UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM NEUROCINCIAS

PAPEL DO ZINCO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:

DEFESAS ANTIOXIDANTES

E SINALIZAO CELULAR VIA PI3K/AKT

CRISTINA FLORES BOROWSKI

FLORIANPOLIS, OUTUBRO DE 2006.

PAPEL DO ZINCO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:

DEFESAS ANTIOXIDANTES

E SINALIZAO CELULAR VIA PI3K/AKT

Dissertao apresentada Universidade

Federal de Santa Catarina como

requisito parcial para obteno de grau

de Mestre em Neurocincias.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Bainy Leal

Co-orientador: Prof. Dr. Alcir Luiz Dafre

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM NEUROCINCIAS

FLORIANPOLIS, OUTUBRO DE 2006.

ii

Nossas limitaes esto dentro

das nossas mentes. Se conseguirmos ter

essa percepo, no existir limites, e

seremos do tamanho dos nossos sonhos.

iii

AGRADECIMENTOS

Concluir o mestrado foi um grande desafio. Muitas pessoas dedicaram seu tempo e

esforo, dando sua contribuio para me ajudar nesse processo. Esse perodo foi de grande

aprendizado e crescimento, no s intelectual, mas pessoal. Essas pessoas a quem gostaria

de agradecer contriburam de vrias formas pra esse crescimento. Portanto, agradeo...

A minha me, por todo o amor, conselhos e pela fora nos momentos difceis.

Tambm por ter possibilitado a minha vinda pra Florianpolis sem bolsa de estudos. E aos

meus irmos pela amizade e pelo amor. Enfim, muito obrigada por tudo, de todo o meu

corao. Amo vocs.

Ao Professor Alcir, meu co-orientador, gostaria de agradecer pela oportunidade,

pela fora, amizade, e pela grande ajuda que tornou possvel a realizao desta dissertao.

Obrigada tambm pela orientao e por todos os ensinamentos no perodo em que

trabalhamos juntos.

Ao Jeferson, que idealizou boa parte deste trabalho, e me ajudou muito com os

experimentos. Obrigada, tambm, pela amizade e pela fora.

Ao Professor Rodrigo Leal, meu orientador, pela oportunidade de realizar este

trabalho, pelos ensinamentos e por toda a ajuda. s meninas do lab, Thas, Camila, Ana e

Fernanda, obrigada pelo companheirismo e pela ajuda neste trabalho. Sem todos vocs, ele

no seria possvel. Ao Francesco, obrigada epla amizade e pela fora. Sara, obrigada pela

fora.

Aos Professores Carlos Alberto Gonalves e Carmem Gottfried, pela amizade e pelo

carinho. Ao pessoal do lab 33, agradeo pela amizade, pelo apoio, pelo carinho, enfim, foi

um grande prazer ter conhecido e convivido com todos vocs.

Aos Professores Nlson, Carla, Ana Lcia e Marcelo, com quem tive a oportunidade

de conviver e aprender muito, seja nas disciplinas ou pelo convvio neste prodo.

iv

Ao Professor Adair, por todos os conselhos e incentivo, pela amizade e pelo apoio.

Ao Secretrio da Ps-Graduao Nivaldo, por todo o apoio e ajuda neste perodo.

Maria Carmelita, pela preciosa ajuda nesse processo.

v

SUMRIO

RESUMO.................................................................................................................ix ABSTRACT...........................x LISTA DE FIGURAS.............................................................................................. xi LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................. xii 1. INTRODUO .................................................................................................... 1

1.1. Zinco nos Processos Biolgicos ........................................................................ 1

1.2. Zinco no Sistema Nervoso Central ................................................................... 2

1.3. Radicais livres e espcies reativas de oxignio (ERO) ................................. 7

1.3.1. Defesas Celulares .......................................................................................... 10

1.3.1.1. Defesas No Enzimticas .......................................................................... 11

1.3.1.2. Defesas Enzimticas .................................................................................. 12

1.4. Zinco e estresse oxidativo ................................................................................ 17

1.5. Sinalizao Celular ............................................................................................ 19

1.5.1. Protenas Quinases ........................................................................................ 20

1.5.1.1. Akt como Elemento Regulatrio Essencial ............................................. 21

1.5.1.2. Papel de Radicais Livres e ERO na Sinalizao Celular...................... 24

2. OBJETIVOS...................................................................................................... 27 3. MATERIAL E MTODOS ................................................................................. 28

3.1. Animais ................................................................................................................ 28

3.2. Tratamentos in vivo ........................................................................................... 28

3.2.1. Tratamento Agudo ou com Doses Repetidas de ZnCl2 ........................... 28

3.3. Tratamentos in vitro ........................................................................................... 29

vi

3.3.1. Tratamento das Fatias de Hipocampo. ....................................................... 29

3.4. Avaliao da Viabilidade Celular. .................................................................... 30

3.5. Parmetros Antioxidantes................................................................................. 31

3.5.1. Avaliao da Atividade Glutationa Peroxidase (GPx) .............................. 31

3.5.2. Avaliao da Atividade Glutationa Redutase (GR) ................................... 32

3.5.3. Avaliao da Atividade Glutationa S-Transferase (GST)......................... 32

3.5.4. Avaliao da Atividade Catalase (CAT) ...................................................... 33

3.5.5. Avaliao da Atividade -Glutamil Transpeptidase (GGT) ...................... 33

3.5.6. Mensurao dos Nveis de GSH Total (GSH-t) ......................................... 34

3.6. Dosagem de Protenas ..................................................................................... 34

3.7. Separao de Protenas ................................................................................... 35

3.8. Eletrotransferncia e Imunodeteco ............................................................. 36

3.9. Anlise Estatstica.............................................................................................. 37

4. RESULTADOS.................................................................................................. 38 4.1. Estudos in vivo ................................................................................................... 38

4.1.1. Glutationa no hipocampo e no crtex de ratos jovens tratados com

ZnCl2 de forma aguda. .............................................................................................. 38

4.1.2. Enzimas antioxidantes em hipocampo e crtex de ratos jovens tratados

com ZnCl2 de forma aguda. ..................................................................................... 39

4.1.3. Glutationa no hipocampo e no crtex de ratos jovens tratados com

doses repetidas de ZnCl2. ........................................................................................ 41

4.1.4. Enzimas antioxidantes em hipocampo e em crtex de ratos jovens

tratados com doses repetidas de ZnCl2. ................................................................ 42

4.2. Estudos in vitro com fatias hipocampais de ratos jovens ............................ 45

vii

4.2.1. Enzimas antioxidantes em fatias de hipocampo tratadas com diferentes

concentraes de ZnCl2. .......................................................................................... 45

4.2.2. Avaliao da viabilidade celular em fatias hipocampais expostas ao

ZnCl2. ........................................................................................................................... 47

4.2.3. Efeito do pr-tratamento com ZnCl2 sobre a inibio de viabilidade

celular causada pelo perxido de hidrognio em fatias hipocampais............... 48

4.2.4. Fosforilao da Akt em fatias hipocampais de ratos jovens tratadas com

ZnCl2. ........................................................................................................................... 49

4.2.5. Ao do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a fosforilao da Akt

induzida pelo ZnCl2. .................................................................................................. 51

4.2.6. Ao do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a viabilidade celular em

fatias hipocampais expostas ao ZnCl2. .................................................................. 51

5. DISCUSSO..................................................................................................... 54 6. CONCLUSES ................................................................................................. 64 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................. 66

viii

RESUMO

O zinco um metal de transio presente nas sinapses, especialmente do crtex cerebral e hipocampo, onde desempenha um papel modulatrio sobre diversas protenas, incluindo enzimas e receptores. Neste trabalho foi realizado um estudo das aes do zinco in vitro (10-100 M; 2h) sobre a atividade de enzimas antioxidantes, sobre a viabilidade celular e sobre a modulao da via PI3K/AKT em fatias de hipocampo de ratos imaturos (14 dias de idade). Alm disso, foram tambm avaliados os efeitos da administrao in vivo do zinco sobre a atividade de enzimas antioxidantes em hipocampo e crtex cerebral de ratos jovens. Neste caso, foram utilizados tratamentos via intraperitoneal com ZnCl2 seguindo dois protocolos: a) tratamento agudo de ratos com 13 dias de idade, atravs da administrao de dose nica de ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/Kg); b) tratamento com doses repetidas dirias de ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/Kg) por 5 dias no perodo ps-natal (PN) entre o 8 e 12 dia de idade. Os animais foram avaliados no 14 dia PN. Os resultados do estudo in vivo mostraram que no houve alterao nos nveis de glutationa total (GSH-t) em nenhum dos tratamentos ou estruturas analisadas. Entretanto, nos dois modelos de tratamento, foi observado um aumento na atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST) e glutationa peroxidase (GPx) no hipocampo, mas no no crtex cerebral. A atividade das enzimas glutationa redutase (GR) e catalase no foram alteradas pelos diversos tratamentos com zinco e em nenhuma das estruturas analisadas. Nos estudos in vitro utilizando fatias hipocampais de ratos jovens todas as doses testadas de ZnCl2 (10 a 100 M) produziram uma significativa e progressiva inibio da enzima GR, o que no aconteceu com as enzimas GST, GPx e -glutamil-transpeptidase (GGT), sugerindo um efeito seletivo do metal sobre a enzima GR. A viabilidade celular foi analisada pela medida da reduo do MTT. Os resultados mostraram que o ZnCl2, nas concentraes mais elevadas (100-300 M), reduziu significativamente a viabilidade celular em fatias de hipocampo. Em funo da inibio in vitro da enzima GR pelo zinco, responsvel pela regenerao intracelular de glutationa reduzida (GSH), foi analisado um possvel efeito de sinergismo entre o ZnCl2 e o agente pr-oxidante H2O2. Os resultados mostraram que o pr-tratamento com zinco (10-100 M; 2h) no alterou a citotoxicidade (avaliada pelo MTT) produzida pelo H2O2 (1 mM). Este resultado sugere que a inibio da GR pelo zinco no est diretamente relacionada toxicidade do H2O2. O zinco 100 M, mas no 30 M, promoveu ativao significativa da AKT, observada atravs de um significativo aumento de fosforilao na Serina 473. O uso de LY294002, um inibidor de PI3K, enzima responsvel pela ativao da AKT, inibiu a fosforilao no sitio 473, indicando que o efeito do zinco sobre AKT dependente desta via.

