paulo eduardo herbst leonardo likes lockssiaibib01.univali.br/pdf/paulo herbst, leonardo...
TRANSCRIPT
1
PAULO EDUARDO HERBST
LEONARDO LIKES LOCKS
AVALIAÇÃO HISTOMORFOLÓGICA DA EFETIVIDADE DO
MATERIAL LITHOTHAMNIUM CALCAREUM NO PROCESSO DE
NEOFORMAÇÃO ÓSSEA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para obtenção do título de Cirurgião-Dentista, sob orientação da professora Maria Regina Orofino Kreuger.
Itajaí (SC) 2009
2
PAULO EDUARDO HERBST
LEONARDO LIKES LOCKS
AVALIAÇÃO HISTOMORFOLÓGICA DA EFETIVIDADE DO
MATERIAL LITHOTHAMNIUM CALCAREUM NO PROCESSO DE
NEOFORMAÇÃO ÓSSEA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito parcial para obtenção do título de Cirurgião-Dentista, sob orientação da professora Maria Regina Orofino Kreuger. Orientador: Profª. Dra Maria Regina Orofino Kreuger
1. Profª. Dra. Maria Regina Orofino Kreuger________________________
Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)
2. Prof°. Alberto Fedelli Júnior___________________________________
Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)
3. Prof°. Dr. David Rivero Tames_________________________________
Curso de Odontologia da Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI)
3
AGRADECIMENTOS
Agradecemos primeiramente a Deus, por ter nos concedido o dom da vida.
Agradecemos aos nossos pais sem os quais não teríamos a chance de
alcançar mais essa vitória em nossas vidas.
Agradecemos as pessoas que amamos, nossos amigos, colegas com os quais
convivemos e aprendemos a nos superarmos.
Agradecemos a nossa orientadora, prof. Dra. Maria Regina Orofino Kreuger,
pela paciência, compreensão, apoio, orientação e sabedoria transmitida.
Agradecemos ao prof. Davi Rivero Tames, a profa. Elisabete Rabaldo Bottan,
a Maria, a Beatriz, e todos que de um modo direto ou indireto participaram de nossa
pesquisa.
A TODOS O NOSSO MUITO OBRIGADO!
PAULO EDUARDO HERBST
LEONARDO LIKES LOCKS
4
AVALIAÇÃO HISTOMORFOLÓGICA DA EFETIVIDADE DO MATERIAL LITHOTHAMNIUM CALCAREUM NO PROCESSO DE NEOFORMAÇÃO ÓSSEA
Paulo Eduardo HERBST e Leonardo Likes LOCKS Orientadora: Prof. Dra. Maria Regina Orofino KREUGER Defesa: setembro de 2009
Resumo: Em algumas situações o osso não responde convenientemente ao reparo, a utilização de um produto para ajudar e/ou acelerar no reparo ósseo iria ser de grande ajuda na Odontologia assim como nas outras áreas da saúde. O objetivo desse trabalho de pesquisa foi de avaliar o comportamento da alga marinha Lithothamnium calcareum quando utilizada para material para enxertos ósseos. Foram utilizados 12 animais que foram submetidos à perfuração em ambas as pernas traseiras, a perna esquerda recebeu soro fisiológico (grupo controle) e a perna direita recebeu o Lithothamnium (grupo experimental). Após, transcorridos 15 dias de pós-operatório, estes animais foram sacrificados e ambas as pernas retiradas e coradas com HE (hematoxilina e eosina) para a análise dos resultados. Os resultados mostraram que quando na presença do Lithothamnium calcareum no interior das lojas ósseas, o reparo ósseo ocorreu sem o surgimento de necroses teciduais, sem rejeições teciduais. Também houve maior grau de osteogênese em relação aos sítios cirúrgicos de controle. Conclui-se que o Lithothamnium calcareum é biocompatível aos tecidos ósseos, aplicável como enxerto ósseo.
Palavras-chave: enxerto ósseo, materiais biocompatíveis, reparo ósseo.
5
HISTOMORPHOLOGICAL EFFECTIVE EVALUATION OF THE MATERIAL IN PROCESS LITHOTHAMNIUM CALCAREUM OSTEOGENESIS
Paulo Eduardo HERBST e Leonardo Likes LOCKS Adviser: Profa. Dra. Maria Regina Orofino KREUGER Defense date: September 2009
Abstract: In some situations, the bone does not respond properly to repair the use of a product to help and / or accelerate the bone healing would be of great help in Dentistry as well as in other health areas. The objective of this research work was to evaluate the behavior of marine algae Lithothamnium calcareum material when used for bone grafts. Were used 12 animals that were subjected to drilling in both hind legs, the left leg received saline (control group) and right leg was Lithothamnium (experimental group). After, within 15 days postoperatively, the animals were sacrificed and both legs removed and stained with HE (hematoxylin and eosin) for the analysis of results. The results showed that when in the presence of Lithothamnium calcareum inside the shops bone, the bone healing occurred without the emergence of tissue necrosis without tissue rejection. There was also a greater degree of osteogenesis for surgical control sites. We conclude that the Lithothamnium calcareum is biocompatible to bone tissue, applied as bone graft.
Key-words: bone grafts, biocompatible materials, bone repair.
6
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 07
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 09 2.1 Tecido Ósseo.............................................................................................. 09 2.2 Biomateriais................................................................................................ 12 2.2.1 Lithothamnium Calcareum...................................................................... 17 2.3 Reparo Ósseo.............................................................................................. 19
3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 23 3.1 Local de Pesquisa...................................................................................... 23 3.2 Animais........................................................................................................ 23 3.3 Substância Usada....................................................................................... 23 3.4 Procedimentos............................................................................................ 24 3.4.1 Procedimentos Cirúrgicos...................................................................... 25 3.5 Análise Microscópica................................................................................. 27 3.6 Análise Estatísticas.................................................................................... 28
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................... 29
5 CONCLUSÃO.................................................................................................. 37
7
1 INTRODUÇÃO
Em algumas situações o osso não responde convenientemente ao reparo,
como em perdas muito acentuadas devido a traumas e em processos patológicos e
a utilização de um produto para ajudar e/ou acelerar no reparo ósseo iria ser de
grande ajuda na Odontologia assim como nas outras áreas da saúde.
