penicilina industrial
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
ENGENHARIA QUÍMICA
PURIFICAÇÃO DE PENICILINA G POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS
ANDRÉ NOGUEIRA CASTRO DE BARROS
SÃO CARLOS – SP - BRASIL AGOSTO DE 2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
PURIFICAÇÃO DE PENICILINA G POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS
ANDRÉ NOGUEIRA CASTRO DE BARROS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
SÃO CARLOS – SP - BRASIL AGOSTO DE 2008
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar
B277pp
Barros, André Nogueira Castro de. Purificação de penicilina G por adsorção em resinas hidrofóbicas / André Nogueira Castro de Barros. -- São Carlos : UFSCar, 2008. 80 f. Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2008. 1. Penicilina. 2. Adsorção. 3. Resinas hidrofóbicas. I. Título. CDD: 660.28423 (20a)
Dedico este trabalho aos meus pais, Idevar e Cecília,
e às minhas irmãs, que em mais uma etapa de minha
vida estiveram presentes, incentivando-me a
continuar caminhando
“A penicilina cura os homens, mas é o vinho que
os torna felizes.” (Fleming)
“A felicidade não está no fim da jornada, e sim em
cada curva do caminho que percorremos para
encontrá-la.” (Autor Desconhecido)
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Deus por ter me dado a oportunidade de estar no mundo.
Aos meus pais, Idevar e Cecília, às minhas irmãs, Lili e Ju e à toda minha família,
agradeço todo o amor, carinho, compreensão e respeito.
Aos amigos da UFSCar, que me "aturaram" todos os dias, muitas das pessoas que
passaram e passam pelo que eu passei e passo: ficar longe da família em busca de um ideal
comum.
Meus agradecimentos especiais:
À minha orientadora, professora Dra. Raquel de Lima Camargo Giordano, pela
orientação, insistência e por ter confiado em meu trabalho;
À Dasciana de Sousa Rodrigues, a Dasci, pela alegre e divertida convivência no
laboratório, pelas valiosas conversas e sugestões que foram essenciais para o
desenvolvimento deste trabalho;
À Bruna pela amizade, companheirismo, pelas festas e momentos de descontração
durante os 7 anos que estive presente em São Carlos. À Aline, pela amizade e por todos os
momentos de apoio que juntos precisamos para a realização desse trabalho. À Carol, pelos
divertidos momentos nos corredores do DEQ e na academia. À Débora, pelos momentos
de conversa, discussões e entendimentos. Ao Edson, pelas conversas online e pela
divertida risada. Ao Adilson, pela paciência diária na hora do almoço;
A todos os amigos de laboratório, Wellington, Geisa, Bia, Thiago, Adriano, Danielle,
Andrea, pelos conselhos técnicos, pelo apoio, pela amizade e pelos momentos de
descontração que deixaram o ambiente de trabalho mais agradável. A todos os amigos da
pós-graduação, Mônica, Ana Maria, Anny, Silvia, Luana, Ivana, Letícia e Sandra, pelo
apoio e pela amizade;
A todos os amigos de São Carlos, Karime, Carmen, Luana, Koki, Marina, Ricardo,
Luciano e Guilherme, pelo convívio, pela paciência, pelo apoio e pela amizade;
A Ju Lessa pelas dicas experimentais, pela eterna amizade, pelos momentos de
desabafo. Ao Bruno pela disposição sempre que precisava de um amigo. Ao Wagner pelo
convívio, pelo apoio, pela compreensão e pela amizade. A Mariana, Carla e Alexandre,
pela sinceridade de uma amizade, onde vimos que a distância não é suficiente para separar
os amigos.
Tenho muito a agradecer e a muitas pessoas que me auxiliaram até onde já cheguei. A
todos que colaboraram direta ou indiretamente para a concretização deste trabalho.
Para vocês, ofereço estas páginas...
Muito obrigado a todos!
À FAPESP pela bolsa concedida.
À CNPq e FINEP pelo apoio financeiro.
À PRODOTTI S/A pelo apoio financeiro e incentivo à pesquisa.
À Fundação de Culturas Tropicais pela doação do Penicillium.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS i
RESUMO
A separação de produto biotecnológico é uma área de grande importância econômica,
pois representa parcela predominante no custo do produto. Na produção industrial de
penicilina G (penG), a separação do antibiótico vem sendo feita por extração em solvente
orgânico. Contudo, a diminuição no uso desses solventes vem se tornando imperativa em
muitos processos químicos, devido a questões ambientais, o que vem motivando a
empresa farmacêutica PRODOTTI S/A, produtora de penG, a buscar rotas menos
agressivas ao ambiente. Adsorção é uma das operações de concentração/purificação mais
utilizadas na indústria química e é baseada na atração exercida sobre o produto (fase
líquida) por uma fase sólida. Projeto conjunto UFSCar/Prodotti/FINEP, em andamento,
visa estudar, entre outros objetivos, a viabilidade técnica da substituição da extração com
solvente pela adsorção de penG em resinas hidrofóbicas. Sendo um ácido fraco, a adsorção
de penG é favorecida em baixos valores de pH. Entretanto, a penG pode se degradar
nesses valores de pH, sendo necessário, portanto, se buscar condições adequadas de
operação.
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do pH e da temperatura na
eficiência de adsorção da penG em resinas hidrofóbicas, buscando condições de máxima
eficiência mas que não acarretem sua degradação. Foi necessário inicialmente desenvolver
metodologia de análise que permitisse quantificação de grande número de amostras de
penG no meio de cultivo, ou seja, na presença de outros nutrientes, bem como
discriminasse entre a forma preservada e a degradada. Foram comparados os métodos de
CLAE, iodométrico e bioensaio, concluindo-se que CLAE era preciso e quantificava
também a degradação, o que permitiu realizar estudos de estabilidade de penG a diferentes
valores de pH e temperaturas. Esse método permitiu determinar o tempo máximo em que o
antibiótico não degradava em cada condição, bem como o tempo de cultivo e, portanto,
que a variação nas concentrações presentes no meio não afetavam a quantificação de
penG. Contudo, CLAE é um método caro para estudo envolvendo grande número de
amostras provenientes de caldo de cultivo. Desenvolveu-se assim nova metodologia
baseada na hidrólise completa da penicilina G, catalisada por penicilina G acilase, que se
mostrou precisa, reprodutível e foi por isso utilizada nas etapas seguintes deste trabalho.
Avaliou-se a seguir a eficiência de adsorção de pen G das resinas XAD-4, XAD-7, XAD-
761 e carvão ativado, verificando-se que XAD-4 era a mais eficiente, com pequena
aumento de eficiência a pH 4,0 (44%) quando comparada com pH 6,0 (36%). Para a resina
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS ii
selecionada, XAD-4, foi então investigada as cinéticas de adsorção e determinadas as
isotermas de equilíbrio a diferentes valores de pH e temperaturas. A isoterma de Langmuir
foi a que melhor se ajustou aos dados experimentais em todas as condições, obtendo-se
máximo valor de qmax de 595,06±51,54 mg penG/g resina, a pH 4 e 4 °C.
Visando estudar a adsorção a valores de pH menores que 4,0 e evitar a degradação de
penG que ocorre quando presente a altas concentrações e valores de pH abaixo de 4,0,
estudaram-se duas estratégias de adsorção. Na primeira, o pH do caldo de cultivo foi
ajustado e em seguida este foi mantido em contato com o adsorvente. Na segunda
estratégia, o adsorvente foi adicionado ao caldo de cultivo a pH 7 e ao longo da adsorção
este pH foi reduzido até ser atingida completa adsorção de penG. O processo com
gradiente e adição gradativa de resina mostrou eficiência de adsorção de 0,77g penG/g
resina e produtividade de 0,31 g penG/g resina/hora, a pH 4,0, enquanto que adsorção
direta a pH 4,0 levou a 0,548g penG/g resina (0,548 g penG/g resina/hora). A estratégia
em gradiente, pois, aumenta a eficiência e diminui a produtividade do processo. Os
resultados mostraram que o ideal seria trabalhar diretamente a valores de pH ainda
menores que 4, mas concentrações elevadas de pen G levam à degradação do antibiótico
nessa faixa de pH. A dessorção de penG foi estudada utilizando a técnica de
planejamento experimental e investigou-se as variáveis pH, temperatura e composição de
mistura água/etanol. Os resultados mostraram que para se obter uma máxima dessorção, o
processo deve ser realizado a 8oC e utilizar como eluente uma mistura de 82,5 % etanol e
17,5 % água em pH 6,2.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS iii
ABSTRACT
The separation of biotechnological products is an area of great economic importance
once it represents the majority of the cost of this product. On industrial production of
penicillin G (penG), the separation of the antibiotic has been made by extraction on
organic solvent. However the decrease on the use of these solvents has become imperative
in many chemical processes, caused mainly by environmental issues, which has
motivating the pharmaceutical company PRODOTTI S/A, penG producer, on the research
of new and less environmental aggressive ways to obtain this substance. Adsorption is one
of the methods of concentration/purification most used by the chemical industry and it is
based on the attraction exercised over the product (liquid phase) by a solid phase. The
project sponsored by UFSCar/Prodotti/FINEP in progress has as one of its aims the study
of the technical availability of substitution of extraction of penG by solvents for extraction
by adsorption in hydrophobic resins. The penG, which is a weak acid, has therefore a
favorable adsorption in low pH values. Nevertheless, penG can degrade itself under such
conditions of pH, being required, in this way, adequate conditions for the operation.
Therefore, the objective of this assignment was evaluate the influence of pH and
temperature on the efficiency on adsorption of penG by hydrophobic resins, seeking
conditions for maximum efficiency that do not result in degradation. Initially, it was
necessary to develop the methodology that could allowed that analysis of a huge amount
of penG samples in culture medium, which means that the penG could be analyzed in the
presence of other nutrients and also could be distinguished between the intact and the
degradated form. Some methods such as CLAE, iodometric and bioassay were analyzed
and the conclusion was the CLAE method was necessary and also was able to quantify the
penG’s degradation rate. This features allowed the studies of penG’s stability when
exposed to different value pH and temperatures, the maximum half-life that it was stable
in each condition and the time of growth, which means that it was possible to determine
the time that the variation in the medium’s concentration that did not affect the
quantification of penG. Nevertheless, the CLAE method is very expensive to be applied to
a large number of samples originated from culture medium. With this in mind, a new
methodology was developed based on the complete hydrolysis of penG catalyzed by the
penicillin G acilase, and this reaction proved to be precise and reproducible, reasons for
being chosen in the later steps of this study. The efficiency of adsorption of penG was
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS iv
evaluated in the resins XAD-4, XAD-7, XAD-761 and activated carbon, and the XAD-4
resin has shown to be the most efficient with little increment of efficiency at pH 4.0 (44%)
when compared to pH 6.0 (36%). Therefore, the XAD-4 resin was studied for parameters
such as adsorption kinetics and the isotherms of adsorption were determined in different
value of pH and temperatures. The Langmuir’s isotherm had the best fit into the data
collected in all the conditions, with maximum value of qmax = 595.06±51.54 mg penG/g
resin, at pH 4 and 4°C.
In order to analyze the adsorptions in value of pH lower than 4.0 without the
occurrence of penG’s degradation that usually occurs at high concentrations of this
molecule and at value of pH lower than 4.0, two strategies referring to the adsorption
conditions were studied. For the first one, the fermentative broth’s pH is adjusted and right
after this same broth is maintained in contact with the adsorbent. For the second method,
the adsorbent was add to the fermentative broth at a pH of 7.0 and with the adsorption
process the pH was reduced until reach the complete adsorption of the penG. The last
process showed a better efficiency of adsorption of 0.77g penG/g resin and productivity of
0.31 g penG/g resin/hour at pH 4.0, meanwhile the direct adsorption at pH 4.0 had an
efficiency of 0.548g penG/g resin (0.548 g penG/g resin/hour). The second strategy with
the gradient is better since it increases the efficiency and decreases the productivity of the
process. The results showed that the ideal situation would be to work with pH values even
lower than 4, but elevated concentrations of penG will lead to the degradation of the
antibiotic in this pH range.
The desorption of penG was studied using a technique of experimental planning and
analysis such as pH, temperature and composition of mixture water/ethanol. The results
showed that to obtain a maximum desorption, the process must be effectuated at 8°C and
utilizes as eluent a mixture of 82.5% ethanol and 17.5% water on a pH of 6.2.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS v
ÍNDICE RESUMO...........................................................................................i ABSTRACT....................................................................................iii 1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 1 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................... 3
2.1 ANTIBIÓTICOS ...........................................................................................................................3 2.2 PENICILINAS..............................................................................................................................3
2.2.1 ESTRUTURA QUÍMICA DAS PENICILINAS.....................................................................................3 2.2.2 PENICILINAS SEMI – SINTÉTICAS.................................................................................................5
2.3 PENICILINA G ............................................................................................................................5 2.3.1 ESTABILIDADE.................................................................................................................................6 2.3.2 PROCESSO DE PRODUÇÃO INDUSTRIAL.......................................................................................9 2.3.3 MÉTODOS DE SEPARAÇÃO...........................................................................................................10
2.3.3.1 PURIFICAÇÃO POR EXTRAÇÃO COM SOLVENTE .........................................................................10 2.3.3.2 OUTROS MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO..........................................................................................11
2.4 ADSORÇÃO ..............................................................................................................................12 2.4.1 TIPOS DE ADSORÇÃO ...................................................................................................................13 2.4.2 ADSORVENTES...............................................................................................................................14
2.4.2.1 CARVÃO ATIVADO .....................................................................................................................16 2.4.2.2 AMBERLITE XAD .......................................................................................................................17
2.4.2.2.1 AMBERLITE XAD-4 ..............................................................................................................18 2.4.2.2.2 AMBERLITE XAD- 7 .............................................................................................................19 2.4.2.2.3 AMBERLITE XAD- 761 .........................................................................................................20
2.4.3 EQUILÍBRIO DE ADSORÇÃO.........................................................................................................20 2.4.3.1 ISOTERMA LINEAR......................................................................................................................22 2.4.3.2 ISOTERMA DE LANGMUIR ...........................................................................................................23 2.4.3.3 ISOTERMA DE FREUNDLICH ........................................................................................................24
2.4.4 SISTEMAS TÍPICOS DE ADSORÇÃO..............................................................................................25 2.4.5 RECUPERAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS POR ADSORÇÃO EM BATELADA .........26
2.5 DESSORÇÃO ............................................................................................................................28 2.6 PLANEJAMENTO ESTATÍSTICO DE EXPERIMENTO...................................................................28
3 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................... 31 3.1 MATERIAIS ..............................................................................................................................31 3.2 MÉTODOS ................................................................................................................................31
3.2.1 PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PENICILINA G.............................................................................31 3.2.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PENG......................................................................32
3.2.2.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) .........................................................32 3.2.2.2 MÉTODO IODOMÉTRICO..............................................................................................................33 3.2.2.3 BIOENSAIO..................................................................................................................................33 3.2.2.4 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PENG..............................................................................................34
3.2.3 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE PENG EM DIFERENTES SOLUÇÕES ........................34 3.2.4 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DE PENG FRENTE A PH E TEMPERATURA ..................35 3.2.5 ENSAIOS DE ADSORÇÃO EM BATELADA....................................................................................35
3.2.5.1 TRATAMENTO DOS ADSORVENTES .............................................................................................35 3.2.5.2 EFICIÊNCIA DE ADSORÇÃO DE PENG: SELEÇÃO DE RESINA........................................................35 3.2.5.3 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE EQUILÍBRIO - CINÉTICA DE ADSORÇÃO .....................................36 3.2.5.4 ISOTERMAS DE EQUILÍBRIO.........................................................................................................36 3.2.5.5 ENSAIOS DE ADSORÇÃO DE PENICILINA G..................................................................................37
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS vi
3.2.6 ENSAIOS DE DESSORÇÃO EM BATELADA ..................................................................................37 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 38
4.1 ESTUDO DA QUANTIFICAÇÃO DE PENICILINA G EM MEIO DE CULTIVO......................................................38 4.1.1 COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS JÁ UTILIZADOS....................................................................38 4.1.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ENZIMÁTICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE PENG........40
4.2 INFLUÊNCIA DA COMPOSIÇÃO (TEMPO DE CULTIVO) DO MEIO DE CULTIVO NA ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DE PENICILINA G.............................................................................................41 4.3 TESTES DE ESTABILIDADE DA PENICILINA G EM MEIO AQUOSO ...........................................43 4.4 EFICIÊNCIA DE DIFERENTES ADSORVENTES NA SEPARAÇÃO DE PENICILINA G EM DIFERENTES VALORES DE PH.........................................................................................................46 4.5 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE EQUILÍBRIO - CINÉTICA DE ADSORÇÃO................................50 4.6 ISOTERMAS DE ADSORÇÃO .....................................................................................................50 4.7 ESTRATÉGIAS DE ADSORÇÃO DE PENICILINA G .....................................................................55
4.7.1 DESENVOLVIMENTO DO PROCESSO DE ADSORÇÃO DE PENICILINA G COM GRADIENTE DE PH .........55 4.8 DESSORÇÃO DE PENICILINA G ................................................................................................59 4.9 PUREZA DA PENG AO FINAL DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO................................................68 4.10 SOLUBILIDADE DE PENICILINA G EM DIFERENTES SOLVENTES .............................................70
5 CONCLUSÕES........................................................................................... 73 6 SUGESTÕES............................................................................................... 75 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 76
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1.: Estrutura básica da molécula de penicilina. ...................................................... 4 Figura 2.2.: Estrutura do ácido 6-amino penicilânico (6-APA) ........................................... 4 Figura 2.3.: Esquema da hidrólise de penicilina G catalisada pela enzima penicilina G
acilase ................................................................................................................ 5 Figura 2.4.: Reação do anel β-lactâmico (Arnott et al, 1995) .............................................. 8 Figura 2.5.: Esquema da degradação ácida da penicilina. (Arnott et al, 1995)................... 8 Figura 2.6.: Esquema da produção industrial de penicilina G (Menezes,1996)................... 9 Figura 2.7.: Separação da penicilina com acetato de amila, em três estágios e em
contracorrente (Treybal, 1980) ........................................................................ 10 Figura 2.8.: Esquema de um trocador catiônico (A) e aniônico (B) (Collins et al, 1995) . 15 Figura 2.9.: Estrutura química básica do carvão ativado.................................................... 17 Figura 2.10.: Estrutura química da resina Amberlite XAD-4............................................. 19 Figura 2.11.: Estrutura química da resina Amberlite XAD-7............................................. 19 Figura 2.12.: Diagrama das isotermas: (a) favorável, (b) linear e (c) desfavorável ........... 21 Figura 2.13.: Isotermas comuns de adsorção (Belter et al, 1988). ..................................... 22 Figura 2.14.: Etapas de transporte de massa na adsorção utilizando adsorventes porosos
(Sleijko, 1985). ................................................................................................ 25 Figura 3.1.: Curva de calibração de penicilina G em água utilizando o cromatógrafo
modelo CLASS - LC10 .................................................................................. 32 Figura 3.2.: Curva de calibração de penicilina G em caldo de cultivo utilizando o
cromatógrafo modelo CLASS VP ................................................................... 33 Figura 4.1.: Curva de calibração de penicilina G utilizando a hidrólise de penG.............. 41 Figura 4.2.:Curvas de calibração para quantificar penG presente em caldo de cultivo
obtido com diferentes tempos. Análise em HPLC, coluna C-18, µBondPack, 3,9x 300mm e fase móvel 20% acetonitrila, 80% tampão fosfato 10mM, pH 6,5, tiossulfato de sódio 10mM em uma vazão de 1 mL.min-1....................... 42
Figura 4.3.: Gráfico da estabilidade de PenG a 4oC em diferentes valores de pH (a) 2,0 (b) 2,5, (c) 3,0, (d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0.................................................................... 44
Figura 4.4.: Gráfico da estabilidade de PenG a 12oC em diferentes valores de pH (a) 2,0 (b) 2,5, (c) 3,0, (d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0. ............................................................. 45
Figura 4.5.: Esquema da Adsorção em Carvão Ativado e gráfico da quantidade de penG adsorvida, em meio aquoso (a) e em caldo (b) ................................................ 47
Figura 4.6.: Gráfico da adsorção de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvão ativado, a 4ºC, pH 6,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pré-tratado para 5 mL de caldo de cultivo contendo 50 g.L-1 de penG.............................. 47
Figura 4.7.: Gráfico da adsorção de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvão ativado, a 4ºC, pH 4,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pré-tratado para 5 mL de caldo de cultivo contendo 50 g.L-1 de penG.............................. 48
Figura 4.8.: Gráfico da adsorção de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvão ativado, a 4ºC, pH 5,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pré-tratado para 5 mL de caldo de cultivo contendo 50 g.L-1 de penG.............................. 48
Figura 4.9.: Efeito do pH sobre a eficiência de adsorção................................................... 49
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS viii
Figura 4.10.: Cinética de Adsorção (a) 4oC e (b) 12oC, utilizando-se 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratada para 2 mL de caldo de cultivo de concentração de penG de 50 g.L-1 em valores de pH 4,0; 5,0 e 7,0..................................................... 50
Figura 4.11.: Isotermas de Adsorção- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de caldo de cultivo. ......................................... 52
Figura 4.12.: Isotermas de Adsorção- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de água deionizada.......................................... 54
Figura 4.13.: Resultados da adsorção de penG a 4°C na faixa de pH de 3,5 a 7,0 utilizando 2 g de XAD-4 adicionados gradativamente em 40mL de caldo com 50g.L-1 de penG................................................................................................................. 56
Figura 4.14.: Resultados da adsorção de penG a 4°C na faixa de pH de 3,2 a 7,0 utilizando 2 g de XAD-4 adicionado gradativamente em 40 mL de caldo com 50 g.L-1 de penG................................................................................................................. 57
Figura 4.15.:Resultados da adsorção de penG a 4°C na faixa de pH de 3,5 a 4,0 utilizando 1,5g de XAD-4 adicionado em 18mL de caldo com 50g.L-1 de penG ............ 58
Figura 4.16.:Diagrama de Pareto para o 1o delineamento .................................................. 61 Figura 4.17.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
no 1o delineamento .......................................................................................... 62 Figura 4.18.: Distribuição dos resíduos em torno da reta que indica normalidade para a
resposta no 1o delineamento ............................................................................ 62 Figura 4.19.: Superfícies de resposta e curva de contorno para a dessorção de penG (%)
em função da temperatura e pH (a) e (b), da temperatura e [EtOH] (c) e (d) e do pH e [EtOH] (e) e (f) no 1o delineamento .................................................. 63
Figura 4.20.: Diagrama de Pareto para o 2o delineamento ................................................. 65 Figura 4.21.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta
no 2o delineamento .......................................................................................... 66 Figura 4.22.: Distribuição dos resíduos em torno da reta que indica normalidade para a
resposta no 2o delineamento ............................................................................ 67 Figura 4.23.: Superfícies de resposta para a dessorção de penG (%) em função da
temperatura e [EtOH] no 2o delineamento ...................................................... 67 Figura 4.24.: Curva de contorno para a dessorção de penG (%) em função da temperatura e
[EtOH] no 2o delineamento ............................................................................. 68 Figura 4.25.: Cromatogramas referentes ao processo de purificação de penG. Linha vede:
caldo fermentativo contendo penG 50 g.L-1 e Linha vermelha componentes do caldo fermentativo dessorvidos com etanol 82,5%. ........................................ 69
Figura 4.26.: caldo de cultivo antes da adsorção e depois da dessorção com solução etanólica........................................................................................................... 70
Figura 4.27.: Solubilidade da penG em mistura de etanol-água a pH 6,2 em diferentes temperaturas ( 0 , 8 e 16oC) ............................................................................ 71
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS ix
ÍNDICE DE TABELAS Tabela 2.1.: Base físico-química para o desenvolvimento de processos de separação
(Ghosh et al, 1996)........................................................................................ 11 Tabela 2.2.:Características da adsorção física e da adsorção química ............................... 13 Tabela 2.3.:Propriedades físicas dos adsorventes Amberlite XAD-4 e XAD-7 e XAD-761.