ix

ABSTRACT

Zinc is a transition metal found on synapses, specially in cerebral cortex and hippocampus, where it has a modulatory role upon several proteins, including enzymes and receptors. The present work was undertaken in order to investigate the effects of zinc in vitro (10-100 M; 2h) on antioxidant defense systems, on cell viability, and on modulation of PI3K/AKT pathway in hippocampal slices of young rats (14 days old). Additionally, we assess the actions of zinc in vivo on the activity of antioxidant defense systems in cerebral cortex and hippocampus of young rats. In this case, ZnCl2 was administered intraperitoneally (i.p.) with the following two protocols: a) acute treatment was performed in 13 days old rats through the administration of a single dose of ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/Kg); b) repeated dosing was performed by the treatment with daily injections of ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/Kg) for 5 consecutive days in the postnatal period between 8th and 12th days old (PN8-12). The animals were analyzed on 14th post-natal day (PN14). The results showed that in vivo administration of zinc was unable of inducing changes total glutathione (GSH-t) levels in either treatments or structures analyzed. However, the results showed an increase of glutathione S-transferase (GST) and glutathione peroxidase (GPx) activity on hippocampus, but not in cerebral cortex, in both treatments used. The glutathione reductase (GR) and catalase activity did not change in either in vivo treatments or structures analyzed. The study using hippocampal slices of young rats (PN14) exposed in vitro to ZnCl2 (10-100 M) for 2 h, showed a significant and progressive inhibition of GR, with no changes in GST, GPx and gamma-glutamyl-transpeptidase (GGT) activity, suggesting a specific in vitro effect of zinc upon GR. Cell viability was analyzed by measurement of cellular capacity to reduce MTT. The results showed that ZnCl2 in the highest concentrations tested (100-300 M), decreased cell viability of hippocampal slices. Once zinc can inhibit GR in vitro, and this enzyme is responsible for intracellular regeneration of reduced glutathione (GSH), a possible sinergistic effect between ZnCl2 and H2O2 was analyzed. The results showed that pretreatment with ZnCl2 (10-100 M; 2h) did not change the citotoxicity (measured by MTT) produced by H2O2 (1 mM), suggesting that the inhibition of GR by zinc is not directly related to H2O2 toxicity. ZnCl2 100 M, but not 30 M, promoted activation of AKT, observed through a significant increase of the phosphorylation on Ser 473. The use of LY294002, a PI3K inhibitor, prevented this activation, indicating that the effect of ZnCl2 on AKT is dependent of PI3K pathway.

x

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1. Localizao do zinco no crebro de ratos. ................................................... 2

Fig. 2. Transporte do zinco para o interior do crebro............................................. 3

Fig. 3. Distribuio do zinco nas clulas nervosas. ................................................. 4

Fig. 4. Transporte de zinco sinptico....................................................................... 5

Fig. 5. Alguns exemplos de espcies reativas de oxignio. .................................... 7

Fig. 6. Reduo univalente do oxignio e formao de intermedirios reativos...... 8

Fig. 7. Estresse oxidativo. ....................................................................................... 9

Fig. 8. Ciclo redox esquemtico mostrando a relao entre enzimas antioxidantes

e a glutationa......................................................................................................... 11

Fig. 9. Alvos bioenergticos potenciais para inibio pelo zinco. .......................... 18

Fig. 10. Diagrama esquemtico do sistema de fosforilao de protenas. ............ 19

Fig. 11. Alvos da regulao da sobrevivncia celular pela Akt.............................. 23

Fig. 12. Vias que podem ser mediadas por estresse oxidativo. ............................ 25

Fig. 13. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens

tratados com o metal de forma aguda................................................................... 38

Fig. 14. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas

antioxidantes em hipocampo de ratos jovens........................................................ 40

Fig. 15. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade de enzimas

antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. ................................................ 41

xi

Fig. 16. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens

tratados com doses repetidas do metal................................................................. 42

Fig. 17. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade

das enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. ................................. 43

Fig. 18. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade

das enzimas antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. ........................... 44

Fig. 19. Atividade de enzimas antioxidantes de fatias hipocampais em resposta ao

tratamento in vitro com ZnCl2. ............................................................................... 46

Fig. 20. Efeitos do ZnCl2 sobre a viabilidade de fatias de hipocampos. ................ 47

Fig. 21. Efeito do tratamento de zinco e H2O2 na reduo do MTT em hipocampo

de ratos jovens. ..................................................................................................... 49

Fig. 22. Efeito do ZnCl2 sobre a fosforilao da protena Akt em fatias hipocampais

de ratos jovens. ..................................................................................................... 50

Fig. 23. Ao do inibidor de PI3K, LY294002, sobre a fosforilao de Akt em

resposta ao tratamento in vitro com zinco............................................................. 52

Fig. 24. Ao do inibidor da PI3K/Akt, LY294002, sobre os efeitos do ZnCl2 na

reduo do MTT. ................................................................................................... 53

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPA: -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid

AMPc: monofosfsto de adenosina clcico

ARE: elemento de resposta a antioxidantes

ATP: trifosfato de adenosina

BSA: albumina srica bovina

CAT: catalase

CDNB: clorodinitrobenzeno

CFS: fluido crebro espinhal

Cu/ZnSOD: cobre-zinco-superxido dismutase

DMSO: dimetil sulfxido

DNA: cido desoxirribonuclico

ECL: quimioluminescncia

EDTA: cido etileno-dinitrilo-tetra-actico

EGFR: receptor do fator de crescimento epidrmico

ERK: quinase regulada por sinal extracelular

ERO: espcies reativas de oxignio

FAD: flavina adenina dinucleotdeo

Fe-SOD: ferro-superxido dismutase

G6PDH: glicose-6-fosfato desidrogenase

GABA: cido -aminobutrico

GCL: -glutamil-cistena sintetase ou glutamato-cistena ligase

GMPc: monofosfato de guanosina cclico

GPx: glutationa peroxidase

GR: glutationa redutase

GSH: -glutamil-cisteinil-glicina ou glutationa

GSH-t: glutationa total

GSSG: dissulfeto de glutationa

xiii

GST: glutationa S-transferase

HEPES: cido N-2-Hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfnico

JNK: quinase c-Jun NH2-terminal

MAPK: protena quinase ativada por mitgenos

MDA: malonildialdedo

Mn-SOD: mangans- superxido dismutase

MTT: brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2,5-difenil-tetrazolium)

NADPH: nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato

NFB: fator de transcrio nuclear kappa B

NMDA: N-Methil-D-Aspartato

NrF2: fator nuclear relacionado ao fator E2

p38MAPK: protena quinase ativada por mitgeno de 38 kDa

PCA: cido perclrico

PH: domnio de homologia plecstrina N-terminal

PI3K: fosfoinositol 3-quinase

PIP2: fosfatidilinositol 3,4-bifosfato

PIP3: fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato

PI(4,5)P2: fosfatidilinositol 4,5-bifosfato

PKB: protena quinase B

PKC: protena quinase C

RNA: cido ribonuclico

RNAm: cido ribonuclico mensageiro

RTK: receptor tirosina quinase

SDS: dodecil sulfato de sdio

SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS

SNC: sistema nervoso central

SOD: superxido dismutase

TBARS: substncias reativas ao cido tiobarbitrico

t-BOOH: hidroperxido de tert-butila

TBS: tampo tris-salina

TBS-T: tampo tris-salina com Tween-20

xiv

TCA: cido tricarboxlico

TEMED: N, N, N, N-Tetrametiletilenodiamina

TGF: fator de crescimento tumoral

xv

1. INTRODUO

1.1. Zinco nos Processos Biolgicos

O zinco (Zn2+) um metal de transio que modula a funo de diversas protenas

regulatrias associadas a uma variedade de atividades celulares (Eom et al., 2001). Nas

clulas de mamferos, o zinco o micronutriente essencial mais abundante depois do ferro.

Aproximadamente 300 enzimas diferentes requerem zinco, inclundo DNA e RNA

polimerases, metaloproteinases e enzimas do metabolismo intermedirio, como piruvato

carboxilase e lactato desidrogenase (Tapiero & Tew, 2003; Vallee & Auld, 1996; Vallee &

Falchuk, 1986). Fisiologicamente, em baixas concentraes, o zinco contribui para

importantes processos biolgicos, incluindo expresso gnica, sntese de DNA, catlise

enzimtica, sinalizao celular e neurotransmisso (Frederickson et al., 2000). Por outro

lado, o excesso de zinco livre nos tecidos do corpo pode ser txico (Choi & Koh, 1998).

O crescimento e a diferenciao de clulas eucariticas geralmente so induzidos

por hormnios e fatores de crescimento que acionam elementos que esto envolvidos em

cascatas intracelulares de sinalizao, envolvendo receptores, mensageiros intracelulares,

protenas cinases, protenas fosfatases e fatores de transcrio (Lau & Huganir, 2006). O

zinco est envolvido em diversos pontos nas vias de transduo de sinal, podendo ser um

componente estrutural ou modulador da atividade de enzimas, protenas regulatrias e

fatores de transcrio (Vallee & Falchuk, 1993; Beyersmann & Haase, 2001). Entretanto,

perturbao na homeostase do Zn2+ intracelular pode, em determinadas situaes, ser letal

1

para as clulas (Koh & Choi, 1994; Manev et al., 1997; Lobner et al., 2000; Marin et al.,

2000).

1.2. Zinco no Sistema Nervoso Central

Similar a outros compostos endgenos, o zinco pode ser tanto um neuromodulador

essencial quanto uma potente neurotoxina, dependendo da sua concentrao intracelular

(Baranano et al., 2001). Baixos nveis de zinco possuem uma ao anticonvulsivante e

neuroprotetora, enquanto altas concentraes de zinco podem matar neurnios e induzir

atividade epiltica (Frederickson & Moncrieff, 1994).

Fig. 1. Localizao do zinco no crebro de ratos. Quadrante caudal esquerdo do crebro de rato (seco horizontal) mostra o zinco vesicular na colorao marrom-escura a preta, a partir da colorao para zinco vesicular pelo mtodo de Danscher. A quarta camada do isocrtex e o hipocampo se mostram bem coradas para o zinco vesicular. A maioria das regies corticais cerebrais fortemente inervada por terminais que contm zinco, enquanto o crtex cerebelar (Ctx Cer) e o tlamo no esto corados para o zinco vesicular. A quarta camada do isocrtex (IV), as regies CA1, hilo do giro denteado (H), estrato oriens (O), estrato radiato (R) e crtex subicular (Sub), todas pertencendo ao hipocampo, se mostram bem coradas para o zinco vesicular (Frederickson et al., 2004).

2

O zinco um nutriente essencial para as funes neurolgicas normais. Dentre os

tecidos, o crebro possui o maior contedo de zinco, apresentando concentraes cerca de

dez vezes maiores que o plasma (cerca de 100 150 M) (Mocchegiani et al., 2005).

