Pesq. agropec. bras., Braslia, v.45, n.8, p.805-810, ago. 2010Patogenicidade de Pythium aphanidermatum a alface cultivadaem hidroponia e seu biocontrole com Trichoderma Katya da Silva Patekoski(1) e Carmen Lidia Amorim Pires-Zottarelli(1)(1)Instituto de Botnica de So Paulo, Avenida Miguel Stefano, no 3687, CEP 04301-012 So Paulo, SP. E-mail: katya_patekoski@yahoo.com.br, zottarelli@uol.com.brResumo O objetivo deste trabalho foi avaliar a patogenicidade de Pythium aphanidermatum a variedades de alface, e a ao do produto Biotrich, formulado com Trichoderma, no controle deste patgeno e na promoo do crescimento das plantas. Em experimento in vitro, plntulas recm-germinadas das variedades de alface Vera e Elisa foram colocadas em placas de Petri com gar-gua e 1 mL de suspenso do produto Biotrich (0,2 mL L-1) e, aps 24 horas, em discos com miclio do isolado de Pythium. As avaliaes foram realizadas aps dez dias de incubao a 20 e 31C. Os testes in vivo foram realizados na primavera e vero, em sistema hidropnico Nutrient Film Technique (NFT), em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2x2x2, como segue: duas variedades; presena ou ausncia do patgeno; e presena ou ausncia de Biotrich. Ao fnal do cultivo, foram avaliadas as massas de matria fresca e seca das plantas. No experimento in vitro, P. aphanidermatum apresentou maioragressividadea31C.Contudo,nofoiverifcadapatogenicidadenostestesinvivo.Demodogeral,o Biotrichnopromoveuocrescimentodasplantas,masfoiefetivonocontroledopatgenoinvitro.Pythium aphanidermatum patognico s variedades de alface Vera e Elisa, a 20 e 31C, e o Biotrich efetivo para o controle desse patgeno nessas temperaturas.Termos para indexao: Lactuca sativa, Oomycota, antagonismo, biocontrole, hidroponia, podrido-de-raiz.Pythium aphanidermatum pathogenicity to hydroponics lettuceand its biocontrol with TrichodermaAbstract The objective of this work was to evaluate the pathogenicity of Pythium aphanidermatum to lettuce varieties, and the action of the product Biotrich, formulated with Trichoderma, in the control of this pathogen and its effect on plant growth promotion. In a in vitro experiment, germinated seedlings of Vera and Elisa lettuce varieties were placed in Petri dishes with water-agar and 1mL Biotrich suspension (0.2 mL L-1), and after 24 hours, on plugs with the Pythium isolate mycelium. The evaluations were done ten days after the incubation at 20 and 31C. In vivo experiments were carried out during the spring and summer, using the Nutrient Film Technique (NFT) system, in a completely randomized design, following a 2x2x2 factorial arrangement, as well: two varieties; pathogen abscence or presence; and with or without Biotrich addition. At the end of cultivation, the fresh and dry weight of shoots and roots were analyzed. In vitro, P. aphanidermatum had increased aggressiveness at 31C. However, no pathogenicity was observed in vivo. Generally, Biotrich did not promote plant growth; however, it was effective in controlling the pathogen in vitro. Pythium aphanidermatum is pathogenic to lettuce varieties Vera and Elisa, at 20 and 31C, and Biotrich is effective for its control at these temperatures.Index terms: Lactuca sativa, Oomycota, antagonism, biocontrol, hydroponic system, root rot. IntroduoOcultivodehortaliasemsistemashidropnicos tem-sedifundidoemtodooBrasil,principalmente odealface.Essaexpansodeve-se,entreoutros fatores,produodehortaliasdetimaqualidade, perenidade na produo e ao melhor aproveitamento do espao fsico com uso desses sistemas (Rodrigues, 2002; Silva & Lima Neto, 2007). Atualmente, estima-se que 8.000 produtores, entre profssionaiseamadores,utilizamatcnicanopas, quetambmutilizadacomoatividadepedaggica emescolas,comointuitodeampliaraconcepo dosalunossobreoconceitodeambienteeoferecer alternativasdetrabalhoerenda(Abrantes,2004; Santos, 2006).A princpio, acreditava-se que, ao se eliminar o solo