....................................................................................................................... 20 Tabela 4.1.: Teste comparativo entre os métodos para quantificar penicilinaG. Amostras:
(1) solução de penG sem a hidrólise por penicilinase , (2) solução de penG na mesma concentração hidrolisada por penicilinase por 30 min e (3) solução de penG na mesma concentração hidrolisada por penicilinase por 60 min. Condições de diluição com tampão fosfato 100mM: 1:500 (bioensaio), 1:4 (iodometria) e 1:1 ( CLAE). .......................................................................... 39
Tabela 4.2.: Estudo comparativo CLAE x Hidrólise enzimática ....................................... 40 Tabela 4.3.: Dados de estabilidade de PenG frente a pH ................................................... 46 Tabela 4.4.: Resultados experimentais obtidos na determinação da isoterma de equilíbrio
para penG utilizando XAD-4, em pH 4 e 7 e temperatura 4oC e 12oC, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de caldo de cultivo............................................................................................................ 51
Tabela 4.5.: Parâmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir, Freundlich e Linear para a penG e seus coeficientes de correlação. .................................. 52
Tabela 4.6.: Porcentagem de penG na sua forma neutra e iônica em diferentes valores de pH. ................................................................................................................. 53
Tabela 4.7.: Resultados experimentais obtidos na determinação da isoterma de equilíbrio para penG utilizando XAD-4, em pH 4 e temperatura 4oC, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de água deionizada. .......... 54
Tabela 4.8.: Parâmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir para a penG e seus coeficientes de correlação. ............................................................................ 55
Tabela 4.9.: Valores utilizados do 1o DCCR para três fatores ........................................... 60 Tabela 4.10.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 1o
delineamento ................................................................................................. 60 Tabela 4.11.: Coeficientes de regressão para a resposta no 1o delineamento..................... 61 Tabela 4.12.: ANOVA para a resposta no 1o delineamento ............................................... 62 Tabela 4.13.: Valores utilizados do 2o DCCR para dois fatores......................................... 64 Tabela 4.14.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 2o
delineamento ................................................................................................. 64 Tabela 4.15.: Coeficientes de regressão para a resposta no 2o delineamento..................... 65 Tabela 4.16.: ANOVA para a resposta no 2o delineamento ............................................... 66 Tabela 4.17.: Relação dos picos dos cromatogramas referentes ao processo de purificação
e os respectivos valores de suas áreas ........................................................... 69 Tabela 4.18.: Solubilidade da penG em diferente solventes a 8oC e pH 6,2 ...................... 71 Tabela 5.1.: Resumo das condicões definidas para o processo de purificação de penG por
adsorção em resina Amberlite XAD-4 em batelada...................................... 74
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS x
NOMENCLATURA
%EA Porcentagem de eficiência de adsorção % 6-APA Ácido 6-amino penicilânico 7-ACA Ácido 7-amino cefalosporânico a Área do pico na análise por CLAE A Forma iônica ABS Absorbância AFA Ácido fenil acético AFNA Ácido fenoxi acético AMM Água de maceração de milho AMPI Ampicilina C* Concentração de soluto em solução no equilíbrio mg/ mL CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência Co Concentração inicial de soluto mg/mL CPC Cefalosporina C DHALO Diâmetro do halo no bioensaio cm DCCR Delineamento composto central rotacional EMPG Éster metílico de fenilglicina EtOH Etanol FG D-fenilglicina HA Forma neutra KF Constante de equilíbrio de Freundlich mL/ mg resina KH Constante de equilíbrio de Henry mL/ mg resina KL Constante de equilíbrio de Langmuir mg / mL L Efeito principal linear da regressão n Indice da isoterma de Freundlich OD Densidade óptica PDAB p-dimetilaminobenzaldeído penG Penicilina G PGA Penicilina G acilase pI Ponto isoelétrico pKa Constante de equilíbrio de ionização Q Efeito principal quadrático da regressão q* Quantidade de soluto adsorvida pela resina no equilíbrio mg/ g resina qm Capacidade máxima de adsorção da resina mg / g resina VL Volume de solução mL w Massa de resina mg
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 1
1 INTRODUÇÃO
O processamento final de produtos biotecnológicos, que envolve as etapas de
separação, concentração e purificação, é usualmente responsável por grande parte do custo
de produção desses compostos.
A enorme competição existente em nível mundial no setor da indústria de processos
biotecnológicos em geral, e particularmente da indústria farmacêutica, vem colocando dois
tipos de desafios. O primeiro tipo é análogo àquele enfrentado pela indústria química
convencional a partir da década de 70: aumentar a eficiência dos processos. O segundo
desafio diz respeito às crescentes exigências de agências governamentais, no sentido da
redução de impactos ambientais. Em outras palavras, a busca por processos “limpos” ou
de “química verde”, ecologicamente sustentáveis, é uma das forças-motrizes do
desenvolvimento de novos processos bioquímicos e farmacêuticos industriais.
A produção de penicilina G se constitui em um clássico processo industrial, onde o
processo de recuperação do produto por extração com solvente orgânico já está bem
estabelecido. No Brasil, a única empresa que ainda detém tecnologia para produção de
penG (microrganismo de alta produtividade, tecnologia, equipamentos) é a Prodotti S/A.
Essa empresa, localizada na Av. João Dias, São Paulo-SP, nas instalações que eram
ocupadas pela SQUIBB, está hoje rodeada pela cidade e tem por isso sérios problemas
ambientais pela incompatibilidade de operação industrial numa agora região urbana. Esses
problemas vêm motivando a Prodotti a trabalhar com processos mais limpos, tais como a
síntese enzimática de ampicilina, na qual já vem trabalhando com o grupo da UFSCar
através de Projeto PIPE–FAPESP (proc.03/13177-4) e projeto FINEP - Ação Transversal
(Inovações da Produção de Antibióticos β-Lactâmicos com Redução de Impactos
Ambientais), ambos em andamento. O processo clássico utilizado na indústria para
produção de penicilina G utiliza a extração com um solvente altamente hidrofóbico
(acetato de amila, por exemplo) para separação do antibiótico do meio de cultivo. O
escape desse solvente para o ambiente, bem como presença dele nos efluentes líquidos da
indústria, mesmo que em baixas concentrações aumenta o impacto ambiental do processo.
Por essa razão, foi proposto, também, como objetivo do projeto FINEP o estudo da
viabilidade técnica da substituição do processo de extração de penicilina G por solvente
por outro menos agressivo ao ambiente.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 2
A utilização de adsorventes poliméricos para processos de purificação e para
recuperação de compostos a partir de soluções diluídas tem sido estudada com muito
interesse nos últimos anos. As principais vantagens da utilização destes adsorventes são
sua seletividade e facilidade de regeneração. Os adsorventes poliméricos neutros mais
comuns são os constituídos por co-polímeros de estireno (ou etilvinilbenzeno) e
divinilbenzeno. Durante anos, esses adsorventes têm sido desenvolvidos para oferecer a
resistência mecânica necessária, apresentarem grandes áreas superficiais para adsorção e
possuírem tamanhos de poros apropriados (Grzegorczk et al, 1996).
O desenvolvimento de um processo de separação eficiente e seletivo que utilize
adsorventes poliméricos requer conhecimento da influência das condições de operação
(pH, força iônica, temperatura, concentração de composto na corrente de entrada) sobre o
fenômeno de adsorção (Vieira et al, 2003). Foi, assim, objetivo deste trabalho, determinar
inicialmente os limites operacionais do estudo em termos de estabilidade da penG e a
seguir se avaliar a influência do tipo de resina, do pH e da temperatura na eficiência de
adsorção desse antibiótico em resinas hidrofóbicas. Para a(s) resina(s) e condições
selecionadas, foram determinadas as isotermas de adsorção e estudadas as condições de
dessorção utilizando-se água e/ou etanol. O estudo foi realizado em água e em caldo de
cultivo para se avaliar a influência da presença de outros componentes na adsorção de
penG.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 ANTIBIÓTICOS
Os antibióticos são produtos do metabolismo secundário de alguns microrganismos
que inibem o processo de crescimento de outros organismos. Eles formam um tipo
especial de agentes quimioterápicos pelo fato de serem produtos metabólicos fortemente
ativos, mesmo em concentrações muito pequenas.
A inibição do processo de crescimento de um microrganismo por outro já era
conhecida há muito tempo. Em 1881, Tyndall verificou que meios de cultura turvos pelo
crescimento bacteriano se tornavam límpidos quando cresciam fungos em sua superfície.
O exemplo de maior destaque data de 1929 quando Alexander Fleming notou a inibição
do crescimento bacteriano em uma placa de Petri com ágar contaminada com o fungo
Penicillium notatum. A substância produzida pelo fungo recebeu o nome de “penicilina”.
(Crueger, 1984)
Durante a Segunda Guerra Mundial, a forte demanda de agentes quimioterápicos para
o tratamento de infecções causadas pelos ferimentos deu origem ao desenvolvimento de
um processo de produção para a penicilina, iniciando-se assim, a era dos antibióticos.
2.2 PENICILINAS
A descoberta da penicilina, o primeiro antibiótico que encontrou uso prático no
homem, marcou o inicio de uma era que produziu grande número de tais substâncias. As
primeiras penicilinas, biossintéticas ou naturais, ainda hoje estão em uso clinico. Outras,
semi-sintéticas, com amplo espectro e melhores propriedades farmacocinéticas, foram
sendo utilizadas no decorrer dos anos (Ligon, 2004)
2.2.1 ESTRUTURA QUÍMICA DAS PENICILINAS
As penicilinas compõem uma classe terapêutica de antibióticos com estruturas
relacionadas e com propriedades e atividades ligeiramente diferenciadas. A estrutura de
todas as penicilinas, mostrada na Figura 2.1, apresenta um núcleo comum, o ácido 6-
amino penicilâmico (6-APA), mostrado na Figura 2.2.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 4
Figura 2.1.: Estrutura básica da molécula de penicilina.
Figura 2.2.: Estrutura do ácido 6-amino penicilânico (6-APA)
O anel β-lactâmico, presente no 6-APA, é responsável pela atividade de todas as
penicilinas. Além desse anel, o 6-APAsua estrutura contém um anel de quatro membros
chamado β-lactâmico e um anel de cinco membros denominado anel tiazolidinico. A
existência do anel β-lactâmico em todas as penicilinas é responsável pela designação geral
destes antibióticos de antibióticos β-lactâmicos.
Na ausência de precursor (ácido da cadeia lateral) o Penicillium chrysogenum produz
baixa concentração de 6-APA, além de misturas de penicilinas. As penicilinas naturais
com interesse industrial e econômico, atualmente, são a penicilina G (benzilpenicilina) e a
penicilina V (fenoximetilpenicilina) (Hillenga, 1995).
A obtenção de uma dada penicilina está, conforme já comentado, relacionada com o
tipo de precursor utilizado. Assim, o fornecimento de sais de ácido fenil acético (AFA)
leva à formação exclusiva de penG, enquanto que o fornecimento de sais de ácido fenoxi
acético (AFNA) leva à formação exclusiva de penicilina V.
As penicilinas naturais podem ser destruídas por enzimas denominadas penicilinases.
Essas enzimas rompem o anel β-lactâmico do núcleo básico da molécula, através da
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 5
hidrólise da ligação amida presente no anel. Por essa razão estas enzimas são também
denominadas β-lactamases. Esse rompimento impede a penicilina de atuar no bloqueio da
formação da parede celular de bactérias, não combatendo assim a infecção. Bactérias que
produzem a enzima penicilinase são assim resistentes a antibióticos β-lactâmicos.
2.2.2 PENICILINAS SEMI – SINTÉTICAS
Em 1959, o 6-APA foi descoberto e sintetizado em quantidades apreciáveis, o que
serviu como ponto de partida para a síntese química de diversos derivados da penicilina
(Nathwani et al, 1993). O anel central, 6-APA, pode ser produzido em grande quantidade
por fungos por fermentação ou por hidrólise enzimática de penG, como mostrado na
Figura 2.3.
Figura 2.3.: Esquema da hidrólise de penicilina G catalisada pela enzima penicilina G acilase
É possível adicionar, a esse anel central, diferentes cadeias laterais, criando novos
tipos de penicilinas que não são encontradas na natureza. Estas penicilinas são
denominadas penicilinas semi-sintéticas, e algumas apresentam vantagens sobre as
penicilinas naturais. Por exemplo, a feneticiclina, umas das primeiras penicilinas semi-
sintéticas produzidas para uso clínico, é mais facilmente absorvida que a penicilina V.
Além de sua atividade intrínseca como antibiótico, a penG é também utilizada como
matéria prima para a produção dos antibióticos semi-sintéticos através da ligação de
diferentes cadeias laterais ao grupo amino do 6-APA. (Pelkzar et al, 1986)
2.3 PENICILINA G
A penG ou benzilpenicilina é o derivado benzílico do 6-APA, apresentado sob a forma
de sal alcalino sódico ou potássico. Os sais alcalinos da penicilina apresentam-se como um
pó cristalino, branco, inodoro, facilmente solúvel em água, muito higroscópico e instável
em solução aquosa devido ao seu anel lactâmico. Funde-se a 215oC, com decomposição
(Menezes, 2000).
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 6
A penicilina G possui um pKa de 2,74. Sua forma neutra é pouco solúvel em água. É
um ácido orgânico fraco. A concentração da sua forma ionizada (polar) varia com o pH e,
conseqüentemente, varia sua solubilidade em água.
A variação da concentração da forma iônica da penG com o pH determina também sua
absorção pelo organismo. No estômago, onde o pH é 2,0 tem-se 15,4% das moléculas de
penG na forma iônica e 84,60% na forma neutra. No duodeno, onde o pH é 6,0 tem-se
99,95% das moléculas ionizadas. Somente a forma neutra, apolar, consegue atravessar a
barreira lipídica da membrana celular. O mesmo fenômeno explica a eficiência da extração
de pen G em solvente apolar nos baixos valores de pH utilizados na indústria e faz prever
a viabilidade de sua adsorção eficiente em resinas hidrofóbicas.
2.3.1 ESTABILIDADE Uma característica importante de penicilinas para seu processamento industrial é sua
estabilidade.
A integridade estrutural do anel β-lactâmico do ácido 6-aminopenicilânico é
primordial para a atividade das penicilinas e cefalosporinas, com a ruptura da ligação
amida desse anel resultando num produto biologicamente inativo. Esse anel é a parte da
molécula dos antibióticos β-lactâmicos que se encaixa no sítio ativo da enzima
responsável pela síntese das peptoglicanas, que formam a parede celular das bactérias. A
ação antibacteriana da penicilina se deve ao fato de que sua presença impede a formação
de uma parede correta, a qual fica, portanto, facilmente sujeita a lise celular. A reação de
abertura do anel pode ser catalisada por ácido, base ou pela enzima β-lactamase, que é
produzida por bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos. A degradação de penG é
influenciada pelo pH, grau de cristalinidade, força iônica, íons metálicos e composição do
solvente (Arnott et al, 1995).
Navarro et al, 2003, apud Strominger, 1967, relatam que a atividade biológica dos
antibióticos β-lactâmicos é atribuída à grande reatividade do anel. Essa reatividade é
devida à tensão estrutural do anel β-lactâmico, que ocorre devido ao fato do ângulo de
ligação entre os átomos (90º) ser inferior ao correspondente ângulo de sp3 híbrido
(109,47º) ou sp2 (120º). Dessa forma, a característica de ressonância da ligação amida,
responsável por sua grande estabilidade, é inibida, resultando na conhecida instabilidade
da estrutura do anel β-lactâmico.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 7
É relatado que a ruptura do anel β-lactâmico é exotérmica, por causa da grande
quantidade de energia liberada na fissão da ligação carbono-nitrogênio. (Michinik, 2004,
apud Pikal et al, 1978)
Navarro et al (2003) acompanharam a metanólise de quatro antibióticos β-lactâmicos
(PenG, Penicilina V, Ampicilina e Amoxicilina) em reação catalisada por Zn2+, para
estudarem a estabilidade dessas moléculas. Verificaram que a reação de degradação ocorre
através da formação de dois complexos metálicos com a penicilina intacta, que se
decompõem a diferentes velocidades para gerarem produtos idênticos. Compararam os
resultados entre si e entre os obtidos na presença de Cd2+ (Navarro et al, 1999) e
verificaram que a velocidade de degradação de penicilinas em metanol catalisada por íon
cádmio é muito maior que a catalisada por íon zinco.
A absorção de penicilina, que requer a sua passagem pela barreira lipídica da
membrana celular, é um fenômeno semelhante ao da sua extração e da sua adsorção em
um meio hidrofóbico. Quanto menor o pH, mais moléculas de penG estarão na forma
eletricamente neutra e, portanto, terão mais facilidade em se transferir para o meio
hidrofóbico (lipídeos da membrana ou solvente orgânico ou resina hidrofóbica). Contudo,
a molécula é instável a pH ácido. O pH ótimo de adsorção/extração deverá ser assim uma
solução de compromisso entre coeficiente de partição e estabilidade da molécula no tempo
necessário de contacto.