Apesar de neurnios que contm zinco serem encontrados em vrias regies do crebro,

incluindo neocrtex, amdala e bulbo olfatrio, os neurnios do hipocampo (Fig.1) tm a

maior concentrao de zinco e so particularmente vulnerveis ao dano celular mediado

pelo on (Haug, 1967; Perez-Clausell & Danscher, 1985; Frederickson, 1989; Frederickson

et al., 2000; Li et al., 2001a). No sistema lmbico, o zinco regula tanto a transmisso

sinptica inibitria quanto excitatria no hipocampo. Alm disso, o zinco pode ter um

importante papel na formao da memria (Takeda, 2000).

Fig. 2. Transporte do zinco para o interior do crebro. A albumina e os aminocidos histidina e cistena ligados ao zinco so fontes deste metal no plasma. O zinco pode atravessar a barreira hematoenceflica e a barreira hemato-fluidocrebroespinhal. No interior do crebro, pode se ligar a metaloprotenas ou ser incorporado a vesculas sinpticas em neurnios glutamatrgicos (modificado a partir de Takeda, 2004).

O transporte de metais-trao para dentro do crebro rigorosamente regulado pelas

barreiras hemato-fluidocrebroespinhal e hematoenceflica (Fig. 2). O zinco atravessa a

3

barreira hematoenceflica ligado albumina, ou a aminocidos como histidina e cistena

(Takeda, 2000). No crebro, em condies normais, 90% do zinco se encontra ligado a

protenas, como metalotionenas (Cole et al., 1999). O restante, cerca de 10%, ser

seqestrado nas vesculas sinpticas de neurnios que contm zinco, e posteriormente

liberado dos terminais neuronais (Crawford & Connor, 1973; Frederickson et al., 2004;

Takeda, 2004) (Fig.3).

Fig. 3. Distribuio do zinco nas clulas nervosas. O zinco pode ser encontrado ligado metaloprotenas ou no interior de vesculas sinpticas. O transporte do zinco feito pelas protenas transportadoras ZnT e ZIP. Uma vez liberado na fenda sinptica, o zinco pode se ligar a receptores de membrana ou entrar no neurnio ps-sinptico, atravs de canais proticos ou pela ao de transportadores, acionando cascatas de protenas quinases que, atravs da sinalizao celular, podem induzir a expresso gnica. Em altas concentraes, o zinco pode levar o neurnio apoptose. (Adaptado de Colvin et al., 2003).

A captao de zinco nas clulas neuronais ocorre ao nvel de corpo celular, bem

como pelo terminal neuronal. Como os terminais pr-sinpticos liberam zinco, e o corpo

4

celular e os dendritos do neurnio ps-sinptico possuem canais permeveis ao zinco, sob

condies favorveis, o zinco poder translocar do interior do neurnio pr-sinptico para o

interior do neurnio ps-sinptico. Durante atividade neuronal intensa pode se esperar uma

intensificao desta translocao (Atar et al., 1995; Yin et al., 1998; Sensi et al., 2000;

Kerchner et al., 2000).

Fig. 4. Transporte de zinco sinptico. Vesculas com a protena transportadora de zinco vesicular, ZnT3 (1), reunidas no Aparelho de Golgi de neurnios glutamatrgicos que contm zinco, so transportadas pelo axnio (2). Uma vez no terminal pr-sinptico, essas vesculas podem ser vistas contendo tanto zinco livre quanto glutamato (3). O zinco e o glutamato so liberados por exocitose dependente de clcio e impulso nervoso (4). Na fenda sinptica o zinco modula uma variedade de canais transportadores e receptores (5-10) em neurnios e clulas gliais. Os canais de clcio possuem certa permeabilidade ao zinco (5 e 9), permitindo sua entrada na clula ps-sinptica, onde ele ligado s metalotionenas (MT) (11). Oxidao e nitrosilao de tiis das metalotionenas pelo xido ntrico (NO) promovem a liberao somtica do zinco (12) (Frederickson et al., 2005).

A liberao de zinco na sinapse juntamente com o neurotransmissor glutamato tem

sido bem documentada (Fig. 4), e o termo gluzinrgico tem sido proposto para descrever

esse tipo de neurnios (Frederickson, 1989; Frederickson & Bush, 2001). Durante

atividades fisiolgicas, incluindo memria e aprendizado, as fibras musgosas do hipocampo

5

podem transmitir informao aos neurnios desta estrutura em freqncias

excepcionalmente altas. Durante esses perodos, o zinco liberado sinapticamente pode agir

de forma a proteger os neurnios contra os potenciais de ao excitotxicos conseqentes

da transmisso glutamatrgica aumentada atravs da inibio dos receptores N-Metil-D-

Aspartato (NMDA) via um stio de ligao de alta afinidade (Paoletti et al., 1997). A

concentrao de zinco nas vesculas glutamatrgicas de aproximadamente 300-350 M

(Perez-Clausell & Dansher, 1985; Takeda, 2000). Durante a atividade neuronal, estimado

que o zinco atinja um pico de concentrao sinptica de 10-100 M (Vogt et al., 2000),

podendo chegar a nveis ainda maiores aps uma atividade sinptica aumentada (Assaf &

Chung, 1984; Howell et al., 1984; Molnar & Nadler, 2001).

Durante estmulo normal, o zinco liberado dos terminais pr-sinpticos

glutamatrgicos pode ser translocado para a clula ps-sinptica atravs dos canais de Ca2+

dependentes de voltagem ou dos receptores AMPA/cainato, podendo acionar cascatas de

sinalizao neste neurnio (Sensi et al., 1999a). H evidncias de que tal translocao

contribui para a injria celular induzida pelo zinco na excitotoxicidade (Li et al., 2001b).

Assim, apesar dos importantes papis neuromodulatrios do zinco livre, a liberao

excessiva deste metal nos botes sinpticos pode resultar em morte neuronal ps-sinptica

(Frederickson, 1989; Frederickson et al., 1989; Koh et al., 1996; Ahn et al., 1998).

Portanto, os estudos que investigam os mecanismos de neurotoxicidade do zinco tm

focado, principalmente, sua interao com o sistema glutamatrgico.

Considerando os aspectos relacionados neurotoxicidade do zinco, tem sido

indicado que a excessiva liberao pr-sinptica do metal pode contribuir ou participar de

eventos bioqumicos relacionados neurodegenerao aps isquemia global transitria e

trauma cerebral (Aniksztejn et al., 1987; Suh et al., 2000; Weiss e Sensi, 2000; Koh, 2001).

6

Alm disso, tem sido proposto que o aumento nos nveis intracelulares de zinco aps um

evento de estresse, pode tambm se originar de compartimentos dos prprios neurnios

ps-sinpticos, como estoques mitocondriais e zinco ligado a metalotionenas (Frederickson

et al., 2004).

1.3. Radicais livres e espcies reativas de oxignio (ERO)

Radicais livres so molculas que possuem eltrons desemparelhados no seu orbital

mais externo (Marks et al., 1996) e podem ser tanto molculas orgnicas, tais como

quinonas, ou inorgnicas como o nion superxido (O2-). So altamente reativos e,

portanto, com tempo de vida muito curto. So formados durante o metabolismo celular

normal e, tambm, quando o organismo exposto a uma srie de estmulos como radiao

ionizante e biotransformao de xenobiticos (Comporti, 1989).

Fig. 5. Alguns exemplos de espcies reativas de oxignio. Fonte: http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/ROS.html Acessado em Julho de 2006.

Espcies reativas de oxignio (ERO) so compostos contendo oxignio (Fig. 5).

ERO incluem os radicais livres como o nion superxido, (O2-), o radical hidroxila (OH),

radicais hidroperoxil (HO2), e as espcies no radicalares como o perxido de hidrognio

(H2O2) e o oxignio singlet (O2) (Halliwell & Gutteridge, 1999). Estas espcies so

altamente reativas e podem agir como sinalizadores celulares, ou ainda como causadores de

7

dano ao DNA, ativadores pr-carcingenos, e podem alterar o sistema de defesa

antioxidante celular (Comporti, 1989; Cerutti, 1994; Liochev e Fridovich, 1999).

O oxignio molecular, em seu estado fundamental, um bi-radical contendo dois

eltrons desemparelhados no seu orbital mais externo. Entretanto, estes dois eltrons

desemparelhados apresentam spins de mesma orientao, tornando o O2 uma molcula

pouco reativa, podendo reagir com apenas um eltron por vez. O O2 capaz de aceitar

quatro eltrons, o que o reduz gua. Entretanto, redues parciais do O2 conduzem ao

aparecimento de diversas espcies reativas (Fig 6).

Fig. 6. Reduo univalente do oxignio e formao de intermedirios reativos. Os quatro passos para a reduo de O2 geram, progressivamente, superxido, perxido de hidrognio, radical hidroxila e gua (modificado a partir de Marks et al., 1996).

Quando o O2 aceita um eltron, formado o nion superxido, considerado um

radical por possuir um eltron desemparelhado. Essa reao no termodinamicamente

favorvel e requer um agente fortemente redutor como, por exemplo, a CoQ na cadeia

transportadora de eltrons. Quando o superxido recebe um eltron, reduzido a perxido

de hidrognio, que no um radical, mas pode gerar o radical hidroxila em conseqncia

de uma nova reduo. Finalmente, em um ltimo passo, a entrada de mais um eltron reduz

o radical hidroxila gua (Marks et al., 1996).

Durante o metabolismo basal das clulas aerbicas, existe uma produo constante

de radicais livres e ERO acompanhada pela sua contnua inativao atravs da ao de

8

antioxidantes, de modo a manter a integridade celular estrutural e funcional. A condio de

estresse oxidativo foi definida como um distrbio no balano pr-oxidante e antioxidante

(Fig.7), em favor do primeiro, podendo causar danos celulares (Sies, 1997; Ho et al., 1998).

Desta forma, o estresse oxidativo pode resultar: (1) da maior gerao de ERO, (2) da defesa

insuficiente das enzimas antioxidantes, (3) da liberao de metais de transio, potenciais

geradores do radical hidroxila, (4) da combinao destes fatores (Halliwell, 2001).

Fig. 7. Estresse oxidativo. Estresse oxidativo ocorre quando a taxa de produo de espcies reativas de oxignio e radicais livres excede a taxa de sua remoo pelos mecanismos de defesa antioxidantes. Fonte: http://www.asiaandro.com/1008-682x/6/59htm. Acessado em Julho de 2006.

Os danos causados pelo estresse oxidativo incluem, principalmente, clivagem do

DNA pela hidroxilao da guanina e metilao da citosina (Lee et al., 2002), lise

mitocondrial, influxo de clcio, oxidao de protenas, gerando derivativos carbonil e

nitrotirosina (Adams et al., 2001), e peroxidao de lipdios da membrana celular (Marks et

al., 1996). Os organismos aerbicos desenvolveram, portanto, diferentes mecanismos de

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http://www.asiaandro.com/1008-682x/6/59htmhttp://www.asiaandro.com/1008-682x/6/59htm

defesa antioxidante, enzimticos e no-enzimticos, que podem prevenir a formao das

ERO, reagir com estes intermedirios reativos, bem como reparar os danos causados pelos

mesmos (Sies, 1993).