nosistemadeproduohidropnica,bemcomoos patgenos nele contidos, seria preservada a integridade dos rgos subterrneos da planta. Entretanto, passada aeuforiadosprimeiroscultivos,percebeu-seque afrequnciacomqueasdoenasapareciamera proporcional ao tempo de uso e das prticas de manejo do sistema (Lopes et al., 2005).806 K. da S. Patekoski e C.L.A. Pires-ZottarelliPesq. agropec. bras., Braslia, v.45, n.8, p.805-810, ago. 2010Dospatgenosdetectadosemcultivos hidropnicos,destacam-seosisoladosdognero Pythium Pringsheim, frequentemente destrutivos para amaioriadasculturashidropnicas,principalmente nas pocas em que ocorre a elevao da temperatura dasoluonutritivaedoambientedascasasde vegetao,quandoessesisoladospodemcausar podrido-de-raiz ou infeco subclnica, com reduo signifcativa na produtividade das culturas, mesmo na ausncia de sintomas radiculares ou foliares visveis (Owen-Going et al., 2003; Sutton et al., 2006). Nesses sistemas, so relatados isolados de diversas espcies, quenormalmentenoapresentamespecifcidadede hospedeiro(Plaats-Niterink,1981;Stanghellini& Kronland, 1986; Herrero et al., 2003; Teixeira et al., 2006).O controle biolgico tem sido apontado como um mtodo promissor para minimizar o uso de agrotxicos e promover a proteo das culturas, pois se baseia em procedimentosambientalmentecorretosquepodem fazerpartedeumsistemadecontroleintegradode doenas(GrigolettiJunioretal.,2000;Slininger etal.,2003).Osmicrorganismosestudadosparao controle de Pythium em cultivos hidropnicos incluem espciesdebactriasdosgnerosBacillusCohn, Paenibacillus Ash et al., Enterobacter Hormaeche & Edwards, Pseudomonas Migula, e fungos dos gneros ClonostachysArnaud,TrichodermaPers.,Fusarium Link ex Fr., Penicillium Link ex Fr., Saccharomyces Meyen,etambmPythiumoligandrumDrechsler (Graveletal.,2005;Corra,2006;Cipriano,2009). Trichoderma spp. encontra-se entre os mais estudados e utilizados mundialmente (Bentez et al., 2004). Por serem facilmente propagados e formulados em laboratrio,comboacapacidadedearmazenamento (Melo,1996),isoladosdeTrichodermatmsido utilizados na formulao de produtos para biocontrole, comercializadosemdiversospasesetambmno Brasil, como o caso do Biotrich (Biovale Produtos AgropecuriosLtda.,VenncioAiresBrasil). Entretanto,afaltadepesquisasobresuaaplicao emsistemashidropnicosimpossibilitamaiores concluses sobre sua efetividade.Oobjetivodestetrabalhofoiavaliara patogenicidade de Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp.avariedadesdealface,eaaodoproduto Biotrich,formuladocomTrichoderma,nocontrole dessepatgenoenapromoodecrescimentodas plantas.Material e MtodosOsexperimentosforamconduzidoscomuma cepadePythiumaphanidermatum,isoladaderazes sintomticasdetabacohidropnico(Nicotiana tabacumL.),provenientedaColeodeCulturasdo NcleodePesquisaemMicologiadoInstitutode Botnica, So Paulo (CCIBt 2006). AsvariedadesdealfaceestudadasforamaElisa (lisa) e a Vera (crespa), consideradas, respectivamente, como mais e menos suscetveis ao patgeno (Patekoski & Zottarelli, 2009). Foram utilizadas sementes Sakata no peletizadas. O produto Biotrich, Lote 04/set/2009, (BiovaleProdutosAgropecuriosLtda.,Venncio Aires,Brasil),formuladobasedeTrichoderma,foi testado na formulao lquida (suspenso em gel). Osexperimentosinvitroforamrealizadosa20C, temperaturatimaparaagerminaodesementes dealface(Nascimento&Cantliffe,2002),ea31C, temperaturatimaparaocrescimentodoisoladode P.aphanidermatum(Patekoski&Zottarelli,2009). PlacasdePetricomgar-guareceberamalquotade 1 mL de suspenso de Biotrich (0,2 mL L-1), plntulas de alface recm-germinadas (sete por placa), dispostas naperiferiadasplacas.Aps24horas,umdiscode 6 mm de dimetro, com miclio do patgeno crescido em corn meal gar, foi inoculado no centro das placas (Baptista, 2007). As testemunhas foram placas com o patgeno e sem o produto e com o produto e sem o patgeno, contendo asplntulasdealface.Utilizou-seodelineamento experimentalinteiramentecasualizado,comcinco