A temperatura de operação é outra variável importante. A adsorção é exotérmica e o
equilíbrio assim deverá ser favorecido a baixas temperaturas. A menor temperatura deverá
também favorecer a estabilidade da molécula no baixo pH, uma vez que diminui a
velocidade da reação de abertura do anel β-lactâmico catalisada pelos íons H+. Contudo,
na menor temperatura, o tempo necessário para ocorrer a adsorção irá aumentar, havendo,
pois uma solução de compromisso entre quantidade adsorvida e tempo necessário para que
ocorra essa adsorção.
Estudos foram realizados para minimizar perdas por degradação. Arnott et al (1995)
estudaram o efeito do campo elétrico de alta voltagem na degradação de penG. Segundo
Arnott et al (1995), a aplicação do campo elétrico durante a extração por solvente oferece
significativas vantagens sobre outras técnicas de intensificação.
Benedict et al (1945) estudando a estabilidade de penG a diferentes valores de pH,
identificaram a estabilidade ótima desta a pH 6,0, com meia vida de 396h em 24ºC, que foi
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 8
reduzida rapidamente para a ordem de minutos , quando se testou o pH 2,0. A Figura 2.4
mostra a reação do anel β-lactâmico e a Figura 2.5 mostra um esquema da degradação
ácida da penicilina.
Figura 2.4.: Reação do anel β-lactâmico (Arnott et al, 1995)
Kheirolomoom et al (1999) estudaram a estabilidade da penG em função da
temperatura e pH. A análise da estabilidade mostrou que penG é mais estável no intervalo
de pH de 5,0 a 8,0. A estabilidade máxima da penG é em torno do pH 6,0 e sua
instabilidade é muito mais elevada em valores de pH ácidos do que valores de pH básicos.
A estabilidade da penG diminui com o aumento na temperatura para todos os valores de
pH.
Figura 2.5.: Esquema da degradação ácida da penicilina. (Arnott et al, 1995)
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 9
2.3.2 PROCESSO DE PRODUÇÃO INDUSTRIAL
A penicilina é produzida industrialmente pelo cultivo aeróbico do fungo Penicillium
chrysogenum ou outro, em reatores agitados, com aeração, operados de forma semi-
descontínua (isto é, alimentação contínua de várias substâncias em um cultivo
descontínuo) (Menezes, 1996).
A Figura 2.6 mostra um esquema da produção industrial de penG.
Figura 2.6.: Esquema da produção industrial de penicilina G (Menezes,1996).
O tanque de cultivo é carregado com um substrato, que pode ser composto de açúcar
(exemplos: glicose ou sacarose), água de maceração de milho (AMM) e outras substâncias
(exemplo: sais), que são fonte de carboidratos, nitrogênio e nutrientes (Menezes, 1996).
Um exemplo de produção industrial de penG se inicia com a preparação do inóculo
para a fermentação, com a inoculação de balões de 500 mL, contendo 100 mL de meio de
cultura, com esporos de Penicillium chrysogenum. Os balões são em seguida colocados
num agitador orbital, numa câmara a 25ºC e após 4 dias o caldo de cultura resultante é
utilizado para inocular balões contendo 2 L de meio. O caldo dessa segunda etapa em
balões é utilizado como inóculo para nova propagação, com a duração de apenas 2 dias,
num tanque de 100 L com agitação, aeração, arrefecimento e controle de pH e
temperatura. Por fim, num tanque com 500 L de meio, produz-se, após 3 dias, um volume
de cultura suficiente para inocular até 120 m3 de meio em tanques com 200 m3 de
capacidade (Menezes, 1996).
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 10
Após a inoculação do meio segue-se uma fase breve de operação descontínua (cerca de
12 h). A partir daí se iniciam adições controladas de açúcar e outras substâncias (ácido
fenilacético, sais, óleos vegetais, gorduras animais, amônia e ácido para correção do pH)
em quantidades suficientes para manter constante o teor de biomassa na fase de produção
da penicilina. A regulação das adições é estabelecida empiricamente para cada estirpe de
fungo (Menezes, 1996).
A condução desse processo é quase exclusivamente manual, sendo apenas controlados
automaticamente a concentração de O2 dissolvido, o pH e a temperatura. O pH e a
temperatura são mantidos constantes (6,5 e 25-27ºC) e a velocidade de aeração está
geralmente entre 0,5 e 1,0 m3 de ar/m3 de meio/min (Menezes, 1996).
A purificação da penicilina, após a fase de fermentação, é feita através de várias etapas
rápidas de extração líquido-líquido do caldo fermentado, ora com um solvente orgânico
(por exemplo, acetato de amila ou butila, ou metil isobutil cetona), ora com uma solução
aquosa, sob baixa temperatura (de 0 a 3ºC) e com controle rígido de pH. O resultado final
é um sal de penicilina (sal de potássio, sódio ou de procaína, dentre outros)
(Menezes, 1996).
2.3.3 MÉTODOS DE SEPARAÇÃO
2.3.3.1 PURIFICAÇÃO POR EXTRAÇÃO COM SOLVENTE
A extração líquido-líquido por meio de solventes orgânicos é o processo que vem
sendo utilizado na indústria para separação de penG do caldo de cultivo. Os principais
solventes utilizados na extração são a acetona, o acetato de amila,o acetato de butila, o
hexano, entre outros (Treybal, 1980).
Na extração da penicilina, utilizam-se extratores com três estágios operando em
contracorrente, como representado na Figura 2.7.
Figura 2.7.: Separação da penicilina com acetato de amila, em três estágios e em contracorrente (Treybal, 1980)
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 11
A corrente que contém a maior concentração de penicilina é a que está saindo no
terceiro estágio, ou seja, corrente de solventes com penicilina, enquanto nos dois estágios
anteriores a corrente de solvente contém pouca penicilina.
Como penG é um ácido fraco, sua forma neutra é extraída na fase orgânica (apolar).
Assim, o primeiro passo na extração é ajustar o pH da fase aquosa entre 2 - 2,5 e
extrair a penicilina para a fase orgânica (solvente). O extrato é então tratado com uma
solução de pH aproximadamente 6,0 para obter uma solução aquosa rica em penicilina.
Para o próximo passo, o pH é novamente ajustado com ácido para um valor baixo e a
penicilina é novamente extraída pelo solvente obtendo uma solução concentrada pura.
A operação de extração é realizada com dificuldade, pois a penicilina degrada
rapidamente com a redução do pH. Assim para a extração em temperatura ambiente, é
necessário realizar a transferência da penicilina em pH baixo de maneira rápida.
2.3.3.2 OUTROS MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO O desenvolvimento de novos e eficientes métodos de separação se baseia na
exploração de características físico-químicas do produto, tais como: carga superficial,
hidrofobicidade, peso molecular e bioespecificidade frente a ligantes (íons metálicos),
ponto isoelétrico (pI) e estabilidade (Ghosh et al, 1996). A Tabela 2.1 mostra alguns
processos de separação. Tabela 2.1.: Base físico-química para o desenvolvimento de processos de separação (Ghosh et al, 1996).
Base Físico-Química Processo de separação
Carga
Cromatografia de troca iônica Eletrodiálise
Partição em sistema aquoso bifásico Extração por micela reversa
Hidrofobicidade
Cromatografia por interação hidrofóbica Cromatografia de fase reversa
Precipitação Partição em sistema aquoso bifásico
Ligação específica Cromatografia de afinidade
Tamanho Filtração em gel
Ultrafiltração Diálise
Mobilidade elétrica Eletroforese
Ponto isoelétrico Cromatografia
Cristalização seletiva Velocidade de sedimentação Centrifugação
Atividade da superfície Adsorção
Fracionamento
Solubilidade Extração sólido-líquido Extração supercrítica
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 12
A cristalização vem sendo muito utilizada na indústria química como uma maneira de
isolar e purificar produtos. Além disso, também é uma ferramenta que permite controlar a
forma física de materiais sólidos. A extração líquido-líquido vem sendo utilizada há
décadas na indústria de antibióticos (recuperação de penicilina G e penicilina V), sendo
que essa técnica pode ser operada continuamente.
2.4 ADSORÇÃO
Nas últimas décadas, com o avanço das pesquisas, bem como com o acentuado
desenvolvimento registrado na petroquímica, a adsorção passou a ser utilizada como uma
operação unitária importante dentro da Engenharia Química. Atualmente, a adsorção é
aplicada em processos de purificação e separação, apresentando-se como uma alternativa
importante e economicamente viável em muitos casos.
Segundo Belter (1988), as duas operações unitárias mais comumente usadas para isolar
(concentrar) produtos de soluções diluídas são adsorção e extração. A adsorção tende a ter
uma menor capacidade, mas uma maior seletividade que a extração.
O processo de adsorção envolve a separação de uma substância de uma fase
acompanhada por seu acúmulo ou concentração na superfície de outra. A fase que está
adsorvendo é o adsorvente, e o material concentrado ou adsorvido na superfície desta fase
é o adsorbato. A adsorção é, então, diferente de absorção, processo no qual o material
transferido de uma fase para outra interpenetra a segunda fase para formar uma “solução”
(Sleijko, 1985).
Usualmente o adsorvente é composto de micropartículas que são empacotadas em um
leito fixo por onde passa a fase fluida continuamente até que não haja mais transferência
de massa. Uma vez que o adsorbato concentra-se na superfície do adsorvente, quanto
maior for esta superfície, maior será a eficiência da adsorção. Por isso, geralmente os
adsorventes são sólidos com partículas porosas. (Borba, 2006)
Vários mecanismos podem estar envolvidos na adsorção. Na adsorção física, forças
fracas tais como forças de Van der Waals são dominantes; já na adsorção por troca-iônica,
ligações iônicas fortes são utilizadas (Shulen et al, 1992).
As discussões apresentadas para os processos de adsorção normalmente se referem a
adsorção de gases em superfície de sólidos. Contudo, essas interpretações podem ser
aplicadas analogamente para compostos dissolvidos em líquidos, o que nos ajuda a
visualizar que tipo de fenômeno de adsorção pode ocorrer num determinando processo de
adsorção utilizado em separação de produtos biotecnológicos (Barboza, 1998).
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 13
Biomoléculas adsorvem seletivamente em uma variedade de fases e,
conseqüentemente, técnicas de adsorção vêm se tornando bastantes comuns nas separações
de bioprodutos, principalmente por apresentarem ótima resolução (Kennedy et al, 1995).
2.4.1 TIPOS DE ADSORÇÃO
O processo de adsorção pode ser subdividido em quatro tipos: adsorção química ou
quimissorção, adsorção física ou fisissorção, adsorção de troca iônica e adsorção
específica que pode ser por bioafinidade ou por exclusão de tamanho.
A adsorção física é não específica e às vezes é similar aos processos de condensação.
As forças de atração das moléculas do fluido no sólido são relativamente fracas e o
processo de adsorção ocorre exotermicamente onde o calor envolvido tem a mesma ordem
de magnitude do calor de condensação, 0,5 a 5 kcal/gmol. O equilíbrio é geralmente
rápido e facilmente reversível, uma vez que a energia requerida à dessorção é pequena. A
energia de ativação para adsorção física normalmente não é maior que 1 kcal/gmol, já que
as forças envolvidas neste tipo de adsorção são fracas (Smith, 1985).
Uma característica importante da adsorção química é que sua magnitude não excede a
camada monomolecular. Esta limitação deve-se ao fato de que as forças de valência que
ligam as moléculas na superfície diminuem rapidamente com a distância (Smith, 1985).
Drouguett (1983) comenta que a adsorção física por não ser ativada é muito rápida,
instantânea, enquanto que a química por ser ativada pode demorar dias ou semanas para
atingir o equilíbrio.
A adsorção pode ser resultante da ligação química entre o sólido adsorvente e o
adsorbato presente na fase fluida. Essa ligação ocorre pela troca ou compartilhamento de
elétrons com elementos químicos como complexos ou íons metálicos, ligados à superfície
do material sólido. Este processo denominado quimissorção é exotérmico, ocorre somente
como uma monocamada e é irreversível.
As principais diferenças entrem a adsorção física e química são mostradas na Tabela 2.2.
Tabela 2.2.:Características da adsorção física e da adsorção química Adsorção Física Adsorção Química
• Baixo calor de adsorção (< 2 ou 3 vezes que o calor latente de vaporização).
• Alto calor de adsorção (> 2 ou 3 vezes que o calor latente de vaporização).
• Formação de monocamada ou multicamadas. Não há dissociação das espécies adsorvidas. Somente significante a baixas temperaturas.
• Somente formação de monocamada. Pode envolver dissociação das espécies adsorvidas. Possível em uma larga escala de temperatura.
• Rápida, não ativada, reversível. Não há transferência de elétron embora, possa haver polarização do adsorbato.
• Ativada, pode ser lenta e irreversível. Ocorre a transferência de elétrons, formando uma ligação entre o adsorbato e o adsorvente.
Fonte: Ruthven, 1984
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 14
O termo adsorção se relaciona com processos nos quais moléculas se acumulam na
camada interfacial e dessorção denota o processo contrário. Quando o processo de
dessorção de uma ou várias espécies iônicas é acompanhado por simultânea dessorção de
uma quantidade equivalente de espécies iônicas, este processo é considerado como uma
troca iônica (Zambon, 2003).
Na adsorção de troca iônica, a fase estacionária é altamente carregada, sendo que
solutos com cargas de sinais contrários a esta são seletivamente adsorvidos da fase móvel.
Os solutos adsorvidos podem ser subseqüentemente eluídos, por deslocamentos por outros
íons, com o mesmo tipo de carga, porém com maior força de interação com a fase
estacionária (Collins et al, 1995).
A adsorção específica pode ser por bioafinidade ou por exclusão. A adsorção por
bioafinidade baseia-se principalmente nas propriedades biológicas ou funcionais das
espécies que interagem: a substância a ser separada e o adsorvente. O princípio deste
processo é o isolamento seletivo de macromoléculas biológicas, através das propriedades
dessas substâncias de se unirem reversivelmente a ligantes específicos
(Collins et al, 1995).
A separação por adsorção é baseada em três distintos mecanismos: mecanismo
estérico, de equilíbrio e cinético. No mecanismo de separação estérico, o sólido poroso
tem poros com dimensões que permitem a entrada de pequenas moléculas enquanto
excluem moléculas grandes. O mecanismo de equilíbrio é baseado nas diferentes
capacidades do sólido de acomodar diferentes espécies, isto é, espécies mais fortemente
adsorvidas são preferencialmente removidas pelo sólido. O mecanismo cinético é baseado
nas diferentes taxas de difusão de diferentes espécies dentro do poro, então, pelo controle
do tempo de exposição, a espécie que difunde mais rapidamente é preferencialmente
removida pelo sólido (Do, 1998).
2.4.2 ADSORVENTES
Geralmente, o primeiro passo para o desenvolvimento de um processo de adsorção é a
procura de um adsorvente adequado à separação desejada, o que inclui estudos de
capacidade de adsorção, seletividade, reutilização e estabilidade química e mecânica do
material que se pretende utilizar. As matrizes poliméricas mais usadas no processamento
de antibióticos são compostas de poliestireno e divinilbenzeno (Belter,1985). A seleção de
um adsorvente inclui também considerações da área superficial bem como o tipo de soluto
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 15
e solvente envolvido no processo de adsorção, desde relatos dos tipos de ligações que são
formados entre o sólido e o fluido (Hines et al, 1985).
Os carvões usados são produtos comerciais e não são manufaturados especificamente
para biosseparações. Resinas de troca iônica são baseadas em polímeros sintéticos. Os
polímeros normalmente usados contêm cargas fixas como –SO3-, -COO- ou –NR3-, porém
eles podem adsorver efetivamente solutos iônicos e não iônico (Figura 2.8). Resinas feitas
de estireno e divinilbenzeno muitas vezes adsorvem solutos não polares mais fortemente;
resinas baseadas em éster acrílico tendem a ser mais efetiva para solutos hidrofílicos.
Adsorventes baseados em hidrogéis são muitas vezes feitos de poliacrilamida, os
conhecidos suportes dos géis de eletroforese (Belter et al, 1988).
Figura 2.8.: Esquema de um trocador catiônico (A) e aniônico (B) (Collins et al, 1995)
Os adsorventes sintéticos são materiais esféricos com alta área superficial e uma
superfície hidrofóbica, o que permite a adsorção de compostos orgânicos hidrofóbicos
sobre sua superfície. Por esta função seletiva, eles podem ser usados para extração de
compostos orgânicos de soluções aquosas tais como caldos de cultivo. Considerando a
transferência de massa dos compostos desejados, a função dos adsorventes sintéticos é
similar àquela da extração com solventes. Porém, o uso dos adsorventes sintéticos tem
muitas vantagens sobre os processos convencionais de extração com solventes
(Verral, 1996).
Uma diferença é que os processos adsorventes requerem uma quantidade muito menor
de solventes orgânicos. Estes são freqüentemente tóxicos e inflamáveis logo sua
eliminação pode ter vantagens práticas. Outra diferença é que os adsorventes têm uma
função de peneira molecular baseada na sua estrutura porosa de tal forma que o
fracionamento pelo tamanho molecular pode ocorrer durante o processo. Além disso, os
adsorventes podem ser usados retidos dentro de coluna ou num modo em batelada (em
suspensão). Quando uma grande quantidade de solução tem de ser tratada e a concentração
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 16
do composto desejado é muito baixa, o processo em coluna, com adsorvente empacotado,
pode ser muito eficaz (Verral, 1996).
2.4.2.1 CARVÃO ATIVADO
O carvão ativado é o carbono amorfo, que não tem forma determinada nem regular,
que foi tratado com vapor d’água e calor até adquirir grande afinidade para adsorver
diversas substâncias. São caracterizados por ter uma grande área superficial coberta com
uma combinação de oxigênio e hidrogênio. Essa superfície provavelmente consiste de
grupos polares reativos. Em 1959, sugeriu-se que a superfície destes carvões teria grupos
carbonil, hidroxil, carboxil e lactona. O carvão ativado tem um grande volume de poros
pequenos, o que gera uma grande área superficial. Valores típicos de área superficial para
estes adsorventes estão entre 600 a 1200 m2/g, sendo que é possível encontrar relatos
como 3000 m2/g. Esses poros internos são classificados com base no tamanho dos
microporos (10 a 1000Å) ou macroporos (acima de 1000 Å). A adsorção ocorre
primeiramente nos microporos com os macroporos atuando como canais condutores
(ORNELAS, 2003).
A matéria prima escolhida para a preparação do carvão ativado tem um efeito
determinante nas suas propriedades de adsorção. Madeira, côco, lignina, carvão
betuminoso, petróleo e lodo de carvão ativado têm sido utilizados como matérias primas.
Não existe um tipo de carvão ativado que seja eficiente para todos os fins. Como
descorante, o carvão ativado, com área superficial muito grande e elevado volume de
poros, é mais eficiente que o carvão vegetal e o carvão animal (ORNELAS, 2003).
O principal uso do carvão ativado é na purificação de soluções, como nas soluções
açucaradas de xarope de cana, de açúcar de beterraba ou de milho e na remoção de gostos
e cheiros da água para abastecimento público, de gorduras e de óleos vegetais e animais,
de bebidas alcoólicas, de substâncias químicas e de produtos farmacêuticos. A recuperação
da estreptomicina (antibiótico produzido por fermentação) constitui uma aplicação típica
no tratamento contínuo de efluentes líquidos (ORNELAS, 2003).
O carvão ativado é capaz de adsorver praticamente qualquer solvente orgânico acerca
de 40ºC e dessorvê-lo quando aquecido a 121,1ºC, ou mais para certos compostos. O
carvão ativado pode ser obtido, na atualidade, em forma extrudada (ORNELAS, 2003).
Moléculas de alta massa molecular adsorvem preferencialmente em carvão ativado,
quando comparadas a moléculas de baixa massa molecular. A adsorção é favorecida para
moléculas não polares. Ressalta-se também que o pH da água e a solubilidade do soluto no
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 17
solvente são importantes na sua adsorção pelo carvão ativado, devido ao caráter
hidrofóbico do carvão. A presença de solutos adicionais afetará as características de
adsorção para a remoção de um contaminante específico. Em geral, no entanto, a alta
massa molecular do soluto é o principal fator que controla a possibilidade de sua adsorção.
Moléculas com três ou mais átomos de carbono usualmente são removidas por adsorção
em carvão ativado. Na purificação de produtos biotecnológicos, carvão ativado é utilizado
quase que exclusivamente em meio líquido (ORNELAS, 2003). A Figura 2.9 mostra a
estrutura química do carvão ativado.