O crebro particularmente sensvel aos danos causados por radicais livres e

espcies reativas de oxignio (ERO) devido a sua alta taxa metablica e sua capacidade

relativamente reduzida de regenerao celular comparada com outros rgos (Andersen,

2004). Alm disso, os tecidos cerebrais contm grandes quantidades de cidos graxos

poliinsaturados, que podem ser oxidados por radicais livres. Finalmente, o crebro contm

altos nveis de ferro, o qual tem sido referido como importante elemento associado

produo de radicais livres e injria neural (Herbert et al., 1994).

1.3.1. Defesas Celulares

O organismo possui defesas antioxidantes que o protegem dos danos oxidativos.

Estas defesas podem ser definidas como qualquer substncia que, presente em baixas

concentraes quando comparadas a de um substrato oxidvel, retarda ou inibe

significativamente a oxidao deste (Halliwell e Gutteridge, 1999). Estas defesas podem

ser fornecidas por compostos no enzimticos assim como por enzimas especficas

(Halliwell, 2001). Os antioxidantes protegem as clulas do dano oxidativo (Halliwell, 1992;

Sies, 1996). Portanto, frente a um estresse oxidativo, estas defesas so acionadas para

restabelecer o equilbrio, evitando o dano oxidativo.

10

1.3.1.1. Defesas No Enzimticas

Existem vrias molculas que podem agir como antioxidantes no enzimticos,

entre elas podemos citar: os tocoferis, o cido ascrbico, assim como os carotenides e a

glutationa (GSH) (Sies et al., 1992).

A GSH um tripeptdeo (-glutamil-cisteinil-glicina), sendo considerada o

antioxidante endgeno universal devido a sua importncia na proteo celular contra a

formao de ERO, na homeostase tilica, na manuteno da homeostase redox da clula, e

na defesa contra agentes eletroflicos (Cooper, 1997; Dringen, 2000; Bharath et al., 2002).

Fig. 8. Ciclo redox esquemtico mostrando a relao entre enzimas antioxidantes e a glutationa. A glutationa sintetizada em duas reaes enzimticas seqenciais dependentes de ATP. O primeiro passo da sntese da glutationa (GSH) sintetizado pela -glutamil-cistena sintetase ou glutamato-cistena ligase (GLC), a qual liga os aminocidos L-glutamato e L-cistena. A enzima glutationa sintetase (GS) liga L--glutamato-L-cistena com o aminocido glicina para formar L--glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH). Modificado a partir de Haddad & Harb, 2005.

A GSH utilizada por uma srie de enzimas, como a glutationa peroxidase (GPx) e

a glutationa S-transferase (GST). A GSH sintetizada em dois passos, por duas enzimas

distintas: -glutamil-cistena sintetase ou glutamato-cistena ligase (GCL), que

11

considerada o ponto regulatrio da produo da GSH, e pela glutationa sintetase, que

responsvel pela adio de glicina (Sies, 1999) (Fig. 8). O termo glutationa total (GSH-t)

usado para a soma do dissulfeto da glutationa (GSSG) com sua forma tilica (GSH).

Os grupos tiis contidos na glutationa podem ser oxidados enzimaticamente,

levando formao de pontes dissulfeto (-S-S-). Por outro lado, as pontes dissulfeto so

facilmente reduzidas, formando novamente os grupos tiis. Desta forma, a taxa de reduo

e oxidao dos grupos tiis pode ser o principal fator determinante do potencial de reduo

celular (Galaris & Evangelou, 2002). A razo entre a GSH reduzida e a oxidada

(GSH/GSSG) varia entre os vrios compartimentos celulares, variando de 2:1 no retculo

endoplasmtico a mais de 100:1 em outros compartimentos (Hwang et al., 1992). O

balano entre a GSH reduzida e a oxidada representa um fator chave no estado redox

celular (Meister, 1994).

Foi demonstrado que neurnios em cultura so mais vulnerveis compostos como

perxido de hidrognio (H2O2), hidroperxido de tert-butila (t-BOOH), ou peroxinitrito

(ONOO-)(Ben-Yoseph et al., 1994; Bolaos et al., 1995; Abe & Saito, 1998). Isso

provavelmente ocorre porque neurnios em cultura contm glutationa em uma

concentrao mais baixa do que clulas astrogliais em cultura (Raps et al., 1989; Bolaos et

al., 1995).

1.3.1.2. Defesas Enzimticas

As principais enzimas antioxidantes so: superxido dismutase (SOD), catalase

(CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glicose-6-fosfato

desidrogenase (G6PDH), glutationa S-transferase (GST) e -glutamil transpeptidase (-GT).

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a) Superxido Dismutase (SOD)

A enzima SOD catalisa a dismutao do radical O2- em H2O2 e O2 (McCord e

Fridovich, 1969), conforme representado na equao [1] e [2]. Esta enzima encontrada em

diferentes isoformas. A cobre-zinco-SOD (Cu/Zn-SOD) uma metaloprotena dimrica que

possui em cada subunidade um stio ativo com um tomo de cobre e um tomo de zinco.

encontrada no citoplasma e ncleo das clulas de mamferos (Halliwell e Gutteridge, 1999).

Eq. [1] Enz-Cu2++ O2- Enz-Cu++ O2Eq. [2] Enz-Cu++ O2-+ 2H+ Enz-Cu2++ H2O2

Outras isoenzimas SOD foram identificadas. A enzima mangans-SOD (Mn-SOD)

possui mangans no stio cataltico. Nas clulas humanas, a Mn-SOD encontrada

principalmente na matriz mitocondrial (Halliwell & Gutteridge, 1999). A enzima

extracelular-SOD (EC-SOD) encontrada na superfcie celular, em quantidades muito

pequenas na maioria dos tecidos se comparada s isoformas Cu/Zn-SOD e Mn-SOD

(Marklund, 1984; Oury et al., 1996). Embora os nveis de EC-SOD no crebro sejam

baixos, existem regies especficas, como o hipocampo, nas quais a presena da enzima

EC-SOD necessria para as funes normais de aprendizado e memria (Levin et al.,

1998). A isoforma ferro-SOD (Fe-SOD), que possui ferro no stio cataltico, no

encontrada nas clulas de mamferos (Wandres & Denis, 1992).

b) Catalase (CAT)

A maioria das clulas aerbicas possui atividade catalsica. A localizao

intracelular da catalase basicamente peroxissomal. Nos animais, a CAT est presente em

13

todos os principais rgos do corpo, especialmente no fgado e nos eritrcitos (Halliwell &

Gutteridge, 1999). No sistema nervoso central, a catalase encontrada nos quatro principais

tipos celulares, sendo eles astrcitos, neurnios, oligodendrcitos e microglia (Dringen et

al., 2005).

A CAT decompe o H2O2 em H2O e O2 (Farber et al., 1990), conforme as equaes

abaixo:

Eq. [3] Cat-Fe3++ H2O2 Composto 1 + H2O

Eq. [4] Composto 1 + H2O2 Cat-Fe3++ H2O + O2

c) Glutationa Peroxidase (GPx)

No crebro, a enzima GPx encontrada em astrcitos, neurnios, microglia e

oligodendrcitos (Dringen et al., 2005). Esta enzima est presente principalmente na matriz

mitocondrial, no citoplasma e no ncleo das clulas (Halliwell & Gutteridge, 1999). A

isoforma citoslica de GPx, GPx1, parece ser muito importante para o sistema de defesa

antioxidativo do crebro (Zhang et al., 2000; Crack et al., 2001; Flentjar et al., 2002).

A GPx possui atividade peroxidase, utilizando doadores de eltrons para reduzir o

perxido de hidrognio gua (Little & OBrien, 1968) conforme as equaes abaixo:

Eq. [5] H2O2+ 2GSH 2H2O + GSSG

Eq. [6] LOOH + 2GSH LOH + H2O + GSSG

A GPx possui selnio no stio cataltico e utiliza o tripeptdeo tilico GSH como

doador de eltrons para a reduo do H2O2 (Eq. [5]) e de outros perxidos orgnicos

14

(LOOH, Eq. [6]), tais como os lipoperxidos provenientes da lipoperoxidao lipdica,

impedindo assim a fase de propagao deste processo (Keeling & Smith, 1982). Durante o

processo catalisado pela GPx ocorre a oxidao da GSH, e conseqente formao de uma

ponte dissulfeto entre duas molculas de glutationa (GSSG), com concomitante formao

do lcool (LOH) derivado do perxido orgnico.

d) Glutationa Redutase (GR)

A importncia da enzima GR consiste em manter o equilbrio GSH/GSSG na clula,

pois a GSH uma molcula que tem como funo essencial manter as clulas no seu estado

reduzido. Portanto, ela atua como um agente antioxidante, reduzindo perxidos atravs da

ao da glutationa peroxidase (Meister, 1983; Stamler, 1994; Fujii et al., 2000). No sistema

nervoso central, assim como a GPx, a GR encontrada em astrcitos, neurnios, microglia

e oligodendrcitos (Dringen et al., 2005).

A GR contm um grupo prosttico flavina adenina dinucleotdeo (FAD) transferidor

de eltrons que catalisa a reduo da glutationa oxidada (GSSG) em glutationa reduzida

(GSH) de forma dependente de NADPH (Voet et al., 2000), conforme equao abaixo:

Eq. [7] GSSG + NADPH 2GSH + NADP+

e) Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH)

A enzima G6PDH est presente no citoplasma de todas as clulas. Ela faz parte do

ciclo das pentoses e participa da produo de NADPH, uma molcula necessria em vrios

processos de biossntese e, tambm, na manuteno da atividade da glutationa redutase. A

15

G6PDH catalisa a oxidao da glicose-6-fosfato a 6-fosfogliconolactona, hidrolisada em 6-

fosfogliconato. No processo cataltico, esta enzima utiliza NADP+ como aceptor de

eltrons, gerando equivalentes reduzidos de NADPH que mantm parte do poder redutor

intracelular (Voet et al., 2000).

Eq. [8] Glicose-6-P + NADP+ NADPH + H+ + 6-P-Glucono-1,5-lactona

f) Glutationa S-Transferase (GST)

GST constitui uma famlia de enzimas multifuncionais envolvidas na detoxificao

metablica de agentes eletroflicos incluindo agentes alquilantes, herbicidas, pesticidas e

outros xenobiticos (Ketterer et al., 1988; Mannervik & Danielson, 1988; Vos & Van

Bladeren, 1990). GST possui diferentes isoformas, presentes na maioria dos rgos de

mamferos. So protenas dimricas consistindo de duas subunidades pertencentes mesma

classe, que pode ser , , , e (Mannervik & Danielson, 1988; Meyer et al., 1991). No

crebro de ratos, GST est presente em neurnios, astrcitos, clulas endoteliais e

oligodendrcitos. Alm disso, h diferenas regionais no padro de expresso das classes ,

, de GST (Johnson et al., 1993).

