãos, como no fígado e no coração. O seu excesso apresenta, geralmente, uma de duas

características padrão ao nível do armazenamento do ferro. Quando a eritropoiese é normal

mas o ferro plasmático excede a capacidade da Tf se ligar a ele (por exemplo no caso da

hemocromatose) este é depositado nas células parênquimais do fígado e do coração. Em

contraste, quando o excesso se deve ao aumento do catabolismo dos eritrócitos (por exemplo

em casos de transfusão de sangue), a acumulação ocorre primeiro nos macrófagos

I-Introdução

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reticuloendoteliais e só depois nas células parênquimais. O armazenamento nestas últimas é

particularmente perigoso pois pode causar danos nos tecidos e fibrose (Andrews, 1999;

Deugnier and Turlin, 2011). Para além disso, o excesso de ferro está associado a casos de

cancro, como o carcinoma hepático, cancro do esófago, melanoma e leucemias (Huang, 2003).

Conforme a origem da sobrecarga em ferro as anomalias podem ser classificadas como

genéticas ou adquiridas. De entre as genéticas, existem quatro tipos de desregulações

transmitidas de modo autossómico recessivo e uma de modo autossómico dominante (Tabela

I.1) (Deugnier and Turlin, 2011). A hemocromatose do tipo I é a mais prevalente, sendo

responsável por cerca de 90% dos casos de sobrecarga em ferro e resulta de mutações do gene

HFE que levam a alterações funcionais na proteína codificada pelo gene referido. A

Hemocromatose do tipo IIA e IIB ou Hemocromatose Juvenil é caracterizada pela acumulação

de ferro no organismo numa fase precoce da vida que leva a manifestação de sintomas clínicos

antes dos 30 anos de idade, sendo que resultam de mutações associadas, respectivamente,

aos genes da HJV ou HAMP (Roetto et al., 2003). A Hemocromatose do tipo III está relacionada

com mutações no gene TfR2 (Papanikolaou and Pantopoulos, 2005). Uma forma distinta de

doença hereditária transmitida de modo autossómico dominante é a doença da ferroportina

que está relacionada com mutações patogénicas no gene SLC40A1 que codifica a proteína

exportadora de ferro FPN-1 (Montosi et al., 2001; Sebastiani and Walker, 2007). Ainda dentro

das anomalias genéticas relacionadas com o metabolismo do ferro, encontramos as doenças

da ferroportina do tipo A, aceruloplasminemia hereditária, atransferrinemia hereditária entre

outras. As anomalias adquiridas são aquelas que, não estando directamente implicadas no

metabolismo do ferro, têm a capacidade de gerar uma sobrecarga deste elemento no

organismo. Incluem-se aqui as doenças hematológicas como as talassémias e a anemia

falciforme, que levam a uma sobrecarga em ferro, quer pela produção de um factor eritróide

inibidor da expressão de hepcidina quer pela necessidade de múltiplas transfusões sanguíneas.

Algumas doenças crónicas no fígado, como por exemplo, a inflamação necrótica dos

hepatócitos, a infecção com o vírus da hepatite C e até o próprio consumo de álcool mostrou

poder inibir a expressão de hepcidina (Deugnier and Turlin, 2011).

Tabela I.1: Classificação genética da Hemocromatose

Tipo de Hemocromatose

Gene Cromossoma Proteína Hereditariedade NºOMIM

Tipo I ou clássica HFE 6p HFE Autossómica Recessiva

235 200

Tipo II A ou juvenil

HJV 1q Hemojuvelina Autossómica Recessiva

602 390

Tipo II B ou juvenil

HAMP 19q Hepcidina Autossómica Recessiva

606 464

Tipo III TfR2 7q Receptor 2 da transferrina

Autossómica Recessiva

604 250

Tipo IV ou doença da

ferroportina

SCL40A1 2q Ferroportina 1 Autossómica Dominante

606 069

I-Introdução

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I.3.1-Diferentes tipos de Hemocromatose Hereditária e sua base molecular

A Hemocromatose Hereditária (HH) é a forma mais comum de sobrecarga primária de ferro. A

sua associação à deposição hepática deste elemento foi a base para o termo Hemocromatose,

dos étimos gregos haima para sangue e chromatos para cor, o qual foi cunhado em 1889 por

Von Recklinghausen. Foi descrita pela primeira vez por Trousseau em 1865 como uma

patologia caracterizada pela presença de diabetes, pigmentação da pele de cor bronze e por

cirrose. A origem familiar da Hemocromatose foi postulada por Shiedon em 1935, este

classificou a doença como um erro no metabolismo (Andrews, 1999). À semelhança de outras

patologias genéticas, inicialmente esta doença foi descrita apenas fenotipicamente e só

recentemente, em 1996, é que a base genética molecular foi estabelecida (Feder et al., 1996;

Lyon and Frank, 2001).

Trata-se de uma doença hereditária do metabolismo do ferro em que a absorção intestinal é

excessiva relativamente às reservas do organismo. Ao longo do tempo o excesso de ferro

absorvido leva à saturação da Tf no plasma e à deposição deste em vários tecidos (Fleming and

Sly, 2002). A HH é a doença genética mais comum em indivíduos descendentes de populações

do Norte da Europa afectando 1 em cada 200 a 300 indivíduos sendo mais prevalente em

indivíduos do sexo masculino do que feminino (Lyon and Frank, 2001). Apesar das

manifestações clínicas da HH variarem muito, os sintomas mais característicos são artrite,

arritmia e falha cardíaca, diabetes, cirrose hepática, fadiga, hiperpigmentação da pele,

hipotiroidismo, hipogonadismo e carcinoma hepatocelular (Samuel et al., 2010). Os sinais da

doença são mais frequentes em homens do que em mulheres devido ao efeito protector das

perdas de sangue decorrentes da menstruação e da gravidez em mulheres pré-menopáusicas.

A sintomatologia apresentada por homens e mulheres também tende a diferir sendo os

sintomas mais comuns no sexo feminino a fadiga e a hiperpigmentação e nos homens a cirrose

e diabetes (Lyon and Frank, 2001). Com o aumento da concentração de ferro no fígado, a

prevalência de cirrose, diabetes e doença cardíaca é maior, o que tem implicações directas na

taxa de mortalidade. Em geral, pessoas com HH sintomática têm menor taxa de sobrevivência

do que indivíduos da mesma idade e sexo sem esta patologia (Hanson et al., 2001).

O fenótipo de HH é determinado em primeiro lugar pela taxa e pela magnitude de sobrecarga

em ferro que é dependente das proteínas alteradas e da sua interacção com a hepcidina. Um

rápido influxo de ferro no plasma causa rapidamente problemas cardíacos e insuficiência

endócrina. Em contraste, o aumento gradual de ferro leva a um fenótipo mais suave e o

aparecimento de sintomas é mais tardio. No entanto fenótipos intermédios também estão

descritos (Figura I.4) (Pietrangelo, 2010).

I-Introdução

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Figura I.4: Base genética e gravidade dos fenótipos comuns de hemocromatose. As características básicas da HH são produto de mutações em genes do metabolismo do ferro (HJV, HAMP, TfR2, FPN e HFE). Dependendo do gene envolvido e da sua interferência com a hepcidina, o fenótipo da hemocromatose varia. Se o gene tem um papel importante na síntese de hepcidina (HAMP ou HJV), a sobrecarga de ferro acontece rapidamente e atinge níveis muito elevados, nesse caso o quadro clínico será grave com o aparecimento de sintomas nas primeiras décadas de vida, afectando principalmente o coração e as glândulas endócrinas. Se o gene mutado não afectar tão criticamente este processo (como o HFE) o fenótipo irá manifestar-se mais tardiamente. Existem ainda, fenótipos intermédios (mutações no TfR2 ou combinações raras de mutações) (Adaptado de Pietrangelo, 2010).

I.3.1.1-Hemocromatose do tipo I

A principal causa da HH são mutações no gene HFE (High Fe ou Fe elevado) localizado no braço

curto do cromossoma 6 (6p21.2) (Feder et al., 1996; Sebastiani and Walker, 2007). Este gene é

constituído por sete exões, os primeiros seis codificam os domínios que constituem a proteína

(péptido de sinal, domínios α1, α2 e α3, domínio transmembranar e o citoplasmático), o

sétimo exão não é codificante (Figura I.5) (Fleming and Sly, 2002).

I-Introdução

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Figura I.5: Estrutura do gene HFE, respectivo mRNA e proteína. A). O gene HFE consiste em 7 exões (topo) dos quais apenas os seis primeiros codificam o mRNA da HFE (centro). Cada um desses exões codifica um domínio independente da proteína HFE (abaixo). tm- domínio transmembranar; cyto-domínio citoplasmático. B) Proteína HFE associada com a β2-microglobulina na superfície celular. Os três domínios extracelulares da HFE são designados por α1, α2 e α3. A β2-microglobulina (β2-M) está associada ao domínio α3 (Adaptado de Fleming and Sly, 2002).

O transcrito HFE principal tem cerca de 4,2 kb, no entanto foram descritos outros com

diferentes dimensões (Jeffrey et al., 1999; Thénié et al., 2000; Sánchez et al., 2001). Estes são

atribuídos a mecanismos de splicing alternativo, sendo o seu significado biológico ainda

desconhecido na maioria dos casos (Fleming and Sly, 2002; Martins et al., 2011).

Existem duas mutações mais frequentes no gene da HFE, a C282Y e a H63D (Sebastiani and

Walker, 2007). A maioria dos doentes com Hemocromatose do tipo I tem a transição de G→A

no nucleótido 845 (exão 4) do gene HFE, que resulta na substituição de uma cisteína por uma

tirosina no aminoácido 282 da proteína (C282Y). Esta mutação em homozigotia impede a

interacção da proteína HFE com o seu chaperone β2-microglobulina (β2-M) o que leva a que

não haja o seu direccionamento para a membrana, pelo que a HFE fica predominantemente

localizada no reticulo endoplasmático das células e é posteriormente degradada. Actualmente

ainda não é totalmente conhecida a fisiopatologia da doença associada à HFE. De acordo com

o modelo da programação dos enterócitos, da falta da HFE funcional resultará numa redução

da entrada de Fe2-Tf para as células das criptas duodenais, o que levará a uma falsa avaliação

de carência em ferro no duodeno, pois a quantidade deste elemento armazenado está a

aumentar. O resultado é uma regulação positiva da expressão de proteínas do metabolismo do

ferro e um aumento na absorção e transporte deste do lúmen duodenal para a circulação. Por

outro lado, é colocada também a hipótese de que, devido ao papel que a HFE tem na síntese

da hepcidina, a existência da forma mutada possa de alguma forma alterar os sinais ou

factores apropriados para a expressão desta hormona crucial na homeostase do ferro. Desta

forma o organismo não terá a capacidade de regular a absorção de ferro (Fleming and Sly,

2002).

A maioria dos indivíduos com Hemocromatose Hereditária são descendentes de um ancestral

comum Celta que viveu há cerca de 60 ou 70 gerações, portador de uma única mutação

missense a C282Y (Ajioka et al., 1997). Dado que esta mutação não confere um obstáculo à

I-Introdução

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reprodução e pode até ter sido vantajosa no passado aos seus portadores, foi transmitida à

descendência e espalhada através de migrações, sendo em geral mais frequente em indivíduos

do Norte da Europa (Merryweather-Clarke et al., 1997). Em Portugal existem diferenças

regionais nas frequências alélicas desta mutação, sendo que a norte do país a frequência é

idêntica à encontrada em alguns países do Norte da Europa com um valor de 5,8 % enquanto a

sul a frequência é de 0,9 % (Cardoso et al., 2001).

A outra mutação comum no gene HFE é a H63D, que corresponde a uma transversão de G→C

no nucleótido 187 do gene, resultando na substituição de histidina por aspartato no

aminoácido 63 da proteína (H63D). Esta é encontrada em 15-40% da população caucasiana

(Fleming and Sly, 2002), e pensa-se que impede a formação de uma ponte salina, alterando a

conformação proteica daquela região. Esta variante da proteína HFE ao contrário da resultante

da C282Y é processada, transportada e expressa à superfície. No entanto, não tem a mesma

afinidade pelo TfR1 que a proteína não alterada. Como consequência dá-se uma maior

deposição de ferro nas células (Waheed et al., 1997). Esta mutação é mais prevalente que a

anterior (Merryweather-Clarke et al., 1997). Em Portugal, ao contrário do que acontece com a

mutação C282Y, a mutação H63D apresenta uma distribuição mais homogénea (17-19

%)(Cardoso et al., 2001). Em termos evolutivos a mutação H63D é anterior à C282Y. A primeira

poderá ter surgido em vários locais diferentes como resultado de pressões selectivas sobre o

gene HFE. Estas pressões podem ter acontecido devido à presença de doenças infecciosas ou

condições ambientais de indisponibilidade de ferro (Rochette et al., 1999).

Verificou-se que alguns dos indivíduos compostos heterozigoticamente para a C282Y e para a

H63D podem desenvolver excesso de ferro, no entanto a penetrância deste genótipo é menor

do que para a homozigotia da C282Y. Aos indivíduos homozigóticos para a H63D estão

também associados ao aumento de ferro. A penetrância clinica deste genótipo é menor, no

entanto têm vindo a ser reportados uma grande variedade de fenótipos (Gobbi et al., 2004).

Outras mutações no gene HFE têm sido descritas, sobretudo em heterozigotia composta com a

C282Y, e associadas a casos de hemocromatose do tipo I mas de carácter menos grave. É o

caso da mutação S65C, que corresponde a uma transversão de A→T no nucleótido 193 do

gene HFE, resultando na substituição de uma serina por uma cisteína (Trifa et al., 2012). Ainda,

outras mutações raras na proteína HFE têm sido identificadas, como por exemplo a G93R,

I105T e a Q283P (Figura I.6)(Lyon and Frank, 2001).

I-Introdução

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Figura I.6: Representação esquemática de mutações descritas no gene HFE. A mutações mais frequentemente associadas a HH encontram-se no exão 2 (H63D) e no exão 4 (C282Y). As caixas a cinzento representam os exões do gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005) .

I.3.1.2-Hemocromatose do tipo II ou Hemocromatose Juvenil

A Hemocromatose do tipo II ou Hemocromatose juvenil (HJ) é o tipo mais grave desta

patologia podendo levar à morte de indivíduos jovens (Gobbi et al., 2002). Trata-se de uma

doença hereditária com transmissão autossómica recessiva que normalmente surge antes dos

30 anos. Enquanto na HH o depósito e acumulação de ferro evolui lentamente e afecta mais os

homens, no tipo juvenil a evolução/gravidade dá-se mais rapidamente e afecta os dois sexos

em igual proporção. Tal como a HH clássica as principais complicações clínicas são:

hipogonadismo, doença cardíaca, cirrose hepática, diabetes, artropatias e pigmentação da

pele, mas neste tipo com maior gravidade. No entanto, neste caso os sintomas mais comuns

são o hipogonadismo e as cardiomiopatias. O depósito rápido de ferro pode ser fatal na grande

maioria dos doentes com HJ, devido a falha cardíaca (Andrews, 1999; Roetto et al., 2003).

A HJ é geneticamente heterogénea e está relacionada com alterações em um de dois genes. A

Hemocromatose Juvenil do tipo 2A é a forma mais frequente (cerca de 90% dos casos de HJ) e

está associada ao locus 1q21 (Roetto et al., 1999). O gene responsável foi identificado em 2004

como sendo o da HJV (Papanikolaou et al., 2004). Mutações neste gene causam sobrecarga

grave em ferro o que, correlacionado com baixos níveis de hepcidina, sugere que a HJV afecta

positivamente a cascata que regula a expressão desta hormona ao nível do fígado (Figura

I.3)(Babitt et al., 2006).

O gene HJV tem cerca de 4,2kb e foi identificado por Papanikolaou e colaboradores

(Papanikolaou et al., 2004). É transcrito e processado num mRNA maduro contendo a

totalidade dos exões e em quatro variantes de splicing adicionais, que codificam três isoformas

proteicas de 200, 314 e 426 aminoácidos. A HJV é essencialmente expressa no fígado adulto e

fetal, no coração e no músculo (Martinez et al., 2004; Papanikolaou et al., 2004). A proteína

codificada pelo transcrito principal, a variante que não sofre splicing, contém múltiplos

domínios incluindo um péptido sinal na zona N-terminal, um domínio de três aminoácidos

repulsive guidance domain (RGD), um factor de Von Willebrand (vWf) e um domínio

transmembranar na zona C-terminal característico de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol

I-Introdução

- 16 -

(GPI-anchor) (Papanikolaou et al., 2004). A remoção dessa âncora poderá gerar uma isoforma

solúvel (Lin et al., 2005). A HJV revela uma considerável homologia na sequência de

aminoácidos com os factores proteicos repulsive guindance molecules (RGM) que actuam

como co-receptores de BMPs, que são factores de crescimento com papéis importantes em

várias actividades biológicas através de ligações a determinados receptores, desencadeando

vias de sinalização que regulam a transcrição de genes específicos. A HJV actua como co-

receptor de BMP para modular a transcrição do gene HAMP, tendo assim um papel importante

no metabolismo do ferro através da regulação da expressão da hepcidina (Papanikolaou et al.,

2004). Encontram-se descritas várias mutações (Figura I.7), essencialmente localizadas nos

exões 3 e 4 deste gene que codificam a zona mais conservada da estrutura proteica,

nomeadamente o domínio RGD, vWf e o domínio transmembranar (Lanzara et al., 2004) .

Figura 7: Representação esquemática de mutações descritas no gene HJV. A maior parte das mutações encontram-se no exão 3 e no 4, sendo neste último que se encontra a G320V que está presente na maioria dos indivíduos com HJ subtipo 2A. As caixas a cinzento representam os exões do gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005) .

Várias mutações no gene da HJV têm sido descritas nos últimos anos em diversas populações.

A maioria dos indivíduos com HJ do tipo 2A apresenta uma transversão de G→T no nucleótido

959 do gene da HJV, que resulta na substituição de uma Glicina por uma Valina na posição 320

da proteína (G320V). Casos de HJ relacionados com mutações no gene da HJV não parecem ser

agravados quando existem mutações no gene HFE, nomeadamente no caso da mutação H63D

(Lanzara et al., 2004; Lee et al., 2004; Papanikolaou et al., 2004).

A Hemocromatose Juvenil do tipo 2B é menos frequente (correspondendo a cerca de 10% dos

casos de HJ) e está associada ao locus 19q13.1 onde está localizado o gene HAMP, constituído

por 3 exões e que codifica para a hepcidina (Park et al., 2001). Caracteriza-se por uma

sobrecarga em ferro particularmente mais grave que a do subtipo 2A. Os seus portadores

tendem a apresentar precocemente sintomas cardíacos (Santos et al., 2009). Existem várias

mutações descritas no gene HAMP (Figura I.8) que parecem estar relacionadas com este tipo

I-Introdução

- 17 -

de HJ, nomeadamente a R56X e a C70R (Roetto et al., 2003). Esta última corresponde a uma

troca de T→C, que resulta na substituição de uma cisteína por uma arginina. Esta alteração de

um aminoácido neutro por um básico leva a alteração do péptido, uma vez que uma das oito

císteinas conservadas e que são criticas para a estabilidade do polipéptido é modificada

(Roetto et al., 2004). São vários os estudos que indicam que estados homozigóticos para as

mutações referidas estão associados a sobrecarga de ferro (Gobbi et al., 2002; Lanzara et al.,

2004).

Figura I.8: Representação esquemática de mutações descritas no gene HAMP. No caso das mutações no gene HAMP estão descritas algumas mutações, não existindo nenhuma frequentemente associada à HJ subtipo 2B. As caixas a cinzento representam os exões do gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005).

I.3.1.3-Hemocromatose do tipo III

A Hemocromatose do tipo III está relacionada com alterações no TfR2. A primeira mutação

identificada foi a Y250X, esta é uma mutação nonsense que foi descrita em 6 indivíduos de 2

famílias Italianas (Camaschella et al., 2000). O gene TfR2 é constituído por 18 exões, localiza-se

em 7q22 e codifica para a proteína TfR2 que está envolvida na captura de Tf pelos hepatócitos

e também na síntese de hepcidina (Santos et al., 2012).

O fenótipo apresentado por estes doentes é idêntico ao dos indivíduos com HH do tipo I, no

entanto também é detectado em indivíduos jovens à semelhança do que acontece no caso da

HJ (Le Gac and Férec, 2005). Esta patologia é rara e têm sido descritos poucos casos de

mutações no TfR2 (Figura I.9), no entanto, tanto em modelos animais como em doentes com

HH do tipo III verifica-se um decréscimo dos níveis de hepcidina (Majore et al., 2006).

I-Introdução

- 18 -

Figura I.9: Representação esquemática de mutações descritas no gene TfR2. A Y250X foi a primeira mutação a ser descrita neste gene e está localizada no exão 6. As caixas a cinzento representam os exões do gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005).