Figura 2.9.: Estrutura química básica do carvão ativado
2.4.2.2 AMBERLITE XAD
Em 1965, Rohm & Haas comercializaram o primeiro adsorvente orgânico sintético
macroporoso, também chamado de resina Amberlite XAD. Esses adsorventes foram
descritos como pérolas rígidas insolúveis. Possuem alta variedade de área superficial,
porosidade e distribuição de tamanho de poros. Devido a estas diferenças nas propriedades
de superfície, os adsorventes Amberlite XAD exibem uma ampla faixa de espectros de
polaridade de superfície que vai de um extremo não polar até o outro altamente polar. A
quantidade relativamente grande de dados de adsorção disponíveis tem demonstrado que
os adsorventes Amberlite XAD são altamente versáteis e efetivos como meios de adsorção
(Voser, 1982).
Segundo Voser (1982) não é possível predizer exatamente quais materiais serão
adsorvidos por um dado adsorvente; porém, sob um ponto de vista prático, o conceito
geral de que moléculas hidrofóbicas ou não polares ou porções de moléculas são atraídas
por superfícies hidrofóbicas e hidrofílicas ou materiais polares a superfícies polares ou
hidrofílicas é um conceito proveitoso. Se cada molécula é pensada como tendo ambos os
terminais hidrofóbico e hidrofílico, então o terminal hidrofóbico será atraído pelo
adsorvente hidrofóbico como Amberlite XAD-4. Isto é particularmente verdade quando a
adsorção ocorre a partir de soluções aquosas. Adsorventes de polaridade intermediária ou
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 18
hidrofílica como Amberlite XAD-7 terão uma atração por ambos os terminais da
molécula, o hidrofóbico e o hidrofílico.
Adsorção sobre resinas poliméricas é um método usado para a remoção de compostos
químicos e farmacêuticos a partir de soluções diluídas. O uso destes adsorventes para
separação de aminoácidos, a partir de soluções aquosas diluídas, está começando a ser
estudada como técnica promissora na separação destes compostos (Doulia et al, 2001;
Grzegorczyk et al, 1996).
Vieira et al (2003), estudaram a adsorção em resinas hidrofóbicas de ampicilina
(AMPI), D-fenilglicina (FG), éster metílico de fenilglicina (EMPG) e 6-APA, sendo os
dois primeiros produtos e os dois últimos reagentes na síntese de ampicilina, catalisada por
penG acilase (PGA). A influência do pH, nas eficiências de adsorção desses compostos,
nas resinas XAD-4, XAD-7 e XAD-761, foi avaliada na faixa de pH entre 4,5-8,5. Os
valores obtidos a 4°C foram pouco superiores aos obtidos a 25°C. A eficiência de
adsorção de AMPI e 6-APA diminuíram com o aumento do pH, para as três resinas.
Comportamento oposto foi observado para EMPG, e o pH não afetou a eficiência de
adsorção de FG. Os resultados obtidos através de ensaios em batelada mostraram que a
resina XAD-4 apresentou os melhores valores de seletividade e capacidade de adsorção.
Essa resina atingiu uma razão de ampi/FG= 7,0, ou seja, a resina adsorve 7 vezes mais
ampicilina do que fenilglicina a pH 8,5 e apresentou capacidade de adsorção máxima de,
aproximadamente, 455 mg de ampicilina/ g de resina, a pH 6,5. Diferentes modelos de
equilíbrio de adsorção foram ajustados aos dados experimentais: os modelos Linear e de
Langmuir representaram a adsorção de FG e ampicilina sobre a resina XAD-4 a pH 6,5,
respectivamente.
2.4.2.2.1 AMBERLITE XAD-4
Amberlite XAD-4 é um adsorvente polimérico (copolímero de estireno-divinilbenzeno)
na forma de grânulos brancos. É um polímero não iônico, cujas propriedades de adsorção
derivam da sua estrutura devido à natureza aromática na sua superfície e apresenta elevada
área superficial. A estrutura permite excelente estabilidade física, química e térmica
(Rohm & Haas- XAD-4, 2003).
A Figura 2.10 mostra a estrutura química, e a Tabela 2.3 apresenta algumas
propriedades físicas da resina Amberlite XAD-4.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 19
Figura 2.10.: Estrutura química da resina Amberlite XAD-4
2.4.2.2.2 AMBERLITE XAD- 7
A resina Amberlite XAD-7 é um polímero de acrílico e divinilbenzeno, não iônico,
alifático e com ligações cruzadas, do qual deriva suas propriedades adsortivas. Possui
estrutura macroreticular e apresenta-se na forma de esferas brancas insolúveis. Apresenta
elevada área superficial e excelente estabilidade física e térmica. Devido sua natureza
alifática, o adsorvente polimérico, Amberlite XAD-7, pode adsorver compostos não
polares de sistemas aquosos e compostos polares de solventes não polares
(Rohm & Haas- XAD-7, 2003). A Figura 2.11 mostra a estrutura química da resina
Amberlite XAD-7.
Figura 2.11.: Estrutura química da resina Amberlite XAD-7
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 20
2.4.2.2.3 AMBERLITE XAD- 761
A resina Amberlite XAD-761 é um adsorvente fenólico altamente poroso e granular,
apresenta-se na forma de esferas de coloração ocre. A presença dos grupos hidroxila
fenólico e alcoólico contribui para suas propriedades hidrofílicas (Rohm & Haas- XAD-
761, 2004).
A Tabela 2.3 apresenta as propriedades físicas dos adsorventes: Amberlite XAD-4,
XAD-7 e XAD-761.
Tabela 2.3.:Propriedades físicas dos adsorventes Amberlite XAD-4 e XAD-7 e XAD-761.
Resinas Propriedade Amberlite XAD-4# Amberlite XAD-7## Amberlite XAD-761###Polaridade Hidrofóbica Intermediária Hidrofílica
Funcionalidade Aromática Acrílica Fenólica
Forma Física Grânulos brancos Esferas brancas insolúveis
Grânulos de coloração ocre
Área superficial (m2/g) > 750 > 380 150-250 Diâmetro médio do poro (nm) 5 9 0,6-0,8
Porosidade (mL/mL) > 0,50 > 0,50 0,95-1,18 Faixa de pH de Trabalho 0,0 – 14,0 0,0 – 14,0 0,0 -8,0 Temperatura máxima(°C) 150 150 40
Porosidade*** = medida por porosímetro de mercúrio Fontes: ***Bautista et al, 1999 # Rohm & Haas Co- XAD4, 2003 ## Rohm & Haas Co XAD-7,2003
### Rohm & Haas Co XAD-761,2004
2.4.3 EQUILÍBRIO DE ADSORÇÃO
Adsorção de uma substância de uma fase para a superfície de outra em um sistema
específico leva a uma distribuição termodinamicamente definida daquela substância entre
as fases quando o sistema alcança o equilíbrio. A maneira comum de representar esta
distribuição é expressar a quantidade de substância adsorvida por unidade de massa de
adsorvente, q*, como função da concentração residual de equilíbrio, C*, da substância
remanescente na fase “solução” (Slejko, 1985).
Independente do modelo matemático proposto, uma condição necessária, mas não
suficiente, para a descrição adequada da dinâmica de adsorção em colunas de leito fixo é
que a relação matemática utilizada (isotermas de adsorção, isotermas de troca iônica, lei de
ação das massas) represente apropriadamente os dados de equilíbrio entre as fases na
coluna (Ernest et al, 1997; Silva et al, 2002). Além disso, a primeira etapa num projeto de
sistemas consiste na seleção do material adsorvente, cuja avaliação é realizada por meio
dos dados experimentais ou relações de equilíbrio.
O estudo do equilíbrio de adsorção, que não corresponde à transferência de massa entre
as fases, é usado para determinar a distribuição do adsorbato entre o seio da fase fluida e
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 21
da fase adsorvida na superfície do sólido adsorvente. A distribuição de equilíbrio é
geralmente medida à temperatura constante, e é referida como isoterma de equilíbrio
(Hines et al, 1985). O estudo do equilíbrio de adsorção dá informação sobre a capacidade
do adsorvente ou a quantidade requerida para remover uma unidade de massa do adsorbato
sob as condições do sistema (Aksu et al, 2003).
A natureza geral da inclinação ou da zona de transferência de massa da curva de
ruptura (perfil de concentração do efluente de uma coluna) é influenciada pela isoterma de
equilíbrio, embora a forma do perfil de concentração possa ser significativamente
modificada por efeitos cinéticos (Ruthven, 1984).
Para um propósito de avaliar a dinâmica de adsorção, as isotermas são classificadas em
(a) favoráveis, (b) linear e (c) desfavorável. A Figura 2.12 mostra estes três tipos de
isotermas.
Figura 2.12.: Diagrama das isotermas: (a) favorável, (b) linear e (c) desfavorável
Na maioria dos processos de adsorção, as isotermas são favoráveis e, portanto, a
dessorção é desfavorável. Na dessorção, a zona de transferência de massa é dispersiva,
conduzindo a uma propagação contínua do perfil de concentração, enquanto que na
adsorção, a zona de transferência de massa é compressiva, conduzindo a um
comportamento padrão (Ruthven, 1984).
Como na extração, a análise da adsorção está baseada no equilíbrio e nos balanços de
massa. A diferença básica é que o equilíbrio não é apresentado como coeficiente de
partição, mas sim como uma isoterma de adsorção. Isotermas típicas de adsorção são
mostradas na Figura 2.13. Para cada isoterma, a abscissa corresponde à concentração de
soluto em solução, geralmente expressa em massa de soluto por volume de solução. A
ordenada corresponde à concentração de soluto sobre a superfície adsorvente,
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 22
freqüentemente expressa em massa de soluto por massa de adsorvente. As três isotermas
mostradas na Figura 2.13 ocorrem em biosseparações (Belter et al, 1988).
As isotermas podem ser determinadas no equilíbrio, sendo utilizadas para a seleção de
um adsorvente baseado na sua capacidade, ou alternativamente, elas podem ser
determinadas como função do tempo, sendo utilizadas para selecionar um adsorvente com
base na sua taxa de adsorção (Sleijko, 1985).
Figura 2.13.: Isotermas comuns de adsorção (Belter et al, 1988).
A informação do equilíbrio de adsorção é uma parte muito importante no
entendimento do processo de adsorção. Não importa quantos componentes estão presentes
no sistema, o equilíbrio de adsorção dos componentes puros é ingrediente essencial para o
entendimento de como estes componentes podem ser acomodados pelo sólido adsorvente
(Do, 1998).
2.4.3.1 ISOTERMA LINEAR
Em uma adsorção sobre superfície uniforme, onde as concentrações são
suficientemente baixas, tal que uma molécula está isolada da molécula vizinha, a relação
de equilíbrio entre as concentrações da fase fluida e da fase adsorvida será linear
(Ruthven, 1984). Obtém-se assim o modelo de isoterma mais simples, que é o da adsorção
linear ou partição constante, que é descrito por uma equação da seguinte forma:
*CK*q H= (2.1)
onde q* é a quantidade de soluto adsorvido por quantidade de adsorvente, C* é a
concentração de soluto em solução, e KH é a constante de equilíbrio (Sleijko, 1985).
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 23
Este modelo tem a vantagem de descrever um conjunto de dados de adsorção em
termos de um único parâmetro, KH, e simplificar a modelagem dos dados, já que pode ser
resolvido implicitamente para qualquer um dos termos. Todos os demais modelos de
isotermas, como por exemplo, os modelos de Freundlich e Langmuir, podem ser reduzidos
direta ou indiretamente à relação linear sob condições especiais (Sleijko, 1985).
2.4.3.2 ISOTERMA DE LANGMUIR
A isoterma de Langmuir é um modelo teórico, cuja expressão matemática fundamenta-
se nas seguintes hipóteses:
I. Todos os sítios do sólido têm a mesma atividade para a adsorção;
II. Não existe interação entre as moléculas adsorvidas;
III. Toda adsorção segue o mesmo mecanismo, e cada complexo adsorvente-adsorbato
tem a mesma estrutura;
IV. A extensão da adsorção não é mais que a formação de uma camada
monomolecular sobre a superfície do adsorvente. (Borba, 2006).
A expressão matemática para isoterma de Langmuir para um sistema
monocomponente é dada por:
*CK*Cqm*q
L +×
= (2.2)
em que q* é a quantidade adsorvida pela resina no equilíbrio (mg/ g resina), C* é a
concentração de soluto em solução no equilíbrio (mg/ mL), qm é a capacidade máxima de
adsorção da resina (mg/ g resina) e KL é a constante de adsorção de Langmuir (mg/ mL).
Esta isoterma possui forte base teórica e está fundamentada num postulado de reação
química entre o soluto e os sítios vagos sobre a superfície do adsorvente e a não existência
de interação entre soluto-soluto, resultando num recobrimento em monocamada:
Soluto + sítios vagos = sítios preenchidos (2.3)
KL , constante de adsorção de Langmuir, é o inverso da constante de equilíbrio, sendo
descrita por
(2.4)
além disso, o número total de sítios ativos deve ser fixado,
[sítios totais] = [sítios vagos] + [sítios preenchidos] (2.5)
combinando as duas últimas equações temos:
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 24
(2.6)
Assim, sendo o número de sítios preenchidos proporcional a q*, a equação 2.6 é
equivalente a equação 2.2 (Belter et al, 1988).
As constantes da isoterma de Langmuir têm significado físico. O parâmetro KL
representa a razão entre a taxa de adsorção e dessorção. Portanto, baixos valores deste
parâmetro indicam forte afinidade do íon pelos sítios do material. O parâmetro qm
representa o número total de sítios disponíveis no material adsorvente (Borba, 2006).
Embora derivada para explicar situações de adsorção reversíveis, a equação de
Langmuir pode refletir adequadamente sistema de adsorção irreversível e está
caracterizada pela formação de monocamada que indica a capacidade de saturação
(Ko et al, 2001).
2.4.3.3 ISOTERMA DE FREUNDLICH
Ao contrário da forte base teórica apresentada pela isoterma de Langmuir, esta
isoterma muitas vezes falha ao descrever dados experimentais adequadamente
(Sleijko, 1985). A isoterma de Freundlich não prevê a saturação do adsorvente. Assim, o
modelo permite a existência de uma cobertura superficial infinita (Reed et al, 1993).
Essa isoterma corresponde à adsorção em sítios não uniformes. Nesse caso o calor de
adsorção freqüentemente diminui com o aumento da cobertura na superfície. A falta de
uniformidade, todavia, pode ou existir previamente nos diferentes sítios de adsorção ou ser
causada pelas forças repulsivas entre átomos ou moléculas adsorvidas. Especialmente no
caso da ligação entre a superfície e o adsorbato ser parcialmente iônica, as repulsões
podem se tornar grandes, diminuindo notadamente o calor de adsorção em coberturas mais
elevadas. A equação 2.7 descreve matematicamente esta isoterma:
nFCKq ** = (2.7)
onde KF é a constante de equilíbrio de Freundlich (mL/ mg resina) e n é um índice
desta isoterma. O índice 1/n é indicativo da energia ou intensidade da reação (Sleijko,
1985).
As dimensões de KF dependem do valor de n, se a adsorção é favorável, então n < 1;
se esta é desfavorável, então n > 1 (Belter et al, 1988).
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 25
2.4.4 SISTEMAS TÍPICOS DE ADSORÇÃO
As primeiras observações relacionadas ao processo de adsorção foram feitas no século
XVIII, contudo é recente o desenvolvimento de tecnologia para aplicação deste fenômeno
em processos industriais, como purificação e separação de produtos. O desenvolvimento
desta operação foi realizado tomando-se como base a utilização de leitos fixos e
fluidizados, colocando-se um sólido adsorvente em contato com uma alimentação fluida
(Homem, 2001).
Os processos de separação que utilizam a técnica de adsorção podem ser operados
basicamente de duas formas: através de bateladas e em leito fixo.
A maneira pela qual um adsorvente entra em contato com a solução, contendo o soluto
a ser adsorvido, é particularmente importante para operações de separação em grande
escala. As taxas de adsorção sobre os adsorventes são controladas pelos processos de
transporte do soluto até a superfície e dentro dos adsorventes, como pode ser visto na
Figura 2.14.
Figura 2.14.: Etapas de transporte de massa na adsorção utilizando adsorventes porosos (Sleijko, 1985).
Os ensaios em batelada são convenientes e informativos para selecionar o tipo de
adsorvente ou para otimizar certas condições. Nos experimentos em batelada, os
parâmetros a serem examinados incluem a relação massa de adsorvente/volume de
solução, pH, temperatura e tempo de contato. Se o composto de interesse tem um ou mais
grupos ionizáveis, o pH pode influenciar na capacidade de adsorção do sólido adsorvente.
Desta maneira, para adsorção em resinas hidrofóbicas, o pH deveria ser ajustado de tal
forma que o composto de interesse não esteja ionizado. É desejável empregar resinas com
o menor diâmetro possível, operando em condições eficientes, para permitir que se alcance
altas taxas de adsorção. O termo “operação eficiente” é importante; a escolha de um
determinado tamanho de resina impõe algumas restrições ao tipo de sistema de reator que
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 26
pode ser usado. Adsorventes de alta capacidade, por exemplo, são geralmente utilizados
em reatores em batelada ou de mistura (Sleijko, 1985).
2.4.5 RECUPERAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS POR ADSORÇÃO EM BATELADA Prasad et al (1980) investigaram o desempenho de quatro trocadores iônicos
semelhantes na purificação de estreptomicina através do estudo cinético e o
comportamento do equilíbrio de adsorção. Os ensaios em batelada foram realizados com
sulfato de estreptomicina em solução aquosa em cada adsorvente separadamente. Os
autores observaram que a capacidade de adsorção de estreptomicina nos diferentes
trocadores iônicos obedece à seguinte ordem: KB-2 > Indion 236 > IRC-50 > KB4-P2.
Também foi observado que não há influência da temperatura no equilíbrio de adsorção
dentro da faixa estudada (13 a 23ºC) em todos os adsorventes testados.
Boothroyd (1986) descreveu vários métodos de recuperação de cefalosporina C (CPC).
Dois estágios são comuns nos processos descritos, a filtração como primeiro estágio de
separação sólido-líquido, e o estágio final de purificação que envolve a concentração da
CPC através da adsorção de seu núcleo carboxílico em uma resina fracamente básica
(IRA-68) e dessorção com acetato de potássio ou acetato de sódio seguido da precipitação
da cefalosporina C como sal de potássio ou de sódio, respectivamente. As variações do
processo ocorrem na preparação do filtrado para o estágio final. O objetivo desses estágios
intermediários é a remoção de todos os íons fortes que possam ser adsorvidos
preferencialmente à cefalosporina.
Ghosh et al (1996) descreveram processos típicos de purificação de cefalosporina C. O
primeiro processo utiliza uma combinação de técnicas de membrana e cromatografia. As
células são removidas por microfiltração e proteínas e polissacarídeos são removidos por
ultrafiltração. O permeado da ultrafiltração é concentrado por osmose reversa e o
antibiótico é finalmente purificado por cromatografia líquida de alto desempenho,
obtendo-se uma recuperação acima de 98,5%.
Em outro método, foi sugerido o uso de uma combinação de ultrafiltração, coluna
cromatográfica e osmose reversa. A recuperação pode ser maior que 90% através das
colunas cromatográficas utilizando resina trocadora de ânions de base fraca (Diaion WA-
30), adsorventes poli aromáticos neutros (Diaion HP-20 e Amberlite XAD-2000) e
trocadora de cátions de ácido forte (Diaion SK-1B), nessa seqüência. O método de
purificação é concluído com a secagem do produto, obtendo-se a cefalosporina na forma
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 27
de sal de sódio ou potássio (Ghosh et al, 1996). Mais uma vez observa-se que adsorção
sempre está presente na purificação de CPC.
Bautista et al (1999) desenvolveram um estudo sobre o equilíbrio de adsorção da α-
amilase obtida a partir da Aspergillus oryzae em duas resinas poliméricas comerciais, uma
resina hidrofóbica (AmberliteXAD-761) e uma resina trocadora aniônica (Duolite A-568).
Os autores determinaram o efeito do pH, força iônica e temperatura na retenção do
adsorbato, estudaram a capacidade de adsorção das resinas e o equilíbrio de adsorção
através da obtenção das isotermas de adsorção em diferentes temperaturas. Foi possível
concluir que para o sistema hidrofóbico a constante de adsorção aumenta com o aumento
da força iônica enquanto que utilizando a resina trocadora de íons o efeito é oposto. Isso
ocorre devido a competição entre os sais presentes na fase móvel e os grupos carregados
da α-amilase pelos grupos amino da resina trocadora de íons. Em ambos os sistemas a
constante de adsorção cresce quando o pH decresce de 8,0 a 6,0. Também foi observado
que o equilíbrio de adsorção em diferentes temperaturas mostrou um comportamento não
linear para os dois sistemas descritos pela isoterma de Langmuir.