A catlise de GST propicia a conjugao destes agentes eletroflicos com o grupo -

SH da GSH [Eq. 9], tornando os compostos mais hidroflicos, facilitando sua

metabolizao e excreo (Ketterer et al., 1983). GST apresenta tambm atividade

glutationa peroxidase [Eq. 6] independentemente de selnio, podendo reduzir perxidos

orgnicos (Mosialou et al., 1993).

16

Eq. [9] GSH + X GS-X

g) -Glutamil Transpeptidase (-GT)

-glutamil transpeptidase (-GT ou GGT) uma enzima glicoprotica ligada

superfcie da membrana celular, onde catalisa a transferncia do grupo -glutamil da GSH

nas suas formas reduzida e oxidada por hidrlise de uma ligao -glutamil para outros

aminocidos aceptores, peptdeos ou gua, (Meister et al., 1981). No final da reao

catalisada por GGT so formados aminocidos -glutamil (ou peptdeos -glutamil) e o

dipeptdeo CysGly.

No sistema nervoso central de ratos adultos, a GGT est principalmente localizada

nos ps astrocticos perivasculares que circundam os vasos sangneos, e em alguns

pericitos (Zhang et al., 1997; Cambier et al., 2000).

1.4. Zinco e estresse oxidativo

Tanto o excesso quanto a deficincia de zinco podem levar ao estresse oxidativo e,

conseqentemente, ativar ou inibir fatores de transcrio sensveis oxidao, podendo

afetar a funo, a proliferao e a sobrevivncia celular (Oteiza et al., 2004). Embora o

zinco no seja ele prprio um oxidante, este metal pode inibir a produo da energia celular

atravs de mecanismos que aumentam o estresse oxidativo (Fig. 9) (Dineley et al., 2003).

Alguns estudos evidenciam que o estresse oxidativo pode ser o principal causador de morte

neuronal pelo zinco (Kim et al., 1999b; Noh et al., 1999; Noh & Koh, 2000).

17

Fig. 9. Alvos bioenergticos potenciais para inibio pelo zinco. O zinco pode comprometer a produo de energia celular atravs da inibio da gliclise pela inibio da enzima gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), da inibio do ciclo do cido tricarboxlico (TCA) pela inibio docomplexo -cetoglutarato desidrogenase (KGDHC), e da inibio da cadeia transportadora de eltrons. Possveis conseqncias do aumento da concentrao de zinco intracelular incluem consumo reduzido de O2, nveis de ATP reduzidos, aumento na gerao de ERO, permeabilidade mitocondrial transitria (PTM), e morte neuronal. O impacto do zinco na permeabilidade mitocondrial, bem como os mecanismos responsveis pela captao de zinco pela mitocndria permanecem obscuros (modificado a partir de Dineley et al., 2003).

Um aumento no zinco intracelular pode causar disfuno mitocondrial, o que pode

levar gerao de espcies reativas de oxignio (Sensi et al., 1999b). A inibio do ciclo

do cido tricarboxlico (TCA) pelo zinco poderia estimular a produo de ERO atravs da

inibio do complexo da -cetoglutarato desidrogenase (Gazaryan et al. 2002). Alm disso,

um aumento nos nveis de zinco intracelular causa a inibio da atividade da GR in vitro

(Mize & Langdon, 1962), e aumenta a gerao de nion superxido pela enzima NADPH

oxidase (Noh & Koh, 2000), resultando em elevada produo de ERO. Por fim, tem sido

sugerido que o zinco tambm pode contribuir na patobioqumica de desordens

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neurodegenerativas, tais como Mal de Parkinson, algumas formas de Esclerose Lateral

Amiotrfica, e Mal de Alzheimer (Cuajungco & Lees, 1997; Puttaparthi et al., 2002;

Friedlich et al., 2004).

1.5. Sinalizao Celular

Nos organismos multicelulares, as clulas necessitam utilizar vias de sinalizao

para comunicar-se entre si e para comandar diversas funes relacionadas, entre outras,

migrao, proliferao, diferenciao e morte (Davis, 2000). Neste processo, a fosforilao

de protenas representa uma via comum e de fundamental importncia.

Fig. 10. Diagrama esquemtico do sistema de fosforilao de protenas. As protenas cinases catalisam a transferncia de -fosfato (P) do ATP a resduos de serina (Ser), treonina (Thr), ou tirosina (Tyr) presentes nas protenas substratos. As protenas fosfatases catalisam a hidrlise da ligao fosfoster, causando a liberao do fosfato inorgnico (Pi). Fonte: modificado a partir de http://www.emdbiosciences.com. Acessado em Julho de 2006.

Sinais extracelulares, dentro ou fora do SNC, so conhecidos por produzir muitos de

seus efeitos fisiolgicos atravs da regulao do estado de fosforilao de protenas

19

http://www.emdbiosciences.com/

especficas em suas clulas-alvo (Robinson & Cobb, 1997; Hunter, 2000; Greengard,

2001). Um sistema de fosforilao de protenas consiste de: uma protena cinase, uma

protena fosfatase, um substrato protico e ATP (Fig. 10).

1.5.1. Protenas Cinases

Protenas cinases so classificadas como protenas serina/treonina ou tirosina

cinases porque so capazes de fosforilar substratos proticos em resduos de serina/treonina

ou tirosina. As protenas cinases catalisam a transferncia de um grupo fosfato do ATP

para o grupo hidroxila no respectivo resduo de aminocido em seu substrato protico (Fig.

10) (Nestler & Greengard, 1999).

A fosforilao de protenas realiza um papel fundamental na regulao de diversas

funes celulares, sendo o principal mecanismo acionado no processo de transduo de

sinal em resposta a diversos sinais extracelulares (Hunter, 1995; Pawson & Scott, 1997;

Lau & Huganir, 1999; Nestler & Greengard, 1999; Schillace & Scott, 1999; Hunter, 2000;

Lau & Huganir, 2006). A fosforilao de uma protena altera sua carga e, por conseqncia,

sua conformao de forma reversvel. Esse mecanismo regula a atividade funcional de

diversas protenas, desencadeando respostas biolgicas especficas. Dessa forma, a

fosforilao/defosforilao de protenas pode regular importantes processos biolgicos,

como a atividade cataltica de enzimas, abertura/fechamento de canais inicos, atividade de

receptores, atividade de fatores de transcrio, localizao intracelular de protenas e

dinmica do citoesqueleto (Greengard, 2001).

No SNC, tem sido bem documentada a cascata de sinalizao da via PI3K-Akt e seu

envolvimento na regulao da sobrevivncia celular atravs de diversos mecanismos,

20

incluindo fosforilao e inibio de mediadores pr-apoptticos (Datta et al., 1999), e

upregulation da expresso de genes com potencial antiapopttico (Andjelkovic et al.,

1997; Meier et al., 1997). Alm disso, h evidncias do envolvimento da via PI3K-Akt no

metabolismo, atravs da sua atuao na captao de glicose (Kohn et al., 1995; Kohn et al.,

1996).

1.5.1.1. Akt como Elemento Regulatrio Essencial

A protena quinase B (PKB) ou Akt amplamente expressa em mamferos, sendo

que trs membros desta famlia de serina/treonina cinases so conhecidos, sendo eles PKB

ou Akt1, PKB ou Akt2, e PKB ou Akt3. A expresso celular da Akt pode variar entre os

diferentes tipos de tecidos e clulas (Chong et al., 2005). A Akt1 a isoforma mais

expressa. Embora a Akt2 seja expressa em nveis menores do que a Akt1, ela ocorre em

tecidos responsivos insulina, como msculo esqueltico, fgado, corao, rins e tecido

adiposo (Altomare et al., 1995). Akt parte da superfamlia de protenas cinases AGC

(protena cinase dependente de cAMP/protena cinase G/protena cinase C), e consiste de

trs domnios funcionais. O domnio N-terminal com homologia plextrina (PH) fornece

stios de ligao para os fosfolipdios de membrana, os quais esto envolvidos no

recrutamento da Akt para a membrana plasmtica (Brazil et al., 2004). O domnio cataltico

da Akt tem especificidade por resduos de serina ou treonina de protenas substrato para

Akt (Frech et al., 1997). O domnio carboxil terminal possui um motivo hidrofbico

caracterstico da famlia AGC (Peterson & Schreiber, 1999). A fosforilao dos resduos de

serina e treonina desse motivo hidrofbico necessria para a completa ativao da cinase

(Andjelkovic et al., 1997; Yang et al., 2002; Brazil et al., 2004; Hanada et al., 2004).

21

Em diversos tipos celulares, fatores trficos ou citocinas, via modulao de

receptores tirosina cinases ou mesmo de receptores acoplados protena G, causam

ativao da enzima fosfatidil inositol 3 quinase (PI3K), junto membrana celular (Fig. 11).

Aps a ativao, PI3K fosforila, na posio 3, os glicerofosfolipdeos de membrana

fosfatidilinositol 4,5-bifosfato [PI(4,5)P2] ou fosfatidilinositol 4-monofosfato [PI(4)P],

resultando na produo de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) e fosfatidilinositol 3,4-

bifosfato (PIP2). Este evento conduz ao recrutamento de Akt junto membrana plasmtica,

que, atravs da regio com homologia plextrina, liga-se aos PIP2 ou PIP3 de membrana,

sendo sua transio do citosol para a membrana plasmtica um evento essencial para sua

ativao (Thomas et al., 2002; Brazil et al., 2004; Hanada et al. 2004). Assim, a Akt se

torna disponvel para a fosforilao pela PKD1 na Treonina (Thr)308 e por uma outra

protena cinase ainda no estabelecida na posio Serina (Ser)473 (Stephens et al., 1998;

Datta et al., 1999; Brazil et al., 2004; Hanada et al. 2004). A fosforilao dos resduos de

Thr-308 e Ser-473 considerada crtica para a ativao da Akt (Bellacosa et al., 1998;

Yang et al., 2002). Muitos dos efeitos antiapoptticos desses fatores de crescimento podem

ser atribudos, em parte, ativao desta via, o que foi primeiramente demonstrado em

clulas PC12 por Yao e Cooper (1995).

22

Fig. 11. Alvos da regulao da sobrevivncia celular pela Akt. Modificado a partir de Song et al., 2005.