(ESQUISATTO, 2006)
Há muito tempo tem-se utilizado Lithothamnium calcareum nas costas
francesas e inglesas como corretor de solos ácidos e/ou deficientes em cálcio. O
Gênero lithothamnium, alga calcária da família das coralinaceaes, se desenvolve e
prolifera nas profundezas marinhas das ilhas Glénans, crescendo em profundezas
de até 40m. O papel químico atribuído ao Lithothamnium Calcareum é que permite
melhorar o pH dos solos ácidos afim de facilitar a assimilação dos elementos
nutritivos e atividade biológica. (LIMA et a, 2002)
Apenas as formas livres (free-living) das algas calcárias, tais como rodolitos,
nódulos, e seus fragmentos, são viáveis para a exploração econômica, pois
constituem depósitos sedimentares inconsolidados, facilmente coletados através de
dragagens. A plataforma continental brasileira representa, em nível global, a maior
extensão coberta por sedimentos carbonáticos. São utilizadas para diversos fins,
agricultura (em maior volume), potabilização de águas para consumo, dietética,
indústria cosmética, nutrição animal e tratamento da água em lagos.
O Lithothamnium é um produto de origem natural, fornecendo nutrientes
balanceados pela natureza, altas concentrações de cálcio e nutrientes catalisadores
do metabolismo, trazendo como benefícios a fácil absorção pelos animais, sem
antagonismo iônico, melhorando a conversão alimentar, maior fixação de fósforo,
rápida recuperação de fraturas. (ALGAREA, 1997)
8
Existe na área de reparo ósseo odontológico uma vasta literatura, entretanto,
com o material que foi descrito, não há nenhuma pesquisa relacionada com a
aceleração de reparo ósseo. Devido à ausência de pesquisa nesta área, o presente
trabalho tem como objetivo avaliar histomorfologicamente os efeitos do
Lithothamnium calcareum quando utilizado como material para ajudar e/ou acelerar
na neoformação óssea.
9
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Tecido Ósseo
O tecido ósseo é um dos mais resistentes e rígidos tecidos do corpo animal.
Constituinte principal do sistema esquelético, ele é considerado um tecido estrutural
e também metabólico (KAPLAN et al., 1994).
Em relação a sua função estrutural, pode-se incluir o fato do osso atuar como
suporte dando apoio aos músculos esqueléticos, convertendo as contrações em
movimentos úteis, além de servir como cobertura protetora para estruturas vitais
como coração, pulmão, cérebro, medula espinhal e medula óssea (CASTANIA,
2002; CARNEIRO et al., 2005).
Metabolicamente, trata-se de um tecido conjuntivo formado por células e
material intercelular calcificado, a matriz óssea, que serve de reserva de íons
especialmente de cálcio e fósforo e funciona como banco de minerais, os quais
podem ser extraídos quando houver necessidade no organismo (KAPLAN et al.,
1994; MOURE, 2001; MIRANDA et al., 2005).
O tecido ósseo atua como suporte para os tecidos moles e protege órgãos
vitais. É um tecido extremamente rígido, sendo um tipo especial de conjuntivo
formado por matriz óssea, osteócitos, osteoblastos e osteoclastos. (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 1995)
Os osteoblastos são formados a partir de células osteoprogenitoras,
sintetizam a parte orgânica regulando a deposição de cálcio e a mineralização da
10
matriz extracelular do osso e são encontrados como uma camada continua sobre as
superfícies ósseas sofrendo deposição ativa (VIEIRA, 1999).
Histoquimicamente, os osteoblastos reagem fortemente para a fosfatase
alcalina, uma enzima freqüentemente correlacionada com a mineralização
(CASTANIA, 2002).
Á medida que os osteoblastos vão se mineralizando transformam-se em
osteócitos. (SERAKIDES et al., 2006).
O osteócito é a célula óssea madura, é essencial para a manutenção da
matriz óssea; após sua morte, ocorre reabsorção da matriz, através dos
osteoclastos. (TEN CATE, 1994)
Os osteoclastos reabsorvem o tecido ósseo através da secreção de
colagenase ou outras enzimas que atacam a parte orgânica da matriz óssea.
Também participam na eliminação dos restos de células de tecido ósseo que se
formam durante a reabsorção do osso. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995).
São responsáveis pela remoção do osso (osteoclasia) possuem os
mecanismos celulares necessários para a dissolução dos materiais ósseos e para a
ingestão da matriz orgânica. Neles mitocôndrias são abundantes e o citoplasma
pode exibir alguns vacúolos contendo partículas ósseas previamente fagocitadas.
(BANKS 1992).
Todas as superfícies ósseas são revestidas por periósteo ou por endósteo. As
células do periósteo possuem importante papel no crescimento dos ossos e na
reparação de fraturas. (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995)
O tecido ósseo tem como principais funções: suporte, proteção, locomoção e
reserva de minerais (TEN CATE, 1994).
11
A função primordial do tecido ósseo é manter a integridade do esqueleto, com
cerca de 99% do cálcio de todo o nosso organismo, o tecido ósseo serve como um
reservatório para manutenção de cálcio no organismo, essa manutenção da
homeostase de cálcio depende do ritmo de renovação óssea, sendo necessário a
continua reabsorção e disposição que constitui o processo de remodelação do osso.
(SERSON, 1985)
A matriz óssea é formada por uma parte orgânica, onde encontramos fibras
colágenas; e uma parte inorgânica onde são identificados vários íons, como por
exemplo os de fosfato e cálcio. (ROSSI JÚNIOR, 1990)
Os ossos são reservatórios de cálcio, fosfato e outros íons e são essenciais
na manutenção dos níveis desses elementos no sangue. Apesar do aspecto inerte,
os ossos, são remodelados e se mantêm vivos por toda vida, quando lesados são
capazes de reparação, o que demonstra sua permanente vitalidade.
(KATCHBURIAN; ARANA, 1999)
O osso é composto de uma rígida matriz orgânica, cerca de 30% de seu peso,
e 70% de sais de cálcio, porém o osso recém-formado pode possuir uma
percentagem bem mais alta de matriz em relação aos sais. (SERSON, 1985)
Macroscopicamente há duas formas de osso: cortical (compacto) e esponjoso
(medular). No osso compacto, a matriz de colágeno esta organizada em forma de
lamelas concêntricas, geralmente ao redor de um canal vascular central, constituído
o sistema de Harvers. Nos canais centrais contêm nervos e vasos sanguíneos que
se comunicam entre si e com a medula óssea através dos canais de Volkmann. Já o
osso esponjoso apresenta uma matriz mais porosa, organizada em trabéculas. Há
diferenças não apenas estruturais entre osso compacto e esponjoso, há também
diferenças funcionais, sendo o osso cortical ou compacto responsável pela
12
resistência e proteção, e pode ser encontrado nas diáfises de ossos longos e na
superfície externa de ossos chatos, já o osso esponjoso ou medular atuam nas
funções metabólicas, e delimitam espaços intertrabeculares que são preenchidos
por medula óssea vermelha, onde ocorre produção de celulares sanguíneas.