Dutta et al (1999) estudaram a adsorção de alguns antibióticos semi-sintéticos
(cefadroxil, cefalexina, 6-APA e 7-ACA) em carvão ativado e quatro tipos de resinas
poliméricas. Observaram que há grande dependência entre o pH e a quantidade adsorvida.
Segundo eles, o fenômeno de adsorção foi determinado por interações hidrofóbicas entre o
antibiótico e o adsorvente. Eles concluíram que o carvão ativado é o melhor adsorvente
dos antibióticos estudados, porém os estudos foram realizados em meio aquoso.
Barboza et al (2000) estudaram a purificação da cefalosporina C, proveniente de caldo
de cultivo, em coluna de leito fixo utilizando a resina não iônica Amberlite XAD-2. O
processo de adsorção pôde ser avaliado em termos de fator de purificação e fator de
concentração. A diminuição da temperatura de 25 para 10ºC a um pH de 3,6 favoreceu o
processo de adsorção. Assim nas melhores condições de operação da coluna de leito fixo,
temperatura de 10ºC e pH 3,6, os autores obtiveram um fator de concentração de
cefalosporina C de 7,6 e um fator de purificação de 4,7, considerados bons fatores na
purificação de antibióticos.
Casey et al (2007) estudaram a eficácia do uso de resinas para a recuperação da
geldanamicina de caldos de fermentação. Foram avaliadas as resinas Amberlite XAD-4, 7,
16, 1180 e 1600, e Sepabeads SP-850 e Diaion HP-20. Todas as resinas avaliadas foram
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 28
capazes de recuperar 90% de geldanamicina em uma concentração de 15 g.L-1, sendo
seletivas para adsorção de geldanamicina ao invés dos contaminantes.
2.5 DESSORÇÃO
Um dos mais críticos passos nos processos de purificação por adsorção está
relacionado à dessorção dos compostos de interesse, com a recuperação ou não do
composto adsorvido. A dessorção é normalmente acompanhada pelo uso de condições que
resultem em uma significante queda na afinidade da ligação adsorvente-adsorbato. Uma
ótima condição de dessorção é aquela que permite uma completa e efetiva recuperação do
adsorbato em volumes relativamente pequenos, enquanto ao mesmo tempo não
compromete a atividade química de ambos, adsorvente e adsorbato. A dessorção é
normalmente efetuada por mudanças no pH, no potencial iônico, e composição química do
tampão (Rehm et al, 1993).
Quando o composto alvo é um neutro não ionizável, solventes orgânicos miscíveis em
água, como os alcoóis menores, são usados como eluentes. Porém, um tampão aquoso ou
mistura tampão/solvente pode ser preferível para compostos ionizáveis (isto é, mais
solúveis em água) (Verrall, 1996).
Todas as substâncias orgânicas ou inorgânicas que mudam a polaridade do produto
adsorvido, pela formação de sais, ou que possuem uma maior afinidade pela resina são
possíveis eluentes. Alguns exemplos são: ácidos, bases, soluções tampão, sais inorgânicos,
substâncias orgânicas neutras solúveis em água (alcoóis), solventes orgânicos não
miscíveis em água e água (quente, refrigerada) (Voser, 1982).
A escolha da composição do eluente e da sua concentração determina a seletividade, o
volume de eluato e se o ácido ou base adsorvido é dessorvido como um sal ou ácido ou
base livre. Quando se decide sobre a composição do regenerante, a solubilidade das
impurezas e sua afinidade para com a resina devem ser levadas em consideração.
Idealmente se espera alcançar 100% de regeneração com um volume mínimo de
regenerante. Elevadas temperaturas durante a regeneração podem ser vantajosas
(Voser, 1982).
2.6 PLANEJAMENTO ESTATÍSTICO DE EXPERIMENTO
A necessidade crescente da otimização de processos, minimizando custos e tempo,
maximizando rendimento, produtividade, pureza e melhor qualidade de produtos levam os
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 29
engenheiros de processos, e particularmente os bioquímicos a buscarem técnicas
sistemáticas de planejamento de experimentos.
A utilização de experimentos planejados estatisticamente, associada às técnicas de
superficie de resposta, tem sido utilizada para a otimização dos processos. O planejamento
de experimentos é uma técnica cuja aplicação em processos químicos industriais vem
crescendo continuamente, principalmente a partir da década de 80 com a evolução dos
microcomputadores e a disponibilidade de “softwares” estatísticos que facilitaram os
cálculos e a análise de dados.
O mais importante beneficio do planejamento estatístico de experimentos é que ele
pode dar mais informações por experimento do que ensaios não planejados, além de
reduzir o tempo gasto e melhorar a eficiência das investigações, particularmente quando
muitas variáveis são potencialmente importantes. Um segundo beneficio é um ensaio
organizado através da coleção e análise de informação. Freqüentemente as conclusões de
um experimento planejado são evidentes, sem análises estatísticas extensivas. Outra
vantagem é a certeza de confiabilidade da informação à luz de variação experimental e
analítica. Essa análise criteriosa dos resultados, quando apresentados em um trabalho, traz
mais credibilidade às conclusões do pesquisador (Staeheli, 1987).
O planejamento dos experimentos, isto é, a especificação detalhada das operações
experimentais que devem ser realizadas, dependerá do objetivo particular que ele queira
atingir. Cada objetivo irá requerer um planejamento diferente, para que possa ser
alcançado de forma eficaz. Um planejamento de experimentos bastante utilizado é o
planejamento fatorial de dois níveis, de grande utilidade em investigações preliminares,
quando se deseja saber se determinadas variáveis têm ou não influência sobre a resposta, e
não se está preocupado ainda com uma descrição muito rigorosa dessa influência. São
planejamentos muito simples de executarem e podem ser ampliados para formarem um
planejamento mais sofisticado, que é necessário quando se quer conhecer melhor a relação
funcional existente entre as respostas e as variáveis. Por outro lado, quando se deseja fazer
apenas uma triagem inicial das variáveis, é vantajoso começar pela execução de um
planejamento fatorial incompleto, o chamado fatorial fracionário (Box et al, 1978).
Através destas técnicas sistemáticas de condução de experimentos é possível avaliar
o efeito principal de cada variável na resposta desejada, bem como as interações entre elas.
A partir da análise de variância pode-se propor um modelo probabilístico adequado que
correlacione as respostas em função das variáveis estudadas, construindo-se a superficie
de resposta para determinar as faixas ótimas de operação. Nem sempre o objetivo do
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 30
trabalho em estudo é a otimização do processo, mas sim um melhor conhecimento sobre as
respostas do sistema frente a variações ou perturbações que podem ocorrer dentro das
faixas de operações estabelecidas. Assim, outra informação muito importante que pode ser
obtida através do planejamento fatorial é a variação das variáveis que apresentam
nenhuma ou pouca influência nas respostas, fornecendo subsídios fundamentais quanto à
flexibilidade e robustez do sistema e conseqüentemente na definição da melhor estratégia
de controle operacional (Rodrigues et al, 1998).
Quando o número de variáveis aumenta, crescem as chances de que uma ou mais
variáveis não afetem significativamente a resposta, seja por meio de efeitos principais, seja
por meio de efeitos de interação. Então as opções são os planejamentos fatoriais
fracionados, que são úteis nas etapas prévias de desenvolvimento de processos. Assim,
este procedimento é muito interessante em termos qualitativos, mas não se deve a partir de
um planejamento fracionado otimizar o processo, pois os efeitos principais estão
confundidos com interações de 2a e 3a ordem ou superiores, conforme o tipo de resolução
do fracional (Box et al, 1987).
A metodologia de superficie de resposta é uma técnica de otimização baseada no
emprego de planejamentos fatoriais, introduzida na década de 50, e que desde então tem
sido usada com grande sucesso na modelagem de diversos processos industriais
(Box et al, 1987).
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 31
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
Penicilina G potássica, fornecida pela empresa Prodotti S/A; resinas XAD-4, XAD-7 e
XAD-761, da Rohm & Haas Co; Carvão Ativado (dp < 1,19 mm), da Synth. Metanol grau
HPLC, da Tedia Brazil. Todos os outros reagentes são de grau analítico de diferentes
fornecedores.
Penicillium chrysogenum cultivado para obtenção de caldo típico foi doado pela
Fundação de Culturas Tropicais.
Escherichia coli ESS, cedida gentilmente pela pesquisadora Paloma Liras (Área de
Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales, Universidad de León,
León, Spain).
3.2 MÉTODOS
3.2.1 PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PENICILINA G
O meio de manutenção para P. chrysogenum foi preparado utilizando a técnica de tubo
inclinado e era constituído de extrato de malte – 20 g.L-1, peptona – 1 g.L-1, glicose – 20
g.L-1e agar – 20 g.L-1. A cada cinco meses o fungo era transferido desse meio sólido para
um outro tubo inclinado com um novo meio de manutenção .
O cultivo do microrganismo iniciou-se com a transferência dos esporos contidos nos
tubos com meio de manutenção para um erlenmeyer contendo 100 mL do meio de cultivo
composto de: água de maceração de milho – 28 mL.L-1, fosfato de sódio monobásico –
5,2 g.L-1, sulfato de amônio (NH4)2SO4 –5,2 g.L-1, hidróxido de cálcio Ca(OH)2 –1,2 g.L-1,
carbonato de cálcio CaCO3 – 0,8 g.L-1, polipropileno 2000 (antiespumante) – 2,6 mL.L-1,
água – 800 mL. L-1 e sacarose – 10 g.L-1.
O erlenmeyer, contendo a suspensão de esporos para germinação, foi mantido em
agitação (250 rpm), a 25ºC por 24 horas. Em seguida o caldo de cultivo resultante foi
distribuído em erlenmeyers contendo meio de cultivo fresco, no qual se adicionou o
precursor para a produção de penG (fenilacetato de potássio – 2,56 g.L-1).
Após 24 horas, o caldo de cultivo era filtrado à vácuo com papel filtro qualitativo (de
diâmetro 7,0 cm) para remoção da massa de fungos e o filtrado era armazenado a -20oC.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 32
3.2.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PENG
Para a determinação da concentração de penG foi utilizada a cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), o método iodométrico, o bioensaio e a hidrólise enzimática de
penG.
3.2.2.1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
A análise de penG em meio aquoso foi realizada utilizando a técnica CLAE,
empregando-se uma coluna C-18, µBondPack, 3,9x 300mm e fase móvel 20% acetonitrila,
80% tampão fosfato 10mM, pH 6,5, tiossulfato de sódio 10mM em uma vazão de
1 mL/min, com detecção UV a 254nm usando-se o cromatógrafo da marca Shimadzu
modelo CLASS-LC10. Ao utilizar o cromatógrafo modelo CLASS-VP, alterou-se a fase
móvel para 25% metanol e 75% água deionizada, excluindo a existência de sal na fase
móvel.
A concentração de penG em amostras foi calculada a partir de uma curva de calibração
(Área pico X Concentração penG), a qual foi preparada utilizando como solvente, água ou
caldo de cultivo livre de penG. As curvas de calibração e as equações obtidas são
apresentadas nas Figuras 3.1 e 3.2.
Figura 3.1.: Curva de calibração de penicilina G em água utilizando o cromatógrafo modelo CLASS - LC10
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 33
Figura 3.2.: Curva de calibração de penicilina G em caldo de cultivo utilizando o cromatógrafo modelo CLASS VP
3.2.2.2 MÉTODO IODOMÉTRICO
A determinação da concentração de penG pelo método iodométrico foi realizada
empregando-se uma seqüência de reações com a penG. Primeiramente, uma solução
contendo penG (2mL) foi misturada com 2 mL de NaOH 1N por 15 minutos com a
finalidade de romper o anel β-lactâmico produzindo o ácido penicilinóico. Neutralizou-se
a solução com 2 mL de HCl 1,2N. Adicionou-se um excesso de solução de iodo 0,01N
(10mL). Após 15 minutos reagindo, o iodo não consumido foi titulado com tiossulfato de
sódio 0,01N (USP 26, 2003).
3.2.2.3 BIOENSAIO
Para a realização dos bioensaios utilizou-se a Escherichea coli ESS, bactéria sensível a
antibiótico β-lactâmico. A bactéria foi cultivada em meio agar nutriente (5 g.L-1de
peptona, 3 g.L-1 de extrato de carne, 20 g.L-1 de agar e 100mL de água destilada, com pH
ajustado em 7,2), por 48 horas em estufa a 36- 37 ºC.
Para suspender os microrganismos utilizados no bioensaio, adicionaram-se 10 mL de
solução salina (0,9% m/v) para cada tubo contendo bactérias cultivadas em 20 mL de agar
nutriente inclinado. A densidade optica (OD) da suspensão resultante foi lida a um
comprimento de onde de 600 nm, em espectrofotômetro.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 34
A suspensão obtida foi misturada ao meio agar nutriente de tal forma que 1 mL da
solução com OD600 igual a 1 fosse adicionado a 100 mL de agar. Nessa parte do
procedimento, tomou-se o cuidado de controlar a temperatura do agar de tal forma que ela
não fosse muito alta para matar o microrganismo e ao mesmo tempo não tão frio para não
solidificar o agar.
Após a mistura, alíquotas de 20 mL de agar foram despejadas em placas de Petri com
150 mm de diâmetro, previamente esterilizadas.
Após solidificação do meio, perfurou-se o número necessário de poços de 5 mm de
diâmetro, nos quais foram adicionados 20 µL das soluções preparadas de amostra ou de
padrão de antibiótico, adequadamente diluídas.
As placas foram incubadas a 36-37ºC por 24 horas, medindo-se, então, os diâmetros
dos halos de inibição.
3.2.2.4 HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE PENG
Para a hidrólise, a amostra contendo penG foi diluída em tampão fosfato 100mM
pH 9,0 em proporção 1:1. Um milímetro dessa solução foi adicionado a um microtubo de
capacidade de 1,5 mL o qual foi mantido fechado em um banho termostatizado a 37°C em
repouso. A essa mistura, adicionou-se 50 µL da solução de PGA (5U), e a reação ocorreu
durante 20 minutos formando 6-APA. Para a determinação da concentração de 6-APA em
solução foi usado o método PDAB – Balasinghan et al (1972). Assim, ao fim da hidrólise,
uma alíquota de 25 µL foi transferida a uma cubeta de capacidade de 4mL contendo
2,5mL de p-dimetilaminobenzaldeído (PDAB). Após 2,5 minutos, a amostra foi analisada
em espectrofotômetro (marca PHARMACIA BIOTECH modelo Ultrospec 2000) a 415nm
e a absorbância foi determinada.
3.2.3 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE PENG EM DIFERENTES SOLUÇÕES
A solubilidade da penG em diferentes soluções foi determinada seguindo o método de
Gude et al,1996. Os ensaios foram realizados a temperatura constante, 8oC em fracos de
100 mL. As amostras foram preparadas gravimetricamente, ou seja, eram adicionadas
massas conhecidas de penG até a percepção de formação de precipitado. Os frascos foram
lacrados e então eram colocados em uma mesa incubadora rotativa (“shaker”), sob
agitação suave (100 rpm). Todas as amostras foram agitadas por pelo menos 4 horas e em
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 35
seguida as suspensões foram deixadas para sedimentar. Após a sedimentação, amostras do
sobrenadante foram retiradas por meio de uma seringa acoplada a um filtro de 0,2µm,
evitando a passagem de sólidos. Após essa etapa, as amostras foram analisadas por
cromatografia de alta eficiência (CLAE).
3.2.4 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE DE PENG FRENTE A PH E TEMPERATURA
Os experimentos de determinação da estabilidade foram realizados em batelada. Não
foi utilizado tampão, ou seja, os valores de pH foram ajustados apenas no inicio de cada
experimento. Ajustou-se o pH (nos valores pré-determinados) de 100 mL de água
destilada (a 4°C e 12oC) e adicionou-se 0,3g de penG obtendo-se uma solução 3 g.L-1 e
ajustou-se novamente o pH. Essa solução foi colocada em agitação com temperatura
controlada. Coletaram-se amostras no decorrer do tempo e essas foram diluídas em tampão
fosfato 100 mM pH 7,0 (1:1) para interromper a degradação e a concentração residual de
penG foi determinada através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).Os testes
de estabilidade foram realizados em meio aquoso e em triplicata.
3.2.5 ENSAIOS DE ADSORÇÃO EM BATELADA
3.2.5.1 TRATAMENTO DOS ADSORVENTES
Inicialmente, as resinas XAD foram pré-tratadas com metanol, etanol e água
destilada. Para cada grama de resina, foram adicionados 2 mL de metanol e a mistura foi
mantida sob agitação por 30 minutos. Em seguida, a resina foi separada por filtração a
vácuo e o procedimento foi repetido duas vezes. A resina tratada com metanol foi lavada
com água destilada e seca em estufa a 50ºC por 24 h. Em seguida, a resina passou por um
processo de hidratação utilizando etanol e água. 100 mL de etanol foram mantidos em
contato com a resina até que não fosse observadas bolhas de ar no etanol, indicando que o
volume interno das partículas do adsorvente estava totalmente preenchido pelo solvente.
Em seguida, o etanol foi substituído por água destilada e a resina foi lavada
abundantemente com água destilada em sistema de filtração a vácuo.
3.2.5.2 EFICIÊNCIA DE ADSORÇÃO DE PENG: SELEÇÃO DE RESINA
Para os estudos de eficiência de adsorção, utilizou-se 0,25g (em base seca) de
adsorvente pré-tratado (XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvão ativado) para 5 mL de caldo
de cultivo de concentração de penG de 50 g.L-1, temperatura de 4oC, e pH de 6,0; 5,0 e
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 36
4,0. Determinou-se a concentração de penG no sobrenadante depois de 45 minutos de
adsorção (amostrando-se com filtro de tamanho de corte de 0,45 µm) sob agitação. A
eficiência de adsorção foi calculada por meio da relação percentual entre a concentração
inicial e a final de penicilina na solução, conforme mostrado na Equação 3.1.
100*)(
% ∗−
=O
O
CCC
EA (3.1)
onde C* é a quantidade de equilíbrio em solução do composto e Co é a concentração
inicial do mesmo. Assim, uma eficiência de adsorção de 50% expressa que 50% da
concentração inicial do composto foi adsorvida pela resina.
3.2.5.3 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE EQUILÍBRIO - CINÉTICA DE ADSORÇÃO
Para cinética de adsorção, utilizou-se 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratada para
2mL de caldo de cultivo com 50 g.L-1 de penG, temperatura de 4 ºC e 12 oC, e valores de
pH de 4,0; 5,0 e 7,0. Retiraram-se amostras do sobrenadante nos tempos 0, 2, 4, 6, 10, 20,
30, 45 e 60 minutos. Quando a concentração de penG em solução era constante, o
equilíbrio era alcançado. A concentração de penG na amostra foi determinada por
hidrólise enzimática.
3.2.5.4 ISOTERMAS DE EQUILÍBRIO
Para isoterma de adsorção, utilizou-se 0,1 g (em base seca) de adsorvente pré-tratado
para 2mL de caldo de cultivo com diferentes valores de concentração de penG,
temperatura entre 4 e 12oC, e valores de pH entre 4,0 e 7,0. Determinou-se a concentração
de penG no sobrenadante depois de atingido o equilíbrio de adsorção. As concentrações de
equilíbrio na resina, q*, foram determinadas pelo balanço de massa, utilizando a Equação
3.2:
wVCC
q LO *)(*
−=
(3.2)
sendo q* a concentração adsorvida do composto no equilíbrio por massa de resina, Co a
concentração inicial, C* a concentração em solução do composto no equilíbrio, VL o
volume de solução e w a massa de resina utilizada.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 37
Com os dados de q* e C*, é possível estabelecer qual modelo da literatura (Linear,
Langmuir e Freundlich – Equações 2.1, 2.2 e 2.7, respectivamente) representa a cinética
de adsorção na resina escolhida para extração de penG.
3.2.5.5 ENSAIOS DE ADSORÇÃO DE PENICILINA G
Para promover uma máxima adsorção de penG, optou-se pela análise de dois métodos
de adsorção: o uso ou não de gradiente de pH durante o processo.
No caso da adsorção sem gradiente, o pH da solução de penG em contato com a resina
foi vagarosamente ajustado até o valor de 4,0, a fim de evitar degradação pontual da penG.