Muitos estudos tm demonstrado que a ativao da Akt necessria para a

sobrevivncia celular, sendo que a apoptose induzida pela retirada de fatores de

crescimento, radiao UV, dano ao DNA, e tratamento com TGF, em muitos tipos

celulares, reduzida atravs da transfeco da Akt constitutivamente ativa. Em contraste, a

introduo da Akt dominante negativa (ou inativa) bloqueia a sobrevivncia de clulas

mesmo na presena de fatores de crescimento, reforando a significncia desta via na

preveno de morte celular (Dudek et al., 1997).

Akt um fator de sobrevivncia crtico que pode modular vias celulares no sistema

nervoso central e perifrico. Numerosos estudos identificaram a Akt como um fator chave

na proteo contra a morte celular (Lawlor & Alessi, 2001). Estudos anteriores

demonstraram que a superexpresso da Akt nos neurnios do SNC previne apoptose

23

induzida pela privao celular de fatores de crescimento (Datta et al., 1997). Akt previne

apoptose promovendo a sobrevivncia celular. Isso ocorre, primariamente, via fosforilao

da protena pr-apopttica BAD, desfazendo sua interao com as protenas anti-

apoptticas Bcl-2/Bcl-XL e evitando a liberao mitocondrial do citocromo c (Datta et al.,

1997; Prasad et al., 2000).

Portanto, tem sido bem documentado que Akt necessria para a sobrevivncia de

neurnios (Crowder & Freeman, 1998). O aumento da forma ativa da Akt (fosfo-Akt) pode

promover a sobrevivncia celular durante exposio a radicais livres ou estresse oxidativo

(Matsuzaki et al., 1999; Chong et al., 2003; Kang et al., 2003a,b), dano ao DNA (Henry et

al., 2001; Kang et al., 2003a), pr-condicionamento hipxico (Wick et al., 2002), exposio

ao peptdeo -amilde (Wick et al., 2002), e administrao de TGF- (Conery et al.,

2004).

A ativao da Akt, porm, nem sempre desejada. Sob certas condies, a

sobrevivncia celular aumentada durante a ativao da Akt poderia fomentar o crescimento

de clulas neoplsicas. Um estudo recente identificou a Akt como um alvo potencial a ser

bloqueado durante o tratamento de clulas cancerosas que contm mutaes no fator de

crescimento epidrmico (EGF) (Sordella et al., 2004).

1.5.1.2. Papel de radicais livres e ERO na sinalizao celular

Recentemente, tem sido proposto que as espcies reativas de oxignio possuem um

papel no mecanismo coordenado da sinalizao celular. Foi demonstrado que elas

estimulam um grande nmero de vias de transduo de sinal que so importantes na

manuteno da homeostase celular neuronal (Borg & London, 2002).

24

As complexas redes de sinalizao envolvem numerosas vias bioqumicas, e tm

sido extensivamente estudadas quanto ao seu papel na sobrevivncia ou morte celular em

consequncia de processos neurodegenerativos ou de injria ao SNC. Como mostrado na

Fig. 12, muitas dessas vias podem ser reguladas pelo estado redox celular como

consequncia, por exemplo, da modificao oxidativa de protenas ou de stios especficos

(Finkel, 1998).

Fig. 12. Vias que podem ser mediadas por estresse oxidativo. ERO ativam muitas vias de sinalizao celular. Algumas podem estar envolvidas na promoo de morte celular, como as vias de p38, JNK, p53 e JAK/STAT, enquanto outras cascatas, como aquelas envolvendo ERK1/2, Akt e HSF-1 tm sido propostas como citoprotetoras (modificado a partir de Martindale & Holbrook, 2002).

As cascatas de sinalizao envolvidas na sobrevivncia celular so complexas e os

mecanismos de modulao destas vias pelos diversos fatores, incluindo ERO, no so bem

compreendidos. Estudos tm demonstrado que a ativao de JNK e p38MAPK por ERO

implica na promoo de morte celular, e que a ativao de vias como ERK1/2 e AKT tm

25

se mostrado neuroprotetoras (Martindale & Holbrook, 2002; Hanada et al., 2004; Murphy

& Blenis, 2006). Entretanto, na dependncia do tempo de ativao e do compartimento

celular, podem ser observadas variaes na ao de cada uma das MAPK quanto

capacidade de causar dano ou proteo celular nas resposta de estresse (Chen et al., 2004;

Waetzig & Herdegen, 2005; Murphy & Blenis, 2006).

No que tange especificamente a modulao de Akt por ERO pode ser citado que o

perxido de hidrognio pode levar ativao endgena da Akt em diversas linhagens

celulares, tais como clulas Hela, A549 e glioblastoma humano (Sonoda et al., 1999; Wang

et al., 2000). Alm disso, a ativao da Akt tem sido demonstrada durante estresse

oxidativo em linhagens de clulas neuronais (Kang et al., 2003a,b; Salinas et al., 2003),

clulas primrias de hipocampo (Matsuzaki et al., 1999) e neurnios corticais

(Crossthwaite et al., 2002; Chong et al., 2003).

Diante da importncia do zinco na promoo de estresse oxidativo e na regulao de

diversos alvos proticos, incluindo a possvel modulao de Akt, considerando o papel

fundamental desta protena na regulao neural, se faz importante aprofundar o

entendimento das aes moleculares do zinco sobre estes parmetros. Desta forma, atravs

da compreenso destas aes pretende-se contribuir para a melhor compreenso do papel

neuroprotetor e neurotxico do zinco no SNC.

26

2. OBJETIVOS

Objetivo Geral

O objetivo geral deste trabalho investigar as aes do zinco sobre as defesas

celulares antioxidantes in vivo e in vitro. Alm disso, o estudo pretende investigar possveis

aes do zinco na modulao de alguns alvos moleculares relacionados sinalizao

celular e que poderiam intermediar aes fisiolgicas ou patolgicas do metal.

Objetivos Especficos

1. Determinar o contedo de glutationa total e enzimas antioxidantes (GPx, GST, catalase

e GR), em hipocampo e crtex cerebral de ratos jovens tratados in vivo com zinco.

2. Determinar a atividade das enzimas antioxidantes (GPx, GST, GR e GGT) em fatias de

hipocampo de ratos jovens frente ao tratamento in vitro com zinco.

3. Investigar uma possvel interao entre a ao do zinco e do perxido de hidrognio,

relativo modulao da viabilidade celular em fatias hipocampais de ratos jovens.

4. Caracterizar a modulao pelo zinco da fosforilao da protena quinase Akt em fatias

hipocampais de ratos jovens expostos in vitro ao metal, identificando o possvel papel

desta regulao na modulao da viabilidade celular.

27

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. Animais

Nos modelos experimentais foram utilizados ratos da linhagem Wistar provenientes

do Biotrio Central da Universidade Federal de Santa Catarina. Foram usados ratos jovens

entre 8 e 13 dias de idade. Os animais tiveram acesso irrestrito a gua e comida, e foram

mantidos em ambiente com temperatura entre 22 e 24C, e ciclo claro-escuro de 12 horas

(luzes ligadas das 7:00 s 19:00 h). Os animais foram manipulados e mortos de acordo com

o cdigo de tica de utilizao de animais para pesquisa, conforme protocolo aprovado pela

CEUA-UFSC (Protocolo No. 297/CEUA; Processo No. 23080.012517/2004-36).

3.2. Tratamentos in vivo

3.2.1. Tratamento Agudo ou com Doses Repetidas de ZnCl2

Para o estudo da ao do ZnCl2 in vivo sobre os nveis de GSH-t ,e sobre a atividade

das enzimas antioxidantes GPx, catalase, GR e GST, os animais com 13 dias de idade

foram tratados com uma dose aguda de ZnCl2 com uma injeo intraperitonial de soluo

salina (NaCl 0,9%; controle) ou ZnCl2 (1, 4 ou 16 mg/kg, diludo em soluo salina). Os

animais foram sacrificados 24 horas aps a injeo.

No tratamento com doses repetidas, os animais foram tratados por cinco dias

consecutivos (do 8 ao 12 dia ps-natal) com uma injeo diria intraperitonial (i.p.) de

soluo salina (NaCl 0,9%; controle) ou ZnCl2 (1, 2 ou 4 mg/kg, diludo em soluo

28

salina). Os animais foram sacrificados no 14 dia ps-natal, ou seja, 48 horas aps a ltima

injeo.

Os animais foram mortos por decapitao e as estruturas rapidamente dissecadas

sobre gelo. Para a determinao de GSH-t foi utilizado tecido fresco, enquanto que, para a

determinao da atividade das enzimas antioxidantes, as estruturas foram preservadas em

ambiente contendo gelo seco at seu armazenamento em freezer -80C para posterior

anlise.

3.3. Tratamentos in vitro

Os animais foram mortos por decapitao e o crebro rapidamente retirado e a

seguir dissecado (4C) sob papel filtro umidecido com tampo HEPES/salina (124 mM de

NaCl, 4 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 25 mM de HEPES, 12 mM de glicose e 1 mM de

CaCl2, pH 7.4), previamente oxigenado por 30 minutos. Os hipocampos foram isolados e

rapidamente fatiados na espessura de 400 m, utilizando um fatiador de tecidos de

McIlwain. Aps este procedimento, mantendo as fatias imersas em tampo HEPES/salina

(4C), foi realizada a seleo das fatias hipocampais com aproximadamente o mesmo

tamanho para os procedimentos subseqentes.

3.3.1. Tratamento das Fatias de Hipocampo.

As fatias hipocampais foram usadas para o estudo da ao do ZnCl2 sobre a

viabilidade celular, sobre a atividade das enzimas antioxidantes GPx, catalase, GR e GST.

Neste sentido, fatias de hipocampo (10 fatias/tratamento) foram pr-incubadas, por 30 min,

29

com tampo HEPES/salina (300l), em temperatura ambiente, para recuperao metablica

do tecido. Aps esse perodo, o meio foi retirado e as fatias submetidas a incubaes por

um perodo de 2 horas (37C), em tampo HEPES/salina (controle), ou este mesmo meio

contendo 10, 30, 100 ou 300 M de ZnCl2. Nos estudos de modulao de viabilidade e de

fosforilao de AKT, foi seguido o mesmo protocolo, exceto pela utilizao de apenas uma

fatia/tratamento, realizado em triplicata.

Para determinar se a ao do zinco sobre a viabilidade celular poderia ter sinergismo

com a ao de agentes pr-oxidantes, as fatias foram incubadas com o zinco e, a seguir,

com perxido de hidrognio. Neste protocolo, aps pr-incubao (30 min) com tampo

HEPES/salina, as fatias foram incubadas com diferentes concentraes de zinco (10100

M) por 2 horas (37C). A seguir as fatias foram lavadas com tampo HEPES/salina e,

ento, foi adicionado H2O2 1 mM por 1 hora adicional. Fatias incubadas com ZnCl2 (10-

100 M; 2h) seguidas da incubao apenas com tampo HEPES/salina serviram como

controle relativo ao do zinco isoladamente.