I.3.1.4-Hemocromatose do tipo IV ou Doença da Ferroportina

A Hemocromatose do tipo IV também conhecida por doença da ferroportina foi reconhecida

clinicamente em 1999 (Pietrangelo et al., 1999) e ligada ao gene SLC40A1 em 2001. Este gene

localizado na região 2q32 é constituído por 8 exões (Figura I.10), codifica a ferroportina que é

uma proteína envolvida na exportação celular de ferro (Montosi et al., 2001)

Anomalias no funcionamento da FPN-1 provocam uma retenção e acumulação anormal de

ferro predominantemente nos macrófagos reticuloendoteliais no fígado e baço. Esta retenção

de ferro intracelular provoca uma diminuição nos níveis plasmáticos deste elemento e como

tal há uma redução da disponibilidade deste para se ligar à Tf. Este facto explica porque é que

os níveis de saturação da Tf são normais ou baixos em fases mais avançadas da doença. A

maior parte dos casos relatados são fenotipicamente mais suaves do que os que envolvem a

HH clássica, possivelmente porque a deposição reticuloendotelial de ferro é menos prejudicial

do que a deposição parenquimatosa (Pietrangelo, 2004).

Figura 10: Representação esquemática de mutações descritas no gene SLC40A1. A maioria das

mutações descritas encontra-se no exão 5 e no exão 6. As caixas a cinzento representam os exões do

gene (Adaptado de Le Gac and Férec, 2005).

I-Introdução

- 19 -

I.3.2-Diagnóstico

Os indivíduos com hemocromatose normalmente absorvem 2 a 3 vezes mais ferro a partir da

alimentação do que indivíduos normais. A maioria não apresenta sintomatologia até à idade

adulta (à excepção de portadores de HJ) apesar da saturação da Tf sérica estar aumentada

desde a adolescência. Os primeiros sintomas são inespecíficos e incluem fadiga, disfunção

eréctil e aumento da pigmentação da pele (Andrews, 1999). Até à década de 1990, o

diagnóstico de HH baseava-se fundamentalmente na confirmação histológica de sobrecarga

em ferro. Deste modo, realizavam-se biópsias hepáticas como parte integrante da investigação

do doente com suspeita de hemocromatose ou de flebotomias quantitativas, nos casos em

que a biopsia hepática não era indicada (Santos et al., 2009). Actualmente, os marcadores

bioquímicos mais importantes utilizados para determinar o status de ferro no organismo são o

índice de saturação da transferrina sérica e os valores de ferritina sérica (Hanson et al., 2001).

O índice de saturação (IS) da transferrina sérica é a razão ferro sérico/capacidade de fixação do

ferro. Em condições normais, 20 a 50% dos sítios de ligação do ferro na transferrina estão

ocupados. Valores de saturação superiores a 50% em mulheres pré-menopausicas e superior a

60%, em mulheres pós-menopausicas e nos homens, é indicativo de HH, talassemia, hepatites,

ingestão excessiva de ferro ou toma de progesterona. Consequentemente após tratamentos

de reposição de ferro podem ser encontrados valores superiores a 100% de IS. Níveis baixos

podem estar presentes em casos de anemia ferropénica, subnutrição e na anemia das doenças

crónicas (Andrews, 1999; Hanson et al., 2001).

Valores de ferritina sérica elevados estão associados a manifestações clínicas de HH, pois como

é uma proteína intracelular de armazenamento de ferro, a sua concentração correlaciona-se

significativamente com a quantidade de ferro armazenada no organismo (1 μg/L corresponde

a 10mg de ferro armazenado)(Hanson et al., 2001).

Tem sido definida como sobrecarga de ferro a presença de pelo menos duas constatações de

índice de saturação da transferrina iguais ou superiores a 50% em mulheres e 60% em

homens; e/ou concentrações séricas de ferritina >200 μg/L em mulheres e >300 μg/L em

homens (Bacon et al., 1999; Santos et al., 2009). Indivíduos identificados com estes

parâmetros bioquímicos alterados, portanto com excesso de ferro, têm uma probabilidade

incerta de desenvolver complicações clínicas. Estudos familiares sugerem que 50-70% de

homens e 40-50% de mulheres vão desenvolver sintomas ou complicações devido ao excesso

de ferro no organismo, alguns desses sintomas inespecíficos como é o caso da diabetes e dos

problemas articulares (Hanson et al., 2001). Para esclarecer o diagnóstico de que será um caso

de HH, para além da análise de parâmetros bioquímicos também são efectuados estudos

moleculares às mutações C282Y e H63D no gene HFE. Os testes genéticos nem sempre são

preditivos do desenvolvimento da doença pois há indivíduos com o genótipo que nunca

apresentam os efeitos nefastos resultantes da sobrecarga em ferro (a penetrância é baixa) e

há indivíduos com sobrecarga em ferro sem estas mutações mais frequentes (Olynyk et al.,

1999; Pietrangelo et al., 1999)

I-Introdução

- 20 -

I.3.3-Tratamento

O tratamento para a hemocromatose não se alterou substancialmente desde 1950 e inclui

flebotomias para indivíduos sintomáticos e pré-sintomáticos. A flebotomia terapêutica é o

principal tratamento aplicado a indivíduos com este tipo de patologia. Este procedimento é

seguro, eficaz e económico. Cada 450 a 500mL de sangue contém cerca de 200 a 250mg de

ferro (Andrews, 1999). O tratamento inicial para doentes sintomáticos é composto por

flebotomias semanais ou quinzenais de uma unidade (450mL) de sangue, até que o doente

apresente uma ligeira hipoferritinémia. A terapêutica de manutenção consiste em flebotomias

em intervalos de 2 a 6 meses, dependendo da sobrecarga do indivíduo de modo a manter os

valores de ferritina sérica abaixo dos 50 μg/L (Lyon and Frank, 2001).

A concentração de Ft no soro reflecte as reservas corporais de ferro e é utilizada para

monitorizar o progresso da terapia. Se o tratamento se iniciar numa fase precoce da doença é

possível prevenir danos nos órgãos e aumentar a sobrevivência. É possível estabilizar a cirrose,

hipogonadismo e problemas articulares. A dependência de insulina dos diabéticos não pode

ser travada mas pode ser diminuída e retardada (Hanson et al., 2001; Pietrangelo, 2004).

Outro tipo de terapêutica para o excesso de ferro no organismo é a terapia com quelantes de

ferro que aumenta a excreção deste, no entanto é menos utilizada porque é menos eficiente e

mais cara do que as flebotomias e para além disso tem bastantes efeitos secundários

indesejáveis (Hanson et al., 2001) .

Os doentes com excesso de ferro no organismo são também aconselhados a evitar

suplementos alimentares ricos em ferro e a restringir a ingestão de vitamina C, uma vez que

esta facilita a absorção de ferro. Adicionalmente devem evitar o consumo de alimentos ricos

neste elemento como a carne vermelha (Andrews, 1999).

II-Objectivos

II-Objectivos

- 22 -

O objectivo principal deste trabalho consistiu na pesquisa e caracterização de mutações em

genes relacionados com o metabolismo do ferro, nomeadamente no gene HFE, TfR2, HJV,

HAMP e BMP-6. A pesquisa foi realizada num grupo de 11 indivíduos com parâmetros

bioquímico de grande sobrecarga em ferro, apresentando uma hiperferritinemia muito grave

(ferritina sérica > 2500 μg/L).

Estes indivíduos já tinham sido estudados na Unidade de Genética Molecular do

Departamento de Genética Humana deste Instituto no que respeita à pesquisa das mutações

comuns no gene HFE (C282Y e H63D) normalmente associadas a Hemocromatose Hereditária

do tipo I (clássica). A maioria dos indivíduos não apresentava os genótipos considerados de

risco nesse gene, apenas dois deles eram homozigóticos para a mutação C282Y, o que mesmo

assim é improvável que justifique os níveis de ferritina sérica destes indivíduos uma vez que

são muito superiores à média apresentada por doentes com HH do tipo I. Assim, com este

estudo pretendeu-se pesquisar outros determinantes genéticos, nomeadamente mutações em

cinco genes relacionados com o metabolismo do ferro, que pudessem justificar a sobrecarga

grave de ferro manifestada por estes doentes.

Para se atingir este objectivo principal, tivemos ainda como objectivos secundários:

- A implementação no laboratório da metodologia de PCR para amplificação enzimática in vitro

do gene BMP-6.

- A optimização de algumas metodologias de PCR, já anteriormente utilizadas no laboratório

na amplificação dos outros genes, mas que se revelaram insatisfatórias por originarem

amplificações fracas ou inespecíficas.

- A pesquisa e utilização das ferramentas informáticas necessárias para os estudos in silico de

análise das sequências nucleotídicas de modo a identificar possíveis alterações nas regiões

codificantes assim como de polimorfismos, e para o estudo do impacto das alterações

nucleotídicas a nível do splicing e a nível proteico.

A identificação de mutações associadas a HH é essencial quer para diagnóstico molecular quer

para programas de rastreio populacional. É também fundamental para a compreensão da

elevada heterogeneidade fenotípica e da baixa penetrância e variável expressividade desta

patologia. Para além disso, o estudo funcional das mutações encontradas pode contribuir

significativamente para o conhecimento do papel de algumas proteínas envolvidas no

metabolismo do ferro e portanto da fisiopatologia da doença.

III-Materiais e Métodos

III-Materiais e Métodos

- 24 -

III.1-População estudada

Neste trabalho foram estudados 11 indivíduos, com hiperferritinemia grave que foram

seleccionados de entre os doentes recebidos, no período de 2004 a 2012, na Unidade de

Genética Molecular do Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Dr.

Ricardo Jorge (INSA), em Lisboa, para pesquisa das mutações C282Y e H63D do gene HFE. Os

indivíduos tinham idades compreendidas entre os 29 e os 71 anos datados à altura da sua

entrada no INSA para estudo das mutações anteriormente referidas. Sete indivíduos eram do

sexo masculino (64% da amostra) e 4 do feminino (36% da amostra). Todos vieram

encaminhados de centros de saúde e de hospitais da zona de Lisboa: Hospital de Santa Maria,

Instituto Português de Oncologia e Hospital do Barreiro.

III.1.1-Critérios de selecção da amostra

Os indivíduos seleccionados para o estudo possuíam níveis de ferritina muito elevados, sendo

que valores superiores a 200 μg/L em mulheres e superiores a 300 μg/L em homens são

considerados indicadores de sobrecarga em ferro no organismo (Bacon et al., 1999).

Os indivíduos analisados no presente trabalho apresentavam todos níveis de ferritina

superiores a 2500 μg/L, sendo então classificados como indivíduos com hiperferritinemia

grave.

III.1.2-Obtenção de material genético

O DNA genómico foi extraído a partir de amostras de sangue periférico colhidas em EDTA na

Unidade de Genética Molecular do Departamento de Genética Humana do INSA.

III.2-Reacção em cadeira da polimerase (PCR)

A reacção em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou a genética molecular uma vez que veio

permitir a rápida amplificação, isto é, criação de múltiplas cópias de DNA, por replicação

enzimática. Esta técnica foi descrita em 1988 por Saiki e colaboradores e desde a sua origem

têm surgido várias utilizações em investigação. A amplificação dos fragmentos de DNA é

selectiva, delimitada por duas regiões de sequência conhecida. A síntese de DNA in vitro

envolve a síntese enzimática através de uma polimerase de DNA termoestável isolada de uma

bactéria denominada Thermus aquaticus (Taq) resistente a elevadas temperaturas (Saiki et al.,

1988; Mullis, 1990). A reacção de PCR consiste numa série de ciclos, cada um dos quais

envolve reacções a temperaturas diferentes. Cada ciclo envolve a desnaturação de DNA,

emparelhamento de oligonucleótidos iniciadores e síntese de DNA (Saiki et al., 1988; Mullis,

1990).

III.2.1-Amplificação por PCR de regiões dos genes em estudo

No presente estudo foram amplificadas por PCR as regiões dos genes HFE, TfR2, HJV, HAMP e

BMP-6 descritas na Tabela III.2.

III-Materiais e Métodos

- 25 -

Tabela III.2: Regiões dos genes estudadas

Genes Regiões analisadas

HFE Exões 1 a 6

TfR2 Exões 1 a 18

HJV Exões 2 a 4

HAMP Exões 1 a 3 e Promotor Proximal

BMP-6 Exões 2 a 6

As misturas de reacção (mix) foram preparadas na bancada limpa, livre de ácidos nucleicos,

numa sala exclusiva para preparação de PCR, com material exclusivo e todo o processo foi

realizado em gelo (4ºC).

Os reagentes utilizados e a ordem pela qual foram adicionados estão descritos nas Tabelas III.3

a III.7. As sequências de oligonucleótidos iniciadores utilizados para amplificar as diferentes

regiões em estudo constam das Tabelas III.8 a III.12. As condições de amplificação de cada

fragmento por PCR encontram-se nas Tabelas III.13 a III.17, tendo por base tanto bibliografia

existente como optimizações efectuadas no decorrer do trabalho laboratorial.

Após a preparação da mix na sala de PCR, esta foi aliquotada para os tubos de PCR e no

laboratório foram adicionados os DNAs em estudo. Em todas as reacções foi usado um

controlo negativo (sem adição de DNA) a fim de se controlarem possíveis contaminações. Os

tubos com as misturas de reacção foram colocados num termociclador (Biometra T Gradient)

previamente programado para as condições de amplificação óptimas.

Tabela III.3: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene HFE

Reagentes Exão 1 Exão 2 Exão 3 Exão 4 Exão 5 Exão 6

H2O bidestilada - 15,42 15,42 15,42 - -

Tampão B (10X) 25 - - - 25 25

Tampão α (10X) - 2,5 2,5 2,5 - -

DMSO (99,9%) - 2,5 2,5 2,5 - -

BSA (10 mg/ml) - 0,43 0,43 0,43 - -

MgCl2 (25Mm) - 2 2 2 - -

Oligonucleótidos iniciadores S (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Oligonucleótidos iniciadores AS (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

dNTPs (100 Mm) - 0,5 0,5 0,5 - -

Polimerase Taq (Promega) (5 U/μL)

0,075 - - - 0,075 0,075

Polimerase Taq (Applied Biosystems) (5 U/μL)

- 0,15 0,15 0,15 - -

Mix+DNA (Vf=25 μL)

24,5+0,5

As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; Vf- Volume final;

III-Materiais e Métodos

- 26 -

S- oligonucleótidos directos AS- oligonucleótidos inversos;

Tabela III.4: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene TfR2

Reagentes Exão 1

Exão 2

Exão 3

Exão 4+5+6

Exão 7+8+9

Exão 10

Exão 11+12

+13

Exão 14+15

+16

Exão 17

Exão 18

H2O bidestilada 17,9 - 14,45 14,45 - - - - - -

Tampão B (10X) - 25 - - 25 25 25 25 25 25

Tampão α (10X)

2,5 - 2,5 2,5 - - - - - -

DMSO (99,9%) 2,5 - 2,5 2,5 - - - - - -

BSA (10 mg/ml) 0,45 - 0,45 0,45 - - - - - -

MgCl2 (25Mm) 2 - 2 2 - - - - - -

Oligonucleótidos iniciadores S (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Oligonucleótidos iniciadores AS (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

dNTPs (100 Mm) 0,5 - 0,5 0,5 - - - - - -

Polimerase Taq (Promega) (5 U/μL)

0,15 0,075 0,15 0,15 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075

0,075

Mix+DNA (Vf=25 μL)

24,5+0,5

A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1; As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; Vf- Volume final; S- oligonucleótidos directos AS- oligonucleótidos inversos;

Tabela III.5: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene HJV

Reagentes Exão 2 Exão 3 Exão 4

H2O bidestilada 20 - 20

Tampão David (10X) 2,5 - 2,5

Tampão B (10X) - 25 -

BSA (10 mg/mL) 0,35 - 0,35

Oligonucleótidos iniciadores S (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5

Oligonucleótidos iniciadores AS (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5

dNTPs (100 Mm) 0,5 - 0,5

Polimerase Taq (Promega) (5 U/μL)

- 0,075 -

Polimerase Taq (Applied Biosystems) (5 U/μL)

0,15 - 0,15

Mix+DNA (Vf=25 μL)

24,5+0,5

A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1; As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; Vf- Volume final; S- oligonucleótidos directos AS-oligonucleótidos inversos;

III-Materiais e Métodos

- 27 -

Tabela III.6: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene HAMP

Reagentes Promotor Proximal Exão 1 Exão 2+3

H2O bidestilada 15,8 - 19,2

Tampão B (10X) 25 -

Tampão α (10X) 2,5 - -

Tampão PCR (Applied Biosystems) (10X)

- - 2,5

DMSO (99,9%) 2,5 - -

BSA (10 mg/ml) 0,35 - -

MgCl2 (25Mm) 2 - 1,5

Oligonucleótidos iniciadores S (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5

Oligonucleótidos iniciadores AS (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5

dNTPs (100 Mm) 0,5 - 0,2

Polimerase Taq (Promega) (5 U/μL)

- 0,075 -

Polimerase Taq (Applied Biosystems) (5 U/μL)

0,15 - 0,1

Mix+DNA (Vf=25 μL)

24,5+0,5

A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1; As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; Vf- Volume final; S- oligonucleótidos directos AS-oligonucleótidos inversos;

Tabela III.7: Condições laboratoriais utilizadas para cada reacção de amplificação de PCR para os exões do gene BMP-6

Reagentes Exão 2 Exão 3+4 Exão 5+6+7

Tampão B (10X) 25 25 25

Oligonucleótidos iniciadores S (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5

Oligonucleótidos iniciadores AS (15pmol/ μL)

0,5 0,5 0,5

Polimerase Taq (Promega) (5 U/μL)

0,075 0,075 0,075

Mix+DNA (Vf=25 μL)

24,5+0,5

A constituição dos tampões utilizada encontra-se descrita no Anexo 1; As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; Vf- Volume final; S- oligonucleótidos directos AS-oligonucleótidos inversos;

III-Materiais e Métodos

- 28 -

Tabela III.8: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HFE e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)

Exão Directo Reverso Dimensão do fragmento

(pb)

Referência Bibliográfica

1 CGGAGATTTAACGGGGACGT TCGATTTTTCCACCCCCGCC

168 (Le Gac et al., 2001)

2 GGTGTGTGGAGCCTCAACAT AGCTCTGACAACCTCAGGAA

377

3 GGACCTATTCCTTTGGTTGCA

TCCTCCACTCTGCCACTAGAGTA

374

4 AGTTCCAGTCTTCCTGGCAA AGCTCCTGGCTCTCATCAGT

368

5 GTGAGATGAGGATCTGCTCT

GGCAGAGGTACTAAGAGACT

234

6 CCTAGGTTTGTGATGCCTCT

TAGGTTCAACTCTCTCCTGA 186

Tabela III.9: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene TfR2 e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)

Exão Directo Reverso Dimensão do

fragmento (pb)

Referência Bibliográfica

1 TCGCTGGGGGACAGCCTG

TCAAATGAGCATGGTGGTGGGG 232 *

2 TCACTGACCTCATTATTGCC

AAGGCTGGCGGGTGGCAAGA 440 (Roetto et al., 2001)

3 GTGAGAGCCGTCCCCCTCCC

AGACACCAGGCCTGGGCC 386 *

4 ACGTCTCTGGCATCCTTCCCT

GGTGAGCGCCCCGAGCCGCG 276 (Roetto et al., 2001)

5+6 CGCGGCTCGGGGCGCTCACC

ACCCTGAACGATTCTCACTG 452

7+8 ATCCTCTCCGTGGGATGGACA

ACCCACAATCACCCTGTGG 588 *

9 CTGGGTCTCTCTACAACTTCCCC

GCCCCCTATCTTGCCAGGG 292 *

10 GAGAGACACAGGCAGATGGAGG

TCCCTCACTGCCTCTCTGCC 286 *

11+12+13 AGGACAGAAGAAGA

GGGGGTTGGGGAAG 558 *

14+15+16 GGAATAGGGGGTGA

TGGCCTGGGCAGTG 686 *

17 CACTCTGTCCTCGTCTACCT

CAGGACTGGGAAGAGAGCAT 427 *

18 TGGCTGGCGGGA

GCCACCTCCCTGACCCTG 434 *

*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;

III-Materiais e Métodos

- 29 -

Tabela III.10: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HJV e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)

Exão Directo Reverso Dimensão do

fragmento (pb)

Referência Bibliográfica

2 CCCCAAATTCCAGTCTGTT

CTCATTCAGGCTCACATGC

382 (Lanzara et al., 2004)

3 GCAAACTACACTCCGATAGAG

GTGCCCGTGGAAGAATCTCAT

681 *

4 TAACTATGTATGAGGTCTGATTGGG TATGCCAATCTGTATCTCCAAATCA

757 *

*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;

Tabela III.11: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene HAMP e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)

Exão Directo Reverso Dimensão do

fragmento (pb)

Referência Bibliográfica

PP AGCCTCCTGGGCTTAAGCGAT

TGGGTCTTGAGCTTGCTCTGG

862 *

1 AGCAAAGGGGAGGGGGCTCAGACCAC

TCCCATCCCTGCTGCCCTGCTAAGGAC

262 (Merryweather-Clarke et al., 2003)

2+3 TCTCAGAGGTCCACTGGGC

GACACTCGGCAGAGAGAAAG 448 (Jacolot et al., 2004)

PP-Promotor Proximal;

*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;

Tabela III.12: Sequência dos oligonucleótidos iniciadores usados nos PCRs do gene BMP-6 e respectiva dimensão dos fragmentos de DNA amplificados

Oligonucleótidos iniciadores ( 5´→3´)

Exão Directo Reverso Dimensão do

fragmento (pb)

Referência Bibliográfica

2 ATCCCCGTAGTAAGCCGTGG CCCTGCACAGACATAGCTGG

411 *

3+4 ATCCTGACGCTGAGACAGG GCCCGACATCTGAGACTGTG

1216

5+6+7 GCCTGGCATGTGGTAAACTCTC CCACCTCCAACTGTGCTTCC

1449

*Oligonucleótidos iniciadores desenhados para o presente trabalho;

III-Materiais e Métodos

- 30 -

Tabela III.13: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HFE

1-Desnaturação inicial

2.1-Desnaturação

2.2-Emparelhamento

dos Olig. Inic.