Com o gradiente, a solução de penG em pH 7,0 é mantida em contato com a resina por 45
minutos, até atingir o equilíbrio de adsorção. Em seguida o pH é ajustado para 5,0,
novamente por 45 minutos. Esse procedimento foi repetido reduzindo-se o valor de pH até
completa adsorção de penG. Entretanto, para valores baixos de pH (3,0, 2,5 e 2,0), o
procedimento respeitou o tempo que o antibiótico não degradava.
Esses experimentos de adsorção foram realizados a 4ºC com agitação mecânica
(agitador sem pá) e o pH foi ajustado para os valores desejados utilizando titulador
automático (marca METROHM modelo 718 STAT Titrino).
3.2.6 ENSAIOS DE DESSORÇÃO EM BATELADA
A resina contendo penG adsorvida foi filtrada para separação do sobrenadante e
colocada em contato com eluente a diferentes valores de pH, temperaturas e composição
de mistura água/etanol conforme o planejamento fatorial. Amostras foram retiradas com
filtro para determinação da concentração de penG. Esses experimentos de dessorção foram
realizados em mesa incubadora rotativa com agitação de 250 rpm.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 38
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ESTUDO DA QUANTIFICAÇÃO DE PENICILINA G EM MEIO DE CULTIVO
4.1.1 COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS JÁ UTILIZADOS
Várias metodologias são conhecidas e utilizadas para a determinação de penG. Entre
elas destacam-se: cromatografia líquida, bioensaio, titulação iodométrica ou
mercuriométrica e alguns métodos espectrofotométricos baseados na reação de penG com
hidroxilamina ou imidazole (Grime,1979; Zhu, 1997). Cada um destes métodos apresenta
vantagens e desvantagens, e a aplicação desses métodos depende fortemente do tipo de
meio que contém a molécula de interesse.
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é uma das técnicas mais utilizada
para determinação de penG. Apesar de apresentar vantagens como elevada
reprodutibilidade e precisão, a análise de penG em meios complexos como o caldo de
cultivo pode gerar rápida perda de eficiência da coluna, devido ao contato de inúmeras
moléculas contaminantes com a fase estacionária.
Muitas vezes, a baixa sensibilidade (em 254nm) do experimento, associado ao baixo
nível de concentração de penG numa amostra de caldo, exige que um grande volume desta
seja injetado no sistema para atingir níveis detectáveis do analito de interesse, aumentando
assim, o risco de perda de eficiência da coluna cromatográfica devido ligações
irreversíveis que podem ocorrer entre os contaminantes e a fase estacionária.
Uma maneira de minimizar danos à coluna é realizar uma reação de derivatização da
penG para aumentar a sensibilidade do método e reduzir a quantidade de amostra injetada.
Entretanto, as reações de derivatização envolvem o uso de reagentes tóxicos e exigem
maior tempo de análise.
Neste trabalho, um método cromatográfico sem derivatização, descrito em detalhes no
item 3.2.2.1 foi utilizado como método de referência para confirmar a concentração de
penG em algumas amostras, as quais foram anteriormente analisadas por métodos
alternativos.
Um dos métodos investigado e implementado, com vistas a minimizar danos ao
sistema de cromatografia foi o método iodométrico, descrito em detalhes no 3.2.2.2. Este
foi desenvolvido por Alicino, 1940, e há vários anos é utilizado para quantificar penicilina
em muitos produtos formulados, derivados e amostras de caldo de cultivo adequadamente
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 39
tratados (Alicino, 1961). Nesse método, penG reage com iodo e o excesso deste é
quantificado. Apesar de ser uma metodologia simples e de baixo custo, a análise de penG,
com baixo grau de pureza, apresenta alguns obstáculos. Por exemplo, muitos outras
substâncias presentes no meio podem consumir o iodo, resultando assim na determinação
de uma concentração aparente de penG. Além disso, variações na resposta podem ocorrer
em função da temperatura, tempo, pH e concentração de iodo (Grime, 1979).
O bioensaio, método descrito em detalhes no item 3.2.2.3, é um teste de determinação
da concentração de penG ativa no meio. Neste método, bactéria sabidamente sensível a
penicilina G é cultivada em placa onde se perfuram poços para adição de amostras ou
soluções padrão de penG. O halo de inibição de crescimento é proporcional à
concentração de penG, o menor halo corresponde a uma menor concentração de penG.
Contudo, é um método pouco exato e o mais trabalhoso, embora seja também um teste que
garante não só haver penG no meio, mas também que ela está realmente desempenhando a
função esperada.
Investigou-se inicialmente a eficiência do método iodométrico na quantificação de
penG em caldo de cultivo, preparando-se 50 mL de uma solução padrão de penG 50g.L-1
em tampão fosfato 100mM, pH 7,0. Alíquotas dessa solução foram analisadas pelo método
cromatográfico, iodométrico e bioensaio.
Em seguida, 25 mL da solução de penG 50g.L-1 foi submetida à inativação a 37oC pela
adição de 25mg de penicilinase (enzima que hidrolisa o anel β-lactâmico). Alíquotas desta
solução foram retiradas após 30 e 60 min de hidrólise e foram analisadas pelos três
métodos. As concentrações determinadas em cada método são apresentadas na Tabela 4.1.
Tabela 4.1.: Teste comparativo entre os métodos para quantificar penicilinaG. Amostras: (1) solução de penG sem a hidrólise por penicilinase , (2) solução de penG na mesma concentração hidrolisada por penicilinase por 30 min e (3) solução de penG na mesma concentração hidrolisada por penicilinase por 60 min. Condições de diluição com tampão fosfato 100mM: 1:500 (bioensaio), 1:4 (iodometria) e 1:1 ( CLAE).
CLAE M. Iodométrico Bioensaio C (g.L-1) C (g.L-1) DHALO (cm)
PenG 50g/L 49,14 63,08 5,50 PenG 50g/L hidrólise-30 min 43,12 60,84 4,90 PenG 50g/L hidrólise-60 min 43,18 59,16 4,80
% Hidrolisada 12,13 6,21 12,73
Observou-se que o percentual de redução na concentração de penG ativa determinada
por CLAE é semelhante a estimativa do percentual hidrolisada obtida no bioensaio.
Entretanto, este percentual é menor quando se utiliza o método iodométrico. Estes
resultados indicam que não é possível diferenciar as formas ativas e degradadas de penG
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 40
pelo método iodométrico. Além disso, o longo tempo de análise dessa metodologia nos
incentivou a buscar novas estratégias para quantificar penG na forma intacta de maneira
simples e rápida.
4.1.2 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ENZIMÁTICO PARA A QUANTIFICAÇÃO DE PENG A medida de atividade da enzima penicilina G acilase produzida durante o cultivo de
Bacillus megaterium, quantificando-se espectrofotometricamente o produto da hidrólise de
penicilina G catalisada pela enzima é metodologia amplamente utilizada no grupo de
Engenharia de Processos Enzimáticos do DEQ/UFSCar. Nesse método, ácido 6-
aminopenicilânico (6-APA) gerado na reação reage com dimetilaminobenzaldeído
(PDAB), gerando bases de Schiff coloridas. Baseando-se nessa metodologia, o método
desenvolvido neste trabalho consiste na hidrólise completa da penG presente na amostra
catalisada por penicilina G acilase (PGA) livre (solúvel), quantificando-se 6-APA
produzido com PDAB. Como mostrado na Figura 2.3, para cada mol de penG hidrolisada,
um mol de 6-APA é liberado.
Esse método foi também comparado com análise CLAE. Os resultados obtidos,
mostrados na Tabela 4.2, indicam que as concentrações obtidas através do método
enzimático estão de acordo com os valores de concentração obtidos para as mesmas
amostras analisadas por CLAE.
Tabela 4.2.: Estudo comparativo CLAE x Hidrólise enzimática
CLAE Hidrólise Enzimática
Conc. Teórica de penG ( g.L-1)
Conc. de penG ( g.L-1)
Conc de penG ( g.L-1)
50,00 49,65 48,85
25,00 23,56 26,11
12,50 13,21 12,27
6,25 6,21 6,34
A obtenção da curva de calibração utilizando como solvente o caldo de cultivo, o uso
de excesso de enzima no meio e sua especificidade, garantem a boa reprodutibilidade e
exatidão nas medidas realizadas. Assim, a hidrólise enzimática, associada à quantificação
do 6-APA através de reação com PDAB (Balasinghan, 1972), foi utilizada neste trabalho
de maneira satisfatória, visto que penG em diferentes meios e em ampla faixa de
concentração foi determinada com exatidão e precisão.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 41
Como pode ser observado na Figura 4.1, o ajuste linear apresenta correlação excelente,
demonstrando que a curva de calibração pode ser aplicada dentro da faixa de concentração
utilizada.
Figura 4.1.: Curva de calibração de penicilina G utilizando a hidrólise de penG
4.2 INFLUÊNCIA DA COMPOSIÇÃO (TEMPO DE CULTIVO) DO MEIO DE
CULTIVO NA ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DE PENICILINA G
As características do caldo de cultivo variam com o tempo de cultivo devido à
liberação de vários compostos orgânicos, os quais podem interferir na análise da penG. A
análise deste efeito é importante para o estudo de adsorção de penG em diferentes
concentrações, visto que esta concentração também está associada ao tempo de cultivo.
Assim, inicialmente, foram realizados experimentos para caracterizar caldos de
cultivos obtidos em diferentes tempos com o objetivo de monitorar o surgimento de
interferentes na análise de penG. Esse efeito foi investigado adicionando-se quantidades
conhecidas de penG a caldos de cultivo obtidos em diferentes tempos e analisando-se por
cromatografia líquida de alta eficiência, as respostas obtidas (áreas dos picos
correspondentes a concentrações conhecidas de penG) para as mesmas concentrações nos
diferentes meios de cultivos. Foram analisados caldos de cultivos obtidos em 24, 48 e 120
h (Figura 4.2). Os resultados mostram que não há variações significativas dos coeficientes
angulares das curvas que correlacionam linearmente área de pico em função da
concentração de penG, para os diferentes tempos de cultivo analisados.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 42
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,120,0
5,0x105
1,0x106
1,5x106
2,0x106
2,5x106
3,0x106
24 h -> A= 2,18*Conc.PenG - 115851,84
48h -> A= 2,68*Conc.PenG - 275563,08
Área
Conc. PenG (g.L-1)
120h -> A= 2,22* Conc.PenG -212754,37
Figura 4.2.:Curvas de calibração para quantificar penG presente em caldo de cultivo obtido com diferentes tempos. Análise em HPLC, coluna C-18, µBondPack, 3,9x 300mm e fase móvel 20% acetonitrila, 80% tampão fosfato 10mM, pH 6,5, tiossulfato de sódio 10mM em uma vazão de 1 mL.min-1.
Os resultados apresentados na Figura 4.2 indicam que uma única curva de calibração
pode ser utilizada para analisar caldos de cultivos obtidos em diferentes tempos, pois os
compostos orgânicos liberados não interferem significativamente na quantificação de
penG.
O objetivo principal neste trabalho é investigar a eficiência de adsorção de penG em
diferentes resinas hidrofóbicas. A partir dos resultados obtidos anteriormente observa-se
que as condições de análise já estão bem estabelecidas. Entretanto, ainda se faz necessário
definir os intervalos de pH e temperatura em que a molécula de interesse (penG) é estável.
Em seguida, dentro deste intervalo, estabelecer qual a melhor resina, a melhor temperatura
e o melhor pH para adsorção de penG .
Portanto, a próxima etapa deste trabalho foi estudar a estabilidade de penG em
diferentes temperaturas e pH.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 43
4.3 TESTES DE ESTABILIDADE DA PENICILINA G EM MEIO AQUOSO
A degradação da penG em uma solução aquosa é devido à dissociação do grupo
carboxil que transforma penicilina ativa em produtos inativos, tais como o ácido penicílico
(Hersbach et al, 1984).
As temperaturas típicas usadas industrialmente na estocagem da penG, enquanto
aguarda separação do microorganismo, e na extração com solvente estão em torno de 12oC
e 4oC, respectivamente. Assim, os ensaios de adsorção e estabilidade da penG foram
realizados nessas duas temperaturas (Kheirolomoom et al, 1999).
Quanto mais ácido o pH, menos ionizada estará a penG e, portanto, maior deverá ser a
sua afinidade pela resina hidrofóbica, conforme observou Vieira et al (2003) para
ampicilina. É por essa razão que, também na indústria, a extração líquido-líquido com
solvente hidrofóbico é feita no valor de pH entre 2-2,5. Torna-se importante, então,
estudar a estabilidade de penG a valores de pH ácidos e assim foram realizados testes de
estabilidade a pH variando de 2,0 a 7,0.
Os gráficos apresentados na Figura 4.3 mostram os resultados dos experimentos de
estabilidade de penG em diferentes valores de pH a 4oC. A linha azul indica o tempo
máximo em que não se observa perda, por degradação, da penG.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 44
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(a)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(b)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(c)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(d)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(e)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(f)
Figura 4.3.: Gráfico da estabilidade de PenG a 4oC em diferentes valores de pH (a) 2,0 (b) 2,5, (c) 3,0, (d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0.
Os resultados obtidos mostram que penG não se degrada entre valores de pH de 4,0 a
7,0 durante os 60 minutos de ensaio. Para pH 2,0, observou-se rápida degradação de penG
e uma degradação mais lenta em pH 3,0. Entretanto, como economicamente é mais
interessante trabalhar com temperaturas mais altas, realizou-se o estudo da estabilidade em
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 45
diferentes valores de pH a 12oC. Os gráficos apresentados na Figura 4.4 mostram esses
resultados.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(a)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(b)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(c)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(d)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(e)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
Con
c. N
orm
aliz
ada
Tempo (min)
(f)
Figura 4.4.: Gráfico da estabilidade de PenG a 12oC em diferentes valores de pH (a) 2,0 (b) 2,5, (c) 3,0, (d) 4,0, (e) 5,0, (f)7,0.
Durante o isolamento da penG, 10-15% do produto são perdidos e manter a
integridade da molécula é importante para a redução de tais perdas
(Kheirolomoom et al, 1999). Portanto, neste trabalho foram determinados os intervalos de
tempo em que não ocorre degradação de penG em valores de pH específicos.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 46
Os tempos que a penG pode permanecer em solução com diferentes valores de pH a
4ºC e 12ºC sem que se observe degradação, estão apresentados na Tabela 4.3.
Tabela 4.3.: Dados de estabilidade de PenG frente a pH
pH T(°C) 2 2,5 3 4 5 7
4 2 min 15 min 30 min 1 h 1 h 1 h 12 2 min 2 min 4 min 1 h 1 h 1 h
Após estimar a estabilidade de penG em diferentes valores de pH, seguiu-se a etapa de
adsorção em diferentes resinas XAD e carvão ativado.
4.4 EFICIÊNCIA DE DIFERENTES ADSORVENTES NA SEPARAÇÃO DE PENICILINA G EM DIFERENTES VALORES DE PH
Dutta et al (1999) estudaram a adsorção de antibióticos β-lactâmicos em carvão
ativado e resinas poliméricas. Observaram que há grande dependência entre o pH e a
quantidade adsorvida. Segundo eles, o fenômeno de adsorção foi determinado por
interações hidrofóbicas entre o antibiótico e o adsorvente. No entanto, esses estudos foram
realizados em meio aquoso.
Atualmente, na indústria, o processo de purificação de penG pode envolver uma etapa
utilizando carvão ativado para a remoção de impurezas presentes no caldo de cultivo.
Uma vez que essa etapa é realizada na indústria acreditava-se que ela não deveria implicar
grandes perdas de penG. Foram realizados experimentos preparando-se soluções 50 g.L-1
de penG utilizando como solvente água ou caldo de cultivo para avaliar o efeito das
impurezas na eficiência de adsorção de penG em carvão ativado.
As condições utilizadas neste experimento foram pH 6,0, temperatura de 4ºC,
concentração de penG de 50 g.L-1, 1 hora de adsorção e 0,1g do carvão ativado
(previamente tratado) em 5 mL de caldo de cultivo. Em pH 6,0 penG está praticamente
toda ionizada (99,9%) e não deverá ter grande afinidade pelo carvão ativado.
A Figura 4.5 apresenta os resultados de adsorção em carvão ativado.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 47
(a) (b)
Figura 4.5.: Esquema da Adsorção em Carvão Ativado e gráfico da quantidade de penG adsorvida, em meio aquoso (a) e em caldo (b)
Observou-se que, para uma mesma massa de penG adicionada à água ou caldo de
cultivo, uma quantidade bem maior de penG dissolvida em água (aproximadamente 62%)
é adsorvida em carvão ativado, enquanto somente 14 % de penG presente em caldo de
cultivo é adsorvida. Assim, mesmo com a competição dos demais componentes do caldo
de cultivo pelo adsorvente e a presença de um grupo ácido ionizado na penG, ainda se
observa uma razoável adsorção do antibiótico. Considerando-se esses resultados, decidiu-
se não incluir a adsorção em carvão ativado para a retirada de impurezas do caldo, mas, o
carvão ativado será utilizado como um adsorvente na continuidade do estudo.
Passou-se a seguir a testes de adsorção em diferentes resinas XAD e carvão ativado,
visando selecionar qual tinha maior eficiência de adsorção de penG. A Figura 4.6 mostra
os resultados obtidos no teste de adsorção de penG em diferentes adsorventes em pH 6,0 e
temperatura de 4°C.
Figura 4.6.: Gráfico da adsorção de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvão ativado, a 4ºC, pH 6,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pré-tratado para 5 mL de caldo de cultivo contendo 50 g.L-1 de penG.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 48
Esse teste mostrou que a maior eficiência de adsorção, aproximadamente 36% de
penG presente no caldo, foi obtida com XAD-4.
Visando confirmar os resultados iniciais, que apontam XAD-4 como melhor resina,
foram determinadas as eficiências de adsorção de penG a pH 4,0 e 5,0, utilizando as
mesmas condições do experimento anterior. As Figuras 4.7 e 4.8 mostram os resultados
obtidos no teste de adsorção de penG em diferentes adsorventes, temperatura de 4°C, pH
4,0 e pH 5,0 , respectivamente.
Figura 4.7.: Gráfico da adsorção de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvão ativado, a 4ºC, pH 4,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pré-tratado para 5 mL de caldo de cultivo contendo 50 g.L-1 de penG.
Figura 4.8.: Gráfico da adsorção de penG em XAD-4, XAD-7, XAD-761 e carvão ativado, a 4ºC, pH 5,0, 1h, utilizando 0,25g (em base seca) de adsorvente pré-tratado para 5 mL de caldo de cultivo contendo 50 g.L-1 de penG.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 49
Conforme pode ser observado na Figura 4.9, não houve alteração significativa na
eficiência de adsorção em qualquer resina utilizada com o pH. Essa alteração foi em torno
de 8% ao longo da faixa de pH estudada utilizando a resina XAD-4, enquanto que a
alteração foi em torno de 7%, 6% e 6% utilizando XAD-7, XAD-761 e carvão ativado,
respectivamente.
Figura 4.9.: Efeito do pH sobre a eficiência de adsorção
Ainda, penG não mostrou alteração no padrão de adsorção para as diferentes resinas
nos três valores de pH testados. Observou-se que nos três valores de pH estudados, a
porcentagem de penG adsorvida é maior na XAD-4 seguida da XAD-7, carvão ativado e
XAD-761. Esses resultados indicam, pois Amberlite XAD-4 como melhor adsorvente, a
qual foi, portanto selecionada para uso em todo restante do trabalho.
Dutta et al (1999) afirmam que o carvão ativado é o melhor adsorvente de alguns
antibióticos β lactâmicos (como cefalexina, cefadroxil e 6-APA). No entanto, os estudos
foram realizados em meio aquoso. Como mostrado anteriormente, penG é altamente
adsorvida em carvão ativado quando em meio aquoso, como mostrado na Figura 4.5.
Entretanto, isso não foi observado na adsorção de penG em caldo de cultivo, devido à
competição entre impurezas e penG.
Após estimar o melhor adsorvente a ser utilizado no trabalho, procurou-se estudar a
cinética de adsorção, visando também estabelecer o tempo de contato necessário para
garantir que o equilíbrio fosse alcançado.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 50
4.5 DETERMINAÇÃO DO TEMPO DE EQUILÍBRIO - CINÉTICA DE ADSORÇÃO
O tempo necessário para se atingir o equilíbrio depende da velocidade de adsorção,
portanto da afinidade entre a matriz e a penG, e da temperatura de adsorção. O fenômeno
está ilustrado na Figuras 4.10 (a) e (b), que apresentam os resultados a 4oC e 12oC,
respectivamente.