3.4. Avaliao da Viabilidade Celular.

A viabilidade celular das fatias foi medida pelo mtodo do MTT. Aps os

respectivos tratamentos, as fatias hipocampais foram incubadas com MTT (0,5 mg/ml em

tampo HEPES/salina) por 30 minutos a 37C. O MTT (brometo de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-

il]-2,5-difenil-tetrazolium = Thiazolyl blue) um sal de tetrazlio solvel em gua, o

qual convertido em um formazam prpura aps clivagem do anel de tetrazlio por

desidrogenases mitocondriais (Liu et al., 1997). O formazam solubilizado com a adio

de dimetil sulfxido (DMSO), formando um composto colorido cuja densidade ptica

30

medida em 550 nm em uma leitora de placas de 96 poos. A atividade mitocondrial

(viabilidade celular) diretamente proporcional capacidade redutora sobre o MTT e,

portanto, produo de cromgeno.

3.5. Parmetros Antioxidantes

O hipocampo ou crtex cerebral foram homogeneizados em 300 l de tampo

HEPES 20 mM, pH 7,0 e centrifugados a 20.000 g por 30 min. O sobrenadante foi coletado

para as dosagens das enzimas antioxidantes.

3.5.1. Avaliao da Atividade Glutationa Peroxidase (GPx)

A GPx catalisa a reduo do H2O2, bem como de perxidos orgnicos, utilizando a

glutationa reduzida (GSH) como co-substrato para esta reao para produzir glutationa

oxidada (GSSG). A GSSG reduzida pela glutationa redutase com o consumo de NADPH

( = 6.220 M-1 cm-1), que pode ser acompanhado espectrofotometricamente em 340 nm

(Wendel, 1981; Floh & Gnzler, 1984). Para este ensaio, o meio de reao continha

tampo fosfato 0,1 M, pH 7,0, 1 mM EDTA, GSH 1 mM e NADPH 0,1 mM. Adicionou-se

amostra neste meio para mensurar o consumo inespecfico de NADPH atravs de uma

leitura por 2 min a 340 nm. Ao adicionar o substrato t-BOOH (hidroperxido de tert-butila)

1 mM, a leitura foi realizada por mais 2 min. Ao decrscimo de absorbncia por minuto

obtido descontou-se o consumo inespecfico de NADPH. O valor obtido foi dividido pelo

coeficiente de extino molar do NADPH ( = 6.220 M-1 cm-1) e multiplicado pelas

31

diluies. O valor foi expresso como mUnidades/mg de protena. Uma Unidade

corresponde a 1 mol/ml/min.

3.5.2. Avaliao da Atividade Glutationa Redutase (GR)

A GR catalisa a reduo da glutationa oxidada (GSSG) atravs da oxidao do

NADPH. Ao utilizar o substrato GSSG, a enzima leva ao consumo de NADPH, que

acompanhado em 340 nm. A velocidade de consumo do NADPH, em condies de

saturao, expressa a atividade enzimtica (Carlberg e Mannervik, 1985). O meio de reao

continha tampo fosfato 0,1 M (pH 7,0), 1 mM de EDTA e NADPH 0,2 mM. Aps

adicionar a amostra, o consumo inespecfico de NADPH foi medido por 2 min a 340 nm.

Ao adicionar o substrato GSSG 1 mM, a leitura foi realizada por 2 min adicionais. Do

decaimento por minuto obtido descontou-se o consumo inespecfico de NADPH. O valor

obtido foi dividido pelo coeficiente de extino molar do NADPH ( = 6.220 M-1 cm-1) e

multiplicado pelas diluies. O valor foi expresso como mUnidades/mg de protena. Uma

Unidade corresponde a 1 mol/ml/min.

3.5.3. Avaliao da Atividade Glutationa S-Transferase (GST)

A GST catalisa a conjugao da GSH com o substrato sinttico 1-cloro-2,4-

dinitrobenzeno (CDNB) que produz um conjugado que detectado em 340 nm. A atividade

enzimtica proporcional velocidade de produo do composto conjugado (Habig &

Jakoby, 1981). Para este ensaio, o meio de reao continha tampo fosfato 0,1 M, pH 7,0, 1

mM de EDTA e GSH 1 mM. Foram feitas leituras independentes realizadas por 2 min para

32

mensurar a velocidade da reao espontnea do CDNB com GSH, neste caso, sem a

presena da amostra. Depois de acrescentar a amostra e o segundo substrato (CDNB 1 mM)

ao meio de reao, realizou-se a leitura por 2 min a 340 nm. Ao decaimento por minuto

obtido com a amostra, descontou-se a velocidade da reao espontnea. O valor obtido pelo

coeficiente de extino molar do conjugado GSH/CDNB ( = 9.600 M-1 cm-1) foi

multiplicado pelas diluies. O valor foi expresso como mUnidades/mg de protena. Uma

Unidade corresponde a 1 mol/ml/min.

3.5.4. Avaliao da Atividade Catalase (CAT)

A alta velocidade de reao desta enzima, associada a uma baixa afinidade,

permite a determinao de sua atividade na presena de concentraes elevadas de H2O2

(10 mM). A atividade determinada pela velocidade de consumo da H2O2 no primeiro

minuto da reao. A leitura foi realizada em 240 nm (Aebi, 1984).

3.5.5. Avaliao da Atividade -Glutamil Transpeptidase (GGT)

A atividade da GGT foi analisada nos pellets das fatias submetidas

centrifugao, os quais foram ressuspensos em tampo HEPES 20 mM pH 7,0. Os tecidos

foram incubados com -glutamyl p-nitroanilide e o dipeptdeo glicil-glicina. A GGT

transfere a poro -glutamyl da -glutamyl p-nitroanilide. No processo de transferncia do

grupo gama-glutamil do substrato sinttico gama-glutamil-p-nitroanilida para glicil-glicina,

um cromforo formado e lido em 410 nm. A formao da cor diretamente proporcional

atividade da enzima (Meister et al., 1981; Griffith, 1981).

33

3.5.6. Mensurao dos Nveis de GSH Total (GSH-t)

O hipocampo e o crtex cerebral foram homogeneizados em cido perclrico (PCA)

0,5 M. As amostras foram centrifugadas por 2 min a 15.000 g, e o sobrenadante foi retirado

e diludo 10 vezes em tampo fosfato de potssio, 0,1 M, pH 7,0, para assim neutralizar a

amostra.

O mtodo utilizado enzimtico e foi originalmente descrito por Tietze (1969), e

posteriormente modificado por Akerboom e Sies (1981). Este mtodo cclico e detecta

tanto GSSG como GSH, definido como glutationa total (GSH-t). As leituras foram feitas

em espectrofotmetro a 412 nm por 2 min, contendo fosfato de potssio 0,1 M pH 7,0, 0,2

U/ml de GR, 0,1 mM DTNB, 1 mM EDTA e 0,2 mM NADPH. A concentrao de

glutationa foi obtida atravs da realizao de uma curva padro com concentraes

conhecidas de GSSG. Os valores so expressos em mol/g tecido fresco.

3.6. Dosagem de Protenas

Para a anlise atravs de Western Blotting, as protenas foram dosadas atravs do

mtodo de Peterson (1977). Sobre alquotas de 3l das amostras foram adicionados 397l

de gua e 400l do reagente de Lowry (0,2 N de NaOH, 2,5% de SDS, 5% de Na2CO3,

0,2% de CuSO4 e 0,1% de tartarato duplo de sdio e potssio). As amostras foram agitadas

imediatamente e deixadas em repouso por dez minutos. Em seguida foram adicionados 200

l do reagente de FOLIN 0,4 N, seguido de agitao imediata, e incubadas por 30 minutos.

34

A leitura foi realizada em 750 nm e as concentraes foram obtidas atravs de uma curva-

padro utilizando albumina de soro bovino (BSA).

Para a anlise da atividade da glutationa e das enzimas antioxidantes, o contedo de

protenas foi quantificado pelo mtodo de Bradford (1976). A absorbncia foi lida em

espectrofotmetro a 595 nm, usando albumina de soro bovino como padro.

3.7. Separao de Protenas

As fatias hipocampais foram colocadas individualmente em tampo de amostra (4 %

de SDS, 50 mM de Tris e 100 mM de EDTA , pH 6.8) e aquecidas por cinco minutos para

permitir a solubilizao do tecido. Foram usados 100l de tampo de amostra por fatia.

Cada fatia hipocampal de animais de 14 dias tinha, em mdia, 150g de protena. Em

seguida foi adicionada a soluo de diluio de amostra (40% de glicerol, 25mM de Tris e

Bromofenol Blue; pH 6.8), numa proporo soluo de diluio/soluo de amostra de

25:100 (v/v), e 8% de -mercaptoetanol. As protenas (50g/poo) foram separadas por

eletroforese em minigel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE), usando gel de

separao a 10% e gel de entrada a 4% de acrilamida. A eletroforese foi realizada com

corrente fixa de 20 mA por placa e voltagem mxima de 140 V, por aproximadamente 2,5

h, em temperatura ambiente, utilizando-se o tampo superior (190mM de glicina, 25mM de

Tris e 0,1% de SDS) e o inferior (50 mM de Tris; pH 8.3). Aps a corrida, os gis foram

submetidos eletrotransferncia.

35

3.8. Eletrotransferncia e Imunodeteco

Aps a eletroforese o gel foi fixado durante 1 hora em soluo fixadora (50% de

metanol e 8% de cido actico) e a seguir foi lavado com tampo superior de eletroforese

(25 mM de Tris, 190 mM de glicina e 0,1% de SDS) por 30 minutos. Aps esse perodo, o

gel foi equilibrado em tampo de transferncia (50 mM de cido Brico e 4 mM de EDTA;

pH 8.9) durante 30 minutos. As protenas foram transferidas do gel para a membrana de

nitrocelulose no sentido do plo negativo para o positivo, utilizando um sanduche

compreendido de espuma de suporte, papel filtro, gel, nitrocelulose, novamente papel filtro

e espuma de suporte. A transferncia foi realizada a 4C usando corrente de 400 mA por 3

horas em uma cuba contendo tampo de transferncia. Aps a eletrotransferncia, as

membranas foram coradas com soluo de Ponceau [0,5% de Ponceau (w/v) em 1% de

cido actico (v/v)] para controle da transferncia.