2.3- Síntese de DNA

3- Extensão final

Nº de ciclos de 2.1 a 2.3

Exão T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP 1 94 5´ 94 30´´ 57 30´´ 72 30´´ 72 5´ 35

2 94 10´ 94 30´´ 55 30´´ 72 30´´ 72 10´ 32

3 94 10´ 94 30´´ 53 30´´ 72 30´´ 72 10´ 32

4 94 10´ 94 30´´ 55 30´´ 72 30´´ 72 10´ 32

5 94 5´ 94 30´´ 57 30´´ 72 30´´ 72 5´ 35

6 94 5´ 94 30´´ 57 30´´ 72 30´´ 72 5´ 35 Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;

Tabela III.14: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene TfR2

1-Desnaturação

inicial

2.1-Desnaturação

2.2-Emparelhamento

dos Olig. Inic.

2.3- Síntese de DNA

3- Extensão final

Nº de ciclos

de 2.1 a 2.3

Exão T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP 1 95 10´ 95 30´´ 63 30´´ 72 30´´ 72 10´ 35

2 95 5´ 95 30´´ 58 30´´ 72 1´ 72 10´ 32

3 95 5´ 95 1´ 67 1´ 72 1´ 72 10´ 35

4 95 5´ 95 1´ 61 1´ 72 1´ 72 10´ 35

5+6 94 5´ 94 30´´ 63 30´´ 72 30´´ 72 5´ 35

7+8 94 5´ 94 30´´ 61 30´´ 72 30´´ 72 5´ 35

9 95 5´ 95 30´´ 61 30´´ 72 30´´ 72 5´ 32

10 95 10´ 95 30´´ 64 30´´ 72 30´´ 72 10´ 36

11+12+13 95 10´ 95 30´´ 68 30´´ 72 30´´ 72 10´ 35

14+15+16 95 10´ 95 1´ 59 45´´ 72 45´´ 72 10´ 35

17 95 10´ 95 30´´ 63 30´´ 72 30´´ 72 10´ 30

18 94 5´ 94 30´´ 63 30´´ 72 30´´ 72 5´ 35 Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;

Tabela III.15: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HJV

1-Desnaturação inicial

2.1-Desnaturação

2.2-Emparelhamento

dos Olig. Inic.

2.3- Síntese de DNA

3- Extensão final

Nº de ciclos de 2.1 a 2.3

Exão T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP 2 94 5´ 94 45´´ 56 30´´ 72 1´30´´ 72 10´ 35

3 94 5´ 94 45´´ 58 30´´ 72 1´30´´ 72 10´ 35

4 94 5´ 94 45´´ 52 30´´ 72 1´30´´ 72 10´ 35 Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;

III-Materiais e Métodos

- 31 -

Tabela III.16: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene HAMP

1-Desnaturação inicial

2.1-Desnaturação

2.2-Emparelhamento

dos Olig. Inic.

2.3- Síntese de DNA

3- Extensão final

Nº de ciclos de 2.1 a 2.3

Exão T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP PP 95 5´ 95 30´´ 60 30´´ 72 1´ 72 10´ 32

1 95 5´ 95 30´´ 61 30´´ 72 30´´ 72 10´ 32

2+3 94 5´ 94 45´´ 68 30´´ 72 30´´ 72 10´ 40 Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo;

Tabela III.17: Condições de PCR para amplificação dos exões do gene BMP-6

1-Desnaturação inicial

2.1-Desnaturação

2.2-Emparelhamento

dos Olig. Inic.

2.3- Síntese de DNA

3- Extensão final

Nº de ciclos de 2.1 a 2.3

Exão T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP T(ºC) TMP 2 95 5´ 95 30´´ 62 30´´ 72 30´´ 72 10´ 30

3+4 95 5´ 95 30´´ 61 30´´ 72 1´30´´ 72 10´ 30

5+6+7 95 5´ 95 30´´ 61 30´´ 72 1´30´´ 72 10´ 30 Olig. Inic- Oligonucleótidos iniciadores; TMP- tempo.

III.3-Electroforese em gel de agarose

A electroforese em gel de agarose é o método mais vulgarmente utilizado na separação,

identificação e purificação de fragmentos de DNA. Esta técnica baseia-se no facto das

moléculas de DNA, tal como acontece com outras moléculas biológicas, possuírem carga

eléctrica. A detecção dos fragmentos de DNA no gel de agarose é possível através da coloração

com brometo de etídeo (EtBr). Este composto intercala-se entre as bases dos ácidos nucleicos,

emitindo fluorescência quando iluminado com radiação ultravioleta (Lee et al., 2012).

Após a amplificação dos exões dos genes referidos anteriormente realizou-se uma

electroforese em gel de agarose contrastado com EtBr. Os fragmentos de DNA obtidos foram

identificados com o auxílio do marcador de massa molecular DNA ladder 100bp plus da

Applichem ou do marcador HyperLadder II da Bioline (Figura III.11). Em todas as situações, a

preparação do gel foi realizada de modo semelhante, diferindo apenas na concentração de

agarose utilizada que variou entre 1% e 1,5% (p/v) de acordo com as dimensões do fragmento.

Os géis com as amostras e os marcadores já referidos foram sujeitos a electroforese durante

30 minutos a 90 V e foram visualizados sob luz ultravioleta num transiluminador Uvitec

Cambridge. As amostras aplicadas no gel foram preparadas misturando 10 µL de produto de

PCR e 5 µL de azul de bromofenol. Após o visionamento das bandas foi efectuado o registo

fotográfico. Quando a utilização dos produtos de PCR não foi imediata, estes foram

armazenados à temperatura de 4ºC.

III-Materiais e Métodos

- 32 -

Figura III.11: Marcadores de massa molecular. A) Marcador HyperLadder II, num gel de agarose a 1,5%, é descrito o tamanho de cada banda no gel em pb. B) Marcador DNA ladder 100bp plus, num gel de 1,7% de agarose, é igualmente descrito o tamanho de cada banda no gel em pb.

III.4-Purificação dos produtos de amplificação

Os produtos de PCR foram purificados com o objectivo de eliminar os oligonucleótidos

iniciadores, sais, enzimas e nucleótidos não incorporados que se mantêm na mistura de PCR

em conjunto com os fragmentos de DNA amplificados, de modo a não interferirem com o

método de sequenciação automática. Quando a amplificação foi conseguida utilizando tampão

α a purificação foi efectuada através do método de coluna, com recurso ao kit

NucleoSpin®Extract II PCR clean-up, de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de

amplificação que resultaram da amplificação com as outras misturas de reacção foram

purificados com EXOSAP-IT PCR Clean-up kit. Foi adicionado directamente a 5 μL de produto

resultante da amplificação 2,5 μL de EXOSAP-IT, sendo esta mistura posteriormente incubada a

37ºC durante 15 min seguido de 15 min a 80ºC.

Em alguns casos os produtos de purificação foram visualizados em gel de agarose como

descrito anteriormente para confirmar a eliminação dos oligonucleótidos iniciadores e a

quantidade de produto purificado disponível para sequenciar.

III.5-Sequenciação dos produtos purificados

A sequenciação automática é um método que possibilita a identificação de sequências

nucleotídicas assim como de alterações na cadeia de DNA. Esta técnica foi desenvolvida por

Sanger e colaboradores em 1977, e consiste na utilização de bases alteradas quimicamente,

denominadas didesoxi que não possuem o grupo hidroxilo terminal que permitiria a ligação da

base seguinte (Sanger et al., 1977). A reacção de síntese termina sempre que é incorporada na

cadeia uma destas bases alteradas, uma vez que na sua presença não se formam ligações

fosfodiester com o nucleotido seguinte. Estes fragmentos de DNA são separados por

B A

III-Materiais e Métodos

- 33 -

electroforese em função do tamanho e a sequência pode ser lida. A sequenciação automática

assenta nos princípios referidos anteriormente, com algumas diferenças resultantes da

evolução tecnológica. Os didesoxirribonucleotidos terminadores da reacção de sequenciação

são marcados com um fluorocromo na extremidade 3´, que emite radiação quando é atingido

por uma fonte de luz de excitação. Os fragmentos são separados em função do tamanho numa

electroforese capilar durante a qual o aparelho regista a intensidade de fluorescência que é

detectada na janela de leitura para cada um dos canais correspondentes aos terminadores

utilizados. Os dados são posteriormente analisados por um software e no final obtém-se um

electofluorograma da sequência onde é possível identificar os nucleótidos.

A pesquisa de mutações foi efectuada por sequenciação dos produtos de PCR purificados. Os

reagentes utilizados e a ordem pela qual foram adicionados estão descritos na Tabela III.18.

No processo de sequenciação foram utilizados os oligonucleótidos iniciadores das respectivas

reacções de amplificação, a uma concentração de 2pmol/μL para um volume final de 10 μL,

tendo sido os produtos purificados submetidos ao programa descrito na Tabela III.19,

realizado no termocliclador (T1 Thermocycler). Após o processo de sequenciação, os produtos

foram enviados para a unidade de tecnologia e inovação (UTI) do INSA onde foram

precipitados e submetidos a electroforese capilar a fim de se obterem as respectivas

sequências nucleotídicas no dispositivo 3130X Genetic Analyser, Abi Prism (Applied

Biosystems).

Tabela III.18: Condições laboratoriais utilizados por cada reacção para a sequenciação automática

Reagentes Quantidade (em μL)

H2O bidestilada 3,5

Tampão BigDye 3,5

Oligonucleótido iniciador S ou AS (2pmol/ μL) 1

BigDye (Applied BioSystems) 0,5

DNA purificado 1,5 As quantidades dos reagentes estão expressas em μL; 25 ciclos

S- oligonucleótido directo; AS-oligonucleótido inverso;

Tabela III.19: Condições de PCR para a sequenciação automática

Sequenciação Temperatura T(ºC) Tempo

Desnaturação inicial 96 1´

Desnaturação 96 10´´

Emparelhamento dos oligonucleótidos iniciadores

50* 5´´

Síntese de DNA 60 4´

*No PCR para sequenciação dos exões 11+12+13 e 14+15+16 do gene TfR2 a temperatura de emparelhamento dos

oligonucleótidos iniciadores utilizada foi de 60ºC.

III.6-Análise bioinformática

A análise bioinformática consiste na utilização de uma diversidade de bases de dados e de

programas informáticos que permitem análises tão diversas como a identificação de genes e

respectiva estrutura, tradução de sequências de nucleótidos em sequências de aminoácidos,

III-Materiais e Métodos

- 34 -

previsão de estruturas de ácidos nucleicos e de proteínas e de alterações nestas, assim como,

previsão sobre a localização e função de proteínas, entre outras (Saeys et al., 2007).

III.6.1-Análise das sequências nucleotídicas

A análise das sequências foi feita usando o software Chromas versão 2.33 disponível on line

(http://www.technelysium.com.au/chromas.html), de modo a identificar possíveis alterações

nos exões dos genes em estudo.

No caso de se encontrar alterações, recorreu-se às bases de dados Ensemble

(http://www.ensembl.org/index.html), GeneCards ® (http://www.genecards.org/) e PubMed

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) a fim de se verificar se o polimorfismo já havia sido

descrito.

III.6.2-Análise das alterações a nível proteico

A previsão do efeito das alterações encontradas a nível proteico baseou-se na utilização do

programa Polyphen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml). Esta é uma

ferramenta que prevê o possível impacto da substituição de um aminoácido na estrutura e

função da proteína. Esta previsão é baseada em regras empíricas directas que são aplicadas à

sequência e à informação estrutural e filogenética que caracterizam a substituição. De modo a

efectuar as previsões foi calculado através deste programa os modelos HumDiv e HumVar que

permitem avaliar o impacto de uma determinada alteração genética ao nível da proteína. O

primeiro, HumDiv, corresponde a uma compilação de todos os alelos com efeito prejudicial

conhecido sobre a função molecular causadora de doença mendeliana em humanos, presentes

no banco de dados UniProtkB (http://www.uniprot.org/), juntamente com as diferenças entre

as proteínas humanas e as suas homólogas de outras espécies de mamíferos, assumidas como

não prejudiciais. O HumVar é obtido usando todas as mutações que causam doenças em

humanos que estão descritas na base UniProtkB, juntamente com SNPs (polimorfismo de um

nucleótido) comuns que não estão envolvidos em patologias. Com o programa referido

anteriormente foram ainda efectuados alinhamentos das sequências de aminoácidos.

III.6.3-Análise do impacto das alterações nucleotídicas a nível do splicing

Para a previsão das alterações de splicing recorreu-se ao programa Human Splicing Analyser

(http://www.umd.be/HSF/) que é uma ferramenta que prevê os efeitos das mutações nos

sinais de splicing ou identifica estes locais em qualquer sequência humana. Este software

pesquisa sequências de acordo com matrizes de similaridade, determinadas anteriormente, e

que estão associadas a elementos que influenciam o processo de splicing de pré-mRNA

(Desmet et al., 2009).

IV-Resultados

IV-Resultados

- 36 -

IV.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro Neste trabalho foram seleccionados 11 indivíduos com fenótipo de hiperferritinemia grave que

apresentavam níveis de ferritina superiores a 2500 μg/L (Tabela IV.20). Estes indivíduos já

haviam sido rastreados para a existência das mutações comuns no gene HFE, normalmente

associadas a Hemocromatose Hereditária do tipo I. A maioria dos indivíduos (número 3 ao 11

na Tabela IV.20) não apresenta os genótipos considerados de risco nesse gene. Dois desses

indivíduos (número 1 e 2 na Tabela IV.20) apresentam um genótipo de risco para HH (são

homozigóticos para a mutação C282Y) o que pode explicar, em parte, o fenótipo. Contudo, os

níveis de Ferritina destes indivíduos são bastante superiores à média apresentada por doentes

típicos com HH do tipo I, o que sugere que possam ter co-herdado outras mutações em outros

genes relacionados com o metabolismo do ferro que estejam a agravar o fenótipo.

Para a realização da pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do

ferro, nomeadamente no gene HFE, TfR-2, HJV, HAMP e BMP-6, foram escolhidas

metodologias já utilizadas no laboratório. Algumas foram optimizadas e outras implementadas

de novo. Assim, recorreu-se ao DNA dos referidos indivíduos e procedeu-se à amplificação por

PCR das sequências génicas a analisar, tal como descrito no capítulo de materiais e métodos.

Seguiu-se a sequenciação automática dos fragmentos e a leitura das respectivas sequências

que, nalguns casos, revelou a presença de alterações pontuais nalguns dos genes analisados

(Tabela IV.20). As alterações detectadas foram posteriormente estudadas ao nível da

interferência na estrutura proteica e no possível impacto no splicing do respectivo gene.

Tabela IV.20: Características dos indivíduos em estudo, genótipo HFE e outros genes onde foram detectadas alterações

Indivíduo Sexo

Idade (anos)

Ferritina sérica (µg/L)

:15-200

:30-300

Ferro (µg/dL)

:35-140

:50-175

Saturação Transferrina

(%)

:20-50

:20-60

Gene HFE Gene/s Alterados

* H63D C282Y

1 F 56 8000 270 91 HH YY BMP-6 TfR-2

2 M 48 3900 - - HH YY HJV

3 M 33 3499 272 73 HD CC -

4 F 31 3728 - - HD CC BMP-6

5 M 61 5026 165 61 HH CC -

6 M 71 3977 114 31 HH CY -

7 M 49 5390 154 - HD CC -

8 F 44 2823 39 - HH CC -

9 F 29 3488 64 - HD CC -

10 M 50 9567 302 100 DD CC BMP-6 e TfR2

11 M ** 4000 - - HD CC BMP-6

*Gene/s relacionados com o metabolismo do Fe onde se encontraram alterações;

**Sem referência da idade do indivíduo; HD- Heterozigotia para a H63D; DD- Homozigotia para a H63D; HH- Indivíduo sem mutação H63D; CY- Heterozigotia para a C282Y; YY- Homozigotia para a C282Y; CC- Indivíduo sem mutação C282Y;

Valor de Referência para indivíduos do sexo feminino;

Valor de Referência para indivíduos do sexo masculino;

IV-Resultados

- 37 -

IV.2-Pesquisa de alterações no gene HJV

IV.2.1-Alteração P124L

Após a aplicação da metodologia descrita no capítulo de materiais e métodos, no caso da

amostra do indivíduo 2 (portador da mutação C282Y em homozigotia) foi observada uma

alteração no exão 3 do gene HJV.

A sequenciação automática do fragmento de DNA amplificado com 681 pb, englobando o exão

3 do gene HJV (Figura IV.12; A e B) revelou uma transição C→T, em heterozigotia, no codão

124 (c.371 C→T), que tem como consequência a alteração do resíduo de prolina (CCT) para um

de leucina (CTT). Esta alteração não se encontra identificada na base de dados Ensemble

(http://www.ensembl.org/index.html consultado a 22-08-12), no GeneCards ®

(http://www.genecards.org/ consultado a 22-08-12) nem no PubMed

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed consultado a 22-08-12).

Figura IV.12: Detecção e identificação da alteração P124L no exão 3 do gene HJV: A) Amplificação do material genético visível em gel de agarose. B) Electroferograma da reacção de sequenciação automática. M-Marcador corresponde ao marcador de peso molecular HyperLadder II; C/N-Controlo negativo que corresponde a uma reação de PCR realizada na ausência de DNA; A amostra número 2 corresponde ao indivíduo número 2 na Tabela IV.20.

pb

2000 1000

300

B P124L

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 C/N A

IV-Resultados

- 38 -

IV.2.1.1-Estudo do impacto da alteração P124L na proteína HJV

As sequências de aminoácidos das proteínas HJV de um grupo de espécies de mamíferos

diferentes (Figura IV.13) foram alinhadas utilizando a ferramenta bioinformática PolyPhen-2.

Neste alinhamento foi ainda incluída a sequência peptídica humana, tendo-se verificado que o

aminoácido nativo (P124) é altamente conservado entre espécies.

Figura IV.13: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína HJV de 10 espécies de mamíferos diferentes, utilizando o software PolyPhen-2. Homo sapiens-Homem; Oryctolagus cuniculus-Coelho; Tursiops truncates-Golfinho; Felis catus-Gato; Loxodonta africana-Elefante; Tarsius syrichta-Tarsius; Bos taurus-Boi; Canis familiaris-Cão; Microcebus murinus- Rato lemur; Cavia porcellus- Porquinho-da-índia.

O programa Polyphen-2 foi também utilizado para calcular os modelos HumDiv e HumVar

(Figura IV.14) que permitem prever a influência da alteração provocada pela mutação na

proteína, ou seja o seu impacto na patogenicidade da proteína. Neste caso pretende-se

compreender em que medida a alteração P124L poderá interferir na estrutura final da HJV. No

modelo HumDiv esta alteração apresentou um score de 0,978 e no modelo HumVar de 0,913

indicando ambos uma previsão de impacto nocivo desta alteração ao nível da proteína.

Figura IV.14: Previsão da patogenicidade da alteração P124L na proteína HJV através do programa Polyphen-2.

IV.2.1.2- Estudo do impacto da alteração a nível do splicing

Embora a mutação P124L no gene HJV seja do tipo missense, ou seja com um impacto directo

de alteração de codão no gene e de aminoácido na proteína, há sempre a possibilidade deste

tipo de mutações poder também afectar, de algum modo, o processo de splicing. Esta hipótese

foi também analisada através de um estudo in silico. Assim, o estudo do efeito da alteração

P124L

IV-Resultados

- 39 -

c.371 C→T (P124L) a nível dos sinais de splicing foi efectuado usando o software Human

Splicing Finder (Tabela IV.21). Desta análise verificou-se que não surgiu nenhum novo local

aceitador ou dador de splicing e que desapareceu um motivo enhancer e um silencer, existindo

ainda o aparecimento de um silencer com score de 61,36.

Tabela IV.21: Descrição dos fenómenos de splicing provocados pela alteração c.371 C→T em comparação com os fenómenos que ocorrem na forma nativa do RNA de HJV

Sinais de splicing Score da sequência nativa

(0-100)

Score da sequência alterada (0-100)

Variação (%)

Local aceitador de Splicing

81,25 80,6 -0,8

Branch Point 77,51 86,54 +11,65

Motivo enhancer 83,04 - Desaparece

90,90 93,05 Mantem-se

Motivo silencer - 61,36 Novo

67,64 - Desaparece

IV.3-Pesquisa de alterações no gene BMP-6

IV.3.1-Alteração c.857+12 C→T

Na amostra do indivíduo número 1 (portador da mutação C282Y em homozigotia), foi

observada uma alteração na região intrónica a jusante do exão 2 do gene BMP-6, ou seja, no

intrão 2 deste gene.