(MARX; GARG, 1998)
Em um osso cortado, verifica-se que ele é formado por uma parte sem
cavidades visíveis, conhecido como osso compacto e por partes com muitas
cavidades intercomunicantes, chamado osso trabecular. Porém, histologicamente,
as duas estruturas possuem a mesma composição (JUNQUEIRA; CARNEIRO,
1999).
2.2 Biomateriais
Os biomateriais podem ser definidos como uma substancia ou combinação de
duas ou mais substancias, farmacologicamente inertes, de natureza sintética ou
natural, que são utilizados para melhorar, aumentar ou substituir total ou
integralmente tecidos e órgãos. (FERREIRA et al., 2007).
Vários tipos de biomateriais e suas associações experimentais com diversas
sustâncias vêem sendo estudados no processo de reparação óssea. Contudo, a
reconstrução tecidual de defeitos ósseos causados por traumas, processos
infecciosos, neoplasias ou anomalias do desenvolvimento, ainda representa um
desafio em procedimentos ortopédicos e odontológicos, direcionando os estudos á
13
investigação de substitutos do osso autógeno e de agentes farmacológicos que
facilitem sua integração. (SASSIOTO, 2004)
Os biomateriais têm-se tornado uma alternativa para a correção de defeitos
ósseos, levando ao desenvolvimento de substitutos ósseos que possam apresentar
características biológicas aceitáveis. (CAMARINI et al. 2006)
Os biomateriais devem ser utilizados em contato íntimo com os tecidos do
indivíduo e devem possuir características de: aplicação clínica, ausência de riscos
trans-operatórios, mínimas seqüelas pós-operatórias, biodisponibilidade,
previsibilidade e aceitado pelo paciente. (SERVICE, 2000).
Em geral não devem induzir uma resposta negativa ao hospedeiro e, para
tanto, devem se assemelhar quimicamente com o mesmo, característica essa
definida de biocompatibilidade (FERREIRA et al., 2007).
O material biocompatível ideal deve ser: não tóxico, não induzir resposta
imunológica, esterilizável, sendo ainda capazes de indução de diferenciação de
células em osteoblastos, sendo ao mesmo tempo gradualmente absorvível,
fornecendo um suporte para formação de um novo osso. (AABOE et al., 1995)
A busca por substitutos ósseos é natural, em virtude dos inconvenientes da
técnica de enxerto ósseo autógeno, que por vezes, os pacientes necessitam de
internação, maior período de convalescença, susceptibilidade a infecções nos sítios
doadores, e ainda reabsorção progressiva e constante (CARVALHO et al. 2004)
Os biomateriais podem ser classificados de acordo com suas propriedades, e
divididos em: osteogênicos, osteoindutores e osteocondutores. Os biomateriais
osteogênicos são materiais orgânicos capazes de estimular os osteoblastos a formar
14
osso diretamente, os osteoindutores, por sua vez, são materiais capazes de induzir
a transformação das células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos,
aumentando o crescimento ósseo, ou formando tecido ósseo ectópico, e os
osteocondutores, que geralmente são inorgânicos provenientes de materiais
desproteinizados, que alem de conduzirem a aposição do novo osso em sua
superfície, favorecem a migração, proliferação e maturação de células progenitoras.
(URIST, 1965)
Os materiais biocompatíveis são classificados também acordo com suas
características físico- químicas resultantes do processamento dos biomateriais, ou
seja, orgânicos e inorgânicos. Os materiais orgânicos, geralmente osso bovino, em
condições de ph e temperatura controlados, é desmineralizado removendo os
componentes inorgânicos celulares, restando basicamente o colágeno tipo I. O
material inorgânico é obtido através da desproteinização do osso através de
processos termoquímicos que removem sua porção orgânica, restando basicamente
em hidroxiapatita. (CARVALHO et al. 2004)
Nas últimas três décadas os materiais de preenchimento têm recebido grande
atenção, prováveis substitutos para enxertos ósseos, devido a sua
biocompatibilidade, bioatividade e por fornecerem uma estrutura de suporte de
osteocondução, contendo um alto conteúdo de cálcio e fósforo, essenciais para a
neoformação do tecido ósseo. (SCIADINI et al. 1997)
O sulfato de cálcio (ou simplesmente gesso Paris) geralmente é fabricado a
partir de apenas uma matéria prima que é a gipsita, por calcinação. O subproduto
contém predominantemente o sulfato de cálcio em valores variáveis, trióxido de
15
alumínio, óxido de magnésio, carbonato de cálcio e sílica, substâncias estas que
podem interferir no processo de reparação óssea. (BASTOS; ZANON, 2004)
O enxerto alógeno implantado em cães adicionado com o sulfato de cálcio
houve uma aceleração na taxa de mineralização em relação ao enxerto sem adição
do sulfato de cálcio. (PELTIER; ORN, 1958)
Alvéolos de cães foram preenchidos com sulfato de cálcio e observou-se as
seguintes evidências: radiográficas: osso trabecular mais denso que o normal após
12 semanas; histológica: em intervalos menores de tempo, melhor organização e
exclusão de células epiteliais como também, níveis mais elevados de preenchimento
com osso maduro. (RADENTZ; COLLINS, 1965)
O sulfato de cálcio demonstrou que possuía uma reabsorção acelerada em
relação a outros dez materiais testados, apresentando também potencial
osteogênico. Muitos pesquisadores estudaram e aplicaram o sulfato de cálcio, e
concluíram que o material em contato direto do osso, ocorria uma regeneração
óssea mais rápida. (CESCHIN, 1984)
. O gesso Paris, que é um pó cerâmico derivado do CaSO4, pode constituir-
se num material alternativo para implantes, tanto em tecidos moles como em osso.
(HOGSET; BREDBERG, 1986)
As escolhas para os materiais de enxertia devem ser direcionadas para o
enxerto ósseo autógeno, por proporcionar um prognóstico previsível e mais seguro.