Para a imunodeteco as membranas foram lavadas primeiro com gua miliQ,

depois com TBS (10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7.5). A seguir foram bloqueadas

por 1 hora com 5% de leite desnatado em TBS em temperatura ambiente. Aps esse

primeiro bloqueio, as membranas foram lavadas por 3 vezes de 5 minutos com TBS-T

(Tween-20 0,05%, 10 mM de Tris e 150 mM de NaCl, pH 7.5) e submetidas a um segundo

bloqueio de 1 hora usando uma soluo de 1,5% de gelatina em TBS. As membranas foram

novamente lavadas 3 vezes (5 minutos cada) com TBS-T, para finalmente serem incubadas

com o anticorpo primrio anti-fosfo Akt (p-serina-473) durante 12-14h e anti-Akt total por

um perodo de 2 horas temperatura ambiente.

Aps as incubaes, as membranas foram novamente lavadas com TBS-T (4 vezes

de 5 minutos) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com anticorpos secundrios

36

especficos (conjugados peroxidase). Para a imunodeteco, as membranas foram lavadas

4 vezes (5 minutos) com TBS-T e 2 vezes com TBS, sendo que as bandas correspondentes

s respectivas protenas foram reveladas utilizando kit ECL (quimiluminescncia)

conforme as recomendaes do fabricante. As medidas de fosforilao e/ou imunocontedo

das protenas foram realizadas atravs de densitometria. Para anlise de uma mesma

membrana com sucessivos anticorpos foi realizado o strip de membrana, que consistia na

sucessiva lavagem das membranas com: 1) gua milli-Q, 2) NAOH 0,2 M, 3) gua milli-Q

e 4) TBS-T (5 min em cada).

3.9. Anlise Estatstica

Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA, seguido, quando apropriado, do

teste de Duncan. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0,05.

37

4. RESULTADOS

4.1. Estudos in vivo

4.1.1. Glutationa total no hipocampo e no crtex cerebral de ratos

jovens tratados com ZnCl2 de forma aguda.

Os nveis de glutationa total (GSH-t) em resposta ao tratamento agudo com ZnCl2

(1, 4 ou 16 mg/kg) foram avaliados em hipocampo e crtex cerebral de ratos imaturos com

14 dias de idade (PN14). Os resultados mostraram que o tratamento com metal no causou

alterao significativa dos nveis de GSH-t em nenhuma das estruturas analisadas (Fig. 13).

Fig. 13. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens tratados com o metal de forma aguda. Os painis mostram os nveis de GSH-t em hipocampo (A) e crtex cerebral (B) de ratos tratados no 13 dia ps-natal (PN13) com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos foram avaliados no PN14. O contedo de glutationa expresso em mol/g tecido. Os valores representam as mdias + E.P.M. (n = 5 - 6). O tratamento no causou alterao significativa nos nveis de GSH-t nas regies estudadas.

38

4.1.2. Enzimas antioxidantes em hipocampo e crtex cerebral de ratos

jovens tratados com ZnCl2 de forma aguda.

O tratamento agudo de ratos imaturos (PN13) com ZnCl2 aumentou

significativamente a atividade das enzimas antioxidantes GPx [F(3,18)= 4,57; p 0,05] e

GST [F(3,18)= 3,68; p 0,05] em hipocampo, quando comparados ao controle (Fig. 14 A e

B). O aumento foi de 55% e 36% para a atividade de GPx e GST, respectivamente, e foi

observado apenas na dose de ZnCl2 16 mg/kg. A atividade das enzimas catalase e

glutationa redutase (GR) no sofreu alterao significativa em resposta ao tratamento com o

metal (Figura 14 C e D). Avaliando o crtex cerebral os resultados mostraram que o

tratamento com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg) no alterou, de forma estatisticamente

significativa, a atividade das enzimas antioxidantes GPx, GST, catalase e GR (Fig. 15).

39

Fig. 14. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no hipocampo, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C), glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados no 13 dia ps-natal (PN13) com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no PN14. A atividade da enzima antioxidante GPx (A) demonstrou um aumento de 55% em relao ao controle na dose de 16 mg/kg de ZnCl2. A atividade da enzima GST (B) demonstrou um aumento de 36% em relao ao controle, na dose de 16 mg/kg de ZnCl2. O perfil da atividade das enzimas catalase (C), bem como GR (D) no sofreu nenhuma alterao significativa. Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias dos valores + E.P.M. (n = 5 - 6). * P < 0,05 quando comparado ao grupo controle (soluo salina).

40

Fig. 15. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade de enzimas antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no crtex cerebral, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C), glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados no 13 dia ps-natal (PN13) com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no PN14. Os valores de atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam a mdia + E.P.M. (n = 6).

4.1.3. Glutationa total no hipocampo e no crtex cerebral de ratos

jovens tratados com doses repetidas de ZnCl2.

Os nveis de glutationa total (GSH-t) em resposta ao tratamento com doses repetidas

de ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/kg), administradas em ratos imaturos do 8 ao 12 dia do perodo ps-

natal (PN8-12), foram avaliados no hipocampo e no crtex cerebral de animais no 14 dia

41

ps-natal (PN14). Os resultados mostraram que o tratamento com ZnCl2 no causou

alterao significativa dos nveis de GSH-t no hipocampo ou crtex cerebral (Fig. 16).

Fig. 16. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens tratados com doses repetidas do metal. Os painis mostram os nveis de GSH-t em hipocampo (A) e crtex cerebral (B) de ratos tratados com doses repetidas de ZnCl2. O tratamento compreendia a administrao i.p. de ZnCl2 (1, 2, e 4 mg/kg) no perodo do 8 ao 12 dia PN. Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no 14 dia PN. O contedo de glutationa expresso em mol/g tecido. Os valores representam as mdias + E.P.M. (n = 5 - 6). Os tratamentos no causaram alterao significativa nos nveis de GSH-t nas regies estudadas.

4.1.4. Enzimas antioxidantes em hipocampo e em crtex cerebral de

ratos jovens tratados com doses repetidas de ZnCl2.

O tratamento de animais jovens com administrao diria de ZnCl2, entre o 8 e 12

dias de vida ps-natal, aumentou significativamente em cerca de 52% a atividade de GPx

na dose de 4 mg/kg [F(3,20)= 3,37; p 0,05] e a atividade de GST em 31% e 28% nas doses

de 2 e 4 mg/kg [F(3,20)= 15,64; p 0,01], respectivamente (Figura 17 A e B) em relao ao

grupo controle.

42

Os resultados tambm mostram que o tratamento com ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/kg) no

alterou significativamente a atividade das enzimas antioxidantes GR e catalase no

hipocampo de ratos jovens tratados com zinco (Fig. 17 C e D).

Fig. 17. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no hipocampo, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C) e glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados com doses repetidas de ZnCl2. O tratamento compreendia a administrao i.p. de ZnCl2 (1, 2, e 4 mg/kg) no perodo do 8 ao 12 dia PN. Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no 14 dia PN. O tratamento com ZnCl2 na dose de 4 mg/kg causou um aumento de cerca de 52% na atividade de GPx (A) e nas doses de 2 e 4 mg/kg causou aumento da atividade de GST em cerca de 30% (B). Nenhuma das doses de ZnCl2 testadas alterou a atividade das enzimas catalase (C) e GR (D). Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias dos valores + E.P.M. de seis experimentos (n = 6). * P < 0,05 e ** P < 0,01 quando comparado ao grupo controle (soluo salina).

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A atividade enzimtica de GPx, GST, catalase e GR no sofreu alterao no crtex

de ratos jovens por nenhum dos tratamentos com doses repetidas aplicados (ZnCl2 1, 2 e

4mg/kg) (Fig. 18 A - D).

Fig. 18. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no crtex cerebral, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C) e glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados com doses repetidas de ZnCl2. O tratamento compreendia a administrao i.p. de ZnCl2 (1, 2, e 4 mg/kg) no perodo do 8 ao 12 dia PN. Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no 14 dia PN. Os tratamentos no modificaram a atividade no crtex cerebral de nenhuma das enzimas estudadas. Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias + E.P.M. (n = 6).

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4.2. Estudos in vitro com fatias hipocampais de ratos jovens

4.2.1. Enzimas antioxidantes em fatias de hipocampo tratadas com

diferentes concentraes de ZnCl2.

O tratamento in vitro de fatias hipocampais com ZnCl2 (10, 30, 100 M) diminuiu

significativamente a atividade de GR [F(4,37)=44,46; p 0,001] em todas as concentraes

testadas. O tratamento com ZnCl2 10 M causou uma reduo, em relao ao controle, de

27 % na atividade de GR. Na concentrao de ZnCl2 30 M, a atividade da enzima foi

reduzida em 49%, enquanto na concentrao de 100 M, a atividade enzimtica da GR foi

reduzida em 75%. Estes resultados indicam um forte efeito inibitrio do zinco sobre a

atividade de GR e dependente de concentrao (Fig. 19 D).

A atividade das enzimas antioxidantes GGT, GST e GPx tambm foi medida em

fatias hipocampais de ratos jovens tratados in vitro com zinco. Os resultados mostraram que

o tratamento com ZnCl2 (10 - 100 M) no alterou, de forma estatisticamente significativa

a atividade de nenhuma das enzimas estudadas (Fig. 19 A - C).

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Fig. 19. Atividade de enzimas antioxidantes de fatias hipocampais em resposta ao tratamento in vitro com ZnCl2. Fatias de hipocampo de ratos jovens foram expostas durante 2 h s concentraes indicadas de ZnCl2. Aps homogeneizao as fatias foram ensaiadas para medida da atividade das enzimas: -glutamiltranspeptidase (GGT) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), glutationa peroxidase (GPx) (C) e glutationa redutase (GR) (D). A atividade de GR foi fortemente reduzida pelo ZnCl2 de forma dose dependente. Os dados esto expressos como percentagem do controle (100 %). Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias + E.P.M. (n = 5-8). A mdia + E. P. M. da atividade das enzimas antioxidantes no grupo controle foram: GGT 3,39 0,15; GST 34,62 3,99; GPx 7,18 1,74; e GR 17,2 0,71 mU/g . *** P < 0,001 quando comparado ao grupo controle.

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4.2.2. Avaliao da viabilidade celular em fatias hipocampais expostas

ao ZnCl2.

Os resultados mostraram que o tratamento com ZnCl2 diminuiu a viabilidade celular

em fatias hipocampais de forma dependente de concentrao quando comparado aos

grupos-controle. O ZnCl2, aps 2 horas de incubao na concentrao de 100 M, diminuiu

significativamente, em 20%, a viabilidade celular [F(4,26)= 7,13; p 0,001] (Fig. 20). ZnCl2

10 e 30 M no causaram modificao significativa da viabilidade celular. ZnCl2 300 M

causou um efeito similar ao ZnCl2 100 M. Com base nestes dados e considerando os

possveis nveis sinpticos do metal (Frederickson et al., 2005), optamos por utilizar ZnCl2

100 M como concentrao mxima de metal, nos estudos de modulao de vi