Após a reacção de PCR que visou amplificar o exão e intrão 2 do referido gene, o produto foi

sujeito a uma electroforese em gel de agarose, permitindo a visualização do fragmento de 411

pb (Figura IV.15.A). Posteriormente, a sequenciação automática (Figura IV.15.B) permitiu a

identificação de uma transição C→T na IVS2. Encontrou-se esta alteração em heterozigotia na

posição +12 (c.857+12C→T), ou seja, 12 desoxirribonucleótidos após o final do exão 2 do

referido gene.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/N

2000

100

pb

1000

300

A

IV-Resultados

- 40 -

Figura IV.15: Detecção e identificação da alteração c.857+12 C→T a jusante do exão 2 do gene BMP-6. A) Amplificação do material genético visível em gel de agarose. B) Electroferograma da reacção de sequenciação automática. M-Marcador corresponde ao marcador de peso molecular HyperLadder II; C/N-Controlo negativo que corresponde a uma amplificação feita sem DNA; A amostra número 1 corresponde ao indivíduo número 1 na Tabela IV.20.

Esta alteração já havia sido identificada anteriormente com a referência rs2241669

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2241669).

IV.3.1.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing

A análise do efeito da alteração c.857+12 C→T a nível do splicing não revelou alterações ao

nível dos locais aceitadores/dadores de splicing nem alterações significativas ao nível dos

scores dos motivos enhancer e silencer (Tabela IV.22).

Tabela IV.22: Descrição do efeito da alteração c.857+12 C→T no splicing do RNA de BMP-6

Sinais de splicing Score da sequência nativa

(0-100)

Score da sequência alterada (0-100)

Variação (%)

Local aceitador de Splicing

70,57 69,91 -0,94

67,86 67,25 -0,9

Branch Point Não surgem diferenças

Motivo enhancer 86,72 82,05 Mantem-se

73,91 82,05 Mantem-se

Motivo silencer 63,18 63,18 Mantem-se

B

IV-Resultados

- 41 -

IV.3.2-Alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C

No exão 4 do gene BMP-6 foram detectadas duas alterações presentes simultaneamente no

indivíduo 4 (portador da mutação H63D em heterozigotia) e no indivíduo número 10 (portador

da mutação H63D em homozigotia).

Após as amostras de DNA terem sido sujeitas à reacção de PCR, confirmou-se a amplificação

do fragmento do exão 4 do gene BMP-6 com o tamanho esperado (1216 pb) (Figura IV.16.A).

A sequenciação automática destes fragmentos (Figura IV.16.B e C) revelou uma transição de

C→T, em heterozigotia no nucleótido 1029 (c.1029 C→T), que altera o codão GCC para GCT.

Essa alteração não tem consequência ao nível da alteração dos aminoácidos, sendo que ambos

os codões codificam o aminoácido alanina. No mesmo fragmento (Figura IV.16.D e E) foi ainda

identificada uma transversão de G→C, em heterozigotia no nucleótido 1104 (c.1104 G→C),

que altera o codão GTG para GTC. Contudo esta alteração não tem, mais uma vez,

consequência ao nível da alteração dos aminoácidos, sendo que ambos os codões codificam

uma valina.

Ambas as alterações, c.1029 C→T e c.1104 G→C, já se encontram descritas correspondendo,

respectivamente, às referências rs61733611 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/

snp_ref.cgi?rs=rs61733611) e rs17557 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?search

Type=adhoc_search&type=rs&rs=rs17557).

1000

2000

300

pb A

B C

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/N

IV-Resultados

- 42 -

Figura IV.16: Detecção e identificação das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no gene BMP-6. A) Amplificação do material genético, visível em gel de agarose, do exão 3, do intrão 3 e exão 4 do gene BMP-6. B e C) Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos número 4 e número 10, respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1029 C→T. D e E) Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos número 4 e número 10, respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1104 G→C. M-Marcador corresponde ao marcador de peso molecular HyperLadder II; C/N-Controlo negativo que corresponde a uma amplificação feita sem DNA; As amostras número 3 e 9 correspondem, respectivamente, aos indivíduos número 4 e 10 na Tabela IV.20.

IV.3.2.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing

Dado que a alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C, apesar de encontradas na região

codificante, não geram substituição de aminoácidos, o impacto destas nos sinais de splicing foi

analisado (Tabela IV.23). No que diz respeito à alteração c.1029 C→T verificou-se que não

surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, no entanto, os scores obtidos para

locais aceitadores putativos previamente existentes aumentaram ligeiramente. Os motivos

enhancer mantêm-se todos e verifica-se o aparecimento de dois novos motivos silencer com

scores de 60,99 e 62,45. Por sua vez a alteração c.1104 G→C não cria nenhum local novo

aceitador ou dador de splicing, no entanto leva à eliminação de dois motivos enhancer (scores

de 74,38 e 78,38 na sequência nativa) e ao aparecimento de um novo com score mais elevado

de 84,76.

D E

IV-Resultados

- 43 -

Tabela IV.23: Descrição do efeito das alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C no splicing do RNA de BMP-6

Alteração Sinais de splicing Score da sequência nativa

(0-100)

Score da sequência alterada (0-100)

Variação (%)

c.1029 C→T Local aceitador de Splicing

78,03 78,88 +1,08

85,51 86,4 +1,05

Branch Point 80,56 56,72 Desaparece

Motivo enhancer - 76,09 Novo

77,50 76,77 Mantem-se

82,22 80,36 Mantem-se

87,46 75,65 Mantem-se

81,01 75,65 Mantem-se

Motivo silencer 65,60 72,1 Mantem-se

- 60,99 Novo

- 62,45 Novo

c.1104 G→C Local aceitador de Splicing

73,94 70,07 -5,23

Branch Point Não surgem diferenças

Motivo enhancer - 84,76 Novo

74,38 - Desaparece

78,16 - Desaparece

Motivo silencer 80,20 70,18 Mantem-se

IV.3.3-Alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C

Foram encontradas duas alterações a jusante do exão 5 do gene BMP-6, ou seja no intrão 5.

A alteração c.1281+24 T→C estava presente nos indivíduos número 1 (homozigótico para a

mutação C282Y), 4 e 11 (portadores da mutação H63D em heterozigotia) e 10 (homozigótico

para a mutação H63D). No que diz respeito ao indivíduo número 1 esta alteração foi

encontrada em homozigotia enquanto nos outros se verificou estar em heterozigotia. A

segunda alteração encontrada nesta região, c.1281-197 T→C, estava presente nos indivíduos

1, 4 e 10. Sendo que o indivíduo 1 é o único que a possui no estado homozigótico.

Após a reacção de PCR, a análise em gel de agarose permitiu a visualização das bandas que

correspondem à amplificação do fragmento de 1449 pb, correspondente ao exão 5, 6 e 7 do

gene BMP-6 (Figura IV.17.A). De seguida, a sequenciação automática (Figura IV.17.B, C, D e E)

permitiu a identificação de uma transição T→C na IVS5, na posição +24 (c.1281+24 T→C), ou

seja, 24 desoxirribonucleótidos a jusante do exão 5 do referido gene. A sequenciação

automática (Figura IV.17.F, G e H) da mesma região permitiu ainda a identificação da transição

T→C na IVS5 localizada na posição c.1281-197 T→C, ou seja, 197 desoxirribonucleótidos a

montante do exão 6.

IV-Resultados

- 44 -

B C D

E F G

pb

1449

A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/N

IV-Resultados

- 45 -

Figura IV.17: Detecção e identificação das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C no gene BMP-6. A) Amplificação do material genético visível em gel de agarose do exão 4, 5 e 6 e do intrão 4 e 5 do gene BMP-6. B, C, D e E) Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos número 1, 4, 10 e 11 respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1281+24 T→C. F, G e H) Electroferograma da reacção de sequenciação automática dos indivíduos número 1, 4 e 10, respectivamente, que permitiu a detecção da alteração c.1281-197 T→C. C/N-Controlo negativo que corresponde a uma amplificação feita sem DNA; As amostras número 1, 3, 9 e 10 correspondem, respectivamente, aos indivíduos número 1, 4, 10 e 11 na Tabela IV.20.

A alteração c.1281+24 T→C já havia sido identificada anteriormente e designada pela

referência rs267172 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=267172). Por

outro lado, a alteração c.1281-197 T→C não havia sido ainda descrita.

IV.3.3.1-Estudo do impacto das alterações a nível do splicing

O impacto destas duas alterações (c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C) foi analisado ao nível do

impacto destas nos sinais de splicing (Tabela IV.24). Relativamente à alteração c.1281+24 T→C

verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, para além disso,

surgiram dois novos motivos enhancer com scores de 80,86 e de 80,96. Por sua vez a alteração

c.1281-197 T→C também foi analisada recorrendo ao human splicing finder. Desta análise

verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, sendo que o

local dador de splicing da sequência alterada apresenta um score de 39,28 enquanto o da

sequência nativa é de 66,11. Para além disso, verifica-se o aparecimento de um motivo

enhancer e o desaparecimento de um motivo silencer.

H

IV-Resultados

- 46 -

Tabela IV.24: Descrição do efeito das alterações c.1281+24 T→C e c.1281-197 T→C no splicing do RNA de BMP-6

Alteração Sinais de splicing Score da sequência nativa

(0-100)

Score da sequência alterada (0-100)

Variação (%)

c.1281+24 T→C Local aceitador de Splicing

70,39 69,49 -1,27

Branch Point Não surgem diferenças

Motivo enhancer 75,41 76,83 Mantem-se

82,46 84,31 Mantem-se

- 80,86 Novo

- 80,96 Novo

Motivo silencer 66,91 66,91 Mantem-se

76,27 72,92 Mantem-se

c.1281-197 T→C Local aceitador de Splicing

83,23 81,98 -1,51

Local dador de Splicing

66,11 39,28 -40,59

Branch Point Não surgem diferenças

Motivo enhancer 79,72 81,13 Mantem-se

- 76,77 Novo

Motivo silencer 75,18 77,21 Mantem-se

62,75 - Desaparece

IV.3.4-Alteração c.1542+4 G→A

No indivíduo número 10 (portador da mutação H63D em homozigotia) foi observada outra

alteração, esta na região 3´-UTR do exão 7 do gene BMP-6.

A sequenciação automática deste fragmento (Figura IV.18) permitiu identificar uma transição

G→A no exão 7, em heterozigotia, na posição +4, ou seja, 4 desoxirribonucleótideos depois do

codão de terminação do referido gene. Verificou-se ainda, que esta alteração não havia sido

identificada anteriormente nas bases de dados consultadas.

Figura IV.18: Detecção e identificação da alteração c.1542+4 G→A no gene BMP-6. Electroferograma da reacção de sequenciação automática no indivíduo número 10.

IV-Resultados

- 47 -

IV.3.4.1-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing

Verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de splicing, e surgiu um

novo Branch Point, assim como um motivo enhancer, este último com score de 82,10 (Tabela

IV.25).

Tabela IV.25: Descrição do efeito da alteração c.1542+4 G→A no splicing do RNA de BMP-6

Sinais de splicing Score da sequência nativa

(0-100)

Score da sequência

mutada (0-100)

Variação (%)

Local aceitador de Splicing

78,4 78,33 -0,08

Branch Point 52,64 82,27 Novo

Motivo enhancer 83,11 - Desaparece

- 82,10 Novo

Motivo silencer 62,23 62,23 Mantem-se

IV.4-Pesquisa de mutações no gene TfR2

IV.4.1-Alteração c.1851 C→T

No presente estudo verificou-se a existência de uma alteração no gene TfR2 no exão 16,

presente na mostra do indivíduo número 10. Inicialmente, o material genético após ter sido

sujeito a uma reacção de PCR foi analisado numa electroforese em gel de agarose (Figura

IV.19.A). Esta análise permitiu a confirmação da amplificação do fragmento com 686 pb que

resulta da amplificação dos exões 14, 15 e 16 do gene TfR2 e dos respectivos intrões. Foi

identificada, recorrendo à sequenciação automática (Figura IV.19.B), uma transversão G→T no

exão 16, em heterozigotia, que altera o codão 617 de GCC para GCT, sendo que ambos

codificam uma alanina.

Esta alteração havia já sido identificada anteriormente e identificado pela referência

rs2075674 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2075674).

pb

1500 1000

500

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/N

IV-Resultados

- 48 -

Figura IV.19: Detecção e identificação da alteração c.1851 C→T no exão 16 do gene TfR2. A) Amplificação do material genético visível em gel de agarose do exão 14, 15 e 16 e dos respectivos intrões. B) Electroferograma da reacção de sequenciação automática. M-Marcador, corresponde ao marcador de peso molecular DNA ladder 100bp plus; C/N-Controlo negativo que corresponde a uma amplificação feita sem DNA; A amostra número 9 corresponde ao indivíduo número 10 na Tabela IV.20.

IV.4.1.1-Estudo do impacto da alteração ao nível do splicing

Com esta análise verificou-se que não surgiu nenhum novo local aceitador ou dador de

splicing, desapareceu um motivo enhancer que na forma nativa tinha um score de 80,00 e

surgiu um novo motivo silencer com score de 63,28 (Tabela IV.26).

Tabela IV.26: Descrição do efeito da alteração c.1851 C→T no splicing do RNA de TfR2

Score da sequência nativa

(0-100)

Score da sequência alterada (0-100)

Variação (%)

Local aceitador de Splicing

82,73 83,44 +0,86

Branch Point Não surgem diferenças

Motivo enhancer 78,12 82,05 Mantem-se

84,69 70,77 Mantem-se

80,72 70,77 Mantem-se

80,00 - Desapareceu

75,65 80,97 Mantem-se

Motivo silencer - 63,28 Novo

63,36 73,23 Desapareceu

IV.4.2-Alteração R752H

No caso da amostra do indivíduo 1 (homozigótico para a mutação C282Y), para além das

alterações já referidas, foi detectada uma alteração no exão 18 do gene TfR2.

O DNA do indivíduo em estudo foi sujeito a uma reacção de PCR, em seguida a análise em gel

de agarose permitiu a observação da banda que resultou da amplificação do exão 18 do gene

TfR2 (Figura IV.20.A), fragmento esse com 434 pb. A sequenciação automática (Figura IV.20.B)

B

IV-Resultados

- 49 -

revelou uma transição G→A, em heterozigotia no codão 752 (c.2255 G→A), que tem como

consequência a alteração do resíduo de arginina (CGC) para um de histidina (CAC).

Esta alteração já se encontra identificada pela designação rs41295942

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=rs41295942)

Figura IV.20: Detecção e identificação da alteração R752H no exão 18 do gene TfR2. A) Amplificação do material genético visível em gel de agarose. B) Electroferograma da reacção de sequenciação automática. M-Marcador, corresponde ao marcador de peso molecular HyperLadder II; C/N-Controlo negativo que corresponde a uma amplificação feita sem DNA; I1- Indivíduo número 1; A amostra número 1 corresponde ao indivíduo número 1 na Tabela IV.20.

VI.4.2.1-Estudo do impacto da alteração R752H na proteína TfR2

Realizou-se um alinhamento da sequência de aminoácidos da proteína TfR2 de um grupo de

espécies de mamíferos diferentes (Figura VI.21), no programa bioinformático PolyPhen-2.

Neste alinhamento foi ainda incluída a sequência peptídica humana, tendo-se verificado que o

aminoácido nativo (R752) é altamente conservado entre as diferentes espécies.

A

B

2000 1000

300

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C/N

IV-Resultados

- 50 -

*Sequências previstas

Figura VI.21: Alinhamento de sequências de aminoácidos da proteína TfR2 de espécies de mamíferos diferentes, utilizando o software PolyPhen-2. Homo sapiens-Homem; Equus caballus-Cavalo; Oryctolagus cuniculus-Coelho; Sus scrofa-Javali; Canis familiaris-Cão; Canis lupus-Lobo; Bos taurus-Boi; Loxodonta africana-Elefante.

O programa Polyphen-2 foi também utilizado para calcular os modelos HumDiv e HumVar

(Figura IV.22) de modo a prever a influência da alteração provocada pela alteração na

proteína. O modelo HumDiv apresentou um score de 1 e o HumVar de 0,980, valores que

indicam uma levada probabilidade desta alteração levar a modificações graves na proteína

TfR2.

Figura IV.22: Previsão da patogenicidade da alteração R752H na proteína TfR2 através do programa

Polyphen-2.

IV.4.2.2-Estudo do impacto da alteração a nível do splicing

Da análise efectuada aos potenciais sinais de splicing verificou-se que não surgiu nenhum novo

local aceitador ou dador de splicing mas que desapareceu um motivo enhancer e um motivo

silencer (Tabela VI.27).

R752H

IV-Resultados

- 51 -

Tabela VI.27: Descrição do efeito da alteração c.2255 G→A no splicing do RNA de TfR2

Score da sequência nativa

(0-100)

Score da sequência alterada (0-100)

Variação (%)

Local aceitador de Splicing

81,84 81,73 -0,14

Branch Point Não surgem diferenças

Motivo enhancer 72,31 - Desaparece

77,07 72,31 Mantem-se

74,54 72,31 Mantem-se

Motivo silencer 62,75 - Desaparece

77,39 76,12 Mantem-se

V-Discussão dos Resultados

V-Discussão dos Resultados

- 53 -

V.1-Pesquisa de mutações em genes relacionados com o metabolismo do ferro Nos 11 casos seleccionados para este estudo, foram detectadas 9 alterações pontuais das

quais 2 são missense e 7 SNPs (polimorfismo de um nucleótido). Das alterações detectadas, 6

estão já descritas enquanto as restantes 3 são reportadas pela primeira vez neste trabalho

(P124L no gene HJV, c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A no gene BMP-6). Do total das

alterações identificadas, 4 são recorrentes na amostra testada, ou seja, foram encontradas em

mais do que um indivíduo. A localização das alterações encontra-se esquematizada na Figura

V.23.

Figura V.23: Esquema representativo dos genes estudados e da localização das alterações encontradas. As caixas a azul representam os exões do gene HJV, BMP-6 e TfR2.

A Tabela V.28 resume os resultados obtidos relativamente às mutações detectadas nos

diferentes indivíduos. Verificou-se que dos 11 indivíduos testados apenas 5 se mostraram

portadores de mutações nos genes HJV, BMP-6 ou TfR2. De seguida, discute-se

pormenorizadamente cada uma das situações.

HJV

BMP-6

TfR2

Alteração missense SNPs

V-Discussão dos Resultados

- 54 -

Tabela V.28: Alterações moleculares identificadas neste estudo

Indivíduo nº

Genótipo HFE Genes onde se

identificou alteração

Alterações no DNA

Localização Alelos afectados

Mutação na

proteína

1 HH YY BMP-6 c.857+12 C→T Intrão 2 +/- -

c.1281+24 T→C

Intrão 5 +/+

c.1281-197* T→C

Intrão 5 +/+

TfR2 c.2255 G→A Exão 18 +/- R752H

2 HH YY HJV c.371 C→T * Exão 3 +/- P124L

3 HD CC S.A. - - -

4 HD CC BMP-6 c.1281+24 T→C

Intrão 5 +/- -

c.1281-197 T→C*

Intrão 5 +/-

c.1029 C→T Exão 4 +/- A343A

c.1104 G→C Exão 4 +/- V368V

5 HH CC S.A. - - - -

6 HH CY S.A. - - - -

7 HD CC S.A. - - - -

8 HH CC S.A. - - - -

9 HD CC S.A. - - - -

10 DD CC BMP-6 c.1281+24 T→C

Intrão 5 +/- -

c.1281-197 T→C*

Intrão 5 +/-

c.1029 C→T Exão 4 +/- A343A

c.1104 G→C Exão 4 +/- V368V

c.1542+4 G→A *

Região 3´UTR do

exão 7

+/- -

TfR2 c.1851 C→T Exão 16 +/- A617A

11 HD CC BMP-6 c.1281+24 T→C

Intrão 5 +/- -

HD- Heterozigotia para a H63D; DD- Homozigotia para a H63D; HH- Indivíduo sem mutação H63D; CY- Heterozigotia para a C282Y; YY- Homozigotia para a C282Y; CC- Indivíduo sem mutação C282Y; S.A.-Sem Alterações

*-Alterações descritas pela primeira vez neste estudo;

+/+ Alteração encontrada em homozigotia; +/- Alteração encontrada em heterozigotia;

V.2-Discussão da relação genótipo / fenótipo nos diversos casos analisados

V.2.1-Caso 1

O caso número 1 corresponde a um indivíduo do sexo feminino com 56 anos de idade com

8000 µg/L de ferritina. Este indivíduo possui um genótipo de risco para o desenvolvimento de

Hemocromatose Hereditária do tipo I visto ser homozigótico para C282Y. Contudo o facto de

ser mulher, ainda relativamente jovem, e ter um nível elevadíssimo de ferritina levou-nos a

seleciona-la para análise de mutações em outros genes relacionados com o metabolismo do

V-Discussão dos Resultados

- 55 -

ferro. A co-herança do genótipo de risco em HFE com mutações em outros genes relacionados

com o metabolismo do ferro já tem sido descrita na literatura como um factor agravante do

fenótipo de Hemocromatose (Biasiotto et al., 2004; Van Dijk et al., 2007). Esta análise levou à

identificação de 4 alterações diferentes nos genes em estudo, 3 delas presentes no BMP-6 e

uma no TfR2.

No gene BMP-6 foi detectada a alteração c.857+12 C→T no estado heterozigótico, localizada a

jusante do exão 2 deste gene. A análise de splicing (Tabela IV.22) revelou que esta alteração

não leva a alteração dos locais aceitadores ou dadores de splicing, para além de não implicar

nenhuma alteração do Branch Point assim como dos scores dos motivos enhancer e silencer.