No entanto, diante da falta de disponibilidade deste, são de preferência de escolha
os materiais mais reabsorvíveis. (GIACOMO et al., 2003)
Ferreira et al. (2004), avaliaram a capacidade de um pool de proteínas
morfogenéticas bovinas ligada a hidroxiapatita sintética absorvível microgranular
16
(BMPb-HA) em estimular a reparação óssea, em defeito de tamanho crítico em
calvária de rato. Foram produzidos defeitos de 8 mm de diâmetro na calvária de 25
ratos, sendo 15 preenchidos com BMPb-HA homogeneizada com sangue; sendo
este o grupo experimental, e 10 somente com coágulo sanguíneo, formando o grupo
controle. Após 1, 3 e 6 meses de cirurgia foram coletadas as calvárias dos animais
dos grupos experimental e controle. Os resultados morfométricos obtido nas
imagens radiográficas apresentaram ausência de formação óssea nos períodos de 1
e 3 meses, histologicamente, os defeitos estavam preenchidos por tecido conjuntivo
fibroso e inúmeros focos de reação granulomatosa, tipo corpo estranho, ao redor de
aglomerados de hidroxiapatita. Após 6 meses o foco de reação granulomatosa
diminuiu em número e tamanho e os defeitos diminuíram a sua área em 22% em
relação ao controle 0 hora, devido neoformação óssea nas suas bordas. No entanto
apresentaram área semelhante ao controle de 6 meses. Verificou-se neste estudo
que a utilização de BMPb-HA no tratamento de defeitos ósseos cranianos em ratos,
promove a formação de reação granulomatosa tipo corpo estranho que inibe
profundamente a neoformação óssea, sugerindo que a hidroxiapatita sintética
microgranular não é um bom carreador para as BMPs expressarem o seu potencial
indutor.
Os enxertos ósseos ricos em hidroxiapatita de origem bovina absorvível (Bio-
Oss) são, dentre os vários biomateriais disponíveis, os enxertos que tem se
mostrado como uma alternativa viável para as mais diversas especialidades.
(FERREIRA et al., 2007)
17
2.3.1 Lithothamnium Calcareum
Lithothamnium calcareum, ou comumente chamada de alga marinha, é uma
alga calcárea recolhida na costa da Bretanha e, em menor quantidade, na Irlanda. O
esqueleto de alga é constituído de 95 a 99% de minerais, majoritariamente de
carbonato de cálcio e carbonato de magnésio, como também de outros minerais e
em quantidades não negligenciáveis. A Lithothamnium é utilizada principalmente na
agricultura e na alimentação animal, mas está igualmente presente em certos
complementos alimentares humanos. (ASSOUMANI, 1997)
No Brasil, há uma alga chamada Lithothamnium Calcareum, encontrada em
abundância em todo o litoral, que incorpora em sua estrutura macro e
micronutrientes da água do mar. Eles se complementam de forma harmoniosa e
natural, na proporção idêntica ao corpo humano, facilitando assim sua assimilação.
A vida surgiu no mar. A água marinha possui todos os componentes na proporção
adequada para manter a vida. Essa alga é, portanto, a forma de suplementação
mineral vinda da fonte mais pura que existe. (JAMILI, 2008)
O Lithothamnium é um produto de origem natural, fornecendo nutrientes
balanceados pela natureza, altas concentrações de cálcio e nutrientes catalisadores
do metabolismo, trazendo como benefícios a fácil absorção pelos animais, sem
antagonismo iônico, melhorando a conversão alimentar, maior fixação de fósforo,
rápida recuperação de fraturas, além de conferir maior resistência à casca do ovo se
usado de forma parenteral. (ALGAREA, 1997)
As algas calcárias são compostas basicamente por carbonato de cálcio e
magnésio contendo ainda mais de 20 oligoelementos, presentes em quantidades
18
variáveis, tais como Fe, Mn, B, Ni, Cu, Zn, Mo, Se e Sr. O produto pode ser aplicado
no estado natural ou após secagem e moagem. As principais características que
potencializam a atuação deste produto são atribuídas ao seguinte: Disponibilidade
dos micronutrientes que se encontram adsorvidos nas paredes celulares, sendo
assim facilmente assimiláveis pelas plantas e animais. (DIAS 2001)
O Lithothamniun (Concinal Fertilizador®) apresenta em sua composição
química Ca 32%; Mg 2%; S 0,2%; Cl 0,2%; Mo 0,0005% e Fe 0,1%. (KEMPF, 1974).
Lithothamnium é uma pequena alga de aproximadamente 2cm que fica imerso
no fundo do mar, que tem a propriedade de cristalizar alguns elementos minerais
que existem no mar, essencialmente o cálcio e o magnésio, e também mais de 20
tipos de oligoelementos principalmente o Fe, Mn, B, Ni, CU, Zn, Mo, Se e Sr. (DIAS,
2001)
O L. calcareum em seu estado inerte é constituído de matérias minerais (950
a 995g kg-1): 625 a 750g kg-1 de carbonato de cálcio (250 a 300g de Ca kg-1) e 59,5
a 115,5g kg-1 de carbonato de magnésio (17 a 33g de Mg kg-1), e restante, 265,5 a
129,5g kg-1, é constituído de outros minerais e 50 a 5g kg-1 de materiais na fração
orgânica. (MELO, 2002).
Como implantes em cirurgia óssea, a biocerâmica (Hidroxiapatita-Ca10
(PO4)6 (OH)2) fabricada pela substituição do carbonato do material algálico por
fosfatos, oferece uma compatibilidade estrutural, química e biológica quase perfeita
com os tecidos ósseos. (DIAS, 2001).
A alga calcária “Lithothamnium sp” têm muitas aplicações, é uma fonte de
cálcio bio-construído e totalmente absorvidos de imediato, tanto o cálcio quanto os
outros elementos existentes ao contrário das outras fontes similares que são
19
minerais e estão na forma de cristais dificultando a liberação e absorção dos
nutrientes pelo beneficiário. (DIAS, 2001).
A Lithothamnium é uma alga marinha calcárea encontrada em todos os mares
do mundo. Ao absorverem os minerais do ambiente, elas transformam os
componentes químicos em compostos de fácil absorção pelo nosso organismo. A
principal função desses minerais é a formação de enzimas, que funcionam como
catalizadores orgânicos nas trocas químicas das células.Processos degenerativos
como artrites, artroses, osteoporoses e consolidação de fraturas também podem ser
tratadas. A Lithothamnium pode inclusive auxiliar no controle do diabetes. (VINHAL,
2009)
2.4 Reparo Ósseo
O reparo de defeitos ósseos constituí um desafio hoje por possuir pouca
capacidade de regeneração. Diversos estudos vêem sendo realizados há anos, com
a intenção de adquirir novos conhecimentos, que possam auxiliar em cirurgias de
reconstrução, reparações ósseas guiadas, e implantes (ALMEIDA et al., 2000)
A consolidação óssea é um processo complexo responsável pela renovação
do osso ao longo da vida preservando a integridade mecânica do esqueleto
(KODAMA, 2003).
