ICEM 2005

Participação na 9a. Conferência Internacional sobre Mutágenos AmbientaisSão Francisco, Califórnia

2 a 9 de Setembro de 2005

Participante: Gisela de Aragão Umbuzeiro

giselav@cetesbnet.sp.gov.br

SEM ÔNUS PARA A EMPRESAFINANCIADO FAPESP E ORGANIZADORES DO EVENTO

ICEM 2005

OBJETIVO DA PARTICIPAÇÃO

Coordenar mesa sobre Genotoxicologia de Sistemas Aquáticos a convite dos organizadores

do evento e apresentar palestra:A relevância do ensaio com

Salmonella/microssoma na avaliação da qualidade das águas e indicação e azo corantes como importantes contaminantes do meio aquático

ICEM 2005

RESUMO DO EVENTO

Dr. Guilette Jr (Florida) – Contaminantes, genes e saúde: lições da vida selvagem – níveis altos de estradiol no plasma

de jacarés

Dr. Somers (Canada) – Contaminantes ambientais e mutagênese na vida selvagem – faltam muitos estudos para

entendimento dos efeitos adversos

Dr.Claxton (USA) – Mutágenos Ambientais na Atmosfera – avaliação de risco relativa

Dr. Nohmi (Japão) – Diferentes linhagens de Salmonella, deficientes para vários tipos de reparo – podem auxiliar na detecção do tipo de mutágeno presente em matriz ambiental

ICEM 2005

RESUMO DO EVENTO

Dr. Ohe (Japão) e Dr. Donnely (USA) – Mutágenos ambientais em água, ar, solo de sedimento – ficou evidente a

necessidade de se considerar resultados de bioensaios de mutagenicidade (como o teste com Salmonella) como critério

de qualidade ambiental no nível regulatório. O cloro também foi apontado como um desinfectante

bastante problemático utilizado no tratamento de águas gerando diversos produtos indesejesáveis com características

tóxicas e mutagênicas, com implicações em aumento de incidência de câncer nas populações expostas

ICEM 2005

RESUMO DO EVENTO

Dra. Rita Schoeney (USA) mostrou o novo método da USEPA para avaliação de risco carcinogênico e que o “modo de ação” do contaminantes tem que ser incluído na avaliação para que

o mesmo seja considerado como carcinogênico. Outros fatores que influenciam na determinação do “slope factor” são a suscetibilidade infantil e os efeitos de baixa dose

Outras sessões que tratavam especificamente de efeitos de baixa dose como hormesis (que é um efeito benéfico do

agente quando em baixas doses) foram também apresentadas. Pode-se concluir que os valores de obtidos em avaliações de

risco devem ser interpretados como valores orientadores para tomada de decisão e que estão sempre sendo atualizados a

luz de novos conhecimentos científicos.

ICEM 2005

PRÊMIOS

A aluna Danielle Palma de Oliveira, aluna de doutorado e estagiária da CETESB ganhou o Travel Award e o

Environmental Mutagenicity Society Award pela excelência do trabalho apresentado

“Um possível novo sub produto de desinfecção com atividade mutagênica gerado a partir de azo corantes e cloro” que foi desenvolvido aqui na CETESB sob orientação da Dra. Gisela Umbuzeiro em colaboração com o IQ-UNESP de Araraquara

(Dra. Valnice Boldrin Zanoni e aluna Patrícia Carneiro)

Gisela Umbuzeiro também recebeu o Travel Award.

APRESENTAÇÃO FEITA POR GISELA UMBUZEIRO NO ICEM 2005

A RELEVÂNCIA DO TESTE COM SALMONELLA NA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DA ÁGUA E A INDICAÇÃO DE AZO-CORANTES COMO

IMPORTANTES CONTAMINANTES AQUÁTICOS

CO-AUTORES DOS TRABALHOS já publicados: Larry D. Claxton, Sarah Warren – US EPA Harold Freeman – College of Textiles – NCSU T. Watanabe & Y. Terao – Japão Danielle Oliveira USP aluna de doutorado COLABORADORES dos trabalhos em elaboração: ANÁLISES QUÍMICAS Valnice Boldrin & Patrícia Carneiro UNESP- Araraquara ANÁLISES DE CRIPTAS ABERRANTES Daisy Favero Salvadori – FM – UNESP – Botucatu TESTES COM TRADESCANTIA Paulo Saldiva: USP – Faculdade de Medicina TESTES COM RAÍZ DE CEBOLA Maria Aparecida Marin Morales – UNESP – Rio Claro