Deste modo, é pouco provável que promova alterações no splicing, como sejam mecanismos

de splicing alternativo. Esta alteração havia já sido descrita na base de dados do PubMed com

uma frequência de alelo minor, T, de 10,3% (MAF: minor allele frequency). Este é um conceito

que se refere à frequência na qual o alelo menos comum para cada polimorfismo ocorre numa

determinada população e tem sido amplamente empregado em estudos de análise do

genoma. A população utilizada para a determinação da MAF para esta alteração, 1000Genome

phase 1, engloba a análise de 1094 indivíduos provenientes de várias partes do mundo. Em

suma, podemos então concluir que esta alteração se trata de um polimorfismo de um

nucleótido (SNP), o qual não parece ter associação a patologia.

Neste mesmo indivíduo foram também encontradas no gene BMP-6 as alterações c.1281+24

T→C e c.1281-197 T→C em estado homozigótico, localizadas na região intrónica a jusante do

exão 5 do gene BMP-6. A alteração c.1281+24 T→C está já descrita no PubMed, com uma MAF

(alelo C) de 34,9% (1000Genome phase 1), sendo assim um polimorfismo muito frequente. A

análise de splicing (Tabela IV.24) efectuada para este polimorfismo revela que esta alteração

não leva à modificação dos locais aceitadores ou dadores de splicing, assim como do Branch

Point. Contudo, verifica-se o aparecimento de dois motivos enhancer cujos scores não

ultrapassam os 81%. Dado que este local na sequência nativa tinha já um consenso elevado

para a presença de motivos enhancer, pode concluir-se que os dois novos motivos que aqui

aparecem não deverão influenciar grandemente o mecanismo de splicing.

Por outro lado, a alteração c.1281-197 T→C em BMP-6 não se encontra descrita no PubMed. A

análise do efeito desta alteração ao nível do splicing (Tabela IV.24) revelou que esta leva à

diminuição acentuada do score de um local dador de splicing de 66,11 para 39,28 na presença

da mutação, não se tendo verificado alterações ao nível do Branch Point. Verificou-se ainda

que esta também leva ao aparecimento de um motivo enhancer e ao desaparecimento de um

motivo silencer (ambos com valores de score baixos). O facto de se verificar a grande

diminuição do score para o local dador de splicing, conferida pelo polimorfismo, apenas

poderá ter significado biológico no caso de naturalmente ocorrer alguma variante de splicing

do BMP-6, a qual resulte da inclusão parcial do intrão 5 até sensivelmente à posição c.1281-

197. Contudo, não se encontra descrito na literatura qualquer referência a mecanismos de

splicing alternativo associados ao BMP-6. Assim parece pouco provável que haja qualquer

influência deste polimorfismo no fenótipo de sobrecarga em ferro deste indivíduo.

Para além das alterações acima descritas foi ainda detectada no indivíduo número 1 a

alteração R752H (c.2255 G→A) no gene TfR2. Esta alteração já foi previamente descrita com

V-Discussão dos Resultados

- 56 -

uma MAF associada ao alelo A de 9% (Pubmed). Ao nível proteico conduz à substituição do

aminoácido arginina pelo aminoácido histidina. A arginina é um aminoácido polar com carga

positiva e índice de hidrofobicidade de -4,5, enquanto a histidina é polar, tem carga neutra e

tem um índice de hidrofobicidade de -3,2 (http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid

consultado a 04-09-12). O facto de ambos os aminoácidos serem hidrofílicos não leva a uma

previsão de alteração ao nível do folding da proteína. Contudo, o alinhamento múltiplo (Figura

IV.20) realizado para a zona desta mutação, revelou que o resíduo R752 é muito conservado

em termos evolutivos, pelo que poderia ser importante para a função da proteína. Esta

previsão é corroborada pelos scores obtidos pelos modelos HumDiv e HumVar indicando um

impacto potencialmente patogénico associado a esta alteração (Figura IV.21).

No que diz respeito ao seu impacto ao nível do processamento do RNA (Tabela IV.27),

verificou-se que esta alteração não deverá estar implicada em mecanismos de splicing

alternativo, uma vez que não origina novos locais aceitadores ou dados de splicing. Mais ainda

as variações detectadas nos motivos silenciadores e enhancer de splicing não são consideradas

significativas.

Em suma, existem dados obtidos neste estudo que indicam um possível impacto negativo da

R752H ao nível da estrutura (e possivelmente da funcionalidade) da proteína TfR2. Contudo,

um estudo previamente publicado, no qual foi analisada uma amostra de 51 indivíduos com

sobrecarga em ferro, concluiu que a frequência desta alteração era semelhante neste grupo de

indivíduos quando comparada com a obtida para o grupo controlo (Santos et al., 2011). Foi,

deste modo, descartada a hipótese por estes autores de este polimorfismo estar associado à

sobrecarga em ferro nos indivíduos que dela são portadores. No entanto, não se pode

descartar por completo que tenha esse efeito num indivíduo que, já por si, é afectado pela

homozigotia da mutação C282Y no gene HFE (que é o caso do indivíduo número 1). Está

descrito que num estado fisiológico, a proteína HFE se encontra associada ao receptor TfR1 ao

nível da membrana celular. Aquando de um aumento dos níveis circulantes de ferro supõe-se

que a proteína HFE se dissocie deste receptor e passe a associar-se ao TfR2, desencadeando

uma cascata de sinalização que culmina com o aumento da expressão de hepcidina no fígado

(Schmidt et al., 2009). É ainda hipotizado que a TfR2 possa ainda estar envolvido na activação

da expressão da hepcidina por um mecanismo independente da HFE. Efectivamente, o

knockdown conjunto de HFE e TfR2 gera um fenótipo mais grave do que o knockdown

individual de cada um destes genes (Wallace et al., 2009). Deste modo, uma alteração no

estado heterozigótico ao nível do gene do TfR2 poderá não ter um efeito notório num

indivíduo sem alterações no gene HFE, no entanto podemos levantar a hipótese de um efeito

patológico aditivo no caso deste indivíduo com mutações em HFE.

Em suma, a heterozigotia para a R752H em TfR2 aliada à homozigotia para a C282Y em HFE

poderá estar na causa da elevadíssima hiperferritinémia do indivíduo 1. No entanto, será

necessária a realização de estudos funcionais relativamente à mutação R752H para confirmar

esta hipótese.

V-Discussão dos Resultados

- 57 -

V.2.2-Caso 2

Na amostra do caso número 2, correspondente a um indivíduo do sexo masculino de 48 anos,

com o genótipo de risco no gene HFE e com um valor de ferritina sérica de 3900 µg/L, foi

detectada por sequenciação automática a alteração c.371C→T, localizada no exão 3 do gene

HJV.

Esta alteração no DNA leva à substituição do aminoácido prolina pelo aminoácido leucina na

proteína (P124L). A prolina é um aminoácido apolar, com carga neutra e com índice de

hidrofobicidade de -1,6, enquanto a leucina, também apolar de carga neutra, tem um índice de

hidrofobicidade positivo de 3,8. (http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid consultado a 31-08-

12). O índice de hidrofobicidade dos aminoácidos é muito relevante no folding das proteínas.

Os aminoácidos com este índice positivo têm características hidrofóbicas, por outro lado, os

que apresentam índices negativos são hidrofílicos. Assim sendo, a diferença de hidrofobicidade

entre os aminoácidos resultantes da mutação P124L podem alterar a conformação da proteína

HJV, uma vez que os resíduos hidrofóbicos tendem a localizar-se no interior da proteína,

enquanto os hidrofílicos a ser expostos ao contacto com o ambiente aquoso.

A informação obtida no alinhamento de sequências homólogas em espécies diferentes é

reconhecido como um factor importante para compreender a variação genética em humanos

(Miller and Kumar, 2001). Num determinado conjunto de sequências, uma fracção de

aminoácidos está conservada mesmo entre espécies distantes que divergiram há milhares de

anos. Ao longo da evolução as variações que aparecem nessas posições conservadas estiveram

sob uma pressão selectiva muito forte, sugerindo que esses resíduos de aminoácidos são

críticos para a função da proteína. Assim, o resultado de alinhamentos múltiplos

interespecíficos pode ser informativo de quais as regiões proteicas mais susceptíveis a

promover o desenvolvimento de uma doença quando estão mutadas em humanos. O

alinhamento múltiplo (Figura IV.12) realizado para a zona desta alteração, revelou que a P124

é um resíduo muito conservado, pelo que poderá ser importante para a função da proteína.

A alteração c.371 C→T localiza-se no exão 3 do gene, local que codifica para 3 domínios

distintos da proteína HJV: um péptido de sinal, um domínio RGD (repulsive guidance domain) e

um factor de von Willebrand. Mutações nestes locais podem comprometer a interacção com

as integrinas durante a interação proteína-célula, o que pode causar uma diminuição ou uma

perda de função por parte da proteína HJV (Giancotti, 1999). No nosso caso em estudo, a

probabilidade desta alteração causar mudanças significativas na proteína foi ainda evidenciada

pelos scores (HumDiv e HumVar) calculados pelo Polyphen-2 (Figura IV.13). Concluímos assim,

através da análise dos diversos resultados referentes à proteína que, a nova mutação P124L

em HJV, terá muito provavelmente, efeito negativo sobre a funcionalidade da HJV.

A análise efectuada pelo software Human Splicing Finder (Tabela IV.21) revelou que esta

mutação provavelmente não estará implicada em processos de splicing alternativo, uma vez

que não são originados novos locais aceitadores ou dadores de splicing. Verifica-se ainda que

surge um novo motivo silenciador de splicing mas este apresenta um score muito baixo para

ser considerado relevante.

V-Discussão dos Resultados

- 58 -

Deste modo, provavelmente, a heterozigotia para a nova mutação P124L em HJV aliada à

homozigotia para a C282Y em HFE pode justificar o fenótipo apresentado por este indivíduo

(Tabela IV.20). Estão também já descritos na literatura alguns casos nos quais alterações em

heterozigotia nos genes HJV e HAMP estão associados ao agravamento do fenótipo de

hemocromatose em indivíduos homozigóticos para a C282Y ou compostos heterozigóticos

H63D/C282Y (Biasiotto et al., 2004; Van Dijk et al., 2007).

V.2.3-Caso 4

O caso número 4 corresponde a um indivíduo do sexo feminino, jovem com apenas 31 anos de

idade com 3728 µg/L de ferritina sérica. Não apresenta genótipo de risco em HFE, pois apenas

apresenta heterozigotia para a mutação H63D. De notar que a H63D é bastante prevalente na

população portuguesa (frequência alélica entre 17 e 19%) (Cardoso et al., 2001), pelo que na

população em geral é muito frequente encontrarem-se indivíduos heterozigóticos para este

alelo, não sendo, só por si, justificação para o fenótipo apresentado.

A análise genética efectuada neste estudo a este indivíduo levou à identificação de 4

alterações diferentes, todas localizadas no gene BMP-6.

Duas dessas alterações já foram discutidas neste capítulo do trabalho, a c.1281+24 T→C e

c.1281-137 T→C, e foram identificadas no estado heterozigótico. Para além destas foram ainda

encontradas as alterações c.1029 C→T e c.1104 G→C, ambas localizadas no exão 4.

A alteração c.1029 C→T encontra-se descrita no PubMed com uma MAF para o alelo T de 1,9%

(amostra 1000Genome phase 1), sendo assim um polimorfismo relativamente raro ao qual não

foi atribuída, até a data, importância clinica. A análise de splicing (Tabela IV.23) revelou que

esta alteração não leva a variações significativas no que respeita aos locais aceitadores de

splicing. Para além disso, verifica-se que aparecem 2 novos motivos silencer. Os scores obtidos

para estes motivos são relativamente baixos (60,99 e 62,45) quando comparados com os

valores observados para os 5 motivos enhancer localizados na mesma região (76,09; 76,77;

80,36; 75,65 e 75,65). Deste modo pode-se afirmar que esta alteração deverá ser inócua no

que respeita a alterações no processo de splicing. A alteração c.1104 G→C também já se

encontra descrita no PubMed, sendo a MAF para o alelo C, de 40,7% (1000Genome phase 1). É

deste modo classificado como um polimorfismo relativamente frequente e, provavelmente,

sem relevância clinica. A análise de splicing (Tabela IV.23) revela que esta alteração não

deverá levar a alterações nos locais dadores de splicing. Para além disso, verifica-se que

desaparecem dois motivos enhancer com scores de 74,38 e 78,16. O desaparecimento desses

motivos no exão deixaria em aberto a hipótese de este deixar de ser reconhecido como tal e

poder haver o aparecimento de um variante de splicing com a exclusão do exão 4. Contudo

com a alteração é também criado um novo motivo enhancer, motivo este com um score

superior ao dos motivos que desaparecem (84,76) e deste modo parece compensar a ausência

dos motivos nativos.

Deste modo, as alterações encontradas neste indivíduo, juntamente com a heterozigotia para

a H63D não deverão ser suficientes para justificar o fenótipo apresentado por este indivíduo.

Fica assim por explicar este fenótipo. Levanta-se a hipótese de que a lesão molecular possa

ainda ser encontrada noutro gene também associado com o metabolismo do ferro.

V-Discussão dos Resultados

- 59 -

Alternativamente ou concomitantemente poderão existir ainda causas de índole ambiental ou

outras patologias associadas.

V.2.4- Caso 10

O caso número 10 corresponde a um indivíduo do sexo masculino com 50 anos de idade, com

homozigotia para a mutação H63D no gene HFE, e com um nível altíssimo de 9567 µg/L de

ferritina sérica. Aqui foram identificadas 6 alterações diferentes, 5 no gene BMP-6 e uma no

TfR2.

No BMP-6 foram encontradas as seguintes alterações: c.1281+24 T→C, c.1281-197 T→C,

c.1029 C→T, c.1104 G→C e c.1542+4 G→A. Todas as alterações se encontraram no estado de

heterozigotia, tendo as 4 primeiras já sido discutidas nos casos acima descritos. A alteração

c.1542+4 G→A não se encontra descrita no PubMed. A análise de splicing (Tabela IV.25) revela

que não existe alteração no local aceitador de splicing, por outro lado há um aumento do valor

do score do local de branch point de 52,64 para 82,27, para além disso verifica-se o

desaparecimento de um motivo enhancer concomitante com o aparecimento de outro com

um score semelhante. O branch point corresponde a um loop que ocorre durante o processo

de splicing. Após o aparecimento dessa estrutura, ocorrem reacções que levam à libertação do

intrão e à fusão dos exões adjacentes. Por fim, o intrão é separado do complexo pelo

spliceossoma, sendo posteriormente degradado (Corvelo et al., 2010).

Relativamente à mutação encontrada em heterozigotia no gene TfR2, c.1851 C→T (A617A), já

se encontra descrita no PubMed com uma MAF de 15,4% para o alelo T e sendo um

polimorfismo descrito como não tendo importância clinica relevante (Lee et al., 2001; Santos

et al., 2011). A análise de splicing (Tabela IV.26) revelou que não existem alterações que

justifiquem a existência de mecanismos de splicing alternativo.

Apesar de, neste indivíduo, terem sido encontradas várias alterações aliadas à homozigotia

para a H63D no gene HFE, o quadro de sobrecarga em ferro neste indivíduo é extremamente

grave e o genótipo observado não o justifica.

V.2.5-Caso 11

O caso número 11 corresponde a um indivíduo do sexo masculino, cuja informação relativa à

idade nos é desconhecida. É sabido que apresenta heterozigotia para a mutação H63D no gene

HFE. Neste caso encontrou-se apenas uma alteração no gene BMP-6, a c.1281+24 T→C em

heterozigotia, anteriormente descrita para o indivíduo número 1. Os valores de ferritina

observados neste caso são de 4000 µg/L, um fenótipo característico de excesso de ferro, mas

que é pouco provável que seja justificado pela presença da mutação anteriormente referida

juntamente com a H63D em heterozigotia no gene HFE.

V.2.6-Casos onde não se detectaram alterações nos genes analisados

Nos casos número 3 e de 5 a 9 não se encontraram alterações nos genes analisados, foi apenas

confirmada a presença ou ausência das mutações comuns (C282Y e H63D) no gene HFE. Estes

indivíduos à semelhança dos casos discutidos anteriormente possuíam uma hiperferritinemia

muito grave (ferritina sérica > 2500 μg/L) que não foi possível justificar com este estudo.

V-Discussão dos Resultados

- 60 -

Colocamos a hipótese que o excesso de ferro destes indivíduos seja resultado de uma

Hemocromatose secundária que ocorre como resultado de outra patologia, exemplo hepatite

C, ou de uma condição que leve a uma sobrecarga em ferro, exemplo múltiplas transfusões.

Outros factores comuns como o alcoolismo também podem justificar o fenótipo destes

doentes uma vez que indivíduos com doença hepática provocada pelo alcoolismo apresentam

frequentemente um aumento dos depósitos de ferro no organismo que são reflectidos por

elevados níveis séricos de ferro (Ferritina sérica e saturação da Transferrina) (Harrison-Findik,

2007). Não excluímos no entanto a hipótese da hiperferritinemia apresentada por estes 6

indivíduos ser de origem genética, porque podem possuir alterações em genes que não

estudamos e que podem estar implicados no metabolismo do ferro, ou em regiões não

analisadas nos genes estudados.

VI-Conclusão

VI-Conclusão

- 62 -

A desregulação da homeostase do ferro é muito comum e origina situações patológicas que

vão desde a anemia à sobrecarga em ferro. A Hemocromatose Hereditária do tipo I (ou

clássica) é uma doença autossómica recessiva, causada por mutações no gene HFE, frequente

em Caucasianos de ascendência Norte-Europeia. É caracterizada pela absorção

inapropriadamente elevada de ferro da alimentação, resultante da disrupção dos mecanismos

moleculares que deveriam manter a homeostase do ferro no organismo. Apesar das

manifestações clínicas da HH variarem muito, os sintomas mais característicos são artrite,

arritmia, falha cardíaca, diabetes, cirrose hepática, fadiga, hiperpigmentação da pele,

hipotiroidismo, hipogonadismo e carcinoma hepatocelular (Samuel et al., 2010). A detecção

precoce desta patologia é importante porque os danos provocados pelo excesso de ferro no

organismo podem ser prevenidos com tratamento adequado antes do início da

sintomatologia.

Há, contudo, outros tipos de Hemocromatoses Hereditárias, causadas por mutações em outros

genes relacionados com o metabolismo do ferro. O facto do genótipo clássico de risco para a

HH, não parecer ser suficiente para justificar o fenótipo de hiperferritinemia muito grave

(ferritina sérica > 2500 μg/L) apresentado pelos 11 indivíduos em estudo, levou à pesquisa de

mutações em alguns genes relacionados com o metabolismo do ferro: HFE, TfR2, HJV, HAMP e

BMP-6. Assim, o estudo apresentado nesta dissertação visa detectar mutações nos genes

referidos e compreender as respectivas associações genótipo/fenótipo.

A análise dos resultados obtidos permite constatar que, de entre os genes analisados, foram

identificadas alterações nos genes HJV, BMP-6 e TfR2 em 5 dos 11 indivíduos estudados. Das

alterações detectadas, 6 estão já descritas em bases de dados enquanto as restantes 3 (a

P124L no gene HJV, a c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A no gene BMP-6) são reportadas pela

primeira vez neste trabalho. No entanto, apenas em 2 indivíduos com hiperferritinemia grave

foi possível a partir do genótipo encontrado explicar o fenótipo apresentado. Foi o caso do

indivíduo número 1 e 2. No primeiro, o nível elevadíssimo de ferritina de 8000 µg/L pode ser

justificado devido à conjugação da homozigotia para a C282Y no gene HFE e da alteração

R752H em heterozigotia no gene TfR2. Os estudos in silico realizados para a TfR2_R752H

evidenciam que esta mutação afecta a funcionalidade da proteína TfR2. Esta alteração poderá

não ter um efeito notório num indivíduo sem alterações no gene HFE, no entanto podemos

hipotizar um efeito nocivo aditivo num indivíduo que a co-herdou com ambos os genes HFE

mutados. No caso do doente número 2, um indivíduo ainda relativamente jovem mas com um

valor de ferritina sérica de 3900 µg/L, apresenta a alteração P124L em heterozigotia no gene

HJV que, em conjugação com a homozigotia para a C282Y em HFE, também parece justificar o

elevado excesso de ferro apresentado, que não é justificável apenas pelas alterações comuns

no gene HFE.

Assim, fica por esclarecer a causa dos fenótipos de hiperferritinemia bastante elevada

apresentada pelos restantes indivíduos, não sendo de excluir a hipótese de hemocromatose

secundária. Esta poderá ser devida a vários factores ambientais, como por exemplo, toma de

medicação, alcoolismo, transfusões, assim como consequência de outra patologia. É de referir

ainda que, se a hiperferritinémia apresentada for de causa genética, é possível que existam,

nos indivíduos estudados, alterações que não foram detectadas porque nem toda a extensão

de cada um dos genes em estudo foi analisada. Optou-se por analisar as regiões dos genes

VI-Conclusão

- 63 -

onde já estão descritas mutações ou onde a sua existência seria de prever ser mais gravosa em

termos de expressão do gene. Outra hipótese é que estes indivíduos possam possuir mutações

noutros genes actualmente ainda não associados ao metabolismo do ferro, pois a HH não

clássica é caracterizada por uma grande heterogeneidade genética, que traduz mecanismos

fisiológicos complexos ainda não completamente conhecidos.