repeties,cadaumarepresentadaporumaplaca. Aps dez dias de incubao em cmara de germinao comfotoperodode12horas,forammensurados ocomprimentodasradculasehipoctilosea percentagemdeplntulassobreviventes(Baptista, 2007),eosresultadosanalisadosestatisticamente comanlisedevarinciaetestedeTukey,a5%de probabilidade.Osexperimentosinvivoforamrealizadosno Instituto de Botnica, So Paulo, durante a primavera, deoutubroanovembrode2009,evero,dejaneiro afevereirode2010,tendo-seutilizadoestufa hidropnica(TropicalEstufas,BraganaPaulista, Patogenicidade de Pythium aphanidermatum a alface cultivada em hidroponia 807Pesq. agropec. bras., Braslia, v.45, n.8, p.805-810, ago. 2010SP,Brasil),sistemahidropnicoNutrientFilm Technique(NFT)e,comobancadadecultivo,oKit hidropnico residencial (Hidrogood, Taboo da Serra, SP, Brasil), de 1,00x0,70x0,80 m. Utilizou-se a soluo nutritiva Hidrogood Fert (Hidrogood, Taboo da Serra, Brasil)comusodeguamineralBioleve(Bioleve, Lindia,Brasil)emseupreparo,tendo-semantidoa condutividade eltrica entre 1,5 e 1,9 mS cm-1 e o pH entre 5,5 e 6,5 (Furlani, 1995).Odelineamentoexperimentalutilizadofoi inteiramentecasualizado,emesquemafatorial2x2x2 (duasvariedadesxinoculaoounodopatgeno xusoounodeBiotrich),comseisrepeties,cada qualrepresentadaporumaplanta:semPythium,sem Biotrich, variedade Elisa (controle); sem Pythium, sem Biotrich, variedade Vera (controle); com Pythium, sem Biotrich, variedade Elisa; com Pythium, sem Biotrich, variedade Vera; sem Pythium, com Biotrich, variedade Elisa;semPythium,comBiotrich,variedadeVera; comPythium,comBiotrich,variedadeElisa;ecom Pythium, com Biotrich, variedade Vera. AinoculaodeP.aphanidermatumfoirealizada pormeiodaimersodasrazesdasplantasemuma suspenso de zosporos, por 30 min, na concentrao deaproximadamente5x103 zosporospormL (Owen-Going et al., 2003; Baptista, 2007). A aplicao do Biotrich (0,2 mL L-1) nos tratamentos foi realizada apsdoisdiasdotransplantedasmudasparao sistema, com a inoculao do patgeno aps sete dias da aplicao do produto, nos dois ltimos tratamentos (Utkhede et al., 2000; Baptista, 2007).Astemperaturasdaestufaedasoluonutritiva forammonitoradasdiariamente,s6h30,13he19h. A temperatura externa do ar foi fornecida pela Estao meteorolgicadoInstitutodeAstronomia,Geofsica eCinciasAtmosfricasdaUniversidadedeSo Paulo, So Paulo. Os sintomas decorrentes da infeco porPythiumforamavaliadosnosdiassubsequentes inoculaodopatgenoeaotrminodocultivo (55dias).Avaliaram-se,tambm,asmassasfrescae seca (em gramas) da parte area e das razes das plantas, e os resultados foram submetidos anlise de varincia e ao teste de Tukey, a 5% de probabilidade. Resultados e DiscussoOstestesrealizadosinvitrodemonstraramqueo isoladodePythiumaphanidermatumfoipatognico nasvariedadesdealfaceestudadas,tendoreduzido signifcativamenteocomprimentodasradculasa 20 e 31C e a percentagem de plntulas sobreviventes a31C,nostratamentossemaaplicaodo Biotrich (Tabela 1). NaavaliaodaaodoBiotrich,aaplicaodo produtonostratamentoscontrolea31Cocasionou reduosignifcativadocomprimentodasradculas, em ambas as variedades (Tabela 1). Entretanto, quando aplicado na presena de P. aphanidermatum, o produto promoveuaumentosignifcativodocomprimentodas radculas das variedades, tanto a 20C quanto a 31C, e da percentagem de plntulas sobreviventes da variedade Vera a 31C, quando comparado ao tratamento contendo apenas P. aphanidermatum, o que indica a efetividade do produto no controle do patgeno (Tabela 1). Ao avaliar o comprimento do hipoctilo, diferenas estatsticasforamencontradasapenasa31C,com aumento signifcativo com a aplicao do produto nos tratamentoscomesemopatgeno,paraavariedade Vera, e na ausncia do patgeno, para a variedade Elisa. EssesresultadosdemonstramaatuaodoBiotrich como promotor de crescimento do hipoctilo.Nos testes in vivo, as temperaturas registradas foram semelhantesparaosdoisexperimentosrealizados. Naprimavera,foramregistradasmdiasde22,9, Tabela1.Valoresmdiosdocomprimentodaradculaedohipoctilo,epercentagemdeplntulassobreviventesdas variedadesdealfaceVeraeElisa,obtidosnostestesinvitrodepatogenicidadedePythiumaphanidermatumecontrole biolgico com o produto Biotrich, a 20 e 31C(1).