PROGRAMA DE MONITORAMENTO DA QUALIDADE DAS ÁGUAS INTERIORES DO ESTADO DE SÃO PAULO

Azo Dye Processing Plant

Drinking Water TreatmentPlant

Water served for60,000 inhabitants

15 m3/h

540 m3/h

MONITORING SITE CETESB SMA 65/98

MUTAGENIC

340 m3/h

6km

PRE-CHORINATION

LOCAL DE REFERÊNCIA

PRESÍDIO INDÚSTRIA DE TINGIMENTOGALVANOPLASTIA

ETA

CAPTAÇÃO

~6 km

~60.000 PESSOAS

540m3/h

h15 m3/

340m3/h

T. AMESPOSITIVO

EXTRAÇÃO ORGÂNICA

SALMONELLA/MICROSOME

ASSAY

Eluiçãometanol eDCM

Eluição metanolacetato de etila

CONCENTRAÇÃOROTAVAPOR

N2

N

H+

Extração N

10L

resina XAD-4

10L

Descarte da amostra

HCl 0,1NpH ≤ 2

Extração H+resina XAD-4

AMOSTRAS ÁGUA SEDIMENTO

ULTRASONI-CAÇÃO

30g

Metanol e DCM

Filtração

TA98, TA100, YG1024, YG1041, YG1042

(superprodutoras de nitroreductase and acethyltransferase)

Resultados expressos em número de revertentes por litro ou grama equivalente

SALMONELLA/

microssoma

extratoSalmonella typhimurium

+ +

S9

Minimal agar

66h37ºC

Revertentes espontâneos

Espontâneos e induzidos

ANÁLISES QUÍMICAS

● Cromatografia de camada delgada para detecção preliminar de compostos coloridos (corantes) e fluorescentes

● GC/MS/MS – screening de orgânicos semi voláteis

● NMR & MS – determinação das estruturas químicas

● LC/DA – Identificação e quantificação de corantes

● LC/ED – Identificação e quantificação de benzidina

YG1041 +S9 = 5x106 rev/L -S9 =1x106

TA98 +S9 = 3x105 rev/L -S9 = 1x105

FONTE DE POLUIÇÃO IDENTIFICADA COM O TESTE SALMONELLA

EFLUENTE DA INDÚSTRIA DE TINGIMENTO

RIBEIRÃO DOS CRISTAIS

110

1001000

10000

Rev

erta

nts/

liter

TA100

+S9

TA100

-S9

YG104

2+S9

YG104

2-S9

TA98+

S9

TA98-

S9

YG104

1+S9

YG104

1-S9

TRATADABRUTA

RIBEIRÃO DOS CRISTAIS

110

1001000

10000

Rev

erta

nts/

liter

TA100

+S9

TA100

-S9

YG104

2+S9

YG104

2-S9

TA98+

S9

TA98-

S9

YG104

1+S9

YG104

1-S9

TRATADABRUTA

LOCAL DE REFERÊNCIA

MUTAGENICIDADE DA ÁGUA BRUTA COMPARADA COM A TRATADA NORIBEIRÃO DOS CRISTAIS E EM LOCAL REFERÊNCIA

MUTAGENICIDADE RELACIONADA A NITRO/AMINAS AROMÁTICAS

Umbuzeiro et al Chemosphere 54(2004)1589-1597

DOS DEZ CORANTES FORNECIDOS PELA INDÚSTRIA UM CORANTE PREVALENTE FOI DETECTADO POR CCD - BDCP

1= Local referência2- rio após descarga 3= rio na ETA4= água tratadaCVS= BDCP

EFLUENTEINDUSTRIAL BDCP

3 CORANTES IDENTIFICADOS E

SURFACTANTES DESCONHECIDOS

Lodo da ETA Sedimento do ribeirão Cristais

1. loca referência2. após descarga3. na ETA4. BDCP

lodo BDCP

Oliveira et al aceito pelo SSCJ

Corantes do BDCP foram separados por cromatografia

mutagenicidade Estruturas químicas

SALMONELLA MICROSOME

NMR & MS

Número de revertentes/ug teste com SALMONELLA/microssoma

COMPONENT TA98-S9 TA98+S9 YG1041-S9 YG1041+S9

BDCP 3.9 70 76 1,570

D. BLUE 373 1.8 480 100 6,300

D. VIOLET 93 10 1,000 195 4,600

D. ORANGE 37

7.2 46 160 280

Estruturas químicas foram determinadas por ressonância nuclear Estruturas químicas foram determinadas por ressonância nuclear magnética (NMR) e espectrometria de massa magnética (NMR) e espectrometria de massa

Blue Component of BDCP (C.I. Disperse Blue 373)

Br

NO2

O2N NN

CH3CONH

OCH3

N(CH2CH=CH2)2

Violet Component of BDCP (C.I. Disperse Violet 93)

O2N NN N(C2H5)2

CH3COHN

Br

NO2

Orange component of BDCP (C.I. Disperse Orange 37)

O2N NN N

Cl

Cl

C2H5

CH2CH2CN

BDCP – BLACK DYE COMMERCIAL PRODUCTBDCP – BLACK DYE COMMERCIAL PRODUCT

GrupoNITRO

HAROLD FREEMAN

GrupoAMINA

Br

NO2

O2N NN

CH3CONH

OCH3

N(CH2CH=CH2)2

YG1024 +S9mix

0

500.000

1.000.000

1.500.000

2.000.000

2.500.000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

fraction number

revertant/fr.