Assim, as próximas pesquisas na área do metabolismo do ferro deverão continuar a considerar

a hipótese de serem diversos os genes envolvidos nesta patologia e deverão incidir na

pesquisa de novas alterações genéticas nesses genes. Neste âmbito, um dos genes estudados

neste trabalho foi o BMP-6, onde ainda não se encontrou nenhuma alteração relevante capaz

de provocar HH em humanos mas há indícios de que tal aconteça em ratinhos (Meynard et al.,

2009). Espera-se que, no futuro, a descoberta de mutações neste gene em doentes humanos

com HH prove inequivocamente a envolvência do factor BMP-6 na regulação do metabolismo

do ferro no Homem. Assim, um maior conhecimento acerca dos genes e proteínas

relacionadas com os diversos tipos de HH permitirá uma melhor compreensão da variabilidade

fenotípica e genética e dos mecanismos subjacentes a esta patologia.

Como prosseguimento do trabalho realizado para esta dissertação, pretende-se efectuar a

confirmação e validação dos resultados obtidos através da execução de estudos funcionais

para as novas alterações encontradas. Deverão ser realizados estudos tanto em sistemas in

vivo como in vitro. No primeiro caso o material de partida serão células presentes no sangue

periférico dos indivíduos doentes (células mononucleares do sangue periférico), enquanto no

segundo serão utilizadas células transfectadas com construções com as alterações em estudo.

Em ambos os casos, pretende-se a síntese de cDNA a partir dos RNAs, obtidos das células

anteriormente mencionadas, seguida de reacção de PCR com vista à análise do impacto das

alterações ao nível do splicing. No caso das alterações missense encontradas pretende-se

ainda a análise da localização da proteína na célula através da realização de protocolos de

imunofluorescência.

Para além disso, é também importante que as alterações novas descritas neste trabalho

nomeadamente a c.371 C→T (P124L na HJV), a c.1281-197 T→C e a c.1542+4 G→A em BMP-6,

sejam pesquisadas em pelo menos 50 indivíduos da população em geral (100 cromossomas)

para saber se se tratam de polimorfismos. Acresce ainda que, o estudo das famílias dos

doentes permitirá tirar conclusões acerca da segregação das mutações com fenótipos de

sobrecarga em ferro, sobretudo nas famílias onde há segregação de diversos genes mutados

(em cromossomas diferentes) relacionados com o metabolismo do ferro, por exemplo na

família do indivíduo 1 (HFE e TfR2) e família do indivíduo 2 (HFE e HJV). Eventualmente, estas

famílias deverão ser enviadas para uma consulta de aconselhamento genético.

Em conclusão, com este trabalho demos uma pequena contribuição para o conhecimento da

complexidade de alterações genéticas que podem estar na origem da HH não clássica e da sua

relação genótipo/fenótipo.

VII-Referências Bibliográficas

VII-Referências Bibliográficas

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VIII-Anexos

- 71 -

Anexo 1: Soluções

Tampão de PCR 10X (Applied Biosistems)

100 mM Tris-HCl (pH 8,3 a 25ºC)

500 mM KCl

15 mM MgCl2

0,01 % (p/v) gelatina

Tampão de PCR α 10X

116 mM (NH4)2SO4

670 mM Tris-HCl pH 8,8

15 mM MgCl2

0,67 mM EDTA

100 mM β-mercaptoetanol

Tampão de PCR David 10X

166 mM (NH4)2SO4

670 mM Tris-HCl pH 8,8

67 mM MgCl2

0,067 mM EDTA

100 mM β-mercaptoetanol

Tampão de PCR B 10X

50 mM KCl2

10 mM Tris-HCL pH 8,8

150 uM MgCl2

0,01 % (p/v) gelatina

DNTPs (0,04 x 100 Mm)

Tampão TBE 10X (Invitrogen)

1,0 M Tris

0,9 M ácido bórico

- 72 -

Anexo 2: Código Genético e Sequências génicas

Código Genético Padrão

Aminoácidos Abreviatura Símbolo Codão (5´→3´)

Ácido aspártico Asp D GAT e GAC

Ácido Glutâmico Glu E GAA e GAG

Alanina Ala A GCN

Arginina Arg R AGA, AGG e CGN

Asparaginina Asn N AAT e AAC

Císteina Cys C TGT e TGC

Fenilalanina Phe F TTT e TTC

Glicina Gly G GGN

Glutamina Gln Q CAA e CAG

Histidina His H CAT e CAC

Isoleucina Ile I ATT, ATC e ATA

Leucina Leu L TTA, TTG e CTN

Lisina Lys K AAA e AAG

Metionina Met M ATG

Prolina Pro P CCN

Serina Ser S AGT, AGC e TCN

Tirosina Tyr Y TAT e TAC

Treonina Thr T ACN

Triptofano Trp W TGG

Valina Val V GTN

N- Aminoácido A, T, G ou C.

- 73 -

Sequências Génicas

Simbologia utilizada em todas as sequências génicas:

Este estilo- exões; Este estilo-UTR; Este estilo- oligonucleótidos iniciadores usados neste

trabalho; Este estilo-alterações encontradas no decorrer deste estudo.

Gene HFE

CTAAAGTTCTGAAAGACCTGTTGCTTTTCACCAGGAAGTTTTACTGGGCATCTCCTGAGCCTAGGCAATAGCTGTAGGGTGACTTCTG

GAGCCATCCCCGTTTCCCCGCCCCCCAAAAGAAGCGGAGATTTAACGGGGACGTGCGGCCAGAGCTGGGGAAATGGGCCCGCGAGCCA

GGCCGGCGCTTCTCCTCCTGATGCTTTTGCAGACCGCGGTCCTGCAGGGGCGCTTGCTGCGTGAGTCCGAGGGCTGCGGGCGAACTAG

GGGCGCGGCGGGGGTGGAAAAATCGAAACTAGCTTTTTCTTTGCGCTTGGGAGTTTGCTAACTTTGGAGGACCTGCTCAACCCTATCC

GCAAGCCCCTCTCCCTACTTTCTGCGTCCAGACCCCGTGAGGGAGTGCCTACCACTGAACTGCAGATAGGGGTCCCTCGCCCCAGGAC

CTGCCCCCTCCCCCGGCTGTCCCGGCTCTGCGGAGTGACTTTTGGAACCGCCCACTCCCTTCCCCCAACTAGAATGCTTTTAAATAAA

TCTCGTAGTTCCTCACTTGAGCTGAGCTAAGCCTGGGGCTCCTTGAACCTGGAACTCGGGTTTATTTCCAATGTCAGCTGTGCAGTTT

TTTCCCCAGTCATCTCCAAACAGGAAGTTCTTCCCTGAGTGCTTGCCGAGAAGGCTGAGCAAACCCACAGCAGGATCCGCACGGGGTT

TCCACCTCAGAACGAATGCGTTGGGCGGTGGGGGCGCGAAAGAGTGGCGTTGGGGATCTGAATTCTTCACCATTCCACCCACTTTTGG

TGAGACCTGGGGTGGAGGTCTCTAGGGTGGGAGGCTCCTGAGAGAGGCCTACCTCGGGCCTTTCCCCACTCTTGGCAATTGTTCTTTT

GCCTGGAAAATTAAGTATATGTTAGTTTTGAACGTTTGAACTGAACAATTCTCTTTTCGGCTAGGCTTTATTGATTTGCAATGTGCTG

TGTAATTAAGAGGCCTCTCTACAAAGTACTGATAATGAACATGTAAGCAATGCACTCACTTCTAAGTTACATTCATATCTGATCTTAT

TTGATTTTCACTAGGCATAGGGAGGTAGGAGCTAATAATACGTTTATTTTACTAGAAGTTAACTGGAATTCAGATTATATAACTCTTT

TCAGGTTACAAAGAACATAAATAATCTGGTTTTCTGATGTTATTTCAAGTACTACAGCTGCTTCTAATCTTAGTTGACAGTGATTTTG

CCCTGTAGTGTAGCACAGTGTTCTGTGGGTCACACGCCGGCCTCAGCACAGCACTTTGAGTTTTGGTACTACGTGTATCCACATTTTA

CACATGACAAGAATGAGGCATGGCACGGCCTGCTTCCTGGCAAATTTATTCAATGGTACACTGGGCTTTGGTGGCAGAGCTCATGTCT

CCACTTCATAGCTATGATTCTTAAACATCACACTGCATTAGAGGTTGAATAATAAAATTTCATGTTGAGCAGAAATATTCATTGTTTA

CAAGTGTAAATGAGTCCCAGCCATGTGTTGCACTGTTCAAGCCCCAAGGGAGAGAGCAGGGAAACAAGTCTTTACCCTTTGATATTTT

GCATTCTAGTGGGAGAGATGACAATAAGCAAATGAGCAGAAAGATATACAACATCAGGAAATCATGGGTGTTGTGAGAAGCAGAGAAG

TCAGGGCAAGTCACTCTGGGGCTGACACTTGAGCAGAGACATGAAGGAAATAAGAATGATATTGACTGGGAGCAGTATTTCCCAGGCA

AACTGAGTGGGCCTGGCAAGTTGGATTAAAAAGCGGGTTTTCTCAGCACTACTCATGTGTGTGTGTGTGGGGGGGGGGGGCGGCGTGG

GGGTGGGAAGGGGGACTACCATCTGCATGTAGGATGTCTAGCAGTATCCTGTCCTCCCTACTCACTAGGTGCTAGGAGCACTCCCCCA

GTCTTGACAACCAAAAATGTCTCTAAACTTTGCCACATGTCACCTAGTAGACAAACTCCTGGTTAAGAAGCTCGGGTTGAAAAAAATA

AACAAGTAGTGCTGGGGAGTAGAGGCCAAGAAGTAGGTAATGGGCTCAGAAGAGGAGCCACAAACAAGGTTGTGCAGGCGCCTGTAGG

CTGTGGTGTGAATTCTAGCCAAGGAGTAACAGTGATCTGTCACAGGCTTTTAAAAGATTGCTCTGGCTGCTATGTGGAAAGCAGAATG

AAGGGAGCAACAGTAAAAGCAGGGAGCCCAGCCAGGAAGCTGTTACACAGTCCAGGCAAGAGGTAGTGGAGTGGGCTGGGTGGGAACA

GAAAAGGGAGTGACAAACCATTGTCTCCTGAATATATTCTGAAGGAAGTTGCTGAAGGATTCTATGTTGTGTGAGAGAAAGAGAAGAA

TTGGCTGGGTGTAGTAGCTCATGCCAAGGAGGAGGCCAAGGAGAGCAGATTCCTGAGCTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAACAC

AGCAAAACCCCTTCTCTACAAAAAATACAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCATGCACCTGTGATCCTAGCTACTCGGGAGGCTGAGGT

GGAGGGTATTGCTTGAGCCCAGGAAGTTGAGGCTGCAGTGAGCCATGACTGTGCCACTGTACTTCAGCCTAGGTGACAGAGCAAGACC

CTGTCTCCCCTGACCCCCTGAAAAAGAGAAGAGTTAAAGTTGACTTTGTTCTTTATTTTAATTTTATTGGCCTGAGCAGTGGGGTAAT

TGGCAATGCCATTTCTGAGATGGTGAAGGCAGAGGAAAGAGCAGTTTGGGGTAAATCAAGGATCTGCATTTGGACATGTTAAGTTTGA

GATTCCAGTCAGGCTTCCAAGTGGTGAGGCCACATAGGCAGTTCAGTGTAAGAATTCAGGACCAAGGCTGGGCACGGTGGCTCACTTC

TGTAATCCCAGCACTTTGGTGGCTGAGGCAGGTAGATCATTTGAGGTCAGGAGTTTGAGACAAGCTTGGCCAACATGGTGAAACCCCA

TGTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCTGGTGTGGTGGCGCACGCCTATAGTCCCAGGTTTTCAGGAGGCTTAGGTAGGAGAATCCCT

TGAACCCAGGAGGTGCAGGTTGCAGTGAGCTGAGATTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGATAGAGTGAGACTCTGTCTCAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTGAAGGAATTATTCCTCAGGATTTGGGTCTAATTTGCCCTGAGCACCAACTCCTGAGTTCAACT

ACCATGGCTAGACACACCTTAACATTTTCTAGAATCCACCAGCTTTAGTGGAGTCTGTCTAATCATGAGTATTGGAATAGGATCTGGG

GGCAGTGAGGGGGTGGCAGCCACGTGTGGCAGAGAAAAGCACACAAGGAAAGAGCACCCAGGACTGTCATATGGAAGAAAGACAGGAC

TGCAACTCACCCTTCACAAAATGAGGACCAGACACAGCTGATGGTATGAGTTGATGCAGGTGTGTGGAGCCTCAACATCCTGCTCCCC

TCCTACTACACATGGTTAAGGCCTGTTGCTCTGTCTCCAGGTTCACACTCTCTGCACTACCTCTTCATGGGTGCCTCAGAGCAGGACC

TTGGTCTTTCCTTGTTTGAAGCTTTGGGCTACGTGGATGACCAGCTGTTCGTGTTCTATGATCATGAGAGTCGCCGTGTGGAGCCCCG

AACTCCATGGGTTTCCAGTAGAATTTCAAGCCAGATGTGGCTGCAGCTGAGTCAGAGTCTGAAAGGGTGGGATCACATGTTCACTGTT

GACTTCTGGACTATTATGGAAAATCACAACCACAGCAAGGGTATGTGGAGAGGGGGCCTCACCTTCCTGAGGTTGTCAGAGCTTTTCA

TCTTTTCATGCATCTTGAAGGAAACAGCTGGAAGTCTGAGGTCTTGTGGGAGCAGGGAAGAGGGAAGGAATTTGCTTCCTGAGATCAT

TTGGTCCTTGGGGATGGTGGAAATAGGGACCTATTCCTTTGGTTGCAGTTAACAAGGCTGGGGATTTTTCCAGAGTCCCACACCCTGC

AGGTCATCCTGGGCTGTGAAATGCAAGAAGACAACAGTACCGAGGGCTACTGGAAGTACGGGTATGATGGGCAGGACCACCTTGAATT

CTGCCCTGACACACTGGATTGGAGAGCAGCAGAACCCAGGGCCTGGCCCACCAAGCTGGAGTGGGAAAGGCACAAGATTCGGGCCAGG

CAGAACAGGGCCTACCTGGAGAGGGACTGCCCTGCACAGCTGCAGCAGTTGCTGGAGCTGGGGAGAGGTGTTTTGGACCAACAAGGTA

TGGTGGAAACACACTTCTGCCCCTATACTCTAGTGGCAGAGTGGAGGAGGTTGCAGGGCACGGAATCCCTGGTTGGAGTTTCAGAGGT

GGCTGAGGCTGTGTGCCTCTCCAAATTCTGGGAAGGGACTTTCTCAATCCTAGAGTCTCTACCTTATAATTGAGATGTATGAGACAGC

CACAAGTCATGGGTTTAATTTCTTTTCTCCATGCATATGGCTCAAAGGGAAGTGTCTATGGCCCTTGCTTTTTATTTAACCAATAATC

TTTTGTATATTTATACCTGTTAAAAATTCAGAAATGTCAAGGCCGGGCACGGTGGCTCACCCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCC

GAGGCGGGTGGTCACAAGGTCAGGAGTTTGAGACCAGCCTGACCAACATGGTGAAACCCGTCTCTAAAAAAATACAAAAATTAGCTGG

TCACAGTCATGCGCACCTGTAGTCCCAGCTAATTGGAAGGCTGAGGCAGGAGCATCGCTTGAACCTGGGAAGCGGAAGTTGCACTGAG

CCAAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTAGGCAGCAGAGTGAGACTCCATCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGAATTCAGAG

- 74 -

ATCTCAGCTATCATATGAATACCAGGACAAAATATCAAGTGAGGCCACTTATCAGAGTAGAAGAATCCTTTAGGTTAAAAGTTTCTTT

CATAGAACATAGCAATAATCACTGAAGCTACCTATCTTACAAGTCCGCTTCTTATAACAATGCCTCCTAGGTTGACCCAGGTGAAACT

GACCATCTGTATTCAATCATTTTCAATGCACATAAAGGGCAATTTTATCTATCAGAACAAAGAACATGGGTAACAGATATGTATATTT

ACATGTGAGGAGAACAAGCTGATCTGACTGCTCTCCAAGTGACACTGTGTTAGAGTCCAATCTTAGGACACAAAATGGTGTCTCTCCT

GTAGCTTGTTTTTTTCTGAAAAGGGTATTTCCTTCCTCCAACCTATAGAAGGAAGTGAAAGTTCCAGTCTTCCTGGCAAGGGTAAACA

GATCCCCTCTCCTCATCCTTCCTCTTTCCTGTCAAGTGCCTCCTTTGGTGAAGGTGACACATCATGTGACCTCTTCAGTGACCACTCT

ACGGTGTCGGGCCTTGAACTACTACCCCCAGAACATCACCATGAAGTGGCTGAAGGATAAGCAGCCAATGGATGCCAAGGAGTTCGAA

CCTAAAGACGTATTGCCCAATGGGGATGGGACCTACCAGGGCTGGATAACCTTGGCTGTACCCCCTGGGGAAGAGCAGAGATATACGT

GCCAGGTGGAGCACCCAGGCCTGGATCAGCCCCTCATTGTGATCTGGGGTATGTGACTGATGAGAGCCAGGAGCTGAGAAAATCTATT

GGGGGTTGAGAGGAGTGCCTGAGGAGGTAATTATGGCAGTGAGATGAGGATCTGCTCTTTGTTAGGGGGTGGGCTGAGGGTGGCAATC

AAAGGCTTTAACTTGCTTTTTCTGTTTTAGAGCCCTCACCGTCTGGCACCCTAGTCATTGGAGTCATCAGTGGAATTGCTGTTTTTGT

CGTCATCTTGTTCATTGGAATTTTGTTCATAATATTAAGGAAGAGGCAGGGTTCAAGTGAGTAGGAACAAGGGGGAAGTCTCTTAGTA

CCTCTGCCCCAGGGCACAGTGGGAAGAGGGGCAGAGGGGATCTGGCATCCATGGGAAGCATTTTTCTCATTTATATTCTTTGGGGACA

CCAGCAGCTCCCTGGGAGACAGAAAATAATGGTTCTCCCCAGAATGAAAGTCTCTAATTCAACAAACATCTTCAGAGCACCTACTATT

TTGCAAGAGCTGTTTAAGGTAGTACAGGGGCTTTGAGGTTGAGAAGTCACTGTGGCTATTCTCAGAACCCAAATCTGGTAGGGAATGA

AATTGATAGCAAGTAAATGTAGTTAAAGAAGACCCCATGAGGTCCTAAAGCAGGCAGGAAGCAAATGCTTAGGGTGTCAAAGGAAAGA

ATGATCACATTCAGCTGGGGATCAAGATAGCCTTCTGGATCTTGAAGGAGAAGCTGGATTCCATTAGGTGAGGTTGAAGATGATGGGA

GGTCTACACAGACGGAGCAACCATGCCAAGTAGGAGAGTATAAGGCATACTGGGAGATTAGAAATAATTACTGTACCTTAACCCTGAG

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ATACAGAGTCCAAGGGTCTTTTGGGATATTGGGTTATGATCACTGGGGTGTCATTGAAGGATCCTAAGAAAGGAGGACCACGATCTCC

CTTATATGGTGAATGTGTTGTTAAGAAGTTAGATGAGAGGTGAGGAGACCAGTTAGAAAGCCAATAAGCATTTCCAGATGAGAGATAA

TGGTTCTTGAAATCCAATAGTGCCCAGGTCTAAATTGAGATGGGTGAATGAGGAAAATAAGGAAGAGAGAAGAGGCAAGATGGTGCCT

AGGTTTGTGATGCCTCTTTCCTGGGTCTCTTGTCTCCACAGGAGGAGCCATGGGGCACTACGTCTTAGCTGAACGTGAGTGACACGCA

GCCTGCAGACTCACTGTGGGAAGGAGACAAAACTAGAGACTCAAAGAGGGAGTGCATTTATGAGCTCTTCATGTTTCAGGAGAGAGTT

GAACCTAAACATAGAAATTGCCTGACGAACTCCTTGATTTTAGCCTTCTCTGTTCATTTCCTCAAAAAGATTTCCCCATTTAGGTTTC

TGAGTTCCTGCATGCCGGTGATCCCTAGCTGTGACCTCTCCCCTGGAACTGTCTCTCATGAACCTCAAGCTGCATCTAGAGGCTTCCT

TCATTTCCTCCGTCACCTCAGAGACATACACCTATGTCATTTCATTTCCTATTTTTGGAAGAGGACTCCTTAAATTTGGGGGACTTAC

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ATCTGTGGGTAGTATGATGGGTGTTTTTAGCAGGTAGGAGGCAAATATCTTGAAAGGGGTTGTGAAGAGGTGTTTTTTCTAATTGGCA

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TTTCTACCTGGTCTCTCCTTGTTCTGATAATGAAAATTATGATAAGGATGATAAAAGCACTTACTTCGTGTCCGACTCTTCTGAGCAC

CTACTTACATGCATTACTGCATGCACTTCTTACAATAATTCTATGAGATAGGTACTATTATCCCCATTTCTTTTTTAAATGAAGAAAG

TGAAGTAGGCCGGGCACGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAG

Gene HJV

ACCGTCAACTCAGTAGCCACCTCCCTCCCTGCTCAGCTGTCCAGTACTCTGGCCAGCCATATACTCCCCCTTCCCCCCATACCAAACC

TTCTCTGGTTCCCTGACCTCAGTGAGACAGCAGCCGGCCTGGGGACCTGGGGGAGACACGGAGGACCCCCTGGCTGGAGCTGACCCAC

AGAGTAGGGAATCATGGCTGGAGAATTGGATAGCAGAGTAATGTTTGACCTCTGGAAACAGTAAGTCAAAATGAAATTGCAATTCCTT

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ACCAAGGTGCCCCAATCTCCATTTCTCTTTCTGTCTTATTTCTTTCTGGCCTCTGGCCTCTAGCTTTTTGAAGTTTAATTCTCTGTCT