A consolidação óssea de uma lesão óssea está dividida em três fases: fase
inflamatória, fase de reparação e fase de remodelação, a duração de cada fase
depende de vários fatores associados à lesão como: fatores locais, condições de
20
saúde do indivíduo, estado nutricional, suprimento vascular. (RUBIN; FARBER,
1999)
O reparo ósseo envolve várias fases, de eventos celulares que evoluem
desde agressão propriamente dita, formação do hematoma, inflamação, iniciação do
calo plástico, organização do calo e remodelação (CORNELL; LANE, 1992; VIEIRA,
1999).
Inicialmente após a lesão óssea, ocorre a formação de um hematoma que irá
modular e induzir as células necessárias para consolidação. (GUARNIERO et al.,
2007).
Logo após uma lesão óssea (fratura), um extenso coágulo sanguíneo é
formado nos tecidos subperiosteais e moles, assim como na cavidade medular
Após a agressão inicia-se a inflamação que dura até o aparecimento de
cartilagem e osso. (CORNELL; LANE, 1992).
No período de 48 horas o exudato do hematoma contém vários mediadores
inflamatórios, fatores de neoformação de vasos e de crescimento, liberados pelas
células de defesa. (SOUSA, 2003; CORNELL e LANE, 1992).
Em dois a cinco dias, a hemorragia forma um grande coágulo, que
necessariamente é reabsorvido para que a lesão possa cicatrizar. No final da
primeira semana, a maior parte do coágulo é organizada por invasão de vasos
sanguíneos e fibroso inicial, o osso inicial, invariavelmente trançado, também está
formado após sete dias, sendo este osso que corresponde a cicatriz. O tecido de
granulação contendo osso ou cartilagem é denominado e calo ósseo. Nesse período
as células inflamatórias agudas já se dissiparam. (RUBIN; FARBER, 1999)
As circulações medulares e periosteais proliferam muito, sendo fundamentais
para formação do calo ósseo. (SOUSA, 2003). .
21
Três semanas após a indução ocorre o estágio de formação do calo ósseo, o
local da lesão torna-se altamente celular com aumento da vascularização.
(CORNELL; LANE, 1992).
A fase de reparo da consolidação da lesão caracteriza-se pela formação de
um calo de cartilagem e de osso trançado próximo ao local da lesão. As bordas
entalhadas do córtex original foram remodeladas e destruídas por osteoclastos. O
espaço medular foi revascularizado e contem osso traçado reativo, assim como a
área periostal. Na fase de remodelação, durante a qual o córtex é revitalizado, o
osso reativo pode ser lamelar ou trançado. O osso novo é organizado ao longo das
linhas de estresse e das forças mecânicas. É mantida extensa atividade celular
osteoclástica e osteoblástica. (RUBIN; FABER, 1999)
No início do processo de cicatrização, a formação de cartilagem predomina, e
glicosaminoglicanos (mucopolissacarídeos) são encontrados em elevadas
concentrações, seguido por um aumento gradual da concentração de colágeno, com
acúmulo de cristais de cálcio de hidroxiapatita aparecendo já na terceira fase, onde
a formação óssea já é mais evidente (GUARNIERO et. al., 2007).
Na fase de cicatrização, o osso vai ganhando quantidades de uma massa
fusiforme. No meio da fase reparativa, começa a fase de remodelação e da
reabsorção de porções desnecessárias desse calo, bem como a fixação da
trabécula óssea ao longo das linhas de estresse. O módulo celular que controla o
remodelamento através reabsorção, é composto por osteoclastos, que primeiro
reabsorvem o osso, seguido por osteoblastos, que estabelecem novos sistemas
Haversianos (ARISAWA et al., 2000).
22
O resultado final da cicatrização é uma remodelação do osso que, se não tiver
retornado à sua forma original, pelo menos estará modificado para que possa melhor
desempenhar a sua função exigida. (CRUESS; DUMONT, 1985).
Para que não ocorram distúrbios na mineralização, existem requisitos básicos,
como uma concentração adequada de íons cálcio e fosfato, presença da matriz a ser
calcificada, agente de nucleação e controle de agentes reguladores (promotores e
inibidores). Além destes, a formação óssea depende de dois pré-requisitos
indispensáveis: suporte sangüíneo amplo e suporte mecânico. Tendo em vista o
interesse pela reparação óssea é necessário estabelecer, através de cortes
histológicos, como se processa a neoformação óssea em defeitos semelhantes
aqueles realizados em procedimentos cirúrgicos (ALMEIDA et al., 2000).
A cicatrização tem como objetivo restaurar a continuidade das margens da
ferida, restabelecendo as características morfológicas e funcionais do órgão ou
tecido afetado. No processo de reparo, as células progenitoras indiferenciadas tem
papel fundamental. Elas determinam uma série de eventos para restaurar o dano.
(SIQUEIRA JR.; DANTAS, 2000)
Juntamente ao comportamento mecânico excelente, o osso revela potencial
único para regeneração, sendo capaz de reparação de fraturas ósseas sem que seja
observada qualquer cicatriz. (BUSER, 1994).
23
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Local da pesquisa
Laboratório de pesquisa do Curso de Odontologia, Centro de Ciências
da Saúde, Campus Itajaí.
3.2 Animais
Foram utilizados 12 ratos Norvergicus albinnus, machos, adultos com idade
entre 3 e 4 meses e peso médio de 315 gramas. Os animais foram obtidos junto ao
biotério da UNIVALI (Universidade do Vale do Itajaí), acondicionados em gaiolas e
mantidos com água e ração ad libitum.
3.3 Substância Usada
Foram utilizados aproximadamente 1,0 grama de Lithothamnium, da marca
comercial ARKOCAPSULES®, produzido por Arkopharma Beluz s.a.
24
Fotografia 1: Lithothamnium calcareum
3.4 Procedimentos
Os animais foram submetidos a uma perfuração em ambas as pernas
traseiras, a perna esquerda recebeu soro fisiológico (grupo controle) e a perna
direita recebeu o Lithothamnium (grupo experimental).
3.4.1 Procedimento cirúrgico
Os ratos foram anestesiados com ketamina 8mg/kg/peso e xylazina
10mg/kg/peso, mediante injeção intramuscular.
25
Fotografia 2: Anestésico Ketamina 10% e
relaxante muscular Cloridrato de xylazina 2% .
Com o término do procedimento anestésico, os animais foram posicionados
na mesa cirúrgica em decúbito dorsal. As pernas traseiras sofreram tricotomia e anti-
sepsia com povidine - iodine tópico (Polivinil Pirrolidona-PVPI).
Fotografia 3: animal posicionado em decúbito dorsal,
as pernas sofreram a tricotomia para futura incisão.