(a) (b)
Figura 4.10.: Cinética de Adsorção (a) 4oC e (b) 12oC, utilizando-se 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratada para 2 mL de caldo de cultivo de concentração de penG de 50 g.L-1 em valores de pH 4,0; 5,0 e 7,0.
O pH e temperatura são variáveis importantes no estudo de adsorção. Sabe-se que em
valores de pH mais ácidos, a penG encontra-se mais em sua forma neutra e assim facilita
sua adsorção na resina. Isso pode ser comprovado nos ensaios de cinética, que mostrou
uma menor concentração de penG em pH 4,0 quando atingido o equilíbrio.
Sabe-se que a adsorção é exotérmica e o equilíbrio assim deverá ser favorecido a
baixas temperaturas. Como se pode observar nos gráficos da Figura 4.10, nas duas
temperaturas estudadas não observou diferenças no tempo de equilíbrio. Em 4oC, a
adsorção foi levemente mais lenta ao comparada os resultados em 12oC.
A comparação entre os tempos de contato obtidos em ambas as temperaturas mostra
que o estado de equilíbrio foi atingido com 45 minutos. Optou-se assim pela continuidade
do estudo com tempo de contato de 45 minutos.
4.6 ISOTERMAS DE ADSORÇÃO
A determinação da isoterma de equilíbrio é importante para se determinar a
capacidade máxima de adsorção da resina, bem como o valor da sua afinidade. A faixa de
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 51
concentração no estudo em questão foi estabelecida considerando-se dados de produção
industrial, que relatam se atingir valores de até 50 g.L-1 de penG no caldo de cultivo.
Usou-se assim a faixa entre 5 e 50 g.L-1. Como o perfil cinético dos ensaios para a
determinação do modelo cinético foram semelhantes nos diferentes valores de pH, optou-
se por determinar as isotermas de adsorção nas duas temperaturas (4 e 12oC) em apenas
dois valores de pH (4,0 e 7,0).
Os resultados experimentais utilizados na determinação da isoterma de equilíbrio para
a penG utilizando resina XAD-4 são apresentados na Tabela 4.4.
Tabela 4.4.: Resultados experimentais obtidos na determinação da isoterma de equilíbrio para penG utilizando XAD-4, em pH 4 e 7 e temperatura 4oC e 12oC, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de caldo de cultivo.
4oC 12oC pH 7,0 pH 4,0 pH 7,0 pH 4,0
Co (mg/mL)
C* (mg/mL)
q* (mg penG/ g resina)
C* (mg/mL)
q* (mg penG/ g resina)
C* (mg/mL)
q* (mg penG/ g resina)
C* (mg/mL)
q* (mg penG/ g resina)
50 33,03 339,40 32,73 345,48 33,27 334,52 32,18 356,44 40 24,97 300,60 23,82 323,56 24,23 315,34 22,32 353,70 30 16,89 262,20 16,48 270,43 16,01 279,73 14,10 318,08 25 14,48 210,43 14,24 215,21 13,28 234,38 12,39 252,19 20 9,82 203,60 10,67 186,54 10,47 190,55 8,01 239,86 15 8,48 130,43 8,42 131,64 6,43 171,37 6,23 175,48 10 4,77 104,60 4,77 104,68 3,83 123,42 2,87 142,60 5 2,82 43,56 2,41 51,86 1,50 70,00 1,36 72,74 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
A Figura 4.11 apresenta os resultados obtidos da isoterma de adsorção de penG em
XAD-4 através da técnica descrita anteriormente.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 52
0 5 10 15 20 25 30 35 400
50
100
150
200
250
300
350
400
0 5 10 15 20 25 30 35 400
50
100
150
200
250
300
350
400
0 5 10 15 20 25 30 35 400
50
100
150
200
250
300
350
400
0 5 10 15 20 25 30 35 400
50
100
150
200
250
300
350
400
T=4oC e pH 4,0
q* (
mg
PG /
g X
AD-4
)
C* ( mg / mL )
T=12oC e pH 4,0
q* (
mg
PG /
g X
AD-4
)
C* ( mg / mL )
T=12oC e pH 7,0
q* (
mg
PG /
g X
AD-4
)
C* ( mg / mL )
T= 4oC e pH 7,0
Figura 4.11.: Isotermas de Adsorção- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de caldo de cultivo.
Analisando-se os coeficientes aparentes de correlação apresentados na Tabela 4.5,
pode-se observar que o modelo de Langmuir apresenta um ajuste significativamente
melhor aos pontos experimentais. Assim, pode-se determinar a máxima capacidade e a
constante de adsorção de penG em XAD-4 nas diferentes combinações de valores de pH e
temperatura.
Tabela 4.5.: Parâmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir, Freundlich e Linear para a penG e seus coeficientes de correlação.
Langmuir Freundlich Linear
pH T(oC) qm (mg/g)
KL
(mg / mL) R2 n KF
(mL/ mg resina) R2 KP (mg / mL) R2
4 4 595,06±51,54 21,67±3,64 0,9942 0,615±0,075 43,42±10,15 0,968 10,81±1,41 0,9607 4 534,68±56,36 18,55±4,06 0,9885 0,593±0,089 44,79±12,42 0,950 10,14±1,51 0,9404 12 439,84±14,82 6,17±0,66 0,9958 0,401±0,067 97,39±19,29 0,935 10,48±2,45 0,8867 12 431,72±11,34 9,19±0,67 0,9981 0,458±0,046 71,41±10,13 0,980 9,45±1,65 0,930
Os resultados apresentados nas Tabelas 4.4 e 4.5 indicam que a adsorção é mais
eficiente quando realizada a pH 4,0 e 4oC. Era esperado que a pH 4,0, a eficiência de
adsorção apresentasse resultados significativamente melhores que a pH 7,0, visto que à
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 53
medida que diminui o pH aumenta a concentração da forma neutra , que deverá ter maior
afinidade pela resina. Entretanto, observa-se que a diferença entre os valores de
concentrações de penG na forma neutra (valores calculados na Tabela 4.6) a pH 4,0 e pH
7,0, é muito baixa, o que explica a pouca variação observada na eficiência de adsorção.
Um efeito significativo do pH na adsorção de penG em resina hidrofóbica só seria
observado para valores de pH em torno de 2,74. Além disso, a adsorção de penG contida
em uma matriz complexa (caldo de cultivo) deve considerar o efeito do pH não somente
sobre a penG, mas também sobre todas as moléculas existentes neste meio, as quais
também competirão pelos sítios de adsorção.
Por outro lado, acredita-se que a forma ionizada da penG pode interagir com XAD-4
através de sua cadeia lateral hidrofóbica, ao contrário do que se observa na extração
utilizando solvente hidrofóbico, onde somente a forma neutra é extraída.
Tabela 4.6.: Porcentagem de penG na sua forma neutra e iônica em diferentes valores de pH.
pH Forma Neutra (HA)
Forma Iônica (A-) pH Forma Neutra
(HA) Forma
Iônica (A-) 1 98,21% 1,79% 6 0,05% 99,95% 2 84,60% 15,40% 7 0,01% 99,99%
2,74 50,00% 50,00% 8 ~0,0% ~100,00% 3 35,46% 64,54% 9 ~0,0% ~100,00%
3,2 25,75% 74,25% 10 ~0,0% ~100,00% 3,5 14,81% 85,19% 11 ~0,0% ~100,00% 4 5,21% 94,79% 12 ~0,0% ~100,00% 5 0,55% 99,45% 13 ~0,0% ~100,00%
Analisando os valores da capacidade máxima na mesma temperatura, os resultados
apresentados nas Tabelas 4.4 e 4.5 indicam que a adsorção é mais eficiente quando
realizada a temperaturas menores.
Além da complexidade do meio, também devem ser considerados os erros associados
ao ajuste do modelo de Langmuir, devido principalmente, à correlação dos parâmetros
dificultar a percepção do efeito do pH e da temperatura na adsorção de penG, já que os
valores de KL e qmax podem variar de uma forma que se compensem. Foi possível,
entretanto, determinar as condições experimentais mais adequadas à adsorção, dando
suporte às etapas seguintes deste estudo.
Para efeito comparativo, foi importante estudar a isoterma de equilíbrio de penG em
água deionizada para se determinar a real capacidade máxima de adsorção de penG pela
resina, sem a competição com as impurezas do caldo. A faixa de concentração no estudo
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 54
em questão foi igual ao do estudo com caldo de cultivo. Por apresentar melhores
condições de adsorção, optou-se por determinar a isoterma de adsorção em 4oC e pH 4,0.
Os resultados experimentais utilizados na determinação da isoterma de equilíbrio para
a penG utilizando resina XAD-4 são apresentados na Tabela 4.7.
Tabela 4.7.: Resultados experimentais obtidos na determinação da isoterma de equilíbrio para penG utilizando XAD-4, em pH 4 e temperatura 4oC, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de água deionizada.
4oC pH 4,0
Co (mg/mL) C* (mg/mL) q* (mg penG/ g resina)
50 27,81 472,40 40 19,23 469,48 30 10,04 378,50 20 6,66 295,80 10 2,99 136,00 0 0,00 0,00
A Figura 4.12 apresenta os resultados obtidos da isoterma de adsorção de penG em
XAD-4 através da técnica descrita anteriormente.
0 5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
400
500
q* (
mg
PG
/ g
XAD
-4)
C* ( mg / mL )
Figura 4.12.: Isotermas de Adsorção- Modelo de Langmuir, utilizando 0,1 g (em base seca) de XAD-4 pré-tratado para 2mL de água deionizada.
A Tabela 4.8 apresenta a máxima capacidade e a constante de adsorção de penG em
XAD-4 em 4oC e pH 4,0 utilizando água deionizada.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 55
Tabela 4.8.: Parâmetros Aparentes de Ajuste dos modelos de Langmuir para a penG e seus coeficientes de correlação.
Langmuir
pH T(oC) qm (mg/g)
KL
(mg / mL) R2
4 4 644,21±56,58 8,20±1,91 0,9841
Os resultados apresentados nas Tabelas 4.5 e 4.8 indicam que XAD-4, a 4°C e pH4,
tem capacidade de adsorção de penG dissolvida em água similar à apresentada quando
penG estava dissolvida no meio de cultivo, o que indica que a resina tem alta seletividade
por penG.
Conhecendo a estabilidade da penG em diferentes valores de pH e temperatura, as
propriedades físico-química da resina escolhida e a interação entre penG e resina pode-se
iniciar o estudo de adsorção da penG em Amberlite XAD-4.
4.7 ESTRATÉGIAS DE ADSORÇÃO DE PENICILINA G
4.7.1 DESENVOLVIMENTO DO PROCESSO DE ADSORÇÃO DE PENICILINA G COM GRADIENTE DE PH Em valores de pH mais ácidos, penG é pouco solúvel e apresenta baixa estabilidade.
Entretanto, essa condição é importante para promover melhor adsorção desse antibiótico
em resinas hidrofóbicas. Foi impossível se determinar isotermas de adsorção a valores de
pH menores que 4, pois para valores altos de concentração, em pH menor que 4,0, o
antibiótico tem forte tendência a formar polímeros. Visando estudar a adsorção em valores
de pH baixos, minimizando perdas de penG por degradação, optou-se pelo uso de
gradiente de pH durante a adsorção.
O processo iniciou-se em pH 7,0 e conservou-se nesse pH durante 45 minutos. A
seguir, o pH foi ajustado para 5,0, no qual permaneceu por mais 45 minutos, depois para
4,0, mantido por mais 45 minutos. Em seguida, o pH foi ajustado para 3,0 e permaneceu
por 30 minutos, quando foi novamente ajustado para pH 2,5 por 15 minutos. Retiraram-se
amostras ao final de cada tempo, antes da mudança de pH. Com essa estratégia, ao se
diminuir o pH, a concentração de penG no meio já estaria menor, pois parte dela já estaria
adsorvida, o que possibilitaria a adsorção em pH mais ácido.
A adsorção em sistema de gradiente de pH foi realizada mantendo uma solução sob
agitação mecânica em banho a uma temperatura de 4oC.
Para aumentar a eficiência na adsorção, optou-se em aumentar a quantidade de resina
durante o gradiente de adsorção, simulando uma operação em coluna com ajuste de pH
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 56
entre estágios. Nesse teste, a adsorção iniciou-se com 0,5 g de XAD-4 e a cada mudança
de pH adicionou-se mais 0,5 g, totalizando 2 g de resina em 40 mL de uma solução
50 g.L-1. Alíquotas do sobrenadante foram retiradas e a concentração de penG foi
monitorada ao longo do tempo em todos os valores de pH. Os resultados obtidos nesse
ensaio estão apresentados na Figura 4.13.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 1700
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Con
cent
raçã
o ( g
.L-1)
Tempo (min)
pH 7,0 pH 5,0 pH 4,0 pH 3,5
16,23%
38,87%
69,43%
85,28%
Figura 4.13.: Resultados da adsorção de penG a 4°C na faixa de pH de 3,5 a 7,0 utilizando 2 g de XAD-4 adicionados gradativamente em 40mL de caldo com 50g.L-1 de penG
Considerando que em processo de separação de penG por extração com solvente,
ocorrem perdas entre 10 – 15% (Kheirolomoom et al, 1999), podemos considerar o
processo de adsorção adequado para a recuperação de penG. Contudo, devido às perdas
que podem ocorrer durante a dessorção, decidiu-se fazer um novo experimento usando
uma redução ainda maior do pH, visando atingir adsorção máxima.
Para aumentar a recuperação de penG a partir do caldo de cultivo, o mesmo processo
anterior foi realizado seguido da diminuição do pH de 3,5 para 3,2 sem adição de nova
quantidade de resina. Os resultados obtidos estão apresentados na Figura 4.14.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 57
0 50 100 150 200
0
10
20
30
40
50
Con
cent
raçã
o ( g
.L-1)
Tempo (min)
pH 7,0 pH 5,0 pH 4,0 pH 3,5 pH 3,2
25,16%30,32%
57,74%66,45%
99,03%
Figura 4.14.: Resultados da adsorção de penG a 4°C na faixa de pH de 3,2 a 7,0 utilizando 2 g de XAD-4 adicionado gradativamente em 40 mL de caldo com 50 g.L-1 de penG
Analisando-se os resultados obtidos no segundo experimento de adsorção com
gradiente, quando se reduziu o pH de 7,0 para 4,0, conseguiu-se adsorver
0,77g penG/g resina, ou seja, um valor maior que capacidade máxima de adsorção da
resina XAD-4 (q*= 0,59g penG/ g resina, a pH 4,0 e 4oC). Considerando-se ainda o tempo
de adsorção, nesse mesmo intervalo de pH, tem-se uma produtividade de
0,31g penG/g resina/hora.
Reduzindo-se o pH para 3,5 a capacidade de adsorção da resina e a produtividade
também se reduziram para 0,66 g penG/g resina e 0,22 g penG/g resina/hora. A redução do
pH para 3,2, levou a um aumento da capacidade total de adsorção para
0,99 g penG/g resina e da produtividade para 0,28 g penG/ g resina/hora.
A diminuição da capacidade total e produtividade que se observou quando se reduziu
o pH de 4,0 para 3,5 pode ser explicada pela menor concentração de penG na solução no
início de cada etapa. Contudo, o grande aumento na eficiência de adsorção que se
observou quando se reduziu o pH de 3,5 para 3,2 pode ser explicado pela maior
quantidade da forma neutra nessa faixa de operação e também pela degradação de 25% de
penG nas condições do ensaio (concentração de penG no final da etapa de pH 3,5 a pH 3,2
durante 30 minutos).
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 58
Em novo experimento, 18 mL de uma solução 50 g.L-1 de penG inicialmente em pH
7,0, teve seu pH vagarosamente ajustado até o valor de 4,0. Atingido pH 4,0, adicionou-se
1,5 g de XAD-4. Iniciou-se, então, a adsorção e o monitoramento da concentração de
penG até que atingisse o equilíbrio de adsorção. Após 60 minutos, ajustou-se o pH para
3,5 permanecendo por mais 30 minutos. Os resultados obtidos nesse ensaio estão
apresentados na Figura 4.15.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
10
20
30
40
50
0 20 40 60 80 100
0
10
20
30
40
50 pH 4,0
Con
c. P
enG
(g.L
-1)
tempo ( min )
94,64%91,34%
pH 3,5
Figura 4.15.:Resultados da adsorção de penG a 4°C na faixa de pH de 3,5 a 4,0 utilizando 1,5g de XAD-4 adicionado em 18mL de caldo com 50g.L-1 de penG
Como se pode observar no gráfico de Figura 4.15, após 1h de experimento a pH 4,0,
aproximadamente 91% da penG presente havia sido adsorvida na resina XAD-4, ou seja,
0,55g penG/g resina (0,55g penG/g resina/hora). Entretanto, 0,77g penG/g resina foi
adsorvida usando-se gradiente, com produtividade de 0,31 g penG/g resina/hora. Houve,
assim, aumento da eficiência de adsorção, mas diminuição da produtividade. Nova
tentativa de redução do pH para 3,5 elevou a capacidade de adsorção para 0,58g penG/g
resina, com redução da produtividade para 0,38 g penG/g resina/hora. O uso de gradiente
parece realmente melhorar o desempenho da adsorção, além de proteger a penG da
degradação química. Contudo, trabalhando-se com alta concentração de penG, em baixo
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 59
valor de pH (sem gradiente), a velocidade de adsorção é muito maior, sendo o ideal
trabalhar diretamente com baixo pH.
A tentativa de adsorção com o pH ajustado diretamente para 3,5 resultou em
degradação visível a olho nu da penG, confirmando a ocorrência de polimerização e
degradação do antibiótico em valores de pH inferiores a 4,0, quando concentrações mais
elevadas da forma neutra estão presentes.
O estudo efetuado mostrou que se for aumentada a quantidade de resina, pode-se
atingir altas eficiências a pH 4,0 em 45 minutos ou a pH mais baixos em menores tempos.
A pH 4,0, o antibiótico permanece estável mesmo a altas concentrações. Essa operação é
mais simples, pois requer apenas uma etapa de redução do pH do caldo de cultivo antes do
contato com a resina. Se a adsorção na indústria for realizada em batelada, conforme
estudado aqui, recomenda-se, pois, operação a pH 4,0. Passamos assim, a seguir, para a
próxima etapa prevista: estudo da dessorção de penG.
4.8 DESSORÇÃO DE PENICILINA G
Experimentos preliminares mostraram que o contato com fase aquosa a pH 7,0 não era
suficiente para dessorver penG, sendo necessário assim uso de co-solvente para aumentar
a hidrofobicidade da fase eluente. Optou-se por usar etanol como co-solvente, devido ser
um composto biocompatível, além da sua grande aceitação do ponto de vista ambiental e
ampla disponibilidade no Brasil. Na etapa de dessorção, foi elaborado um procedimento
experimental levando em consideração todas as variáveis independentes que poderiam
influenciar no processo, como: temperatura do eluente, valores de pH do eluente e
composição da mistura água/etanol.
Esse procedimento experimental foi realizado em duas etapas: um delineamento
composto central rotacional (DCCR) para a análise dos efeitos principais das variáveis
sobre as respostas e seqüencialmente, outro planejamento fatorial completo reduzindo o
número de variáveis e alterando as faixas de estudo em função do impacto que elas
tiveram sobre as respostas.
Nos ensaios de dessorção, misturou-se 0,1g de XAD-4, contendo penG adsorvida com
2 mL de mistura água/etanol durante 1 hora. A porcentagem de penG dessorvida no
eluente era medida utilizando-se hidrólise enzimática com PGA e quantificando-se o
6-APA liberado pela reação com PDAB. A base de Schiff formada era quantificada
espectofotometricamente, conforme descrito em Material e Métodos.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 60
Assim, foi realizado um planejamento fatorial completo 23, incluindo os seis pontos
axiais e quatro repetições no ponto central, totalizando 18 ensaios. A Tabela 4.9 apresenta
os valores utilizados no planejamento e a Tabela 4.10, apresenta a porcentagem de penG
dessorvida em cada ensaio.