(1)Mdias seguidas de letras iguais, minsculas nas colunas, para cada temperatura, e maisculas nas linhas, no diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.808 K. da S. Patekoski e C.L.A. Pires-ZottarelliPesq. agropec. bras., Braslia, v.45, n.8, p.805-810, ago. 201024,6e25,3C,paraoambienteexterno,deestufae para a soluo nutritiva, respectivamente. No vero, a temperatura mdia no ambiente externo foi de 23,6C, naestufafoide25,9C,enasoluonutritivafoide 26,5C.OprodutoBiotrich,naconcentraotestada,no promoveu o crescimento das variedades de alface, nos doisexperimentosrealizadosinvivo,semdiferenas signifcativas para as massas fresca e seca da parte area e razes, nos tratamentos controle com e sem a aplicao doproduto(Tabela2).Quantopatogenicidadede P.aphanidermatum,nosexperimentosdaprimavera evero,noforamobservados,nasplantas,os sintomascaractersticosdainfecoporPythium. Comparando-seostratamentoscontendoapenaso patgenoeostratamentoscontrolesemainoculao doPythium,verifcou-sequeoisoladoestudadono ocasionoureduodasmassasfrescaesecadaparte area e razes das variedades.Noexperimentorealizadonaprimavera,foi observadareduosignifcativadamassafrescadas razesdavariedadeVeratratadascomoBiotrich easuspensodezosporos,comparando-seao tratamentocontendoapenasopatgeno(Tabela2). Fato semelhante ocorreu no experimento conduzido no vero, em que reduo signifcativa da massa fresca da parteareaerazesdavariedadeVerafoiobservada, nasmesmascondies.Diferenasignifcativafoi verifcadatambmparaamassafrescadasrazesda variedade Elisa no experimento de vero, com menor massaencontradanotratamentocomoBiotrich emassociaocomP.aphanidermatum,quando comparadoaotratamentocontendosomenteo produto.OisoladodeP.aphanidermatumutilizadoneste trabalhofoipatogniconasvariedadesdealface,nos testesconduzidosinvitro,commaioragressividade verifcadaa31C,oquecorroboraaliteratura, noqueserefereaoaltopotencialpatognicoda espcieemtemperaturasmaiselevadas(Bates& Stanghellini, 1984; Herrero et al., 2003).Nosexperimentosinvivo,P.aphanidermatum,na concentrao de zosporos utilizada no interferiu no desenvolvimentodasplantasdealface.Entretanto, Owen-Goingetal.(2003)obtiveram,comamesma concentraodezosporosdeisoladosdePythium aphanidermatumePythiumdissotocum,diminuio docomprimentodosistemaradiculareextensa Tabela 2. Valores mdios de massa de matria fresca (MFPA) e seca da parte area (MSPA), e massa de matria fresca (MFR) e seca das razes (MSR) das variedades de alface Vera e Elisa, obtidos no teste de patogenicidade de Pythium aphanidermatum e controle biolgico in vivo com o produto Biotrich, nos experimentos da primavera e vero(1).(1)Mdias seguidas de letras iguais, minsculas nas colunas, para cada experimento, e maisculas nas linhas, no diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.Patogenicidade de Pythium aphanidermatum a alface cultivada em hidroponia 809Pesq. agropec. bras., Braslia, v.45, n.8, p.805-810, ago. 2010descoloraomarromouamareladaempimento hidropnico(CapsicumannuumL.).Baptista(2007), porsuavez,emestudocomisoladodePythium dissotocum,verifcouqueopatgeno,inoculado namesmadensidadedeinculoutilizadaneste trabalho,ocasionoupodrido-de-raiz,murchamento ereduodasmassasfrescaesecadaparteareae razes, nas variedades Mimosa e Vera. A diferena em patogenicidade observada entre este estudo e os citados, provavelmente,estrelacionadafortevariaono potencialpatognicoevirulnciaencontradaentre espcies e espcimes de Pythium (Plaats-Niterink, 1981; Owen-Goingetal.,2003;Baptista,2007;Patekoski &Zottarelli,2009),ediferenaemsuscetibilidade observada entre culturas e variedades (Utkhede et al., 2000),circunstnciaemqueoempregodediferentes isoladosdogneroeculturasvegetaispodelevara resultados divergentes. A temperatura, um dos fatores ambientais de maior infunciasobreopotencialpatognicodePythium (Suttonetal.,2006),podetambmterinterferidona patogenicidadedeP.aphanidermatum.Asbaixas temperaturasmdiasverifcadasduranteaconduo dos experimentos podem ter limitado o estabelecimento eoprogressodadoenanasplantasdealface. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram os de Corra (2006) e Cipriano (2009). Alm dos fatores mencionados, o balano nutricional adequado da soluo nutritiva pode ter contribudo para a ausncia do estabelecimento e progresso da doena, no presente estudo.Demaneirageral,oBiotrichnopromoveuo crescimento das variedades de alface nos testes in vitro e in vivo. Entretanto, tal ao benfca tem sido obtida por outros autores em estudos com Trichoderma (Yedidia etal.,2001;Arriagadaetal.,2009;Hoyos-Carvajal etal.,2009),inclusivecomoprprioprodutode biocontroleutilizado.Baptista(2007)verifcouqueo Biotrich,sobformulaolquida,suspensoemgel, nas concentraes de 0,1, 0,2 e 0,3 mL L-1, aumentou o comprimento das radculas das variedades de alface VeraeMimosaemexperimentosrealizadosem laboratrio, a 20 e 27C, e que a aplicao do produto naconcentraode0,2mLL-1resultouemaumento das massas fresca e seca das razes das variedades, em testes com kits hidropnicos caseiros. Nostestesinvitro,oproduto,naconcentrao testada, foi prejudicial ao desenvolvimento das plntulas emalgunstratamentoscontrole,comadiminuio docomprimentodasradculas.Emsetratandodo controledeP.aphanidermatum,ostestesconduzidos emlaboratrio,nopresentetrabalho,mostraramque Biotrichfoiefetivonocontroledopatgeno,esua efcinciaverifcadatambmporBaptista(2007). Segundoesseautor,oBiotrich,sobformulao lquida e suspenso em gel, nas concentraes de 0,1, 0,2e0,3mLL-1efcientenocontroledePythium dissotocum,nasvariedadesdealfaceMimosae Vera, em testes realizados em laboratrio (a 20 e 27C) e em experimento com kits hidropnicos caseiros. Os resultados obtidos com relao patogenicidade de Pythium aphanidermatum in vivo contribuem para o conhecimento da epidemiologia da podrido-da-raiz ocasionadaporessaespcie.SegundoSuttonetal. (2006),oconhecimentodaetiologiaeepidemiologia dessaenfermidade,almdeseusefeitosnafsiologia das plantas, so essenciais para novas perspectivas das pesquisas e para o desenvolvimento de melhores prticas para o manejo da doena em cultivos hidropnicos. Concluses1. O isolado de Pythium aphanidermatum estudado patognico s variedades de alface Vera e Elisa, em condies de laboratrio.2.Emconcentraode5x103zosporospormL,a cepa de P. aphanidermatum estudada no interfere no desenvolvimentodeplantasdealfacedasvariedades Vera e Elisa, sob cultivo hidropnico.3. Em condio de laboratrio, o produto Biotrich na concentrao de 0,2 mL L-1 no promove o crescimento das variedades de alface Vera e Elisa, mas efciente paraocontroledoisoladodeP.aphanidermatum estudado.4. O produto Biotrich na concentrao de 0,2 mL L-1 nopromoveocrescimentodasvariedadesdealface Vera e Elisa, em cultivo hidropnico.AgradecimentosCoordenaode AperfeioamentodePessoalde Nvel Superior, pelo auxlio fnanceiro sob a forma de concessodebolsadeMestradoprimeiraautorae aoFilipeRosaBaptista,peloauxiliocomastcnicas utilizadas.810 K. da S. Patekoski e C.L.A. Pires-ZottarelliPesq. agropec. bras., Braslia, v.45, n.8, p.805-810, ago. 2010RefernciasABRANTES,J.Ainterdisciplinaridadenoensinomdio:a contextualizao pela hidroponia. Revista Augustus, v.9, p.16-31, 2004.ARRIAGADA,C.;SAMPEDRO,I.;GARCIA-ROMERA,I.; OCAMPO, J. Improvement of growth of Eucalyptus globulus and soil biological parameters by amendment with sewage sludge and inoculation with arbuscular mycorrhizal and saprobe fungi. Science of the Total Environment, v.407, p.4799-4806, 2009.BAPTISTA,F.R.PythiummiddletoniiSparrowePythium dissotocumDrechsleremalface(LactucasativaL.):avaliao patognica e controle biolgico. 2007. 100p. 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