CTCCTCTGGCAGTCTTAGCCCTCTCTTTACCTTATTACCTCAAGACTCCTGATGAAGTTTTAGAAGGAGTTCCCTACGTCCTCTATTC

TGTAGTTTTCTTACCAAGGCCAAATATGACCTCAGATGATGAGTCACTGATACCCTTCTATCCTGCCCCCACTTAGCAATGCCCTTCA

CATTGAGATTCCAAGCATGGGGGCTGCTCCCTGTAAATGATTTCTCCCCACAACTCTAGTCCCTCCATTCTATTCTCCCTCTTGCAGG

ACTCTTCCCCCAATCATATCCTTACCCATAAGATAGGGGAGTTAGGCAGGAGGGATTTAGCCCCTCTCCAACTCCTGTCATCATAAAA

GACTGAGAACTTCAGAATTTGAAAAGAAGAGATTAATGGAAGGAGTGATATTTGGGAAAATACAAGAACTGTTGACTTAGAAAAAACA

AATATTGATTTGCATGTTTGGTTTGCATCCCATTATTCCATGAGAGAGGGAGATTAAAATTGCAGCTCTCTAGAGCTGATGAAAAGAG

ATTGGTTTCCTTTTCATTTGAATACTGATATTCTAGACGGGATGGGTATGCCACCCTTAATCCTTCTTGTGTTCTGACACAAAGGAGG

AAAAGAAATGTATGACTCCTAGAGGGCATCTCCTCCTAATGGAGAGGGACAAATAAGAAGTATGTTTCTGAAATATTTTCAGGTCCTA

ATTTTACTAGGGTACCCACTAGGATTACTGGTATCTGATCTAGCCCCATGATTCCTCCATCTTTGACATACCTGCTGTTTGGTAGCTC

AGAATGGAGCAATACAGTGGACTCTGCCCCCTTGAGTTCACTCAACCTTCCCTCCACCCCCACCTAGGGGTATTGCACAAGGGCCCTA

AAAGTGGCCACAGGAACAGGGCAAAGAGGCTTAACTGCCACACTTATAGTTTGAGGAACTCCAATCTCCCCAAATTCCAGTCTGTTCA

TCCTTTTCTTGATCTCCCCAGATTCACTCCACATTATCCTTACCAATCTTCAATTCTTCTCTCTCTCCATGTCCAGCCAAATTTCTTT

TTTCAGTCACTTACAGGGCTTCCGGTCAAAATTCACTAGGTAGGAGGGTCATCAGCTGGGAAGAACCGGCGCCTGGGAAACCTGGCTG

GATAGGTATGGGGGAGCCAGGCCAGTCCCCTAGTCCCAGGTCCTCCCATGGCAGTCCCCCAACTCTAAGCACTCTCACTCTCCTGCTG

CTCCTCTGTGGACATGGTAAGGAAGGGCCAGGGAAGGGTTTGGGGAAATCTAGAGGGTAGGCTGCTATGTAGGGGTGGGCATGTGAGC

CTGAATGAGTGAGGAGAGATAGGCGCTGAGAGTCCCGATCACTCGCCCTGCTCTCAAATACTAATATTTTATTTCCCGTTCAGTCTGG

GGAAGGCCACTGGGGAAGCCCTTGGTCGACAGGCAGAAGAGATGTGGCAGGCTTACACACTTTTAGTAAGACAGCCGAGAGAACTAGG

GACTAGGGGGTTGGGGGCTGGGGAAGGCCCTTAGTTAGGTTTTAGGAAGGCTGGAAACCCCTGATGAGATTTGGAAGAGTTATGAGCA

AACTACACTCCGATAGAGCAGAGGTCTGAGGACCGTCTCACAATCCTCTCCCTTCTGTCTTTAGCTCATTCTCAATGCAAGATCCTCC

GCTGCAATGCTGAGTACGTATCGTCCACTCTGAGCCTTAGAGGTGGGGGTTCATCAGGAGCACTTCGAGGAGGAGGAGGAGGAGGCCG

GGGTGGAGGGGTGGGCTCTGGCGGCCTCTGTCGAGCCCTCCGCTCCTATGCGCTCTGCACTCGGCGCACCGCCCGCACCTGCCGCGGG

GACCTCGCCTTCCATTCGGCGGTACATGGCATCGAAGACCTGATGATCCAGCACAACTGCTCCCGCCAGGGCCCTACAGCCCCTCCCC

CGCCCCGGGGCCCCGCCCTTCCAGGCGCGGGCTCCGGCCTCCCTGCCCCGGACCCTTGTGACTATGAAGGCCGGTTTTCCCGGCTGCA

- 75 -

TGGTCGTCCCCCGGGGTTCTTGCATTGCGCTTCCTTCGGGGACCCCCATGTGCGCAGCTTCCACCATCACTTTCACACATGCCGTGTC

CAAGGAGCTTGGCCTCTACTGGATAATGACTTCCTCTTTGTCCAAGCCACCAGCTCCCCCATGGCGTTGGGGGCCAACGCTACCGCCA

CCCGGAAGGTCAGGCACTCAATCTTCCTTCCGATCCACCTCATGAGATTCTTCCACGGGCACCATTCCTCCCCATCCCCACTATTCAA

CAGCAATGCTCCCTAATTCCCTTTTCTTCCTCAACCTCTCCCCCATCTCGAATCACTCCCTTCTACCAAACACCTGGAGCTGTAAATC

ACTTCCCCTTGATGGGAATTTGACTCAAATGCAGAAAACCTTGAAGAGACAGTCGGAGAGGGCGGACCTGAGGAGTTTCAGAAGGGAA

ACTTTTCCCTCTCCTAGGAAGTTGCCACGATTAAGTAGAGAGGGGGTTAAGTAGGGATGAGGTAATACTGGAACATAAATAGGAGAAG

GGATCAAGGATTGAGGGCCATAGTAGTCCTGCATCTCTACTTGGATCAGATCTCTAACTATGTATGAGGTCTGATTGGGGGGAAGATG

CACTGAACCCAAAATGAACTGTTTTCCCTCTTGTCCTCACAGCTCACCATCATATTTAAGAACATGCAGGAATGCATTGATCAGAAGG

TGTATCAGGCTGAGGTGGATAATCTTCCTGTAGCCTTTGAAGATGGTTCTATCAATGGAGGTGACCGACCTGGGGGATCCAGTTTGTC

GATTCAAACTGCTAACCCTGGGAACCATGTGGAGATCCAAGCTGCCTACATTGGCACAACTATAATCATTCGGCAGACAGCTGGGCAG

CTCTCCTTCTCCATCAAGGTAGCAGAGGATGTGGCCATGGCCTTCTCAGCTGAACAGGACCTGCAGCTCTGTGTTGGGGGGTGCCCTC

CAAGTCAGCGACTCTCTCGATCAGAGCGCAATCGTCGGGGAGCTATAACCATTGATACTGCCAGACGGCTGTGCAAGGAAGGGCTTCC

AGTGGAAGATGCTTACTTCCATTCCTGTGTCTTTGATGTTTTAATTTCTGGTGATCCCAACTTTACCGTGGCAGCTCAGGCAGCACTG

GAGGATGCCCGAGCCTTCCTGCCAGACTTAGAGAAGCTGCATCTCTTCCCCTCAGATGCTGGGGTTCCTCTTTCCTCAGCAACCCTCT

TAGCTCCACTCCTTTCTGGGCTCTTTGTTCTGTGGCTTTGCATTCAGTAAGGGGACCATCAGTCCCATTACTAGTTTGGAAATGATTT

GGAGATACAGATTGGCATAGAAGAATGTAAAGAATCATTAAAGGAAGCAGGGCCTAGGAGACACGTGAAACAATGACATTATCCAGAG

TCAGATGAGGCTGCAGTCCAGGGTTGAAATTATCACAGAATAAGGATTCTGGGCAAGGTTACTGCATTCCGGATCTCTGTGGGGCTCT

TCACCAATTTTTCCAGCCTCATTTATAGTAAACAAATTGTTCTAATCCATTTACTGCAGATTTCACCCTTATAAGTTTAGAGGTCATG

AAGGTTTTAATGATCAGTAAAGATTTAAGGGTTGAGATTTTTAAGAGGCAAGAGCTGAAAGCAGAAGACATGATCATTAGCCATAAGA

AACTCAAAGGAGGAAGACATAATTAGGGAAAGAAGTCTATTTGATGAATATGTGTGTGTAAGGTATGTTCTGCTTTCTTGATTCAAAA

ATGAAGCAGGCATTGTCTAGCTCTTAGGTGAAGGGAGTCTCTGCTTTTGAAGAATGGCACAGGTAGGACAGAAGTATCATCCCTACCC

CCTAACTAATCTGTTATTAAAGCTACAAATTCTTCACACCATC

Gene HAMP

CTTGTCTGCTTGTGTGTTTGTCCATCTCAGGAGTGGGGAGGGGGCCTGGGGTCTGCAGAGCTCCACGAGGCATGGTTCTGCTGTTGTG

CACATGGCTGTGCATGGTCCCTGCCAGCTGCACCACCCATTACCCAGTGGTTGGTTGGATGGATGGAGGAATTAAGGAATGAATGTCC

CCTTTGAGGCCCTAGACGTGCATGAGGGTGTGGGGAGCTGGGGTCAAGGACATGTCCCATGTTGGAGGAGAGGCAGGGGTCTCCGTGT

CAACAGTTCCTGAAAACACAACCAGCCCCTGGCCCTGCCCTGCTGGGCCAAAGCCCTCCCCTCTGCACCAGCCAATAGTGGGGCCTGG

CCTTGAGCCCCTCACCCCCAGGGAGGGCAGATGGCCAGGGCGCCAAGCTTGGCCCGTCAGCCTGTCGCCTTGCACCAAGGCTCTGGCG

CCTGTGCTGTGACCCCTGCCCCTGCTGATGATGAAACCTGTCCTCAGCTGAGATGCAGCGATGCCTGGTAGGGCTGGGGGCTGCTCCT

GTGTCTCCCCAGGTGAGCACACCCCTATTCACTGGGCCCTGCTTCAGCCTGCAGCACCCTTCAACTCCCAGGAGCTGGGCTTGCCACT

CTGCTCACCTTGTGGAGCTCCATCTGCCTTTCCTCCCCAATTCCCCCACTCCCTGCACTCGTCTCTTCCCACAAGAGCCCTGTCTCCT

TTTCCTAGCTATTCCCATCTGAGGCCATCTTTATTCATTTAGTTTTTAGAGACAGGGTTTCACTCTCACCCAGGCTGGGGTGCAGTGG

CACACAATCACGGCTCACTGCAGCCTTGACCAACTACAGGTGCGTAGCACCACAGCCAAGTTTTTGTATAGATGGGGTCTCGCTTTGT

TACCCAGGCTGTGACAAGAGGAGCCTCCCACGTGGTGTGGATGAGGAGGCAGATGGCAGGGCCTGTGCATTTCTGTGCTTGAGTGGGC

CTTGAAAGTGGTTCAGCAACCAGGAAGAAGTGTTCATTCCTCGACAACAACATCCCCGGGCTCTGGTGACTTGGCTGACACTGGATGG

CCCTGGAATGAAAAAGGCAAAGAGGCAAAATGTGCAAGGGCCCATCTGGAACCAAGGTTTGTTGATCCCCTGGGCCGTGTGCACCCTG

AGCTGGGCCTGGTAGTGGAAAGGAATGAAGGCACTGCAGTCAGGCAGCCTGGGTTCATCCCCCAGCTAGTGGTGTCCTAAGGAACCGG

CTCCCCAAAAACATCCCTGGCTTGTAGTGCTTGCCAATTTCTGGGTGTCAAGACTCCCACTGCTGCTGATTTCAGGATACCAGCATGA

TGCCACTGAATGCAGAGTTTCGAGATGTGCATGGTCTGCTATGTTGAGCCAGGTCTAGCATACCGCTGTGCCCTGCTGTGTTTTAGGG

GAGATGGGGAAACCTGGTGGGTAAGAGCAAAAGCCCTGGAGTCAGGCTGTCCAGGCTAGAATCTCAGCTCTGCCTCTGGCTGAGCAAG

CTTGGGCCATGCCCTGATCTCTGCCTTCAGTGCCTTTTCTGTAAAGTGAAGGAAATGAGTGTCCGACGGGGAGGAGGTTCCTAAAAGG

GAGCAGGGTCTGGGGAGCCCAGGCCTCTGGGGTTGGGTGACTGAGAAGGCAGCCCCTGAATACAGAGCAGAGCTGAAGGTGGGGCAGT

AAGTGCTGCTGGGAGAACAGGCAGCACAGGCTGAGTTGGTGCAGAAGTGAGTCAACATATGTGCCATCGTATAAAATGTACTCATCGG

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CAATCATAGCTCACTGCAACCTCAGCCTCCTGGGCTTAAGCGATCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGATGTGTGCCAC

CACGCCTGGCTAAATTTGTTTAAAATTTTTTTTGTAGAGATGGGGTCTCCCTATGTTGCCCAGGCTAGTCTTGAACTTCTGGGCTCAA

GCGACCCTCCTGCCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCATAAGCCACTGTGCTGGGCCATATTACTGCTGTCATTTATGGCC

AAAAGTTTGCTCAAACATTTTCCAGTTACCAGAGCCACATCTCAAGGGTCTGACACTGGGAAAACACCACGTGCGGATCGGGCACACG

CTGATGCTTGCCCTGCTCAGGGCTATCTAGTGTTCCCTGCCAGAACCTATGCACGTGTGGTGAGAGCTTAAAGCAATGGATGCTTCCC

CCAACATGCCAGACACTCCTGAGGAGCCTGGCGGCTGCTGGCCATGCCCCGTGTGCATGTAGGCGATGGGGAAGTGAGTGGAGGAGAG

CGGAACCTTGATTCTGCTCATCAAACTGCTTAACCGCTGAAGCAAAAGGGGGAACTTTTTTCCCGATCAGCAGAATGACATCGTGATG

GGGAAAGGGCTCCCCAGATGGCTGGTGAGCAGTGTGTGTCTGTGACCCCGTCTGCCCCACCCCCTGAACACACCTCTGCCGGCTGAGG

GTGACACAACCCTGTTCCCTGTCGCTCTGTTCCCGCTTATCTCTCCGCCTTTTCGGCGCCACCACCTTCTTGGAAATGAGAGAGAGCA

AAGGGGAGGGGGCTCAGACCACCGCCTCCCCTGGCAGGCCCCATAAAAGCGACTGTCACTCGGTCCCAGACACCAGAGCAAGCTCAAG

ACCCAGCAGTGGGACAGCCAGACAGACGGCACGATGGCACTGAGCTCCCAGATCTGGGCCGCTTGCCTCCTGCTCCTCCTCCTCCTCG

CCAGCCTGACCAGTGGCTCTGTTTTCCCACAACAGGTGAGAGCCCAGTGGCCTGGGTCCTTAGCAGGGCAGCAGGGATGGGAGAGCCA

GGCCTCAGCCTAGGGCACTGGAGACACCCGAGCACTGAGCAGAGCTCAGGACGTCTCAGGAGTACTGGCAGCTGAACAGGAACCAGGA

CAGGCACGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGTTGAGGCAGGCAGCCCACTTGAGGTCAGTTTGAGACCAGCCTGGC

CAACATGGTAAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAGTTAGCCAGGCTTGGTGGCAGGTGCCTGTAATCCCAGCTACTCGGGAGAC

TGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCGCAAGGTGGAGGTTGCACAGTGAGCTGAGATTGCACCACTGCACTCCAGCCTGGCAACAGAGC

AAGACTCCATCTCCAAAAAAGAACAGAAATCAATGAAGCACCGAGTGACAGGGACTGGAAGGTCCTAATTCCATGGGTATTTACGGAA

CCCCTACGCCGTGTGGAGTCTTATTCTAGACAGTGGGGACGAGGCCATGAACAAGGTAGATGAGAGAGGAGATTTCTCCATCCTGGTC

AGGGAATTTGTTAAAGACTGATGAAAACATGAATAAATAATTGTGTCTAGTACATTCTATTCGTGAATCTCATAACAGACAGTGGTAG

- 76 -

AGTGACCGTGACCCATTCGCCACACAGTAGAGTCACTTTTTTGGTTTGTTTTTTAGAGACAGGGTCTTCCTCTGTTGCTGAGGCTGGA

GTGCAGTGGTGCAGTCATAGTTCACTGCAGCCTCAACCTCCTGTGCTCAAGCAATCCTCCCACCTCAGCGTCCCAAGTAGCTGGGACA

GCAGGCACATGCCACGGGTTGGGGGACCACAGGCATGGTCAAGGGGCTGGCAGTCAAGCAAGTGTTTCATGAGAAAGTGACAGTTGAC

CTTCGTCTTGGAGGGTGAGAGATGGAGGCAGCAAAGACCTAAGGAGAGGACAAGCCAGCATAGCCCAGGGTCAGGCTGAACAAGAGGA

GATGGTGGGACTTGGGGATAAGGCTGAGGGGTGGGCAGTCCCTAAGTCTTGTGGGCAACCATGCAGACACTGATTTTTCCTTGGAATA

AAGAGGAAGCCCCCATAAGCTTTTTTTTTTTTTTCTGAGATAGGGTCTCGCTCTGTCGTTCAGGCTGGTGTGCAGTGGCATCATCTGG

GCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCTTCCCGAGCAGCTGGGATTACAGGCGGCTGCCACCACG

CCCGGCTAATTTTTGTTTTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCACCATGTTGGCCAGACTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAGGTGATTCTCC

CACCTCGGCTTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCACTGCGCCCAGCCTCCTGTAGGTTTTTAAAATGGAGAAAACCACAAT

CTCACTGGCCATGTTTTAAAAAACTTAATCTGCCAGTCAGGCACCATGGCTCACACCTGTAATCCCAGAGTTTTGGGAGGCCAAGGTA

GGAAGATCAGTTGAGCCCAGGAGTTCAAGACCAGCTTGGGCAACACAACCAGACCCCACCTCTACAAAAAATTAAAAAATTAGCCGGG

TGTGGTGGCGTGCACCTGCTGTCCCAGCTACTCGGGAAGCTGAGGCGGGAGCATCGCTTGAGCACAGGAGGTCAAGGCTGCAGGGAGC

TATGACTGTGCCACTGCACTCTGGCCTGGGCAACAGAGGAAGACTCTGTCTAAAAAACAAACAAAAAAAGTGACTCTGCTGTGTGGCA

AATGGATTGAGGGGCAAGAATGCAGGGAGGTGTGTTAGGAGGCTGGCACTGGCATCCAGGCAGGGGAAGGTGATATCCCAAAGAAGAG

TAGCAGCTGTGGAAAGAGGAGGAGGCGGATCTGGGAGGTTTTTTTTTTTAGGAAAAGCCGCCCATGGGAAGGTGAGCAGAAGCAAGAA

AGCAAGGCCCCTCCTAAGAGTCCATTTGAGCTCTGGGTTTAAACCACTTGGAGAGGAGCAGGTTGCCGGGAGCCAGTCTCAGAGGTCC

ACTGGGCCCCCTGCCATCCTCTGCACCCCCTTCTGCTTTCACAGACGGGACAACTTGCAGAGCTGCAACCCCAGGACAGAGCTGGAGC

CAGGGCCAGCTGGATGGTGAGCGCAACAGTGATGCCTTTCCTAGCCCCCTGCTCCCTCCCCATGCTAAGGCCGGTTCCCTGCTCACAT

TCCCTTCCTTCCCACAGCCCATGTTCCAGAGGCGAAGGAGGCGAGACACCCACTTCCCCATCTGCATTTTCTGCTGCGGCTGCTGTCA

TCGATCAAAGTGTGGGATGTGCTGCAAGACGTAGAACCTACCTGCCCTGCCCCCGTCCCCTCCCTTCCTTATTTATTCCTGCTGCCCC

AGAACATAGGTCTTGGAATAAAATGGCTGGTTCTTTTGTTTTCCAAACCAGAGTGTCTCTTGTCCTTTCTCTCTGCCGAGTGTCTGTG

CTAAGAGCTTGTCCTGACCCTGCCTTGCAAGCAC

Gene BMP-6

CAACTGGGGGCGCCCCGGACGACCATGAGAGATAAGGACTGAGGGCCAGGAAGGGGAAGCGAGCCCGCCGAGAGGTGGCGGGGACTGC

TCACGCCAAGGGCCACAGCGGCCGCGCTCCGGCCTCGCTCCGCCGCTCCACGCCTCGCGGGATCCGCGGGGGCAGCCCGGCCGGGCGG

GGATGCCGGGGCTGGGGCGGAGGGCGCAGTGGCTGTGCTGGTGGTGGGGGCTGCTGTGCAGCTGCTGCGGGCCCCCGCCGCTGCGGCC

GCCCTTGCCCGCTGCCGCGGCCGCCGCCGCCGGGGGGCAGCTGCTGGGGGACGGCGGGAGCCCCGGCCGCACGGAGCAGCCGCCGCCG

TCGCCGCAGTCCTCCTCGGGCTTCCTGTACCGGCGGCTCAAGACGCAGGAGAAGCGGGAGATGCAGAAGGAGATCTTGTCGGTGCTGG

GGCTCCCGCACCGGCCCCGGCCCCTGCACGGCCTCCAACAGCCGCAGCCCCCGGCGCTCCGGCAGCAGGAGGAGCAGCAGCAGCAGCA

GCAGCTGCCTCGCGGAGAGCCCCCTCCCGGGCGACTGAAGTCCGCGCCCCTCTTCATGCTGGATCTGTACAACGCCCTGTCCGCCGAC

AACGACGAGGACGGGGCGTCGGAGGGGGAGAGGCAGCAGTCCTGGCCCCACGAAGCAGCCAGCTCGTCCCAGCGTCGGCAGCCGCCCC

CGGGCGCCGCGCACCCGCTCAACCGCAAGAGCCTTCTGGCCCCCGGATCTGGCAGCGGCGGCGCGTCCCCACTGACCAGCGCGCAGGA

CAGCGCCTTCCTCAACGACGCGGACATGGTCATGAGCTTTGTGAACCTGGGTAAGGATTTGGGGTAACGTAATGACGAGAACATTTCC

CCCTTTTCAGTGTCCCGGGCCCAGGGGATGGAGTGAGGGGGTGGAGGAGCTCCCGGCGCGCGGGTC(…)AAACTTTAACGCAAGAGTT

TTCATAACTTGCTCTCATGCAAATTCATTCAAATAAGTATATAAGCAGAAGTATTTAAACTAAATAAAATCTAAGAATTTTGCTTCAT

CTTGGGTAACATGAAGGATTTTCATCTCCTCCTCATGGGCCAGCCAGTGGTCTGTTCACTACCCGATCCCCGTAGTAAGCCGTGGGTA

ATTGGTAATCCACCTATGAAGTCAAACGGGGAAACTGGTGAGGTAAGCCCGTGGCACTTAGTCAAGTAACAATAGTTGTCACTCTCTC

TTGTTTAATCTTATAGTGGAGTACGACAAGGAGTTCTCCCCTCGTCAGCGACACCACAAAGAGTTCAAGTTCAACTTATCCCAGATTC

CTGAGGGTGAGGTGGTGACGGCTGCAGAATTCCGCATCTACAAGGACTGTGTTATGGGGAGTTTTAAAAACCAAACTTTTCTTATCAG

CATTTATCAAGTCTTACAGGAGCATCAGCACAGGTATGAAGGCTCGAGAAAGCCCCAAAGGTGGGGCTGGCCCCTGTTTCCCACCTTT

TGTCATGACAATAACCCCAGCTATGTCTGTGCAGGGTGACCTGGAGTTCAGGGGCAGCATGTGAGTACGATGAGGTGGGTGTTGTAAA

TGGGAGTGTTTAGCTGGTGAGATCTTTTGCTATTTGATTTTCCAAATAGCTATCTTTTCCTAAGAAAGCTAGTGAATGTATTTATTAT

AAGCATCTTTTGTGATCA(…)AGATTTTTGGTAAAGTTGAGAGGGTCTGCCGTGTCGGGGTGAAAGCTGATTTCTATGAAGCGCCTTA

TCAGATGTGCCTGTCTCTCCTAATTGTGTCATGCCTGTGTCCTGGGTGGTACCACGCCTTTCAGGGCTATGGCAAGTCACTGTGCTTG

TGCCTCACAGGTAGATGTGATCTGACTCGGGCATGTTTTATCCTGACGCTGAGACAGGAAAGAGTGGGAAGGAGCTTCAGGCAGTGCG

CTATTTACCAGGCCATTTTTTCTTTCTTTCAGAGACTCTGACCTGTTTTTGTTGGACACCCGTGTAGTATGGGCCTCAGAAGAAGGCT

GGCTGGAATTTGACATCACGGCCACTAGCAATCTGTGGGTTGTGACTCCACAGCATAACATGGGGCTTCAGCTGAGCGTGGTGACAAG

GGATGGTAAGTTATTATCCGCAAGCCTCCAACGTCCAGCAAGTCATCAGTTTCACACATTTCCCTTACAGCAGTTGTGATAGAACCGT

GGGCAACAGGCAAGTCCTCAGCTTCAGGATGGCCTCATTTACTGATCCCCCATGACTTGCATTGAGAACCAAAACCTTTCCCGGAGGC

CTCCTAGACAGGAATTGAAAACAGGCTTGGGCAACTTGGAGACAGGAGAGTGGTAATGTTTCCAAGAGGATGGCGATGGGAGGACAGC

TTTTCTAGGCAGAGGCAGGTTGCGGGGGATGCAGCGAGTAAGAGAGAGGCAGGCGCATCTGTTTAAATCCTGACGGATGAACAGGTTT

GCAGTACCCACTCCTCCTGCAGCATCAGAGCCAGCAGCTTGAGGTCCCCACTGCTGATCTGTCCACCAGGGAGGGCAGGGTAACTGCA

GATTCATAATCTAGCAGAAACAGGAGAGCCCAGGAGTTCACGCCACTCCTTCATGTGATTCTGAAACTTTGAAAGGAGTGCTTTGATT

CTGCCAAAAGATGCCATCCCATGGGTGCCAGGCAAGGTTTGGGGATACATGATCTTCTTCTTCACACTCATTCTTAAGGATTAGCACT

TAGGAAACTAGGAAGTATCCCTTAACTGTTGTAGCTACAGGAACAAGTTTCTGTGGAATAAAGAGATGCATGCTTTGATTTGCATTAA

AGGAGTCCACGTCCACCCCCGAGCCGCAGGCCTGGTGGGCAGAGACGGCCCTTACGACAAGCAGCCCTTCATGGTGGCTTTCTTCAAA

GTGAGTGAGGTGCACGTGCGCACCACCAGGTCAGCCTCCAGCCGGCGCCGACAACAGAGTCGTAATCGCTCTACCCAGTCCCAGGACG

TGGCGCGGGTCTCCAGTGCTTCAGGTGGGTTTGTGGGGAGCCTGTGTTTCCAGAAAGCCTTGTTGGCCTCAGTGAGAACAAAAGTTGT

GTCCACAGTCTCAGATGTCGGGCAGCTTCTGCACAGCAAATCCAAAGGCAAATAGGTGTCATATGCATGATGGTACCTTGTACAGTCG

CAGAACATCTGCGTGGGTTCTGAGGGCCCTCAGCCTGGAACACTTGTTACCTGAAGACTCAGGCTGCCCGCATCATGACTGCCTGTTG

ATCCAGA(…)ATGTGAATGTGATGCCTTCCCGGTCTGGCGCCTCTGGGGTGTACTGGGCAAGTCGGCCCACGCCTCCATAGGCCTTGC

ATGCAGCAGGGCTCACAACACACCTCTGTTGCTTAAGGGTGTCCATTCAAGTCACCCTGCTCCCAGTACTGACCCCAGGGTAGACAAA

ACGGATTCCGTAAGACATTCAAGCCAACAGTCAGGAACCTGATGTAGCTGTTGGGTGACCATACTTGTATCTAGGAGGCTATCCTGAG

CCTAGCACAGAGCCTGGCATGTGGTAAACTCTCTATGAAGGAATTAATGAGTTGATGGGTGCATCTTTTGATGGGTGCATCTTTTGAT

- 77 -

CTCCTCCAACAGATTACAACAGCAGTGAATTGAAAACAGCCTGCAGGAAGCATGAGCTGTATGTGAGTTTCCAAGACCTGGGATGGCA

GGTGAGTTCTCTGGACACGGGGGATAAAGGTCCTTTCTCAGCAGTTTACTCTCATCTGAATGGTGGCAGCCATTACCAAACACCCAGA

GCTTGATTGAAGGCTGAGCTGCTTCCTTCTGTGGAAGTCCTGAGGAGCCCTCCCAAATGCTCAGGCTCCTGGAGTAAGGCAGAGGAAG

CTTAGTCTGTGGGGCACCAGGCGCTCCAACACCTTCCTAGGGTGCCTGAGCTCTGTGATCCCTCAAAAATCAATAGCCACATTTCCCA

ATATTCTCACCTCATCCTTTCAAAGCCCATAGGACATACATTTATTTGGGCATTTAAACAAATTTTAATTGAGACAGGGTTGGAAAAA

AATTACCTAATGGTTAACATCTCCAATGGCTGCAAACCAGCTCACCAAACGATGCAGAAGAGCACACGTTTGCCTCGTACCTGAGAAC

CATCACTAGTTTGTAAGAAAGGCAGCAACTTTAATCACAGGTGGTGAGCGATAAAAGGTAGCTTCCATATGCAGGTGGCACTACTTCC

GCAGGAGCACCGTGGGCTCCTGGAGAGGCTTGCTTGGGTCCAAGCACATATTGCTGGCAACCTACGTGCTTCCAGGTAGCAGCTGAGG

CCCTGTGGGCCTCTGCAAGGAGCGAGGGTTCTGGGGTCAGATGGACCAGGTTCACTTCCCAGCATTGCCACTTGAATGTGAACTTGGA

CAAATTCCTAAGCCTTCCTGCGTCTGTATCCTTGCCTGTGCAATGTGAAAAATACCTTTTCACAGCATTCCTGAAAAGCACAAATAGT

GTGAGAAGTGCATGCTCATCTTTTGTTGCTTCCTTTGCATGAAATTAAGGACTGGATCATTGCACCCAAGGGCTATGCTGCCAATTAC

TGTGATGGAGAATGCTCCTTCCCACTCAACGCACACATGAATGCAACCAACCACGCGATTGTGCAGACCTTGGTGAGCTCTCGGAGAC

TTTGTTTTGTAAGTGGGAGTAAGCCAAGACCAGGTGTCATTTCTAAGGTACCTTCTCCCCTTCTGTTTTGGAACAGGTTCACCTTATG

AACCCCGAGTATGTCCCCAAACCGTGCTGTGCGCCAACTAAGCTAAATGCCATCTCGGTTCTTTACTTTGATGACAACTCCAATGTCA

TTCTGAAAAAATACAGGAATATGGTTGTAAGAGCTTGTGGATGCCACTAACTCGAAACCAGATGCTGGGGACACACATTCTGCCTTGG

ATTCCTAGATTACATCTGCCTTAAAAAAACACGGAAGCACAGTTGGAGGTGGGACGATGAGACTTTGAAACTATCTCATGCCAGTGCC

TTATTACCCAGGAAGATTTTAAAGGACCTCATTAATAATTTGCTCACTTGGTAAATGACGTGAGTAGTTGTTGGTCTGTAGCAAGCTG

AGTTTGGATGTCTGTAGCATAAGGTCTGGTAACTGCAGAAACATAACCGTGAAGCTCTTCCTACCCTCCTCCCCCAAAAACCCACCAA

AATTAGTTTTAGCTGTAGATCAAGCTATTTGGGGTGTTTGTTAGTAAATAGGGAAAATAATCTCAAAGGAGTTAAATGTATTCTTGGC

TAAAGGATCAGCTGGTTCAGTACTGTCTATCAAAGGTAGATTTTACAGAGAACAGAAATCGGGGAAGTGGGGGGAACGCCTCTGTTCA

GTTCATTCCCAGAAGTCCACAGGACGCACAGCCCAGGCCACAGCCAGGGCTCCACGGGGCGCCCTTGTCTCAGTCATTGCTGTTGTAT

GTTCGTGCTGGAGTTTTGTTGGTGTGAAAATACACTTATTTCAGCCAAAACATACCATTTCTACACCTCAATCCTCCATTTGCTGTAC

TCTTTGCTAGTACCAAAAGTAGACTGATTACACTGAGGTGAGGCTACAAGGGGTGTGTAACCGTGTAACACGTGAAGGCAATGCTCAC

CTCTTCTTTACCAGAACGGTTCTTTGACCAGCACATTAACTTCTGGACTGCCGGCTCTAGTACCTTTTCAGTAAAGTGGTTCTCTGCC

TTTTTACTATACAGCATACCACGCCACAGGGTTAGAACCAACGAAGAAAATAAAATGAGGGTGCCCAGCTTATAAGAATGGTGTTAGG

GGGATGAGCATGCTGTTTATGAACGGAAATCATGATTTCCCTTGTAGAAAGTGAGGCTCAGATTAAATTTTAGAATATTTTCTAAATG

TCTTTTTCACAATCATGTACTGGGAAGGCAATTTCATACTAAACTGATTAAATAATACATTTATAATCTACAACTGTTTGCACTTACA

GCTTTTTTTGTAAATATAAACTATAATTTATTGTCTATTTTATATCTGTTTTGCTGTAACATTGAAGGAAAGACCAGACTTTTAAAAA

AAAAGAGTTTATTTAGAAAGTATCATAGTGTAAACAAACAAATTGTACCACTTTGATTTTCTTGGAATACAAGACTCGTGATGCAAAG

CTGAAGTTGTGTGTACAAGACTCTTGACAGTTGTGCTTCTCTAGGAGGTTGGGTTTTTTTAAAAAAAGAATTATCTGTGAACCATACG

TGATTAATAAAGATTTCCTTTAAGGCA

Gene TfR2

GATAAGGGGCCCTCCTAGGGCTCCCACAAACGGTTTATCGGTTTATCGCTGGGGGACAGCCTGCAGGCTTCAGGAGGGGACACAAGCA

TGGAGCGGCTTTGGGGTCTATTCCAGAGAGCGGTAAGACTAGTGGGATTGGGAAGACCCCTTAGGCCTTCTCTCTAAGTCCCTCAGCC

CCCTCCCAAGCCCCTGAGGCTGGCCCCTCCTGGACCGTGTCCTGACCTCGCTTCTTCCCACCCCTGCCCCTCCCCCACGCCCCCACCA

CCATGCTCATTTGACACCCCCAAGTCACTGACCTCATTATTGCCAGATGCCTCCCCACCCCCCAGGCCTCTTGCCCCAATCTCATGCC

CACCTCGCCTGCACAGCAACAACTGTCCCCAAGATCCTCTCAGACCGTCTACCAGCGTGTGGAAGGCCCCCGGAAAGGGCACCTGGAG

GAGGAAGAGGAAGACGGGGAGGAGGGGGCGGAGACATTGGCCCACTTCTGCCCCATGGAGCTGAGGGGCCCTGAGCCCCTGGGCTCTA

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TGGGGGTGAGAGCCGTCCCCCTCCCCAGAAGTGAAGGGCTTGGGCTGGGGGAGATTTCTGGGGTCCAGAGGTGGGCATAAAGAGAATC

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- 78 -

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AGGAGGCTGAGGCGGGAGGATGGCTTGAGCCCAGGAACCGGTGATTCCCCTGAGTACCTTGGTGTAAAGTGTCTCCATGAGGCCCACG

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TGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGCGACACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGTCCGCGGGGAGCGCTCTTT

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GCCCAGAAAAGTCCCCACCTCTCCCCGCTTAGGCAAACCAGCCTTCGGGAACGGGTGGCAGGCTCGGCCGGGATGGCCGCTCTGACTC

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- 79 -

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GTTGTCATCGGGGCCCAGAGGGATGCATGGGGCCCAGGAGCAGCTAAATCCGCTGTGGGGACGGCTATACTCCTGGAGCTGGTGCGGA

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CGAGATCGCACCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAATGAGCCTCCTTCTAAAAAAAAGAAAGAAAAGAAAAGAAAAAAAGTGACAT

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GGAGGCCAACACAGGAGAATCGCTGGAGACCAGGAATTCAAAACCAGCCTGGGCAACATAGGGAGACTGCATCTCTACAAAAGTTTTT

TAAAAATTGGCTGGACTTAGTGGTGCATGCCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAAGAGGATGACTTGAACCTGAGAGGTC

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ACCTCAGCGTGCTGCACCTCAAAGCCGTAGTGTACGTGAGCCTGGACAACGCAGTGCTGGGTGAGCTGGGGCAGTGCCACCACCTGGC

CCCCTGGGGTCCACCCTTGCCTCTGGGGCTGAGCCCTGAGCCTGGCATCCCTCCCCTCCCCTTTTTCCAGGGGATGACAAGTTTCATG

CCAAGACCAGCCCCCTTCTGACAAGTCTCATTGAGAGTGTCCTGAAGCAGGCAAGAGCACCCCAGGAATAGGGGGTGAAGGGGAGTAG

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CCCTGCCGTCGAGTTCTCCTTTATGGAGGTGAGACGTCCTCCCCCTGCCCCAGACACAGCGCTAGTCCTTCAGCCTGTCTGCCTCCGC

CCCAGCGTCCACCCTGTCCTGGCAGGACGACCAGGCCTACCCATTCCTGCACACAAAGGAGGACACTTATGAGAACCTGCATAAGGTG

CTGCAAGGCCGCCTGCCCGCCGTGGCCCAGGCCGTGGCCCAGCTCGCAGGGCAGCTCCTCATCCGGCTCAGCCACGATCGCCTGCTGC

CCCTCGACTTCGGCCGCTACGGGGACGTCGTCCTCAGGCACATCGGGAACCTCAACGAGTTCTCTGGGGACCTCAAGGTTCAAGAGGC

CCACCCCGCTCTTGGTCTCTGGGAGTGGGAGGCACTGCCCAGGCCAGGGGGTCCAGCCCCTTCTCTCTGCATTCCCTGGGGTCTAGGT

CCTCTCTGGCAATCCAGCCCATTAACCCCCTGCCTCCAGTCTCCCAGCCCCCAGCATGTGCCATCGCCCAACCTGGCAGGTGCAGGAT

CTTCTCCCCACTCCCTTCATCCTGCCTCCAGCACTCTGTCCTCGTCTACCTCCTCCCTCCTGCGGCCAGGGGTCCCAGCCCCCTTCCC

CATGCTAGGCGGGGGTCCTTGTCCCCATGCTAGGCGGGGGTCCTGGCCCCTGCCGCCAGCCCCAGCCCGCGCCTCCCCACCCCAGGCC

CGCGGGCTGACCCTGCAGTGGGTGTACTCGGCGCGGGGGGACTACATCCGGGCGGCGGAAAAGCTGCGGCAGGAGATCTACAGCTCGG

AGGAGAGAGACGAGCGACTGACACGCATGTACAACGTGCGCATAATGCGGGTGAGGCCCCGCCCTCCTCGCCCCGCCCCCAGTGTCCC

GCCCCTCCCCTGGGGCTCCACCTCCTGGACCTGGCCCCGTCTGCGCGCTCCTCTCTCTCCCCGCCTACACAGTCCCGGTCCTCTGGAT

GCTCTCTTCCCAGTCCTGGACACGCAGTGCTCATAGATCGGTCAGGCTGGAGGACCCGAGCGATCAAAGTGATGAAATGGACAGGGAG

GGCCAGCCTCTTGGCCACAGTCGCCTGGTTTACGCCTGGCAGAACTGGGACAATCCACCCTCCCCCACCCCTCCCCGCTGACTCCCCT

CCTATAGCTCCCACTGCCTCCTCGACCCTTCTGGAAAGAAAAAGCATGTCCACACTGGTCCACAATACGAGGTTACAGGCTGGGAAGT

GCAGAAGGCTAAAGATATTCAGAGTAAGAGAGCTGTTTTCCTTCTGATAATGAAATGGGTGAAATCCAGAAAGGCTGCCTGGAGGAGG

TGTCACGTGAAAGTTAAACAAGAGCTTATTCCCTCACCAATCCCTTCTGCTTAGCTTTGAATCCTTTGCAGCCCACACCCCACCTCCA

GTTCCAACTCCTCCACTTCCTTCCATTTTCTTACTCCAAGAACTCAACCCCTCAACCCTTTGATGTCAAGAAATGGGTGAGTAGGGAC

TGTGGCCATGGGGAAAGGTCTGCAGGGCAAAATAGTAAACAGGATCATCCTCAATGAGTGTGGGGTGAGCTGGGAACTGCAGTGTACA

CAGAGCCACTTGTGCACACACACTCACGGTTTTCAGAGCCAGCATGGCTACCCCTTGGAGGCTCATGTTATCTCTCCTCCTTGCATTT

TCCTGCTTGTGCCCTCTGCCTGTCCCCCTTGGCCATTTACAAACCTATTGCTCTTGCTCGTTCTCCCTTGCCCAGACTAGAGTGCAGT

GGCACCATCTCTGCTCACTGCAACCTCCAACTCCTGGGCTCAAGTGATCCTCCCACCTCAGCCTCCCTAGTAGCTGGGAGTACAGGCA

CGTGCCATGACGCCCGGCTAAATTTTTCTATTTTTTGTAGAGACAGGGTTTTACCATGTTGCCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGGCCT

CAAGTGATCCTCCTGCCTCGGCCTCCCAAATTGCTGGGGTTACAGGCGTGAGCTACTGAACCTGGCCTTCTCCTCTCCTTCTTATATC

TCTTTCTCCATTCATTCTTCTTTAACCTTTGCCTCCTCTACTGGAACAGGGGTGACCCTGGGGTGAGGCAATAGGTTGGGTATGGTTC

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GAGGCTGAGGTGGGCGGATCACCTGGGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGACCAACATGGAGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAA

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TTGCAGTGAGCCGAGAGCACGCCATTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAGAGCGAAAATCCATCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAG

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TTTTTCTGAGACGGTCTCACTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTAGCATGATCTGGGCTCACGGCAACCTCCACCTCCCGGGCTCAA

- 80 -

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