26
Os animais foram submetidos à uma incisão cirúrgica longitudinal com lâmina
de bisturi número 15 na porção proximal da tíbia de ambas as pernas. A divulsão
tecidual foi realizada até expor a parte de interesse da tíbia.
Fotografia 4: Incisão com lâmina de bisturi n° 15.
Após este procedimento foi realizado a osteotomia, com broca esférica
número 6 em baixa rotação sob irrigação com soro fisiológico. A perfuração se
estendeu até a completa inserção da parte ativa da broca, o que permitirá acesso à
cavidade medular.
Após o preenchimento da loja óssea, os planos foram suturados com fio de
seda 4-0 e foi feita a anti-sepsia final com PVPI – tópico.
27
Fotografia 5: Sutura dos planos com fio de seda 4.0.
Os animais foram sacrificados após 15 dias por inalação de éter. As pernas
traseiras foram retiradas e dissecadas. As tíbias foram colocadas em solução de
formol a 10% durante 24 horas e descalcificadas com ácido fórmico a 5% durante 21
dias. Após foram desidratados em soluções de álcool etílico 100%, diafanizados em
xilol antes de serem incluídas em parafina. Em micrótomo foram obtidos cortes
seriados de 7µm de espessura que foram colocados em lâminas de vidro para
microscopia, e submetidos à coloração de hematoxilina e eosina (HE). Em seguida,
foram cobertos com uma lamínula e fixados com resina. Os cortes foram
fotografados com auxílio de fotomicroscópio (Olympus PM-20).
3.5 Análises Microscópica
A região mais central de cada lesão foi analisada ao microscópio óptico com
um reticulo de 100 quadrantes acoplado, para determinar a porcentagem de área de
lesão tecidual (necrose, exsudato e coágulo) e osteogênese em aumento de 100
28
vezes. As médias das leituras obtidas em cada grupo foram determinadas e
expressas graficamente.
3.6 Análise estatística
As médias obtidas de cada grupo foram obtidas através do teste de Tukey,
29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O reparo de defeitos ósseos constituí um desafio hoje por possuir pouca
capacidade de regeneração. Diversos estudos vêem sendo realizados há anos, com
a intenção de adquirir novos conhecimentos, que possam auxiliar em cirurgias de
reconstrução, reparações ósseas guiadas, e implantes (ALMEIDA et al., 2000)
Os resultados desta pesquisa indicam que o material Lithothamnium
calcareum é aceito pelos tecidos orgânicos animais e que mesmo de forma
moderada, aumentou a osteogênese. A biocompatibilidade do produto também foi
determinada pela ausência de áreas de reação inflamatória aguda persistente após
15 dias de reparo ósseo. A análise macroscópica demonstra que todas as lesões
provocadas nos ossos foram semelhantes entre si. Nem nas lesões do grupo
controle quanto do grupo tratado com a medicação foi observado presença de
exsudação e todas as lojas ósseas apresentavam diâmetro equivalente (fig. 1 e 2).
Figura 1 – Aspecto macroscópico da lesão preenchida
com Lithothamnium Calcareum no grupo experimental.
30
Figura 2 – Aspecto macroscópico da lesão preenchida com soro fisiológico no grupo controle.
A análise histológica revela que ocorre crescimento ósseo nas lesões que
receberam a alga lithothamnium calcareum, indicando compatibilidade biológica do
produto utilizado. Esta neoformação óssea não é muito superior a osteogênese
induzida de forma natural, observada pelas lesões que receberam soro fisiológico.
Uma proporção de aproximadamente 60% de crescimento ósseo foi mensurado nas
lesões tratadas com medicamento, e de 40% nas lesões controle (gráfico 1).
Gráfico 1 – Porcentagem de osteogênese nas lojas
ósseas tratadas com Lithothamnium calcareum e soro
fisiológico.
31
Nas fotomicrografias dos cortes histológicos observa-se que nas lojas ósseas
tratadas com a alga não ocorre presença de células inflamatórias ou exsudação ou
mesmo áreas de necrose, reforçando a idéia da histocompatibilidade do tecido
ósseo ao material enxertado. Nas mesmas fotomicrografias é possível observar a
presença de tecido de granulação intercalando as áreas de osteogênese em todas
as lesões ósseas, e em ambos os grupos verifica-se a presença de algumas lesões
com mais osteogênese e menor área de tecido de granulação (fig. 3 e 4).
Figura 3 – Fotomicrografia da loja óssea com material
Lithothamnium calcareum, maior grau de osteogênese (O)
invadindo a medula óssea (MO), cortical óssea (CO).
Figura 4 - Fotomicrografia da loja óssea com soro
fisiológico, menor grau de osteogênese (O).
32
Também de forma inversa, há algumas lesões com mais áreas de osso ainda
a serem formadas (fig. 5 e 6).
Figura 5 - Fotomicrografia da loja óssea com
Lithothamnium Calcareum observar o grau de osteogênese (O).
Figura 6 - Fotomicrografia da loja óssea com soro
fisiológico, observar o grau de osteogênese (O).
Sabe-se que a formação do osso passa por uma fase inicial de formação de
tecido de granulação até amadurecimento em tecido ósseo mineralizado. Rubin e
Faber (1999) destacam que a consolidação óssea de uma lesão óssea está dividida
em três fases: fase inflamatória, fase de reparação e fase de remodelação. Arisawa
et al. (2000) relata que na fase de cicatrização, o osso vai ganhando quantidades de
33
uma massa fusiforme. No meio da fase reparativa, começa a fase de remodelação e
da reabsorção de porções desnecessárias desse calo, bem como a fixação da
trabécula óssea ao longo das linhas de estresse. O fato das lesões tratadas com
Lithothamnium calcareum não terem apresentado áreas de lesão tecisual e de terem
induzido osteogênese, faz com que o material aplicado neste experimento possa ser
utilizado como enxerto em implantes ósseos.
Muitos estudos têm sido feito em busca de materiais orgânicos biocompatíveis
e que possam ser utilizados nos implantes e enxertos ósseos, com diversas
indicações. Sciadini et al. (1997) revela que nas últimas décadas os materiais de
preenchimento têm recebido grande atenção, prováveis substitutos para enxertos
ósseos, devido a sua biocompatibilidade, bioatividade e por fornecerem uma
estrutura de suporte de osteocondução, contendo um alto conteúdo de cálcio e
fósforo, essenciais para a neoformação do tecido ósseo. O fato deste material que já
está sendo amplamente comercializado e indicado para diversas situações clínicas
como osteoporose e gastrite. Jamili (2008) indica fortemente o uso dessa alga, pois
não existe reforço imunológico sem minerais, os macro e micronutrientes do
lithothamnium se complementam de forma harmoniosa e natural, na proporção
idêntica ao corpo humano, facilitando assim sua assimilação, eles são mais
importantes que carboidratos e vitaminas. As informações científicas a respeito
de seu efeito são muito escassas, motivando este estudo.