Tabela 4.9.: Valores utilizados do 1o DCCR para três fatores
Variáveis -1,68 -1 0 1 1,68 T (oC) 4,0 5,6 8,0 10,4 12,0
pH 4,0 4,6 5,5 6,4 7,0 [EtOH]% 0,0 20,0 50,0 80,0 100,0
Tabela 4.10.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 1o delineamento
Ensaios T (oC) pH [EtOH] % Dessorvida
1 -1 -1 -1 29,62 2 +1 -1 -1 34,02 3 -1 +1 -1 32,90 4 +1 +1 -1 31,09 5 -1 -1 +1 64,09 6 +1 -1 +1 62,85 7 -1 +1 +1 74,39 8 +1 +1 +1 75,34 9 -1,68 0 0 66,07 10 +1,68 0 0 68,97 11 0 -1,68 0 65,60 12 0 +1,68 0 63,47 13 0 0 -1,68 31,45 14 0 0 +1,68 79,58 15 0 0 0 70,36 16 0 0 0 73,15 17 0 0 0 70,53 18 0 0 0 72,36
Conforme as condições utilizadas, a porcentagem de penG dessorvida variou de 29,62
a 79,58%. Os pontos centrais apresentam uma pequena variação, indicando uma boa
reprodutibilidade do processo.
Através dos resultados obtidos foi possível determinar os coeficientes de regressão que
estão apresentados na Tabela 4.11.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 61
Tabela 4.11.: Coeficientes de regressão para a resposta no 1o delineamento
Coeficientes de Regressão
Erro Padrão t(8) p-valor Lim. Conf. -
95% Lim. Conf.
+95%
Média 72,15 4,09 17,66 <0,0001 62,73 81,58 T(L) 0,53 2,21 0,24 0,8184 -4,58 5,63 T(Q) -3,92 2,30 -1,70 0,1270 -9,22 1,39
pH(L) 1,43 2,21 0,65 0,5360 -3,67 6,54 pH(Q) -4,97 2,30 -2,16 0,0626 -10,28 0,33
[EtOH] (L) 16,84 2,21 7,60 0,0001 11,73 21,95 [EtOH] (Q) -8,16 2,30 -3,55 0,0075 -13,47 -2,86
T x pH -0,50 2,89 -0,17 0,8664 -7,18 6,17 T x [EtOH] -0,36 2,89 -0,12 0,9041 -7,03 6,31
pH x [EtOH] 2,81 2,89 0,97 0,3607 -3,87 9,48
-,124414
-,173662
,2373028
,6466482
,9693961
-1,70282
-2,16145
-3,5473
7,604086
p=,1
Efeitos Estimados (valores absolutos)
1Lby3L
1Lby2L
(1)T(L)
(2)pH(L)
2Lby3L
T(Q)
pH(Q)
[EtOH](Q)
(3)[EtOH](L)
Figura 4.16.:Diagrama de Pareto para o 1o delineamento
Como pode ser observado na Tabela 4.11, somente os parâmetros, linear e quadrático,
da variável concentração de etanol e o parâmetro quadrático da variável pH do modelo
foram significativos (p-valor < 0,1), como confirmado pelo Diagrama de Pareto
(Figura 4.16).
Pode-se, então, elaborar um modelo com as variáveis codificadas:
%DESSORVIDA = 72,15 - 4,97 pH2 + 16,84 [EtOH] - 8,16 [EtOH]2
Analisando-se a Tabela 4.12, verificamos que o F calculado foi significativo
(p-valor < 0,01) e a porcentagem de variação explicada, de 90,31%.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 62
Tabela 4.12.: ANOVA para a resposta no 1o delineamento
Soma de Quadrados
Grau de Liberdade
Quadrado Médio
F calculado p-valor
REGRESSÃO 4991,44 9 554,60 8,28 0,0037 RESÍDUOS 535,85 8 66,98
TOTAL 5527,29 17 % variação explicada (R²) = 90,31 F 9;8;0,05 = 3,39 (tabelado)
Esses resultados indicam uma relativa concordância entre os valores experimentais e
previstos pelo modelo, expressos na Figura 4.17. Pela Figura 4.18 podemos observar que
os erros de ajustamento estão independentes e normalmente distribuídos em torno da reta.
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Valores Experimentais
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Valo
res
Prev
isto
s
Figura 4.17.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta no 1o delineamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14
Resíduos
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Valo
res
Nor
mai
s Es
pera
dos
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
Figura 4.18.: Distribuição dos resíduos em torno da reta que indica normalidade para a resposta no 1o delineamento
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 63
O delineamento composto central rotacional (DCCR) utilizado neste processo foi
muito interessante para avaliar os fatores que afetam a dessorção da penG. Os modelos
foram significativos, sendo possível construir as superfícies de resposta (Figura 4.19) e
definir as regiões de interesse.
60 50
4,0 5,6 6,8 8,0 9,2 10,4 11,6
T (oC)
4,0
4,6
5,1
5,5
5,9
6,4
6,8
pH
(a) (b)
70 60 50 40 30 20 10
4,0 5,6 6,8 8,0 9,2 10,4 11,6
T (oC)
0
20,2
35,1
50,0
64,9
79,8
94,6
[EtO
H] (
%)
(c) (d)
70 60 50 40 30 20 10
4,0 4,6 5,1 5,5 5,9 6,4 6,8
pH
0
20,2
35,1
50,0
64,9
79,8
94,6
[EtO
H] (
%)
(e) (f)
Figura 4.19.: Superfícies de resposta e curva de contorno para a dessorção de penG (%) em função da temperatura e pH (a) e (b), da temperatura e [EtOH] (c) e (d) e do pH e [EtOH] (e) e (f) no 1o delineamento
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 64
Observando-se as superfícies de resposta, para maximizar a dessorção da penG os
ensaios devem ser realizados entre valores de pH 5,2 a 6,8 em uma concentração de etanol
entre 65% e 100%. Como observado na Figura 4.19 (c) e (d), a temperatura de dessorção
não é significativa, assim fixou-se 8oC (valor no ponto central) como a temperatura de
estudo.
Definidas as faixas mais adequadas para maximizar a dessorção da penG, foi realizado
outro planejamento fatorial completo 22, incluindo os quatro pontos pseudo-axiais e três
repetições no ponto central, totalizando 11 ensaios. Cada ensaio foi realizado em
duplicata. A Tabela 4.13 apresenta os valores utilizados no planejamento e a Tabela 4.14,
apresenta a porcentagem de penG dessorvida em cada ensaio.
Tabela 4.13.: Valores utilizados do 2o DCCR para dois fatores
Variáveis -1 0 1 pH 5,2 6,0 6,8
[EtOH] 65,0 82,5 100,0
Tabela 4.14.: Valores codificados e resposta da porcentagem de penG dessorvida no 2o delineamento
Ensaios pH [EtOH] % Dessorvida
1.1 -1 -1 76,64 1.2 +1 -1 80,21 1.3 -1 +1 79,29 1.4 +1 +1 80,19 1.5 0 0 94,93 1.6 0 0 97,74 1.7 0 0 96,25 1.8 0 -1 74,06 1.9 0 +1 66,38
1.10 -1 0 65,70 1.11 +1 0 70,15 2.1 -1 -1 77,05 2.2 +1 -1 78,33 2.3 -1 +1 82,52 2.4 +1 +1 77,01 2.5 0 0 94,48 2.6 0 0 91,93 2.7 0 0 94,56 2.8 0 -1 57,53 2.9 0 +1 79,34
2.10 -1 0 74,28 2.11 +1 0 80,33
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 65
Conforme as condições utilizadas, a porcentagem de penG dessorvida variou de 57,53
a 97,74%. Os pontos centrais apresentam uma pequena variação, indicando uma boa
repetibilidade do processo.
Através dos resultados obtidos foi possível determinar os coeficientes de regressão que
estão apresentados na Tabela 4.15.
Tabela 4.15.: Coeficientes de regressão para a resposta no 2o delineamento
Coeficientes
de Regressão
Erro Padrão t(13) p-valor
Lim. Conf. -
95% Lim. Conf.
+95%
Média 92,68 0,57 162,97 <0,0001 91,46 93,91 pH(L) 0,32 0,45 0,71 0,4904 -0,66 1,30 pH(Q) -0,70 0,70 -1,00 0,3363 -2,20 0,81
[EtOH] (L) 0,23 0,45 0,51 0,6165 -0,75 1,21 [EtOH] (Q) -14,81 0,70 -21,26 <0,0001 -16,31 -13,30
pH x [EtOH] -1,18 0,55 -2,13 0,0525 -2,38 0,01
,2312109
,319877
-,449961
-,961471
-9,57996
p=,05
Estimativa do Efeito ( Valores Absolutos )
(2)[EtOH](L)
(1)pH(L)
pH(Q)
1Lby2L
[EtOH](Q)
Figura 4.20.: Diagrama de Pareto para o 2o delineamento
Neste caso, a dessorção mostrou-se altamente influenciada pela concentração de etanol
(Figura 4.20). O parâmetro quadrático da variável concentração de etanol do modelo
sobressaiu diante das outras variáveis podendo-se elaborar um modelo com a variável
codificada:
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 66
%DESSORVIDA = 92,68 – 14,81 [EtOH]2
Analisando-se a Tabela 4.16, verificamos que o F calculado foi significativo
(p-valor <0,01) e a porcentagem de variação explicada, de 86,51%.
Tabela 4.16.: ANOVA para a resposta no 2o delineamento
Soma de Quadrados
Grau de Liberdade
Quadrado Médio F calc p-valor
REGRESSÃO 1241,67 5 248,33 20,51 < 0,0001 RESÍDUOS 193,68 16 12,10 TOTAL 1435,35 21
% variação explicada (R²) = 86,51 F 5;16;0,05 = 2,85 (tabelado)
Esses resultados indicam uma relativa concordância entre os valores experimentais e
previstos pelo modelo, expressos na Figura 4.21. Pela Figura 4.22 podemos observar que
os erros de ajustamento estão independentes e normalmente distribuídos em torno da reta.
70 75 80 85 90 95 100 105
Valores Experimentais
72
74
76
78
80
82
84
86
88
90
92
94
96
Val
ores
Pre
vist
os
Figura 4.21.: Valores experimentais versus valores previstos pelo modelo para a resposta no 2o
delineamento
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 67
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
Resíduos
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Val
ores
Nor
mai
s E
sper
ados
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
Figura 4.22.: Distribuição dos resíduos em torno da reta que indica normalidade para a resposta no 2o
delineamento
Os modelos foram significativos, sendo possível construir a superfície de resposta
(Figura 4.23), a curva de contorno (Figura 4.24) e definir as regiões de interesse.
92 90 88 86 84 82 80 78 76
Figura 4.23.: Superfícies de resposta para a dessorção de penG (%) em função da temperatura e [EtOH] no 2o delineamento
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 68
92 90 88 86 84 82 80 78 76
5,205,36
5,525,68
5,846,00
6,166,32
6,486,64
6,806,96
7,12
pH
65,0
68,5
72,0
75,5
79,0
82,5
86,0
89,5
93,0
96,5
100,0
[EtO
H]
Figura 4.24.: Curva de contorno para a dessorção de penG (%) em função da temperatura e [EtOH] no 2o delineamento
Observando-se curva de contorno, para maximizar a dessorção da penG, em torno de
92%, os ensaios devem ser realizados entre valores de pH 5,4 a 7,0 em uma concentração
de etanol entre 80% e 86%. Para uma melhor dessorção, optou-se por utilizar valores de
pH e de etanol que, entre essas faixas, são mais centrais.
Assim, a dessorção será conduzida a 8oC em pH 6,2, utilizando-se como eluente uma
mistura com 82,5% de etanol e 17,5% de água.
4.9 PUREZA DA PENG AO FINAL DO PROCESSO DE PURIFICAÇÃO
A Figura 4.25 mostra os cromatogramas obtidos do caldo de cultivo contendo penG e
da solução eluída da resina XAD-4, onde podem ser vistos os vários picos correspondentes
aos vários componentes presentes. Os picos 1, 2 e 3 são referentes a impurezas e o pico 4 é
referente a penG. A linha verde mostra os picos antes da adsorção e a linha vermelha
apresenta todos os picos referentes aos componentes dessorvidos da resina em solução
etanólica.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 69
(C)
Figura 4.25.: Cromatogramas referentes ao processo de purificação de penG. Linha vede: caldo fermentativo contendo penG 50 g.L-1 e Linha vermelha componentes do caldo fermentativo dessorvidos com etanol 82,5%.
Observa-se que há uma redução significativa na intensidade dos picos referentes a
impurezas do caldo de cultivo. A Tabela 4.17 apresenta os valores da área de cada pico.
Tabela 4.17.: Relação dos picos dos cromatogramas referentes ao processo de purificação e os respectivos valores de suas áreas
Pico Composto Área Inicial Área Final 1 Impureza 1 10664218 2728350 2 Impureza 2 47176290 22694758 3 Impureza 3 9441466 - 4 Penicilina 8762369 4810532
A Figura 4.26 mostra uma foto do caldo de cultivo antes da adsorção e depois da
dessorção com solução etanólica.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 70
Figura 4.26.: caldo de cultivo antes da adsorção e depois da dessorção com solução etanólica.
Observa-se que ocorre uma significante clarificação do caldo de cultivo, indicando
que vários componentes do caldo foram separados da penicilina. Esses componentes não
são detectados nas condições de análise do CLAE.
Analisando os cromatogramas, os valores da área e a foto comparativa, pode-se
observar que a resina Amberlite XAD-4 é seletiva na adsorção e dessorção da penG. Uma
grande quantidade de impurezas presentes inicialmente no caldo de cultivo não estavam
presentes ao final do processo na solução de etanol/água. Apesar de alguns contaminantes
competirem com a penG pelos sítios ativos da resina, a adsorção de penG é maior do que a
adsorção dos contaminantes, o que já havia sido indicado pela comparação entre as
isotermas obtidas para adsorção de penG quando esta estava dissolvida em água ou no
meio de cultivo. CASEY et al. (2007), que estudaram a eficácia de XAD-4 para
recuperação de geldanamicina de caldos de fermentação, também concluiu que a resina era
seletiva para esse antibiótico.
Assim, a penG apresenta-se em uma forma bem mais pura ao final do processo de
purificação. A resina apresenta assim não só alta capacidade de adsorção de pen G, mas
também boa seletividade para o antibiótico.
4.10 SOLUBILIDADE DE PENICILINA G EM DIFERENTES SOLVENTES
Após o processo de dessorção, havia uma solução de penG em 82,5% de etanol e
17,5% de água. Para a utilização da penG, havia a necessidade dela ser retirada da solução
e cristalizada. Então, houve a necessidade de estudar a solubilidade da penG em água,
etanol, mistura 82,5% etanol/água e acetato de isobutila.
Os ensaios foram realizados a temperatura constante, 8oC. Em frascos com 100mL de
cada solvente em pH 6,2, adicionou-se penG até o ponto em que havia a presença de penG
precipitada, indicando saturação da solução. Os frascos foram lacrados e colocados sob
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 71
agitação suave por quatro horas. Em seguida, os frascos permaneceram em repouso para as
suspensões sedimentarem. Após a sedimentação, amostras do sobrenadante foram
retiradas por meio de uma seringa acoplada a um filtro de 0,2µm, evitando a passagem de
sólidos. Após essa etapa, as amostras foram analisadas por cromatografia de alta eficiência
(CLAE) e os resultados estão apresentados na Tabela 4.18.
Tabela 4.18.: Solubilidade da penG em diferente solventes a 8oC e pH 6,2
Solvente Solubilidade (gPenG / L solvente) H2O 385,00
82,5% EtOH-H2O 179,79 EtOH 4,59
Acetato de isobutila 0,24
Para a mistura etanol-água, foram realizados os mesmos ensaios variando a
temperatura da solução e os resultados estão apresentados na Figura 4.26.
Figura 4.27.: Solubilidade da penG em mistura de etanol-água a pH 6,2 em diferentes temperaturas ( 0 , 8 e 16oC)
Os resultados do estudo de solubilidade mostram que penG é altamente solúvel na
mistura etanol-água. A cristalização da penG a partir da mistura etanol-água irá assim
requerer sua concentração, através da evaporação do etanol a vácuo, para evitar
degradação do antibiótico. Contudo, ela deverá ser obtida já com grande pureza,
diferentemente da penG importada, que se apresenta sempre com alto grau de impurezas,
requerendo sua dissolução e recristalização para separação das impurezas. O etanol teria
mesmo que ser recuperado, tal como já ocorre atualmente com o solvente utilizado na
extração líquido-líquido. A cristalização é etapa dominada na indústria e não era objeto de
estudo neste trabalho. O estudo de solubilidade foi feito apenas com o intuito de gerar
dados fundamentais para a etapa seguinte de cristalização. Um estudo mais aprofundado,
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 72
levando-se em conta a evaporação do etanol, deve ser realizado para obtenção de penG
sólida.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 73
5 CONCLUSÕES
O método enzimático desenvolvido para a quantificação de penG apresentou boa
reprodutibilidade e exatidão. Esses resultados foram possíveis devido à obtenção da curva
de calibração utilizando como solvente o caldo de cultivo, e também devido ao uso de
excesso de enzima no meio e sua especificidade. Assim, esse método desenvolvido para
quantificar penG em caldo de cultivo, associada à quantificação do 6-APA através de
reação com PDAB, foi utilizado neste trabalho de maneira satisfatória, visto que penG em
diferentes meios e em ampla faixa de concentração foi determinada com exatidão e
precisão.
Independente do tempo de cultivo, a composição do meio não apresenta influência
na análise de penG.
A adsorção de penG em resinas hidrofóbicas é favorecida em meio ácido.
Entretanto, nesta condição ocorre degradação do antibiótico. Os resultados obtidos nesse
trabalho indicam que penG é estável a 4 e 12°C em valores de pH 4,0 a 7,0 por 1 hora.
Para valores de pH mais ácidos esse tempo diminui, sendo necessário um maior cuidado
para evitar a degradação.
A resina Amberlite XAD-4 é o melhor adsorvente para extração de penG presente
em caldo de cultivo. O estado de equilíbrio da adsorção de penG na resina Amberlite
XAD-4 em valores de pH de 4,0; 5,0 e 7,0 em 4 e 12oC foi atingido com 45 minutos.
A isoterma de Langmuir foi o modelo que melhor representou a adsorção de penG
utilizando a resina Amberlite XAD-4, apresentando capacidade máxima de adsorção de
0,595g penG/g resina, a pH 4, 4°C.
O uso de gradiente de pH durante o processo de adsorção de penG é eficiente e
evita perdas por degradação, mas comparado ao processo sem gradiente é mais demorado,
apresentando o mesmo nível de eficiência.
Para se obter uma máxima dessorção, o processo deve ser realizado a 8oC e utilizar
como eluente uma mistura de 82,5 % etanol e 17,5 % água em pH 6,2.
Os resultados obtidos indicam a viabilidade técnica da utilização de adsorção em
resina hidrofóbica para recuperação de penG.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 74
Resumo das condições definidas para o processo de purificação de penG por
adsorção em resina Amberlite XAD-4 em batelada (Tabela 5.1).
Tabela 5.1.: Resumo das condicões definidas para o processo de purificação de penG por adsorção em resina Amberlite XAD-4 em batelada
ADSORÇÃO DESSORÇÃO
TEMPERATURA DE OPERAÇÃO(oC) 4 8
pH 4,0 6,2 VARIAÇÃO DE pH SEM GRADIENTE SEM GRADIENTE
AGITAÇÃO Agitador mecânico SEM PÁ (1250 rpm)
Agitação em Shaker (250 rpm)
TEMPO DE OPERAÇÃO (min) 45 60
EFICIÊNCIA DA OPERAÇÃO ∼91% de penG adsorvida ∼92% de penG dessorvida
COMPISIÇÃO DO ELUENTE - 82,5 % ETANOL E 17,5%
ÁGUA DEIONIZADA
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 75
6 SUGESTÕES Um estudo mais detalhado do grau de pureza e a cristalização da penG após a
dessorção deve ser realizado para otimizar o processo. Outras resinas poderiam ser
testadas a fim de comparar a eficiência de adsorção e seletividade com os resultados
obtidos nesse trabalho.
O processo de utilização de adsorção em resina hidrofóbica para recuperação de penG
requer ainda estudo em coluna, para otimização e posterior estudo de viabilidade
econômica. É possível que esse estudo resulte em custo maior do processo de adsorção em
relação à extração com solvente. Contudo, as pressões ambientais são a cada dia mais
fortes e o processo proposto substitui solventes altamente hidrofóbicos, cujo escape para o
ambiente é altamente prejudicial, por etanol, um solvente de baixa hidrofobicidade,
amplamente disponível e aceito ambientalmente.
Assim, mesmo com a hipótese de que essa substituição não seja economicamente
viável no momento, ela poderá se tornar imperativa nos próximos anos, o que justifica a
continuidade deste estudo para otimização do processo.
SEPARAÇÃO DE PENG POR ADSORÇÃO EM RESINAS HIDROFÓBICAS 76
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