LODO BDCP

55% da mutagenicidade devida ao CI Disperse

Blue 373

1,500 Rev/ug47,000 Rev/g

Contribuição de corantes na mutagenicidade do lodo da ETA (T. WATANABE & Y. TERAO)

Reference SiteJail Dye processing plantGalvanizer

DWTP

Water intake

~6 km

~60.000 people

540m3/h

3%

340m3/h

106-7 rev/L400,000 ng/L

105-6 rev/L200,000 ng/L

104 rev/L500 ng/L

103-4 rev/g70 ng/g

sedimento

104-5 rev/g7,500 ng/g

lodo

103 rev/L20 ng/L

Água tratada foi encontrado adicionalmente os ácidos halogenados e MX esperados e novos produtos de desinfecção gerados pelo cloro e corantes

MUTAGENICIDADE(YG1041) E CONCENTRAÇÃODO BDCP

- S9

• Nitro ou aminas aromáticas estavam contribuindo para a mutagenicidade do efluente industrial, do rio, do sedimento, da água tratada e do lodo da ETA do Ribeirão dos Cristais

• Corantes do grupo dos nitro-aminoazobenzenos estavam contribuindo para a mutagenicidade detectada

AS LINHAGENS DE SALMONELLA AS LINHAGENS DE SALMONELLA ESTAVAM CERTAS O TEMPO TODO......ESTAVAM CERTAS O TEMPO TODO......

Outros compostos mutagênicos além dos corantes estão presentes nas amostras e estão sendo estudados.

RESULTADOS

ADICIONAIS

COM OUTROS TESTES

realizados através de colaborações

ANÁLISES QUÍMICAS•Benzidina - 47 ug/L (LC-ED)•CI Disperse Blue 373 - 67 ug/L (LC/DA)•CI Disperse Violet 93 - presente•CI Orange 37 - 126 ug/L•Outras aminas aromáticas (GC/MS/MS)•Outros corantes e compostos fluorescentes desconhecidos (CCD)

Lesões pré-neoplásicas-

ACFSamonella microssoma

Aberrações cromossômicas Micronúcleos

BIOENSAIOS

EFLUENTE DA INDÚSTRIA DE TINGIMENTO

FORMATION OF THE PBTA-22-[2-(acetylamino-4-[N-(2-cyanoethyl)ethylamino]-5-methoxyphenyl]-

5-amino-7-bromo-4-chloro-2H-benzotriazole (PBTA-2)

HIGHLY MUTAGENIC FOR SALMONELLA AND GENOTOXIC FOR MAMMALIAN CELLS, GENERATED BY THE REDUCTION AND CHLORINATION OF THE BLUE COMPONENT OF THE BLACK AMINOAZOBENZENE DYE STUDIED -

1022x103

7x103

Rev/nmol

Data from Dr Wakabayashi et al.; Figure from Matsuoka et al 2001

912N =

distalproximal

micr

onuc

lei (

%)

14

12

10

8

6

4

2

0

REFERENCE SITE

DWTP INTAKE

MICRONUCLEI

POINT MUTATIONS

ORGANIC EXTRACTORGANIC EXTRACT

CHEMICAL ANALYSIS showed the presence of: Dyes- Blue (65 ng/L); Violet (12 ng/L); Orange (397 ng/L) and

mutagenic aromatic amines and fluorescent compounds

Ribeirão dos Cristais na ETA

Considerações finais• Corantes e compostos relacionados são importantes contaminantes ambientais e podem ser encontrados em efluentes industriais, água superficial, sedimento, lodos e água tratada utilizada para consumo humano.

• Pouca informação sobre toxicidade e genotoxicidade de corantes está disponível na literatura internacional portanto mais estudos são necessários para elucidar os riscos envolvidos quando a biota ou a população humana em casos de exposição.

•O teste Salmonella/microssoma teve um papel chave no monitoramento da qualidade da água e deveria ser utilizado de forma sistemática na complementação das análises químicas, emcondições padronizadas, como um parâmetro de avaliação da qualidade das águas.

CETESBDeborah RoubicekPaulo Fernando RodriguesLourival WankeFabio KummrowCélia Maria RechCarlos Alberto CoimbrãoFrancisco Viana de CastroWalace SoaresMaria Inês Zanoli SatoRenata Souza Leão Martins

USEPAMike KohanPeggy Mathews

USP E UNESPR. CaritaD. Lobo & S. SoaresR. Alves de Lima & A.P. BazoT. Mazzo & A. SaczkP. Carneiro