A análise histológica deste experimento também revela o crescimento ósseo
invadindo a medular de forma mais pronunciada no grupo tratado com a medicação.
Nas lojas ósseas tratadas com salinas observa-se maior proporção de osso imaturo
comparadas com as lojas tratadas com o material. (Fig.7 e 8)
34
Figura 7 – Fotomicrografia da loja óssea tratada com
Lithothamnium calcareum.
Figura 8 – Fotomicrografia da loja óssea tratada com
soro fisiológico , maior proporção de osso imaturo (OI),
De acordo com Rubin e Farber (1999) a fase de reparo da consolidação da
lesão caracteriza-se pela formação de um calo de cartilagem e de osso trançado
próximo ao local da lesão. As bordas entalhadas do córtex original foram
remodeladas e destruídas por osteoclastos. O espaço medular foi revascularizado e
contem osso traçado reativo, assim como a área periostal. Na fase de remodelação,
durante a qual o córtex é revitalizado, o osso reativo pode ser lamelar ou trançado.
35
O osso novo é organizado ao longo das linhas de estresse e das forças mecânicas.
É mantida extensa atividade celular osteoclástica e osteoblástica.
Com o avanço das técnicas de ósseo reparação utilizadas na odontologia e
medicina, cada dia torna-se mais importante a pesquisa de materiais que possam
beneficiar a reabilitação do pacientes que necessitam destas terapias. A tentativa de
impedir a diminuição maciça de massa óssea como a necessidade de implantar
materiais que possam estimular a produção de osso beneficia a população de uma
maneira em geral. Os produtos extraídos desta alga, cuja constituição segundo Dias
(2001) são compostas basicamente por carbonato de cálcio e magnésio contendo
ainda mais de 20 oligoelementos, presentes em quantidades variáveis, tais como Fe,
Mn, B, Ni, Cu, Zn, Mo, Se e Sr. A alga é colhida e comercializada em larga escala,
são indicados no combate de várias doenças agravadas pela falta de nutrição
mineral. Vinhal (2008) publicou que as algas ao absorverem os minerais do
ambiente, transformam os componentes químicos em compostos de fácil absorção
pelo nosso organismo. A principal função desses minerais é a formação de enzimas,
que funcionam como catalizadores orgânicos nas trocas químicas das
células.Processos degenerativos como artrites, artroses, osteoporoses e
consolidação de fraturas também podem ser tratadas. A Lithothamnium pode
inclusive auxiliar no controle do diabetes. Apesar de Lidgren (2003) informar que os
enxertos derivados de animais (xenógenos) como o osso bovino liofilizado e aqueles
obtidos de corais marítimos e transformados em carbonato de cálcio apresentaram
como desvantagens uma força mecânica fraca, a impossibilidade de predição da
estrutura resultante dos seus empregos, além de que existia o risco de transmissão
de infecções.
36
Os resultados deste estudo contribuem para o registro científico, atualmente
ainda tão reduzido comparado ao grau de comercialização do produto, das
propriedades biológicas da alga litothaminum calcarium quando enxertada em tecido
ósseo.
37
5 CONCLUSÕES
A alga litothaminum calcarium é biocompatível aos tecidos ósseos porque:
- não ampliou a área de lesão tecidual
- não causou rejeição tecidual quando enxertada em lesões ósseas.
- aumentou a quantidade de osso neoformado quando comparado ao grupo controle.
38
REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABOOE, M. et al. Healing of experimentally created defects; a review. Br. J. Oral Maxillofax. Surg., v. 33, n. 5, p. 312-318, oct., 1995 ALGAREA Mineração Ltda., 1997. SUMINAL®, Mimeo, Rio de Janeiro, 4p. ALMEIDA, J. D. et al. Estudo da reparação óssea e mandíbula de ratos. Rev. Fac. Odontol. São José dos Campos, v.3, n.1, jan./jun., 2000.
ASSOUMANI M.B. 1997. AquaMin, a natural calcium supplement derived from seaweed. Agro-Food-Industry Hi-Tech, Sept./Oct. 1997, 45-47
BANKS W.J. Histologia Veterinária Aplicada. 2ed. São Paulo: Manole, 1992. 629p.
BASTOS N. S. C.; ZANON J. Avaliação Histomorfológica do comportamento do Sulfato de Cálcio quando utilizado como material para enxertos ósseos.
BUSER, D. et AL. Guided bone regeneration in implant dentistry. Chicago, Quintessence Books, 1994.
CAMARINI, E. T. et al. Biomateriais associados ou não ao Plasma Rico em Plaquetas em cavidades ósseas mandibulares. Estudo microscópico em cães. v. 3, n. 5, p. 475-479, set./out. 2006
CARNEIRO E. et al. Análise microscópica e radiológica do efeito do tamanho das partículas de matriz de osso medular bovino desmineralizado na reparação de defeito ósseo em fêmures de coelhos. Journal of Applied Oral Science, v.13, n.2, 2005. CARVALHO, P. S. P. et al. Revisão e proposta de nomenclatura para os biomaterias. Implant News, v. 1, n. 3, maio/jun., 2004. CASTANIA, V.A. Enxerto córtico-esponjoso homógeno processado quimicamente e esterilizado em óxido de etileno, em cães. 2002. 89f. Dissertação (Mestrado) - Escola de Engenharia de São Carlos - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Instituto de Química de São Carlos, da Universidade de São Paulo, São Paulo.
CESCHIN, J. R. Implante na reabilitação bucal. São Paulo: Panamed, 1984. p.534
39
CORNELL, C.N.; LANE, J.M. Newest factors in fracture healing. Clinic Orthopedic Philadelphia, n.277, p.297-311, 1992. COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S. L. Robbins patologia estrutural e funcional. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1991. 1231p.
COTRAN, R. S.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. Robbins & cotran patologia. 7. ed. Rio de Janeiro: Elsevier Medicina, 2005. CRUESS, R.L.; DUMONT, J.R. Healing of Bone In:Textbook of Small Animal Orthopaedics, NEWTON C.D.; NUNAMAKER D.M. Textbook of Small Animal Orthopaedics, 1985. Disponivel em: <http://www.ivis.org/especial_books/ortho/chapter_03/IVIS.pdf>. Acesso em: 10 mar 2009. DIAS, G.T.M. Granulados Bioclásticos: Algas calcárias. Rev. Bras. Geof. v.18, n.3, agosto, 2001.
ESQUISATTO, M.A.M. Efeitos de diferentes intensidades de microcorrente no reparo ósseo em ratos Wistar. Ver. Bras. Ort. Agosto, 2006. Disponível em: <http://www.rbo.org.br/secao.asp?sec=204&idIdioma=1>
FERREIRA, G. R. et al . Lack of repair of rat skull critical size defect treated with bovine morphometric protein bound to microgranular bioabsorbable hydroxyapatite. Braz. Dent. J., v. 15, n. 3, 2004. FERREIRA, J.R.M. et al. Enxertos ósseos xenógenos utilizados na implantodontia oral. Implantnews, São Paulo, v. 4, n. 3, p. 303-306, maio/jun. 2007.
GUARNIERO, R. et al. Avaliação do efeito da glicosamina e condroitina na consolidação de fratura: Estudo experimental em ratos. Revista Brasileira de Ortopedia, v.42, n.7 p.201–205, 2007.
HOGSET, O.; BREDBERG, G. Plaster of Paris and hair cell morphology. A scanning electron microscopic study of an alternative implant material for ear surgery. Acta Otolaryngol, v.101, n.5-6, p.445-452, May/June 1986. JAMILI, J. Imunidade e Suplementação Mineral. Essência Vital Newsletter, Rio de janeiro, set. 2008. Disponível em: <http://www.essenciavital.org.br/newsletter/newsletter_ed1_170908.html> Acesso em: 30 jul. 2009
40
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1995. p.433 JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia básica. 9.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999. KAPLAN, F.S. et al. Form and function of bone. In: SIMON, S.R. Orthopaedic Basic Science. Chicago: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1994. p.127-184KATCHBURIAN, E.; ARANA, V. Histologia e Embriologia Oral. São Paulo: Panamericana, 1999. p. 381. KATCHBURIAN, E.; ARANA, V. Histologia eembriologia oral. São Paulo: Panamericana, 1999. KEMPF, M. Perspectivas de exploração econômica dos fundos de algas calcárias da plataforma continental do Nordeste do Brasil. Recife: UFPE, 1974. 22 p. (Trabalho oceanofráfico, 14). KODAMA, A.C. Efeitos do ultra-som pulsado de baixa intensidade em um modelo ósseo de ratas ovariectomizadas analisadas por meio do ensaio de flexo-compressão. 2003. 89f. Dissertação (Mestrado) - Escola de Engenharia de São Carlos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Paulo. LANE, J.M et al. Biosynthetic bone grafting. Clin. Orthop. Rel. Res. 367S, p.107-117, 1999. LIMA, L.M.L. et al. Doses de Lithothamnium calcareum sobre o desenvolvimento de plantas de pimentão. Horticultura Brasileira, v.20, n.2, julho, 2002. MARX, R. E. & GARG, A. K. Bone structure, metabolism and physiology: its impacto n dental implantology. Implant. Dent. v.7, n.4, p.267-76, 1998. MELO, P.C. de. Avaliação do Lithothamnium como corretivo da acidez do solo e fonte de nutrientes para milho-doce e feijoeiro. Lavras: UFLA, 2002. 99p. (Tese: Doutorado em Solos e Nutrição de Plantas). MIRANDA E.S.; CARDOSO et al. Estudo tecidual comparativo no uso de enxerto ósseo orgânico e inorgânico no reparo de fraturar cirúrgicas em rádio de coelhos. Acta Ortopedica Brasileira, v.13, p.245-248, 2005. MOURE, A. Construção de um protótipo de densitômetro ósseo para uso em clínica de grandes animais. 2001. 52 f. Dissertação (mestrado em ciências) – Centro Federal de Educação Tecnológica do Paraná, Engenharia Elétrica e Informática Industrial, Curitiba, Paraná.
41
PELTIER, J.; ORN, D. The effect to the addition of plaster of Paris to autogenous bone grafts in dogs. Surg Forum, v.8, p.571-573, 1958. RADENTZ, W.; COLLINS, C. The implantation of plaster of Paris in the alveolar processes of the dog – J. Periodontol Chicago, v. 36, p. 357, 1965 . ROSSI JÚNIOR, R. Bases Biológicas da Implantodontia. São Paulo: Pancast, 1990. 194 p. RUBIN, E. M. D.; FARBER, J. L. Patologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999. P. 1305-1310 SASSIOTO, M.C.P. Efeito da Casearia sylvestris no reparo ósseo com matriz óssea bovina desvitalizada em ratos. Acta cir. bras., São Paulo, v.19, n.6, nov/dez. 2004. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0102-86502004000600010&Ing=pt&nrm=iso> Acesso em 31 mar. 2008 SCIADINI, M. F. et al. Evaluation of bovine-devired bone protein with a natural coral carrie as a bone-graft substitu in a canine segmental defect model. J. Orthop. Res., v. 15, p. 844-857, 1997. SERAKIDES, R. et al. Patologias do sistema locomotor. Caderno Didático Patologia Veterinária, p.3-60, FEPMVZ- editora, BH, 2006. SERVICE, R. F. Tisseue engineers build new bone. Science,v. 289, n. 5484, p. 1498-1500, 2000. SERSON, D. Implantes Orais, São Paulo: Artes Médicas, 1985. p.408 SIQUEIRA Jr, J. F; DANTAS, C. J. S. Reparação tecidual: aspectos biodinâmicos. In:__ __. Mecanismos celulares e moleculares da inflamação. Rio de Janeiro: Medsi 2008. Cap. 17, p. 197-225. SOUSA, V. L. Efeitos do ultra-som de baixa intensidade sobre a consolidação óssea em fratura de ossos longos (rádio e ulna, tíbia e fíbula) em cães (Canis familiaris). 2003. 127f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. TEN CATE, A.R. Histologia bucal. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1994. p. 95- 111. URIST, M. R. Bone formation by autoinduction. Science, .v. 150, n. 698, p. 893-899, nov., 1965.
42
VIEIRA, J.G.H. Considerações sobre os Marcadores Bioquímicos de Metabolismo Ósseo e sua Utilidade Prática. Arquivo Brasileiro de Endocrinologia e Metabolismo, v.43 n.6, p.415–422, 1999. VINHAL, M. Alga marinha possui mais de 50 minerais fundamentais para a saúde humana. Revista Vigor: Movimento e Saúde. maio, 2009. Disponível em: < http://www.revistavigor.com.br/2009/05/23/alga-marinha-possui-mais-de-50-minerais-fundamentais-para-a-saude-humana/> Acesso em: 30 jul. 2009.